Luận văn Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008

ác định các vi khuẩn Các loại vi sinh vật Nuôi cấy Số mẫu (+) / 270 mẫu Tỷ lệ (%) V. cholerae O1 16 5,92 E. coli 47 17,40 N.A.G 4 1,49 Nghiên cứu của tác giả Đinh Sỹ Hiển và cộng sự tại 25 xã của huyện Từ Liêm, Hà Nội với 2.601 mẫu trong 5 năm cho thấy tỷ lệ dương tính của các loại vi khuẩn gây tiêu chảy là 11,54% [11]. Phải chăng V. cholerae xuất hiện khi các căn nguyên khác phát triển hay V. cholerae là yếu tố mồi từ đó xuất hiện các căn nguyên khác. Nghiên cứu của Lê Lan Hương và cộng sự (1995) đã nghiên cứu trên 121 mẫu phân bệnh nhân có 32 mẫu dương tính với một số vi khuẩn gây tiêu chảy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chiếm tỷ lệ 26,45 % [15], kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Thế Trâm và cộng sự (1985) tại phường Vĩnh Phước, Nha Trang cho thấy tỷ lệ dương tính đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy là 11,34% [42]. Còn tại các bệnh viện có ổ dịch ở khu vực 5 tỉnh Duyên Hải miền Trung qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê với 5.171 mẫu thu thập cho thấy tỷ lệ dương tính với 4 tác nhân gây bệnh là 24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đánh giá nghiên cứu của chúng tôi về phân lập các loại vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mẫu phân ở bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi mắc tả trên 270 mẫu bệnh phẩm cho thấy đối với chủng V. cholerae O1 có 16 mẫu dương tính, với vi khuẩn E. coli có 47 mẫu dương tính, các phẩy khuẩn không phải vi khuẩn tả (N.A.G) có 4 mẫu, trong nghiên cứu chúng tôi các vi khuẩn gây tiêu chảy có tỷ lệ phát hiện dương tính tương đương với các công bố của các tác giả khác. Ngoài ra có một số loaị vi khuẩn khác nhưng vì điều kiện và thời gian ngắn nên chúng tôi chưa đánh giá hết được. Bảng 3.8. Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật nuôi cấy Kết quả Nuôi cấy Tỷ lệ % Âm tính 254 94,07 Dương tính 16 5,93 Tổng 270 100 Tỷ lệ V. cholerae O1 phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả 16 mẫu dương tính trên 270 mẫu chiếm tỷ lệ 5,93% ( Bảng 3.8; biểu đồ 3.6 ), kỹ thuật này cho kết quả rất chính xác nhưng phải qua nhiều bước khác nhau, đặc biệt phải có phòng xét nghiệm vi sinh hợp lý đúng tiêu chuẩn, đủ môi trường nuôi cấy, cán bộ xét nghiệm phải có kinh nghiệm phán đoán để có các hướng cấy chuyển cần thiết tiếp theo, khâu cuối cùng của kỹ thuật là khẳng định bằng ngưng kết kháng huyết thanh đa giá, đơn giá trước khi kết luận. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tỷ lệ phát hiện dương tính V.cholerae O1bằng kỹ thuật nuôi cấy 5.93% 94.07% Âm tính Dương tính Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ dƣơng tính V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy được coi là " tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn còn mặt hạn chế đó là thời gian trả lời kết quả khẳng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát hiện được V. cholerae khi bệnh nhân đã dùng kháng sinh. Kỹ thuật nuôi cấy đã chọn lọc được khuẩn lạc thuần khiết và đặc hiệu ngoài kinh nghiệm của cán bộ xét nghiệm thì yếu tố môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng, môi trường phải đảm bảo chất lượng. Trên môi trường thạch kiềm rất tốt cho sự phát triển của V. cholerae nhưng ngược lại các loại vi khuẩn khác lại không phù hợp do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại tốt với loại vi khuẩn khác. Môi trường thạch TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) là môi trường chọn lọc tốt nhất để phân lập V. cholerae và được dùng rộng rãi trên thị trường, môi trường đã được thương mại hoá đông khô nên dễ pha chế, môi trường có màu xanh sau khi pha chế nhưng chỉ lưu giữ được một thời gian ngắn (3 - 5 ngày ) những khuẩn lạc mọc trên môi trường này không thích hợp cho phản ứng ngưng kết với phản ứng kháng huyết thanh, khuẩn lạc nghi ngờ mọc sau 12 giờ có khuẩn lạc tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng do lên men đường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên saccharose, những vi khuẩn không lên men saccharose có khuẩn lạc màu xanh lơ có thể là V. parahaemolyticus, khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae cần phải cấy trên các môi trường ít chất ức chế như thạch thường, môi trường KIA. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá, các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt V. cholerae. Bảng 3.9. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng TCBS Kích thƣớc khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc n Tỷ lệ % nhỏ 2-3 mm vàng, bóng 67 24,81 nhỏ 1-3 mm không màu 203 75,19 Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả 67 mẫu có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS chiếm tỷ lệ 24,81 % ( Bảng 3.9 ). Môi trường TCBS ( Hình 3.7 ) là môi trường chọn lọc rất tốt trong việc phân lập V. cholerae tuy nhiên khuẩn lạc này không trực tiếp thực hiện phản ứng Oxidase tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc V. parahemoliticus và V. cholerae O1 Hình 3.8. Khuẩn lạc V. cholerae trên môi trƣờng thạch kiềm * Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch kiềm: Là môi trường thạch thường nhưng có pH kiềm ( pH = 9 ) thích hợp cho V. cholerae phát triển, khuẩn lạc V. cholerae nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase. Bảng 3.10. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch kiềm Kích thƣớc Màu sắc khuẩn n Tỷ lệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên khuẩn lạc lạc % nhỏ 1-3 mm Nhỏ, trong, không màu. 62 22,96 nhỏ 1-3 mm Đục, hoặc có các màu khác nhau 218 80,74 Tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm ( Hình 3.8 ) cho thấy môi trường thạch kiềm thích hợp cho V. cholerae O1 phát triển, khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase nên khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi cấy cả 2 loại môi trường kết hợp là TCBS và thạch kiềm và luôn ưu tiên cấy trên thạch kiềm nhiều hơn vì môi trường này V. cholerae O1 mọc nhanh hơn từ 6-24h đã mọc khuẩn lạc và khuẩn lạc này được dùng để thực hiện phản ứng Oxidase và các bước tiếp theo. Trong khi đó trên môi trường TCBS thời gian mọc khuẩn lạc muộn hơn so khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm, nhưng khi mọc đã bổ sung cho nhau về ưu điểm của mỗi loại môi trường, trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho 62 mẫu quan sát khuẩn lạc nhỏ trong không màu chiếm tỷ lệ 22,96 % ( Bảng 3.10 ) * Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trƣờng nuôi cấy Thời gian mọc khuẩn lạc đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy chẩn đoán nhanh V. cholerae O1. Như đã đề cập trong phần tổng quan, nếu có điều kiện nên cấy trên cả 2 loại môi trường là TCBS và thạch kiềm, đặc biệt trên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên môi trường thạch kiềm sau 6 giờ khuẩn lạc đã mọc sẽ được dùng trong phản ứng Oxidase và ngưng kết kháng huyết thanh. Bảng 3.11. Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trƣờng nuôi cấy Theo dõi thời gian mọc khuẩn lạc trên môi trường TCBS và môi trường thạch kiềm chúng tôi nhận thấy trên môi trường thạch kiềm khuẩn lạc mọc 6 giờ sau khi cấy có 21 mẫu mọc chiếm tỷ lệ 7,78 % trong khi đó trên môi trường TCBS chưa có khuẩn lạc nào mọc ( Bảng 3.11 ). Trong phần phương pháp nghiên cứu chúng tôi đã đề cập với thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 môi trường không giống nhau nhưng có ý nghĩa rất quan trọng cho việc khảng định tính chất sinh hóa sau này. Khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae được định hướng dựa vào tính chất sinh vật hóa học để phân biệt được các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột bằng cách chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá. Các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt các loài V. cholerae, đánh giá tính chất sinh vật hóa học chúng tôi chọn 31 mẫu có phản ứng Oxidase dương tính để thực hiện nuôi cấy tiếp trên môi trường sinh vật hóa học. Môi trƣờng Thời gian mọc khuẩn lạc n Tỷ lệ % Môi trường TCBS < 6h 0/270 0 Môi trường thạch kiềm < 6h 21/270 7,78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Các môi trƣờng sinh vật hóa học trong chẩn đoán V. cholerae Bảng 3.12. Bảng đọc kết quả trên môi trƣờng sinh vật hoá học Kết quả thực hiện trên môi trường sinh vật hóa học với 24 mẫu glucoza dương tính, 21 mẫu âm tính đường lactoza, trên môi trường ma nit có 27 mẫu dương tính và 23 mẫu quan sát đường cấy thấy di động, môi trường Indol có 2 mẫu dương tính, đặc biệt trong 3 loại đường thì Arabinoza có 21 mẫu âm tính, mannoza có 20 mẫu dương tính, saccaroza có 20 mẫu dương tính (Bảng 3.12 ) Tính chất sinh vật hóa học có thể phân biệt được các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên để rút ngắn quá trình chẩn đoán ta cần STT Sinh vật hóa học Tiêu chuẩn đánh giá dƣơng tính Kết quả 1 Oxidaza + 31 2 Glucoza / H2S + / + 24 / 23 3 Lactoza - 21 4 Manit + 27 5 Di động + 23 6 urê - 22 7 Indol + 21 8 Arabinoza - 21 9 Mannoza + 20 10 Saccaroza + 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên dùng một số đặc điểm chính để phân biệt (loại trừ ngay các vi khuẩn âm tính với oxidase ). * Nhận biết phản ứng dƣơng tính Oxidase Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc được dùng để thực hiện phản ứng Oxidase, đây là phản ứng rất quan trọng để phân biệt V. cholerae với các vi khuẩn đường ruột khác, V. cholerae có phản ứng oxidase (+). Cách tiến hành đơn giản khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm bằng cách nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều trên giấy lọc đã thấm thuốc thử, quan sát sự đổi màu trong vài phút, có thể coi phản ứng Oxidase như chìa khóa để chẩn đoán vi khuẩn tả vì nếu âm tính thì sẽ loại tìm theo hướng khác, nếu phản ứng dương tính sẽ thực hiện các bước để chẩn đoán vi khuẩn tả. Để rút ngắn quá trình chẩn đoán chúng tôi đã thực hiện một số đặc điểm chính để phân biệt bằng thử phản ứng Oxidase bằng cách nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều trên giấy lọc đã thấm thuốc thử, quan sát sự đổi màu trong vài phút kết quả thể hiện ở ( Hình 3.10 ) Bảng 3.13. Phản ứng Oxidase Kết quả Oxidase Tỷ lệ % Dương tính 31 11,48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Âm tính 239 88,52 Tổng cộng 270 100 V. cholerae có phản ứng Oxidase (+), không nên lấy khuẩn lạc trực tiếp từ môi trường TCBS để làm phản ứng Oxydase từ đó có thể cho kết quả không chính xác mà nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường TCBS sang môi trường không chọn lọc như thạch thường hoặc thạch máu rồi từ đó tiếp tục làm phản ứng Oxidase. Kết quả nghiên cứu chúng tôi cho thấy có 31 mẫu dương tính với phản ứng Oxidase chiếm tỷ lệ 11,48 % ( Bảng 3.13), nếu so kỹ thuật soi tươi phát hiện mẫu nghi ngờ dương tính V. cholerae O1 là 28 mẫu chiếm tỷ lệ 10,37 %. Vấn đề đặt ra trong thực tế nếu các phòng thí nghiệm chưa hoàn chỉnh để thực hiện các bước nuôi cấy thì có thể áp dụng cấy bệnh phẩm từ môi trường tăng sinh vào môi trường thạch kiềm sau 6 giờ ta có thể chọn khuẩn lạc thực hiện phản ứng Oxidase. Hình 3.10. Hình ảnh phản ứng Oxidase * Nhận biết vi khuẩn mọc trên môi trƣờng pepton kiềm Môi trường pepton kiềm được dùng để vận chuyển V. cholerae trong một thời gian ngắn nếu không có môi trường Carry – Blair. Không thể dùng được lâu nếu việc vận chuyển chậm quá 6 giờ vì các vi khuẩn khác như Pseudomonas sẽ mọc lấn át V. cholerae. Pepton kiềm mặn là môi trường tăng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên sinh nên được cấy chuyển liên tiếp 3 lần, mỗi lần 3 giờ ở nhiệt độ 370C. Đây là môi trường tăng sinh tốt nhất cho sự phát triển V. cholerae, vì vi khuẩn này mọc rất nhanh trong pepton kiềm do pH của nó rất thích hợp (pH 8,4-9,2). Khi xét nghiệm mẫu thực phẩm hoặc mẫu nước tìm V. cholerae trong vụ dịch tả người ta thường dùng hai bước tăng sinh bằng pepton kiềm, bước tăng sinh thứ hai nhằm loại bớt các tạp khuẩn, hơn nữa người ta còn dùng môi trường Monsur tellurit-taurocholat để tăng sinh vì môi trường này có nhiều chất ức chế hơn. Theo dõi tính chất mọc của V. cholerae trên môi trường pepton kiềm (môi trường tăng sinh) chúng tôi có một số nhận xét về tính chất mọc váng của V. cholerae trên môi trường pepton kiềm mặn là môi trường tăng sinh có ý nghĩa quan trọng trong các bước của quá trình nuôi cấy vì nếu trong mẫu bệnh phẩm có ít vi khuẩn tả như một số mẫu thực phẩm thì việc cấy môi trường tăng sinh càng đóng vai trò quyết định nếu không sẽ không bao giờ phân lập được vi khuẩn tả trong nước, thực phẩm, là môi trường có độ kiềm cao pH = 8,5 và lượng muối mặn đến 30g trên một lít môi trường, nên khi cấy ở 2-3 giờ đầu các vi khuẩn khác bị ức chế chưa mọc được thì vi khuẩn tả mọc lấn át, do vậy nuôi cấy trên môi trường này có ý nghĩa làm tăng sinh lượng vi khuẩn lên nhiều mặt khác làm thuần khiết đồng nhất khuẩn lạc. Nếu bị nhiễm khuẩn trong quá trình lấy mẫu hoặc nuôi cấy bị nhiễm cũng như bệnh nhân đã điều trị bằng kháng sinh phải sau 3 lần cấy chuyển mỗi lần 3 giờ lúc đó mới có thể phân lập được vi khuẩn tả. Trong nhiều mẫu phân có mật độ vi khuẩn cao ( 107-108/ml phân ) việc tăng sinh là không cần thiết. Canh thang giàu dinh dưỡng thường được sử dụng để phục hồi vi khuẩn, nước pepton kiềm thường được sử dụng nhất, pH của canh thang từ 8,4 - 9,2 thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. V. cholerae là vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, phát triển tốt trong môi trường kiềm có độ pH 8,5 - 9,5 và nồng độ muối đến 15%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.14. Đặc điểm nuôi cấy trên môi trƣờng pepton kiềm Môi trƣờng tăng sinh Môi trƣờng thạch kiềm 1 Môi trƣờng thạch kiềm 2 Môi trƣờng thạch kiềm 3 Kết luận Pepton 1 8 8 Pepton 2 0 6 6 Pepton 3 0 0 2 2 Tổng cộng 16 Kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy nếu bệnh nhân nào mới vào viện chưa điều trị kháng sinh thì việc nuôi cấy phân lập rất dễ và trả lời kết quả nhanh hơn nhiều so với các bệnh nhân đã điều trị thuốc kháng sinh. Qua theo dõi phiếu điều tra và kết quả phân lập trên môi trường pepton kiềm mặn chúng tôi có một số nhận xét ( Bảng 3.14) với 8 bệnh nhân khi vào viện được lấy bệnh phẩm ngay trước khi điều trị bằng kháng sinh thì nhận thấy trên môi trường peptone cấy lần thứ nhất xuất hiện váng nghi tả hơi xám, mỏng, lắc khó tan, sau 4 giờ xen lẫn với váng của tạp khuẩn, sau 8 giờ bằng các phương pháp khác nhau chúng tôi đã trả lời dương tính với V. cholerae. Đồng thời có 6 bệnh nhân phân lập được vi khuẩn tả phải sau 2 lần cấy tăng sinh và 2 bệnh nhân phải sau 3 lần cấy tăng sinh như vậy mới phân lập được điều đó hoàn toàn giống các nghiên cứu khác vì bệnh nhân đã điều trị bằng kháng sinh nên tỷ lệ vi khuẩn ít do vậy khó phân lập hơn. Nếu lấy bệnh phẩm sau 2 ngày sử dụng kháng sinh thì khả năng phát hiện mầm bệnh là rất khó. Một số nhận xét của Thẩm Chí Mục, Phạm Trọng Năm nhận xét về khuẩn lạc trên môi trường đặc và váng của V. cholerae mọc trên môi trường lỏng sẽ dẫn tới sự nhanh chóng chính xác trong khâu trả kết quả. Trong đó có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên đưa ra trên những bệnh nhân có bệnh cảnh lâm sàng điển hình không phải cấy chuyển giai đoạn 2. Những bệnh nhân đã dùng kháng sinh và người lành trong ổ dịch mang vi khuẩn thì phải tăng sinh đến giai đoạn 3 hoặc 4 mới phát hiện được. Trong quá trình nuôi cấy nếu kết hợp quan sát váng của vi khuẩn và khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch kiềm thì tỷ lệ phát hiện dương tính rất cao. Ở tuyến huyện chỉ cần môi trường pepton kiềm qua cấy truyền nhiều lần theo dõi váng của vi khuẩn tả, lấy váng nghi ngờ làm phản ứng ngưng kết sơ bộ nếu ngưng kết gửi lên tuyến trên xác định đồng thời có biện pháp chống dịch ngay [29]. * Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đƣờng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza Thử nghiệm khả năng lên men đường bằng cách dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae cấy vào ống môi trường basicop, sau đó ủ nhiệt độ 37oC/ 18-24 giờ . Đối với V. cholerae thử nghiệm khả năng lên men của 3 loại đường (saccaroza 30%, mannoza 10%, arabinoza 30%), vi khuẩn lên men đường sẽ làm axít hoá môi trường và môi trường chuyển từ xanh lá cây sang vàng. Do vậy khi tiến hành đọc kết quả môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính và giữ nguyên màu môi trường xanh lá cây là âm tính. Bảng 3.15. Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đƣờng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza Nhóm Mannoza Sacaroza Arabinoza Tổng số I + + - 16 II - + - 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên III + + + 2 IV - + + 2 V + - - 0 VI - - - 0 Kết quả phân biệt vi khuẩn tả với các phảy khuẩn khác thuộc 6 nhóm N.A.G trên 3 loại đường với mục đích phân biệt tính chất lên men trên 3 loại đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza nhằm phân biệt các phẩy khuẩn thuộc nhóm N.A.G. Vi khuẩn tả thuộc nhóm I, từ nhóm II đến nhóm VI thuộc các phẩy khuẩn nhóm N.A.G. Có 16 mẫu dương tính nhóm I, trong đó 2 mẫu dương tính nhóm III và 2 mẫu dương tính nhóm IV ( Bảng 3.15). * Kết quả phản ứng kháng huyết thanh Kết quả nghi ngờ trên môi trường sinh vật hóa học và khả năng lên men 3 loại đường là 20 mẫu do vậy từ khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm chúng tôi thực hiện bước định danh cuối cùng và quan trọng là ngưng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá như sau: Bảng 3.16. Kết quả ngƣng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá Kết quả Kháng huyết thanh đa giá Kháng huyết thanh đơn giá Ogawa Inaba Âm tính 4 0 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Dương tính 16 16 0 Tổng 20 16 0 Phản ứng ngưng kết trên phiến kính đủ để xác định sơ bộ là V. cholerae hay không mà không phải làm thử nghiệm nào thêm. Tuy nhiên việc sàng lọc bằng thử nghiệm sinh hóa rất có lợi trước khi thử nghiệm với kháng huyết thanh. Kết quả nhận được từ 2-3 phút sau khi trộn khuẩn lạc với kháng huyết thanh đa giá nếu dương tính các hạt ngưng kết sẽ nổi lên trên nền nước trong, nếu âm tính không thấy hạt nổi và nước sẽ đục. Sau khi ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá chúng tôi tiếp tục thực hiện với 2 loại kháng huyết thanh đơn giá là Ogawa và Inaba. Phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh là bước định danh cuối cùng và quan trọng nhất là ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu sau khi đã sơ bộ bằng các tính chất sinh vật hóa học. ( Bảng 3.16) cho thấy 16 mẫu dương tính với kháng huyết thanh đa giá sau đó ngưng kết tiếp với kháng huyết thanh đơn giá cho kết quả 16 mẫu dương tính Ogawa. 3.2.4. Nhận biết V. cholerae O1 bằng phƣơng pháp test nhanh Chẩn đoán nhanh chính xác bệnh tả là bước rất quan trọng để bước đầu có hướng điều trị bệnh nhân nhanh chóng hiệu quả và biện pháp dịch tễ hợp lý nhằm khống chế bệnh tả. Kit Crystal VC xác định kháng nguyên lipopolysaccharid (LPS) của cả hai nhóm huyết thanh V. cholerae O1 và O139, sử dụng dễ dàng không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, có kết quả nhanh sau 10 phút, độ nhạy của kít theo công bố của nhà sản xuất là 94% đối với khả năng phát hiện ra V. cholerae O1 và 99% đối với khả năng phát hiện ra V. cholerae O139. Độ đặc hiệu 84% với V. cholerae O1 và 96 % với O139 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên [23], rất có ý nghĩa cho những phòng xét nghiệm tuyến huyện, đặc biệt trong thời gian đầu của vụ dịch. Với nguyên lý Kit Crystal VC là thử nghiệm định tính, dựa trên nguyên tắc miễn dịch sắc ký kỹ thuật rất đơn giản, cho kết quả nhanh, dễ đọc kết quả bằng mắt thường, thời gian 15-20 phút quan sát vạch chứng dương xuất hiện màu đỏ, nếu dương tính ở mẫu thử xuất hiện thêm vạch đỏ thứ hai ( Hình 3.11). Hình 3.11. Hình ảnh test nhanh Crystal VC Bảng 3.17. Phát hiện V. cholerae bằng kỹ thuật test nhanh Kết quả Test nhanh Tỷ lệ % Dƣơng tính 17 6,29 Âm tính 253 93,71 * Phản ứng dương tính(+): Xuất hiện 2 vạch màu đỏ * Phản ứng âm tính(-): Xuất hiện một vạch kiểm chứng màu đỏ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tổng 270 100 Nghiên cứu của chúng tôi ( Bảng 3.17 ) nhận thấy trong 270 mẫu thu thập có 17 mẫu dương tính bằng test nhanh chiếm tỷ lệ 6,29%, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu khác và cũng phù hợp với độ nhạy của kít như đã công bố. Nguyễn Bình Minh và cộng sự đánh giá kít chẩn đoán nhanh V. cholerae cho thấy tổng số 65 mẫu thu thập từ bệnh nhân tiêu chảy của Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới Quốc gia và Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội so sánh giữa 2 phương pháp test nhanh và nuôi cấy cho thấy 15 mẫu dương tính cả hai phương pháp, 43 mẫu âm tính, có 6 mẫu kết quả dương tính bằng phương pháp nuôi cấy nhưng lại âm tính với test nhanh. Do vậy test nhanh tuy phát hiện nhanh nhưng vẫn còn tỷ lệ nhỏ âm tính giả nên không thể thay thế phương pháp nuôi cấy để xác định týp huyết thanh [23]. Việc áp dụng test nhanh có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán nhanh V. cholerae sử dụng tương đối đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, có kết quả nhanh sau 10 phút, kít bảo quản dễ dàng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, dễ vận chuyển, tuy nhiên trên thị trường chưa phổ biến rộng rãi do vậy trong nghiên cứu này chúng tôi vẫn phải đề cập áp dụng các phương pháp khác tùy điều kiện cụ thể của từng phòng xét nghiệm. 3.2.5. Chẩn đoán V. cholerae bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều kỹ thuật khác. Kỹ thuật PCR là phương pháp hiện đại, nhanh sau 4-5 giờ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại sinh phẩm đắt tiền, kỹ thuật PCR ưu việt hơn các kỹ thuật khác có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên thể phát hiện bệnh nhân dương tính với V. cholerae ngay khi đã dùng thuốc kháng sinh . * Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật PCR Việc áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh tả đã cung cấp một công cụ nhiều triển vọng đáp ứng nhu cầu cấp thiết phương pháp chẩn đoán nhanh có hiệu quả, khắc phục những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy. Kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn tả trực tiếp trong mẫu phân nhờ khả năng sao chép khuếch đại số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn, kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết từ một đoạn khuôn mẫu sẽ có 2n bản sao, từ một đoạn có thể lên tới hàng tỷ sau 30 đến 40 chu kỳ, các bản sao này do có cùng kích thước phân tử và đủ lớn về mặt số lượng nên có thể phát hiện dễ dàng nhờ điện di trên gel agarose. Bảng 3.18. Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật PCR Kết quả PCR Tỷ lệ % Âm tính 254 94,07 Dương tính 16 5,93 Tổng 270 100 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi ( Bảng 3.18) trên 20 mẫu nghi ngờ dương tính, bằng phương pháp nuôi cấy và kỹ thuật PCR cho kết quả 16 mẫu dương tính với V. cholerae O1, còn lại 4 mẫu không phải là V. cholerae O1. Tỷ lệ V.cholerae O1 dương tính bằng kỹ thuật PCR, cho kết quả chính xác, kết quả mẫu dương tính V. cholerae O1 của kỹ thuật PCR giống như kết quả của kỹ thuật nuôi cấy đều là 16 trường hợp và tỷ lệ dương tính V. cholerae O1 bằng kỹ thuật PCR chiếm tỷ lệ 5,93 % ( Hình 3.12 ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.12. Band 2 đến 12 là V. cholerae , band 13 đến 16 là âm tính 3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán V. cholerae 3.3.1. Kỹ thuật soi tƣơi với kháng huyết thanh đặc hiệu So sánh kỹ thuật soi tươi kết hợp kháng huyết thanh đặc hiệu cho thấy vi khuẩn di động trên vi trường khi soi tươi bằng kính hiển vi, nếu kết hợp nhỏ kháng huyết thanh đặc hiệu vi khuẩn tả đa giá hoặc đơn giá thì khả năng sàng lọc nhanh V. cholerae hiệu quả hơn, sau khi tiến hành nhỏ vài giọt kháng huyết thanh lên lam kính vi khuẩn đang di động, sau đó quan sát vài phút, nếu là vi khuẩn tả sẽ không thấy di động nữa tức vi khuẩn bị bất hoạt bởi kháng huyết thanh tả đặc hiệu. Bảng 3.19. Đánh giá kỹ thuật soi tƣơi với kháng huyết thanh đặc hiệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Kết quả Phƣơng pháp Âm tính Dƣơng tính Tỷ lệ dƣơng tính (%) Soi tươi di động 242 28 10,37 P > 0,05 Bất hoạt di động với kháng huyết thanh đặc hiệu 252 18 6,66 Sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu bất động vi khuẩn tả, kết quả soi trên kính hiển vi thường cũng cho kết quả tốt phù hợp với nền kinh tế tại các cơ sở. Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 28 mẫu di động khi soi tươi, nhưng sau khi nhỏ kháng huyết thanh đặc hiệu cho kết quả 18 mẫu dương tính ( Bảng 3.19). , không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán vi khuẩn V. cholera giữa phương pháp soi tươi di động kết hợp với bất hoạt của kháng huyết thanh đặc hiệu ( P > 0,05 ) Tuy nhiên không phải cơ sở nào cũng có kháng huyết thanh chẩn đoán vi khuẩn tả vì hạn sử dụng ngắn và phải bảo quản 4-8oC điều quan trọng là gần 10 năm nay không có dịch tả nên việc duy trì luôn có kháng huyết thanh sẽ gặp nhiều khó khăn. 3.3.2. Kỹ thuật soi tƣơi và kỹ thuật nhuộm Gram Bảng 3.20. So sánh kỹ thuật soi tƣơi và kỹ thuật nhuộm Gram Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Soi tươi 28 242 270 P < 0,05 Nhuộm Gram 45 225 270 So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram cho thấy phương pháp nhuộm Gram phát hiện 45 mẫu nghi ngờ dương tính, phương pháp soi tươi phát hiện 28 mẫu nghi ngờ dương tính ( Bảng 3.20). Phương pháp soi tươi kết hợp với bất hoạt kháng huyết thanh tả tỷ lệ sàng lọc phát hiện là 6,66% nếu kết hợp với phương pháp nhuộm Gram chúng tôi nghĩ rằng sự bổ trợ các phương pháp với nhau sẽ làm tăng thêm ý nghĩa khoa học cho việc sàng lọc mẫu bệnh phẩm, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong chẩn đoán V. cholerae ( P < 0,05 ). 3.3.3. Kỹ thuật soi tƣơi với kỹ thuật nuôi cấy Nếu có điều kiện kết hợp 2 phương pháp soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy này thì hướng chẩn đoán sẽ được áp dụng đúng theo sơ đồ phân lập. Nghiên cứu chúng tôi ( Bảng 3.20) cho kết quả 16 mẫu dương tính bằng phương pháp nuôi cấy, trong khi đó phương pháp soi tươi phát hiện 28 mẫu nghi ngờ dương tính, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholerae giữa phương pháp soi tươi và nuôi cấy ( P < 0,05 ). Bảng 3.21. Bảng so sánh kỹ thuật soi tƣơi với kỹ thuật nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Soi tươi 28 242 270 P<0,05 Nuôi cấy 16 254 270 3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy So sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy ( Bảng 3.22 ) cho thấy kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện 45 mẫu nghi ngờ dương tính trong khi đó phương pháp nuôi cấy cho kết quả khảng định dương tính 16 mẫu, có sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán vi khuẩn tả giữa phương pháp nhuộm Gram và phương pháp nuôi cấy ( P < 0,05 ). Bảng 3.22. Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Nhuộm Gram 45 225 270 P < 0,05 Nuôi cấy 16 254 270 3.3.5.Phƣơng pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy Bảng 3.23. Bảng so sánh phƣơng pháp test nhanh với nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Test nhanh 17 253 270 P > 0,05 Nuôi cấy 16 254 270 So sánh kỹ thuật nuôi cấy với kỹ thuật test nhanh ( Bảng 3.23 ) cho thấy sự khác biệt giữa 2 kỹ thuật không đáng kể, kỹ thuật nuôi cấy khảng định 16 mẫu dương tính, kỹ thuật test nhanh phát hiện 17 mẫu nghi ngờ dương tính, không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholera O1 giữa phương pháp test nhanh và phương pháp nuôi cấy ( P > 0,05 ). Vấn đề đặt ra nếu tại các phòng xét nghiệm tuyến huyện chưa thực hiện phương pháp nuôi cấy thì nên dùng phương pháp test nhanh cho kết quả sàng lọc nhanh, độ chính xác cũng tương đối chính xác. Chúng tôi không so sánh kỹ thuật soi tươi với thử nghiệm oxidase nhưng trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã ghi lại số liệu mang tính chất tham khảo cho thấy không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholerae giữa thử nghiệm oxidase và phương pháp soi tươi ( P > 0,05 ) tuy nhiên nếu soi tươi thấy vi khuẩn di động và kỹ thuật nuôi cấy chỉ dừng lại ở mức độ quan sát khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm thì kết quả oxydase dương tính kết hợp với soi tươi cũng có ý nghĩa trong việc phát hiện V. cholerae. Kỹ thuật nuôi cấy khâu đầu tiên là cấy trên môi trường tăng sinh và khâu cuối cùng là khảng định bằng kháng huyết thanh đặc hiệu, oxidase là phản ứng đặc trưng ở giữa giai đoạn nuôi cấy mà oxidaza dương tính có thể đưa ra chỉ điểm trong chẩn đoán nhanh V. cholerae có nếu chưa đủ điều kiện thực hiện toàn bộ phương pháp nuôi cấy. Bảng 3.24. Đánh giá kết quả của phƣơng pháp thử Oxidase với kỹ thuật soi tƣơi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Oxidase 31 239 P > 0,05 Soi tƣơi 28 242 3.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy với phƣơng pháp PCR So sánh phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR( Bảng 3.25 ) cho 2 kết quả giống nhau, tuy nhiên mỗi kỹ thuật lại có mặt mạnh và yếu khác nhau, kỹ thuật PCR cho kết quả nhanh trong 4 giờ đã phát hiện mầm bệnh nhưng không phù hợp với tuyến cơ sở vì giá thành cao, trang thiết bị phức tạp, kỹ thuật cũng như trình độ của cán bộ chưa đáp ứng được. Kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả khảng định từ 24 – 48 giờ mới trả lời kết quả và cần một số môi trường nuôi cấy cũng như trang thiết bị phòng vô khuẩn nhưng giá thành phù hợp chỉ cần cán bộ xét nghiệm có kinh nghiệm và có khả năng phân tích kết quả, kết quả nuôi cấy với kỹ thuật PCR cho kết quả dương tính như nhau là 16 mẫu. Bảng 3.25. Bảng so sánh phƣơng pháp nuôi cấy và PCR Phƣơng pháp PCR Nu«i cÊy D•¬ng tÝnh 16 16 ¢m tÝnh 254 254 Tổng 270 270 3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian đƣợc áp dụng các kỹ thuật xét nghiệm trong chẩn đoán V. cholerae Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Kêt quả phân tích, so sánh đánh giá các phương pháp và thời gian áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán V. cholerae chúng tôi tổng hợp ( Bảng 3.26) Bảng 3.26. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian thực hiện Phƣơng pháp XN Đánh giá Dƣơng tính Tỷ lệ % Thời gian thực hiện 1 Soi tươi Di động nhanh 28 10,37 20 phút Bất động kháng huyết thanh 18 6,66 15 phút 2 Nhuộm Gram Gram âm, hình cong 45 16,66 20 phút 3 Test nhanh Dương tính 17 6,29 15 phút 4 Nuôi cấy Ngưng kết KHT 16 5,93 24 – 48 giờ 5 PCR Dương tính 16 5,93 4 giờ Tổng hợp kết quả giữa các phương pháp và thời gian áp dụng các kỹ thuật xét nghiệm trong chẩn đoán V. Cholera ( Bảng 3.26; biểu đồ 3.13 ) có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn các kỹ thuật phù hợp theo điều kiện của từng phòng xét nghiệm. Với bảng tổng hợp này chúng tôi đã đưa ra chỉ tiêu đánh giá, tỷ lệ dương tính, thời gian thực hiện, với mục đích làm cơ sở để cán bộ xét nghiệm nghiên cứu áp dụng sàng lọc nhanh nhất các mẫu nghi ngờ dương tính. Nếu mẫu âm tính sẽ có ngay phác đồ điều trị theo hướng chẩn đoán khác, nếu nghi ngờ sẽ có phác đồ điều trị ngay đồng thời phải tìm hiểu ngay yếu tố dịch tễ nguồn lây bệnh. Kỹ thuật nuôi cấy và kỹ thuật PCR có tỷ lệ phát hiện dương tính là 5,93% sau đến kỹ thuật test nhanh tỷ lệ phát hiện dương tính là 6,29%. Bảng 3.27. Một số phƣơng pháp có thể áp dụng để chẩn đoán nhanh V. cholerae O1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp XN Đánh giá Tỷ lệ Thời gian thực hiện Soi tươi Di động nhanh 10,37 20 phút Bất động KHT Không di động 6,66 15 phút Nhuộm Gram Gram âm, hình cong 16,66 20 phút Test nhanh Dương tính 6,29 15 phút Tổng thời gian thực hiện:  75 phút Bảng các kỹ thuật ( Bảng 3.27 ) đưa ra để các cán bộ xét nghiệm nghiên cứu có thể áp dụng, các kỹ thuật đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, giá thành phù hợp, nếu áp dụng các phương pháp nêu trong bảng thời gian 1giờ cho phép đưa ra kết quả có ý nghĩa sàng lọc mẫu nghi ngờ rất tốt. Phương pháp soi tươi đánh giá dương tính bằng quan sát tính di động cho thấy tỷ lệ dương tính là 10,37% thời gian thực hiện 20 phút đây là kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện, dụng cụ là lam kính, kính hiển vi là đã thực hiện được. Phương pháp nhuộm Gram đánh giá dương tính bằng quan sát hình thể cong và bắt màu Gram âm, thời gian thực hiện 20 phút, tỷ lệ phát hiện dương tính 16,66% là kỹ thuật dễ thực hiện có ý nghĩa trong việc sàng lọc mẫu tại cơ sở. Phương pháp test nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao dùng để áp dụng sàng lọc mẫu rất tốt, trong nghiên cứu tỷ lệ phát hiện nghi ngờ dương tính là 6,29% cho kết quả nhanh sau 15 phút. Tổng thời gian thực hiện của 4 phương pháp xét nghiệm trên là 75 phút với tỷ lệ phát hiện cao nhất là 6,29 %. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 16 17 18 28 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Nuôi cấy PCR Test nhanh Soi tươi + Kháng huyết thanh Soi tươi Nhuộm Gram Biểu đồ 3.13. Biểu đồ tổng hợp các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae Bảng 3.28. Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với bảng lựa chọn ƣu tiên chẩn đoán nhanh V. cholerae O1 Phƣơng pháp XN n Dƣơng tính Âm tính 1 Kỹ thuật nuôi cấy ( Tiêu chuẩn vàng ) 270 16 254 P > 0,05 2 Bảng áp dụng chẩn đoán nhanh (bảng 3.27) 270 17 253 So sánh phương pháp nuôi cấy với bảng ngắn gọn của 4 phương pháp ( Bảng 3.27 ) với P > 0,05 không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholera giữa 2 bảng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Qua nghiên cứu cho thấy mỗi phương pháp đều có mặt mạnh nhưng vẫn có mặt hạn chế, vì vậy cần phối hợp đồng thời các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm như vậy sẽ tăng thêm hiệu quả tỷ lệ phát hiện dương tính. Trong 10 năm gần đây dịch tả hầu như không xuất hiện, đôi khi có một vài bệnh nhân dương tính nhưng mang tính rải rác không thành dịch, nên tài liệu tham khảo gần như không có tài liệu mới. Các tài liệu phần lớn đánh giá về đặc điểm dịch tễ của các vụ dịch, về nghiên cứu ứng dụng các phương pháp chẩn đoán nhanh V. cholerae áp dụng thực tế tại các phòng xét nghiệm tuyến huyện thì chưa có đề tài nào đánh giá đầy đủ, nếu có thì cũng chỉ đưa ra số liệu đánh giá một phương pháp nhưng chỉ phù hợp với phòng thí nghiệm tuyến Trung ương hoặc tuyến tỉnh. Với kết quả nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên địa bàn của phòng thí nghiệm tuyến tỉnh, việc đánh giá so sánh hiệu quả các phương pháp có ý nghĩa rất quan trọng từ đó sẽ lựa chọn được phương pháp phù hợp nhất nhằm sàng lọc mẫu ngay tại cơ sở. Chúng tôi hy vọng trong thời gian tới sẽ ứng dụng triển khai được những phương pháp đã nghiên cứu để giúp các phòng xét nghiệm tuyến huyện làm được một số kỹ thuật, từ đó sẽ có số liệu đánh giá rộng hơn, đáp ứng thực tiễn, tiết kiệm chi phí ít nhất cho đơn vị, giúp cho thầy thuốc có hướng điều trị bệnh kịp thời, đặc biệt giúp các nhà dịch tễ có hướng xử lý nhanh và khoanh vùng ổ dịch giảm lây lan trong cộng đồng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên KẾT LUẬN Nghiên cứu, đánh giá các phương pháp phát hiện Vibrio cholerae O1 trên 270 mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả thời gian từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2008, chúng tôi có một số kết luận sau: 1. Tỷ lệ bệnh nhân dương tính Vibrio cholerae O1 được chẩn đoán xác định là 5,93 %. 2. Đánh giá các kỹ thuật phát hiện V. cholerae O1 cho thấy: 2.1. Kỹ thuật nuôi cấy (được coi là tiêu chuẩn vàng ) tỷ lệ phát hiện dương tính là 5,93% 2.2. Kỹ thuật PCR tỷ lệ phát hiện dương tính là 5,93% phát hiện kết quả nhanh sau 4 – 5 giờ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị và sinh phẩm đắt tiền, phương pháp này phát hiện được cả bệnh nhân dương tính khi đã dùng thuốc kháng sinh. 2.3. Kỹ thuật test nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao tỷ lệ phát hiện dương tính 6,29 % như vậy so với kỹ thuật nuôi cấy có độ sai lệch dương tính là 0,36 %, kỹ thuật cho kết quả nhanh, dễ thực hiện, không đòi hỏi trang thiết bị . 2.4. Kỹ thuật soi tươi đánh giá bằng di động tỷ lệ dương tính là 10,37 % có độ sai lệch so với kỹ thuật nuôi cấy là 4,44% nhưng nếu sử dụng thêm kháng huyết thanh đặc hiệu để bất động vi khuẩn thì tỷ lệ sai lệch giảm từ 4,44 % xuống còn 0,73% rất có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh cũng như hướng điều trị. 2.5. Kỹ thuật nhuộm soi bằng quan sát tính chất bắt màu và hình thể vi khuẩn tỷ lệ phát hiện dương tính là 16,66 % so với kỹ thuật nuôi cấy tỷ lệ sai lệch là 10,73 % Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3. Lựa chọn những kỹ thuật hiệu quả, phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh V. cholerae O1 tại labo tuyến huyện trong giai đoạn hiện nay: 3.1. Kỹ thuật soi tươi kết hợp kháng huyết thanh đặc hiệu của V. cholerae O1 cho kết quả phát hiện là 6,66 % thời gian kết hợp để thực hiện là 25 phút, sự kết hợp của phương pháp này có ý nghĩa rất cao trong việc phát hiện nhanh, phù hợp với phòng thí nghiệm tuyến huyện vì kháng huyết thanh dễ mua có bán trên thị trường và đặc biệt trong nước đã sản xuất, giá thành rẻ phù hợp với tuyến cơ sở. 3.2. Kỹ thuật nhuộm soi thời gian thực hiện 15 phút, tỷ lệ phát hiện dương tính 16,66 % thực hiện kỹ thuật mang tính định hướng giúp cho các kỹ thuật tiếp theo 3.3. Test nhanh tỷ lệ phát hiện dương tính 6,29 % cho kết quả nhanh dễ thực hiện, độ nhạy cũng như độ đặc hiệu tương đối cao. Bảng 3.27. Đã đưa ra số liệu nghiên cứu cụ thể cho từng phương pháp ( Soi tươi, soi tươi bất động kháng huyết thanh, nhuộm Gram, test nhanh ), nên có sự phối hợp chặt chẽ giữa các phương pháp để giảm bớt tỷ lệ sai lệch trong phát hiện, với thời gian 55 phút nếu thực hiện đủ các phương pháp theo bảng trên thì tỷ lệ phát hiện dương tính Vibrio cholerae O1 là 6,29 % góp phần đáng kể kịp thời điều trị sớm cho bệnh nhân , mặt khác có biện pháp ngăn ngừa lây lan dịch trong cộng đồng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐỀ NGHỊ 1. Các phòng xét nghiệm vi sinh cần áp dụng đồng thời các phương pháp để nâng cao tỷ lệ phát hiện Vibrio cholerae O1 trong mẫu bệnh phẩm. 2. Tăng cường năng lực cho phòng thí nghiệm: Hóa chất, thiết bị, con người. Tổ chức tốt mạng lưới những cán bộ làm công tác xét nghiệm thường xuyên trao đổi, thống nhất phương pháp, học tập và trao đổi kinh nghiệm lẫn nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tăng Ấm, Đặng Đức Trạch, Nguyễn Duy Thanh (1983), Bệnh tả El Tor, dịch tễ học và lâm sàng, Nxb Y học, Hà Nội, tr.7-195. 2.Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi khuẩn tả, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr.169-170. 3. Vũ Thanh Bình, Phùng Đắc Cam (1992), “TCP một thành phần kháng nguyên của Vcholerae”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 2(4), tr.87-89. 4. Bộ môn Vi sinh vật (2003), Vibrio. vi sinh Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Nxb Y học, Hà Nội, tr.193-203. 5. Phùng Đắc Cam (2003), Vibrio cholerae và bệnh dịch tả, Nxb Y học, Hà Nội, tr.53-74. 6. Nguyễn Anh Dũng (1991), “Bệnh tả và công tác chuẩn bị phòng chống dịch”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(1), tr.3-7. 7. Bùi Đại (1997), Bệnh tả dịch tễ học và điều trị, Học viện quân y - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.58-65. 8. Lương Văn Đàm, Nguyễn Bá Cẩn, Hoàng Văn Sinh, Vũ văn Nhung (2003), “Một số nhận xét về các vụ dịch tả tại Thanh Hoá”, Công trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Thanh Hoá, tr.58-65. 9. Phan Đạo, Hoàng Thị Phiếm, Nguyễn Đình Sơn (1995), “Nhận xét kết quả xét nghiệm vi sinh vật vụ dịch tả”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(3), tr.18-22. 10. Lê Thị Hồng Hạnh (2002), Tìm hiểu một số đặc tính của Vibrio cholerae O1 ở Việt Nam (1991-2002), Luận văn thạc sỹ Y khoa, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội. 11. Đinh Sỹ Hiển (1988), “Tìm hiểu tình hình bệnh tiêu chảy cấp và hiệu quả của chương trình CDD thí điểm ở Từ Liêm, Hà Nội”, Bộ Y tế, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.7-15. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12. Nguyễn Đăng Hiền, Nguyễn Thị Mai Hương, Đặng Ngân Hà (2008), “Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tiêu chảy do virut Rota tại Việt Nam từ 2007- 2008”, Tạp chí Y học dự phòng, 5(7), tr.19-20. 13. Nguyễn Trần Hiển, Phạm Ngọc Đính (2007), “Tài liệu qui trình xét nghiệm, điều tra, giám sát, phòng chống bệnh tả”, Bộ Y tế, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.1-28. 14. Vũ Quang Huy, Trần Văn Sâm, Vũ Chiến Thắng, Nguyễn Thanh Bình, Đoàn Trọng Tuyên (1993), “Nhận xét cơ cấu và một số đặc điểm của 117 chủng Vibrio phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy cấp tại thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(3), tr.50-55. 15. Lê Lan Hương, Đinh Sỹ Hiền, Nguyễn Thị Thế Trâm, Trần Văn Tùng, Nguyễn Thanh Vân (1995), “Tìm hiểu sự tồn tại của phẩy khuẩn tả ở môi trường nước ngoại sinh và người tại một địa bàn đã nhiều lần xảy ra dịch tả”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(5), tr.347-349. 16. Vũ Minh Hương, Nguyễn Đình Muôn, Nguyễn Văn Hiếu (1994), “Một số trường hợp mắc tả tại Hải Phòng năm 1994”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(2), tr.60-75. 17. Nguyễn Gia Khánh (2008), “Trẻ em Việt Nam mắc bệnh tiêu chảy cấp đứng thư 3 Châu Á”, Mục Y Tế sức khỏe (sggp.org.Vn/y te suc khoe/2008/10). 18. Hạ Bá Khiêm (1995), “Phẩy khuẩn tả”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(5), tr.715-717. 19. Nguyễn Đức Khiển, Nguyễn Đình Sơn, Hoàng Thị Phiếm, Hoàng Hữu Nam (1992), “Kết quả phòng chống dịch tả tháng 5/1992 tại thừa thiên Huế”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 2(3), tr.22. 20. Hoàng Thuỷ Long (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá, Hà Nội, tr.65-80. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21. Nguyễn Bình Minh (2003), “Áp dụng kỹ thuật ADN đa dạng khếch đại ngẫu nhiên (RAPD) nghiên cứu Vibrio cholerae O1”, Tạp chí Y học dự phòng, 13(2), tr.27-30. 22. Nguyễn Bình Minh (2003), “Sự thay đổi tính nhạy cảm kháng sinh của Vcholerae O1 ở Việt Nam và Lào”, Tạp chí Y học dự phòng, 8(4), tr.27. 23. Nguyễn Bình Minh, Ngô Tuấn Cường, Lê Thanh Hương, Nguyễn Hoài Thu (2008), “Đánh giá kít chuẩn đoán nhanh Vibrio cholerae O1 gây bệnh tả”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(2), tr.51-56. 24. Nguyễn Bình Minh, Hoàng Thu Thuỷ, Đặng Đức Trạch (2003), “Miễn dịch dự phòng bệnh tả và hiệu lực của vaccine”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.187-193. 25. Nghiêm Ngọc Minh (2008), Vi sinh vật học phân tử, giáo trình giảng dạy, Viện công nghệ Sinh học, Hà nội, tr.62-76. 26. Lê Thị Ngọc Minh, Nguyễn Đình Sơn, Hoàng Thị Phiếm, Đỗ Diệu Thư, Võ Thu Thuỷ (1992), “Kết quả xét nghiệm vi sinh vật chỉ điểm ở các cơ sở chế biến thực phẩm tại Thừa Thiên Huế, 1992 - 1993”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(3), tr.8-11. 27. Thẩm Chí Mục (1996), Đặc điểm dịch tễ học bệnh tả qua các vụ dịch ở Nam Hà, Luận án Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà nội. 28. Thẩm Chí Mục (1994), “Một số nhận xét về bệnh tả năm 1976 tại Hà Nam Ninh (1994)”, Tạp chí Y học dự phòng, 4(2), tr.19-84. 29. Thẩm Chí Mục, Phạm Trọng Năm (1995), “Một số nhận xét tính chất mốc của phẩy khuẩn tả trên môi trường lỏng và môi trường đặc qua vụ dịch tả 1976 và 1980 tại Hà Nam Ninh”, Hội nội khoa Việt Nam, (1), tr.28-30. 30. Nguyễn Huy Nga (2008), “Về việc tăng cường phòng chống dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm”, Công điện khẩn gửi giám đốc Sở Y tế, giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh / thành phố, Bộ Y tế, Cục Y tế dự phòng và Môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31. Lê Bá Nho (1993), “Một số nhận xét về bệnh tả tại huyện Đông Sơn, Thanh Hoá”, Công trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Thanh Hoá, tr.66-68. 32. Đào Ngọc Phong, Dương Đình Thiện, Nguyễn Duy Thiết (1997), Bệnh dịch tả, Nxb Y học, Hà Nội, 2, tr.309-315. 33. Nguyễn Thị Kiều Phương, Đào Quế Anh, Nguyễn Vĩnh Liên (1994), “Kết quả xét nghiệm vi khuẩn đường ruột từ năm 1975 - 1994”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 4(3), tr.16. 34. Nguyễn Phú Quí (1993), “Chẩn đoán vi khuẩn học bệnh tả do V. cholerae O139”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 3(3), tr.52. 35. Nguyễn Phú Quý, Phùng Đắc Cam, Lương Ngọc Trâm (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá, Hà Nội, tr.78-81. 36. Phạm Song, Nguyễn Tăng Ấm, Đào Đình Đức (1991), Bệnh tả, bách khoa thư bệnh học, Trung tâm biên soạn từ điển bách khoa Việt Nam, Hà Nội, 1, tr.70-75. 37. Nông Thanh Sơn, Lương Thị Hồng Vân (2003), Phương pháp nghiên cứu khoa học, ứng dụng trong y sinh học, Nxb Y học Hà Nội, Hà Nội, tr.20-96. 38. Phạm Kim Thanh, Nguyễn Văn Hiếu (1994), “Kết quả phân lập Vibrio Eltor từ ngoại cảnh trong các vụ dịch tả tại Hải Phòng”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(3), tr.109-110. 39. Trần Tiến (2001), “Giám sát và phòng chống một số bệnh truyền nhiễm gây dịch”, Bộ Y tế, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.19-25. 40. Đặng Đức Trạch (1993), “Dịch tả do Vibrio cholerae O139”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 3(3), tr.52. 41. Đặng Đức Trạch, Đỗ Gia Cảnh, Phạm Kim Sắc, Đỗ Thung, Nguyễn Đức Khiển (1993), “Bệnh dịch tả tại Việt Nam trong những năm gần đây”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 3(3), tr.50. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42. Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê (1985), “Nguyên nhân vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy ở các tỉnh miền Trung (1980-1984)”, Công trình nghiên cứu khoa học (1981-1985) Viện Paster Nha Trang, tr.23-31. 43. Nguyễn Đồng Tú, Ngô Tuấn Cường, Nguyễn Hoài Thu, Lê Thanh Hương, Nguyễn Bình Minh, Đỗ Kim Ninh, Phạm Văn Dịu, Trần Minh Thuỷ (2008), “Giám sát Vibrio cholerae O1 và Vibrio phage trong môi trường nước ngoại cảnh - Các yếu tố dự báo dịch tả”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(4), tr.13- 18. 44. Nguyễn Đồng Tú, Ngô Tuấn Cường, Nguyễn Hoài Thu, Lê Thanh Hương, Nguyễn Bình Minh (2008), “Nghiên cứu thực khuẩn thể tả phân lập từ mẫu nước ngoại cảnh tại Thái Bình”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(4), tr.19- 23. Tiếng Anh 45. Adesina H.O. (1984), “Ident ification of the Cholerae diffusion process in Ibana”, Soc Sci, 18(5), pp.429-440. 46. Akopyanz N., Bukanov N.O., Westblom T.U., Kresovich S. and Berg D.E. (1992), “DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori ditected by PCR-based RAPD fingerprinting”, Nucleic Acids Res, 20, pp.5137-5142. 47. Binh Minh Nguyen, Dac Cam Phung, Noboru Nakasone, Claudia Toma, Naomi Higa, Sunao Iyoda, and Masaaki Iwanaga (2004), “Shiga-Toxin producing Escherichia coli in Vietnam”, Japannese J Tropical Medicine and Hygiene, 32(4), pp.339-341. 48. Briko I.I., Bachtarzi T., Ourtani A., Laouar M. (1985), “Cholerae morbidity problems in 1 of the departments of the Democratic and Popular Republic of Angeria”, Microbiol Epidemiol Immunobiol, 37(5), pp.45-51. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49. CDC (2004), “Cholera and other Vibrio illness surveillance summaries: summary of human Vibrio isolates reported to CDC, 2004”, Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, CDC, MMWR, 47, pp.654-658. 50. CDC (1992), “Cholera associated with international travel 1992”, MMWR, 41, pp.664-667. 51. CDC (1991), “Cholera -- New York”, MMWR, 40, pp.516-518. 52. CDC (1995), “Update: Vibrio cholerae O1 -- western hemisphere, 1991- 1994, and Vibrio cholerae O139 Asia”, MMWR, 44, pp.215-219. 53. CDC (1995), “Update: Vibrio cholerae O1 -- western hemisphere, 1991 - 1994, and V. cholerae O139 -- Asia, 1994”, MMWR, 44, pp.215-219. 54. Dalsgaard A., Skov M.N., Taylor D.N. (1997), “Molecular evolution of Vibrio cholerae O1 strains isolated in Lima, Peru, from 1991 to 1995”, Journal of Clincal Microbiology, 35(5), pp.1151-1156. 55. Ehara M., Nguyen B.M., Nguyen D.T., Toma C., Higa N. (2004), “Drug susceptibility and its genetic basic in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam”, Epidemiol Infect, 132, pp.595-600. 56. Koch R. (1894), “An adress on Cholerae and its bacillus”, BMJ, 2, pp.453-459. 57. Macnamara C. (1876), “A History of Asiatic Cholerae”, London, MacMillan and Co. 58. Morris J.G., Picardi J.L., Lee J.V., Roberts A. (1984),“Isolation of nontoxigenic Vibriocholerae Ogoup 1 from a patient with severe gastro intestinal disease”, J Clin Microbio, 19(2), pp.297-297. 59. Nato F., Boutonnier A., Rajerison M., Grosjean P., Dartevelle S., Guenolo A., Bhuyan N.A., Sack D.A., Nair G.B., Fournier J.M. and Chanteau S. (2003), “One-step immunochromatographic dipstick tests for rapid detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in stool samples”, Clinical Diagn Lab Immunolo Euphytica, 10, pp.476-478. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60. Peak S.H., Lee S.H.,Cho J.H. and Kim Y.S. (2000), “Development of rapid one-step immuno-chromato graphic assay”, Methods, 22, pp.53-60. 61. Sinh D.V., Maria H.M., Matte G.R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B.N., Sanyal S.C., Huq A. and Colwell R.R. (2001), “Molecular Analysis of V. cholerae O1, O139, non - O1, and non - O139 Strains: Clonal Relationships between Clinical and environmental Isolates”, Applied and Environmental Microbiology, Rajiv Gandihic entrefor Biotechnology, Jagathy, Thiruvananthap uram 695014, India, Center for Marine Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institue, Baltimore, Maryland. 62. WHO (1994), “Guidelines for cholerae control”, Genever, pp.1-47.