Luận văn Nghiên cứu xác định tổng số và tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang

+Pha natri bo hiđrua (NaBH4): Hòa tan 0,4 gam NaOH trong 400ml nƣớc, sau đó thêm 4gam Natri bo hiđrua (NaBH4) vào dung dịch trên, lắc nhẹ cho NaBH4 tan hoàn toàn (dung dịch này chuẩn bị hàng ngày). +Axit clohiđric HCl 2M: Pha loãng 165ml Axit clohiđric đặc đến thể tích V = 1 lit bằng nƣớc cất hai lần. + Dung dịch Chì axetat: Hòa tan 10 gam (CH3COO)2Pb.2H2O trong 100ml nƣớc cất hai lần. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.2.1.Phương pháp xác định asen : Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích asen, do giá thành thiết bị cao, cùng với quy trình vận hành phức tạp, nên chỉ có ít phòng thí nghiệm ở Việt Nam sử dụng phƣơng pháp này để xác định asen. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định hàm lƣợng asen trong các mẫu hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. Nguyên tắc của phƣơng pháp đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Các dạng asen vô cơ hòa tan trong dung dịch, có thể ở dạng As (III) hoặc As (V) đƣợc khử về dạng As(III) bằng dung dịch KI vì hiệu suất tạo hydrua của As(V) thấp hơn nhiều so với As(III). Dạng asen này sẽ phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) bởi NaBH4 hoặc kẽm hạt trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat, tạo thành hợp chất màu đỏ tím có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 520 nm. AsO4 3- + 2I - + 2H +  AsO3 3- + I2+ H2O 3Zn + As 3+ + 3H +  3Zn 2+ + AsH3 AsH3+6AgSCSN(C2H5)2 6Ag +3(C2H5)2SCSNH + [(C2H5)2SCSN]As. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Sơ đồ của: Hệ tạo hợp chất mầu của Asin và Bạc đietylđithiocarbamatnhƣ sau. - Phân tích asen tổng số: Để phân tích hàm lƣợng tổng asen trong hải sản, mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng hỗn hợp các axit để chuyển tất cả các dạng asen về asen (V), sau đó asen (V) đƣợc khử về asen (III) bằng KI và xác định bằng phƣơng pháp đo quang. - Phân tích các dạng asen vô cơ: Mẫu hải sản đƣợc chiết trong hỗn hợp methanol- nƣớc bằng siêu âm, sau đó ly tâm và xác định hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong dịch chiết bằng phƣơng pháp đo quang. - Phân tích các dạng asen hữu cơ: Hàm lƣợng asen hữu cơ đƣợc tính toán dựa trên hàm lƣợng asen tổng số và hàm lƣợng asen vô cơ 2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu: - Phân tích asen tổng số: Trong mẫu hải sản, asen đƣợc liên kết chặt chẽ với các protein. Do đó trƣớc khi định lƣợng, cần phá vỡ nền protein của mẫu để đƣa các dạng asen về dạng vô cơ bằng một phƣơng pháp vô cơ hóa thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật vô cơ hóa ƣớt có sử dụng hỗn hợp các axit HNO3, HClO4 và H2SO4 theo các tỷ lệ thích hợp. Hình 2.1 Hệ tạo hợp chất mầu của Asin và Bạc đietylđithiocarbamat Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 - Phân tích asen vô cơ: Để phân tích hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong các mẫu hải sản, chúng tôi sử dụng quy trình chiết của Nguyễn Đình Thuất[13], mẫu đƣợc chiết với MeOH-H2O bằng siêu âm, sau đó ly tâm và tiến hành phân tích bằng phƣơng pháp trắc quang. 2.3. Đối tƣợng nghiên cứu: Asen là nguyên tố độc hại, có khả năng tích lũy sinh học cao, đặc biệt là trong các đối tƣợng thủy hải sản, tuy nhiên mức độ độc hại của asen lại phụ thuộc vào dạng hóa học của chúng. Do vậy đối tƣợng nghiên cứu của luận văn này là sự tích lũy và phân bố các dạng asen vô cơ và hữu cơ trong các loại hải sản bao gồm: Tôm, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, sao biển, vẹm xanh, ngao.. 2.4. Nội dung nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định hàm lƣợng Asen tổng số, dạng hợp chất Asen vô cơ, dạng hợp chất Asen hữu cơ trong các mẫu hải sản trên với nội dung nhƣ sau: 2.4.1. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để xác định asen bằng phương pháp đo quang: - Khảo sát sự hình thành hợp chất mầu của asin với thuốc thử - Khảo sát cực đại hấp thụ của hợp chất màu. - Khảo sát thời gian phản ứng. - Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu, thể tích thuốc thử. - Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định Asen. 2.4.2. Xây dựng qui trình phân tích cho các đối tượng mẫu nghiên cứu. - Nghiên cứu, khảo sát và lựa chọn phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp để định lƣợng Asen. - Nghiên cứu, khảo sát ảnh hƣởng của các loại axit và nồng độ axit đến qui trình xử lý mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 - Xác định qui trình phân tích Asen tổng số, qui trình phân tích dạng Asen hữu cơ và vô cơ trong các mẫu hải sản. - Phân tích định lƣợng Asen tổng số, xác định hàm lƣợng các dạng Asen hữu cơ và vô cơ trong các mẫu hải sản theo qui trình đã xây dựng và xác định đƣợc. - Xử lý và đánh giá kết quả thực nghiệm. - Kết luận về tính độc của các hải sản đã phân tích. 2.5. Lấy mẫu và bảo quản mẫu. - Các mẫu cá, tôm sú, vẹm xanh, sao biển, ngao trƣớc khi phân tích đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất hai lần, cất vào tủ đông cho đến khi đông đá hoàn toàn, sau đó, mẫu đƣợc làm khô bằng phƣơng pháp đông khô chân không để không phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu, giữ nguyên đƣợc dạng hữu cơ trong mẫu. Cuối cùng, nghiền nhỏ mẫu và bảo quản ở nhiệt độ -50C. Hình 2.1: Quy trình xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang Mẫu hải sản dạng bột Asen tổng số Dạng Asen vô cơ cơ Dạng Asen hữu cơ Mẫu đã vô cơ hóa (dạng dung dịch) Mẫu chiết (dạng dung dịch) Mẫu hải sản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình tạo hợp chất màu Để nghiên cứu sự tạo thành hợp chất màu của bạc Đietylđithiocacbamat với khí Asin- AsH3 bằng phƣơng pháp trắc quang, trƣớc hết phải biết đƣợc phổ hấp thụ của thuốc thử và của phức. Vì vậy, công việc đầu tiên là khảo sát phổ của chúng. 3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của thuốc thử: Dùng pipet lấy chính xác 10ml dung dịch HCl 15% vào bình phản ứng, thêm 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ của hệ tạo phức đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút, để yên 10 phút.. Sau đó đem đo mật độ quang của dung dịch thuốc thử với cuvet 1cm ở dải sóng 350nm-750nm. Dung dịch so sánh là Clorofom. Kết quả đo đƣợc biểu diễn trên hình 3.1. 3.1.2. Khảo sát phổ hấp thụ của hợp chất màu - Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 50  g/l vào bình phản ứng của hệ tạohợp chất màu, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ của hệ tạo phức đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút. Dạng asen này phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat tạo hợp chất màu, sau đó, lấy phần hợp chất màu vừa tạo đƣợc đem đo phổ ở dải sóng 350nm - 750nm, với dung dịch so sánh là Clorofom, ta thu đƣợc phổ hấp thụ của hợp chất màu nghiên cứu ở hình 3.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của thuốc thử và phổ hấp thụ của hợp chất màu của Asen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 - Dựa vào phổ hấp thụ của thuốc thử và phổ hấp thụ của phức màu của Asen cho thấy hợp chất màu có đỉnh hấp thụ đạt cực đại tại bƣớc sóng λ max= 520nm. Cũng tại bƣớc sóng này thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat và dung dịch clorofomkhông có đỉnh hấp thụ, vì vậy, để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của phép phân tích, chúng tôi chọn bƣớc sóng λ = 520nm, khi khảo sát mật độ quang trong các phép đo về sau. Dung dịch so sánh đƣợc sử dụng trong các phép đo là Clorofom vì tuy thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat có màu, song vì thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat và dung dịch clorofom đều không có đỉnh hấp thụ tại bƣớc sóng 520nm. Vì thế, trong các phép đo về sau chúng tôi sử dụng dung dịch so sánh là clorofom. 3.1.3. Khảo sát thời gian tối ưu cho việc tạo hợp chất màu. Để xét đến khoảng thời gian nào thì phức có độ quang ổn định, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới sự tạo hợp chất màu nhƣ sau: - Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 50  g/l vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng. Khuấy từ ở bình phản ứng với thời gian thay đổi nhƣ trong bảng 3.1 tạo ra hơi Asin, hơi Asin giải phóng ra đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, tiếp theo, đo mật độ quang của hợp chất màu thu đƣợc ở các thời gian trên tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.1 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.2. Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian Thời gian Mật độ quang(A) 0 0,001 5 0,112 10 0,160 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 20 0,368 25 0,370 30 0,371 60 0,369 Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian 0 0. 5 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 5 10 20 25 30 60 Thời gian (phút) A b s Mật độ quang( A) Hình 3.2 Ảnh hƣởng của thời gian đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu Dựa vào kết quả thu đƣợc trên bảng 3.1 và đồ thị hình 3.2 cho thấy mật độ quang tăng dần trong 20 phút đầu tiên, sau 20 phút mật độ quang ổn định và hầu nhƣ không thay đổi. Nhƣ vậy, hợp chất màu ổn định sau 20 phút và bền trong thời gian dài, do đó chúng tôi chọn thời gian tối ƣu để khảo sát mật độ quang sau khi tạo phức là 20 phút. 3.1.4.Ảnh hưởng của pH đến quá trình khử Asen(III) thành Asin Theo những kết quả nghiên cứu khảo sát và thu thập các tài liệu tham khảo [15,16] về phƣơng pháp phân tích Asen bằng phƣơng pháp đo quang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 cho thấy quá trình khử Asen vô cơ về AsH3 đạt hiệu suất cao nhất tại môi trƣờng Axit có pH = 1. Do đó chúng tôi chọn pH tối ƣu để khảo sát mật độ quang trong quá trình nghiên cứu và phân tích Asen là pH=1 để toàn bộ lƣợng As(III) và As(V) đều đƣợc khử thành Asin. 3.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (KI) tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. Để phân tích hàm lƣợng Asen tổng số trong các mẫu hải sản thì mẫu phải đƣợc vô cơ hóa với hỗn hợp Axit. Các dạng Asen trong mẫu bị oxi hóa và tồn tại ở dạng As(V). Động học của phản ứng tạo hiđrua(AsH3) của As(V) rất chậm so với As(III), do đó cần khử As(V) về As(III) trƣớc khi tiến hành định lƣợng. Tác nhân khử As(V) về As(III) đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu[15,16] cho thấy hiệu suất khử As(V) về As(III) đạt 100% khi sử dụng 1ml dung dịch KI 10% cho 50ml dung dịch, do vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo trƣớc khi thực hiện phản ứng tạo Asin thì mẫu đƣợc thêm 1ml dung dịch KI 10%. 3.1.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn )tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. Qua tham khảo một số tài liệu, xác định Asen bằng phƣơng pháp trắc quang ngƣời ta thƣờng sử dụng hai loại chất khử là: Natribohidrua (NaBH4) và Kẽm (Zn).Việc sử dụng NaBH4 đƣợc ứng dụng nhiều trong phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hóa hơi lạnh, do phản ứng khử của NaBH4 diễn ra nhanh nên đáp ứng đƣợc thời gian đo phổ hấp thụ nguyên tử của Asen. Đối với kẽm, phản ứng khử các dạng Asen vô cơ về Asin diễn ra chậm hơn nên ít đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Tuy nhiên, đối với phƣơng pháp phân tích trắc quang do cần thời gian phản ứng dài để quá trình tạo hợp chất màu đƣợc triệt để, nên kẽm thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp đo quang. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kẽm là chất khử để khử As(III) thành Asin khi tiến hành xây dựng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 đƣờng chuẩn cũng nhƣ phân tích xác định Asen trong mẫu hải sản. Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử Zn đến quá trình tạo hợp chất màu chúng tôi tiến hành thí nghiệm với dãy mẫu chuẩn As(III) có cùng nồng độ là 20  g/l trong nền 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và lƣợng Zn thay đổi nhƣ trong bảng. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và với phản ứng 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Các kết quả khảo sát đƣợc đƣa ra trong bảng 3.2 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.3. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn )tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. STT Lƣợng Zn(g) Độ hấp thụ(A) 1 0 0,002 2 0, 1 0,045 3 0,5 0,075 4 1 0,135 5 2 0,179 6 3 0,181 7 4 0,181 8 5 0,179 9 6 0,184 10 8 0,180 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn) tới độ hấp thụ quang (A) cuả hợp chất màu 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 0, 1 0,5 1 2 3 4 5 6 8 Lượng Zn(g) A b s Độ hấp thụ(A) Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử(Zn)tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. Dựa vào kết quả thu đƣợc trên bảng 3.2 và đồ thị hình 3.3. cho thấy: Mật độ quang tăng khi tăng lƣợng chất khử (Zn) từ 0,1-2 gam. Khi tiếp tục tăng lƣợng chất khử đến 2g thì mật độ quang ổn định và hầu nhƣ không thay đổi. Nhƣ vậy, độ hấp thụ quang của hợp chất màu ổn định và bền khi lƣợng chất khử từ 2gam trở lên. Tuy nhiên, khi tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn cũng nhƣ khi phân tích mẫu nồng độ của Asen có thể cao hơn, do đó, chúng tôi chọn lƣợng chất khử để tạo phức màu của Asen là 4gam trong tất cả các phép đo về sau. 3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác tới sự tạo hợp chất màu Ngoài thời gian và lƣợng chất khử còn rất nhiều yếu tố khác ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu nhƣ: Ảnh hƣởng của thể tích thuốc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 thử, thể tích mẫu, ảnh hƣởng của các ion cản... Vì vậy, để thu đƣợc kết quả tin cậy, tiếp theo, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố này. 3.2.1.Khảo sát ảnh hưởng của thể tích thuốc thử. +Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 20  g/l vào bình phản ứng hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin sẽ đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và phản ứng với dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat có thể tích thay đổi nhƣ trong bảng 3.3 tạo đƣợc hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom , kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng 3.3, và đƣợc biểu diễn trên hình 3.4. Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu. STT Thể tích As(III) chuẩn (ml) Thể tích thuốc thử C5H10AgNS2(ml) CAsen(III) chuẩn (  g/l) Mật độ quang (A) 1 50 2 20 0,195 2 50 4 20 0,180 3 50 6 20 0,178 4 50 8 20 0,170 5 50 10 20 0,150 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 2 4 6 8 10 Thể tích thuốc thử (ml) A bs Abs Hình 3.4 Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu. Dựa vào kết quả thu đƣợc trong bảng 3.3 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, ở thể tích thuốc thử là 2ml hợp chất màu có độ hấp thụ quang là lớn nhất, và phép đo đạt độ nhạy cao nhất, sau đó mật độ quang giảm dần khi tăng thể tích thuốc thử. Tuy nhiên, khi sử dụng thể tích thuốc thử là 2ml, thì sau thời gian phản ứng 20 phút thì thể tích thể tích thuốc thử bị thay đổi nhiều do dung môi bay hơi, dẫn đến độ lặp lại của phép đo thấp, do vậy, vừa để đạt độ nhạy cao và độ lặp lại tốt chúng tôi sử dụng thể tích thuốc thử trong quá trình tạo hợp chất màu là 4ml . 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu. Để xác định đƣợc thể tích mẫu thích hợp nhất cho quá trình phân tích, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu theo các thí nghiệm sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 - Lấy lƣợng dung dịch chuẩn As(III) 20  g/l với các thể tích thay đổi là 50ml, 75ml, 100ml vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, lấy phần hợp chất màu vừa tạo đƣợc đem đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm, dung dịch so sánh là clorofom, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.4 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.5. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thể tích mẫu đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu. STT V(ml) bạc Đietylđithiocacbamat V Asen(III) (ml) A 1 4 50 0,180 2 4 75 0,268 3 4 100 0,354 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Ảnh hưởng của thể tích mẫu đến độ hấp thụ quang(A) của hợp chất màu 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 50 75 100 thể tích mẫu(ml) A b s Abs Hình 3.5. Ảnh hưởng của thể tích mẫu đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu. Dựa vào kết quả thu đƣợc ở bảng 3.4 và đồ thị trên hình 3.5, ta thấy mật độ quang của phức màu tăng tuyến tính khi thể tích mẫu tăng. Do phân tích mẫu phải qua quá trình vô cơ hóa mẫu và do toàn bộ lƣợng Asin giải phóng đƣợc phản ứng với dung dịch Bạc đietylđithiocacbamat, vì vậy để phù hợp với quá trình vô cơ hóa mẫu chúng tôi sử dụng thể tích mẫu là 50ml trong suốt quá trình nghiên cứu. 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các chất đến sự tạo hợp chất màu Các nguyên tố Cr, Co, Cu, Hg, Mo, Ni, Ag, Se là những nguyên tố có khả năng ảnh hƣởng đến quá trình tạo Asin. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 và tài liệu tham khảo [15] thì hàm lƣợng các nguyên tố này trong hải sản là rất nhỏ không ảnh hƣởng đến việc xác định hàm lƣợng Asen trong hải sản. H2S cũng tác nhân gây ảnh hƣởng mạnh đến quá trình tạo hợp chất màu với dung dịch Bạc đietylđithiocacbamat, tuy nhiên , trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích Asen trong hải sản. Trong quá trình phân tích, mẫu phải đƣợc vô cơ hóa mẫu trƣớc khi xác định hàm lƣợng Asen bằng hỗn hợp Axit có tính oxi hóa mạnh, trong môi trƣờng này vì H2S là Axit yếu nên đã đƣợc loại bỏ khỏi mẫu trƣớc khi tiến hành phân tích Asen. 3.2.4. Xây dựng đường chuẩn xác định Asen. Sau khi khảo sát các điều kiện và các yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo hợp chất màu, chúng tôi chọn các điều kiện tối ƣu để xây dựng đƣờng chuẩn nhƣ sau: + Bƣớc sóng tối ƣu: 520nm. + Thời gian tối ƣu: 20 phút. + pH tối ƣu: 1. + Thể tích của thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat: 4ml. + Thể tích dung dịch Asen chuẩn: 50ml. Xây dựng đường chuẩn xác định Asen Chuẩn bị một dãy dung dịch có nồng độ Asen thay đổi đƣợc ghi trong bảng 2.5. Các dung dịch trên đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc Asen 10ppm, cho vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ của các hợp chất màu vào nồng độ Asen đƣợc đƣa ra trong bảng 3.5 và đƣờng chuẩn đƣợc biểu diễn trên hình 3.6. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Bảng 3.5. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ vào nồng độ Asen TT 1 2 3 4 5 6 CAsen(III)(  g/l) 5 10 20 50 75 100 A 0,042 0,091 0,181 0,368 0,552 0,789 Hình 3.6. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ vào nồng độ Asen Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: Y= 0,0076X + 0,0077 Hệ số tƣơng quan R2 = 0,996 Tóm lại, Đƣờng chuẩn xác định Asen có hệ số tƣơng quan lớn và có khoảng tuyến tính rộng, do vậy, cho phép phân tích hàm lƣợng Asen ở dạng vết rất nhỏ. 3.2.5. Giới hạn phát hiện của phương pháp Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc, nồng độ này lớn hơn mẫu trắng với độ tin cậy là 99%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định giới hạn phát hiện của phƣơng pháp bằng cách đo lặp lại 7 lần mẫu dung dịch Asen có nồng độ 10(  g/l), các điều kiện xác định nhƣ khi lập đƣờng chuẩn, chấp nhận sự sai khác giữa độ lệch chuẩn của mẫu và mẫu trắng là không đáng kể. Kết quả đƣợc đƣa ra ở bảng 3.6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Bảng 3.6. Khảo sát độ thu hồi của Asen TT Hàm lƣợng Asen(  g/l) Độ thu hồi (%) 1 11,02 110,2 2 10, 11 101,1 3 11,13 111,3 4 8,87 88,7 5 11,06 110,6 6 9,78 97,8 7 8,52 85,2 TB 10,07 100,7 Từ các kết quả ở bảng 3.6 ta có: Giá trị trung bình: 10,07 Độ lệch chuẩn(S): 0,154 Bậc tự do(n-1): 6 Giá trị t tra bảng với bậc tự do là 6 và độ tin cậy 99%: 3,143 Giới hạn phát hiện(GHPH): GHPH= S x t = 0,5(  g/l) 3.3. Qui trình phân tích Asen tổng số. 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần và nồng độ axit tới quá trình vô cơ hóa mẫu. Quá trình phân hủy mẫu hải sản sau khi đông khô đòi hỏi phải sử dụng các axit mạnh làm tác nhân phân hủy và oxi hóa mẫu. Do vậy, phải lựa chọn thành phần và tỉ lệ các loại axit sao cho quá trình phân hủy mẫu triệt để nhƣng không làm mất lƣợng Asen có trong mẫu phân tích. Axit HNO3 đặc và axit HClO4 có tính oxi hóa mạnh nhƣng nhiệt độ sôi thấp lần lƣợt là: 1210C và 2030C, nếu chỉ sử dụng một trong hai loại axit này để vô cơ hóa mẫu trong hệ hở thì mẫu sẽ không bị phân hủy triệt để do nhiệt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 độ sôi của 2 axit này thấp. Mặt khác, nếu chỉ sử dụng một mình axit HClO4 để xử lí mẫu dễ gây cháy nổ. Axit H2SO4 đặc có tính oxi hóa mạnh và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so với 2 axit trên: 3390C. Tuy nhiên, nếu sử dụng một mình H2SO4 đặc, thì mẫu chậm sôi, các chất hữu cơ sẽ bị cháy tạo thành cặn cacbon, gây hiệu suất thu hồi thấp do Asen bị hấp thụ trên cặn Cacbon. Vì vậy chúng tôi sử dụng hỗn hợp các axit trên để phân hủy mẫu. Để khảo sát ảnh hƣởng của các axit đến quá trình phân hủy mẫu, chúng tôi tiến hành vô cơ hóa 0,1g ngao trong bình phản ứng với lƣợng Asen thêm vào là 20ml dung dịch chuẩn As(III) 10(  g/l), tiếp theo chúng tôi tiến hành vô cơ hóa mẫu với hỗn hợp axit có thành phần và tỉ lệ khác nhau nhƣ trong bảng 3.7. Sau đó thêm 1ml dung dịch KI 10% để chuyển As(V) về As(III), 10ml dung dịch HCl 15%, 4g kẽm sạch để khử As(III) thành Asin. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Hiệu quả sử dụng của các hỗn hợp axit đƣợc đánh giá thông qua độ thu hồi. Ảnh hƣởng của axit và nồng độ axit đến hiệu suất thu hồi đƣợc đƣa ra ở bảng 3.7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của axit và nồng độ axit đến hiệu suất thu hồi Các loại axit đặc (ml) Nhiệt độ(0C) Độ thu hồi (%) HNO3 HClO4 H2SO4 10 0 0 250 22,5 5 5 0 250 42,6 0 0 5 250 20 5 0 5 250 75,2 1 1 1 250 80,8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 1 1 3 250 86,5 1 1 5 250 97,8 Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7. cho thấy: *Khi chỉ sử dụng H2SO4 đặc 98% thì độ thu hồi là 20 %. Khi chỉ sử dụng axit HNO3, độ thu hồi của Asen chỉ đạt 22,5% tại nhiệt độ 250 0 C.Khi chỉ sử dụng hỗn hợp 5ml HNO3 và 5ml HClO4 đậm đặc, độ thu hồi là 42,6%.Ở các kết quả khảo sát tiếp theo cho thấy khi sử dụng hỗn hợp axit với tỉ lệ: HNO3: HClO4:H2SO4 là 1:1:5 thì hiệu suất thu hồi tốt nhất, đạt 97,8% trong thời gian phân hủy mẫu là 30 phút. Vì vậy, chúng tôi sử dụng hỗn hợp 3 axit này với thành phần và tỉ lệ nhƣ trên để vô cơ hóa mẫu trong suốt quá trình nghiên cứu. 3.3.2 Khảo sát hiệu suất của quá trình vô cơ hóa mẫu. Để đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp và hiệu suất quá trình vô cơ hóa mẫu hải sản chúng tôi tiến hành nhƣ sau: Lấy 50ml dung dịch Asen (V) 50ppb cho vào bình phản ứng . Thêm 1ml dung dịch KI 10% để chuyển As(V) về As(III), 10ml dung dịch HCl 15%, 4g kẽm sạch, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ tác dụng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. - Dùng pi pét hút lấy chính xác 0,25ml dung dịch Asen 10ppm, cho vào bình định mức 50ml, thêm 1ml nƣớc cất, 2ml hỗn hợp HNO3 : HClO4 (1:1), 5ml dung dịch H2SO4 đặc. Sau đó, đun ở nhiệt độ 250 0C trong thời gian 30 phút, để nguội, định mức tới vạch bằng nƣớc cất, lắc đều, rồi cho vào bình phản ứng, thêm 1ml dung dịch KI 10% để chuyển As(V) về As(III), 10ml dung dịch HCl 15%, 4g kẽm sạch, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin giải phóng phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. - Hút chính xác 0,25ml dung dịch Axit dimetylasinic DMA 10ppm cho vào bình định mức 50ml, thêm 1ml nƣớc cất, 2ml hỗn hợp HNO3:HClO4(1:1), 5ml H2SO4 đặc, đun ở nhiệt độ 250 0C, trong thời gian 30 phút, lắc đều để nguội, rồi cho vào bình phản ứng, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15%; 4g kẽm sạch, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, tiếp theo, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Kết quả các thí nghiệm để khảo sát độ thu hồi của Asen đƣợc đƣa ra trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Khảo sát độ thu hồi của Asen trong quá trình vô cơ hóa mẫu STT Dung dịch chuẩn Nồng độ (ppb) Mật độ quang (A) Hiệu suất (%) 1 As +5 50 0,364 98,37 2 As +5 (không oxi hóa) 50 0,370 100 3 DMA 50 0,362 97,83 Từ kết quả chỉ ra trên bảng 3.8. cho thấy khi tiến hành vô cơ hóa mẫu dung dịch Asen chuẩn và dung dịch Axit dimetylasinic-DMA có cùng nồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 độ thì độ hấp thụ quang của hợp chất màu của các dung dịch trên có giá trị xấp xỉ bằng độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn As+5 không bị oxi hóa. Nhƣ vậy, hiệu suất của quá trình vô cơ hóa mẫu đạt khá cao, và quá trình vô cơ hóa mẫu với tỉ lệ thể tích HNO3 : HClO4 : H2SO4(đặc) = 1: 1: 5 không ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu. Lƣợng Asen mất đi trong quá trình vô cơ hóa mẫu là không đáng kể. Vì vậy, chúng tôi sử dụng quy trình vô cơ hóa mẫu trên để tiến hành vô cơ hóa các mẫu hải sản trong quá trình nghiên cứu. 3.3.3. Quy trình phân tích Asen tổng số. Từ những kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ƣu: các loại axit, nồng độ axit, ảnh hƣởng của quá trình vô cơ hóa mẫu, quy trình phân tích Asen đƣợc đƣa ra nhƣ sau: Mẫu hải sản mang về rửa sạch bằng nƣớc cất 2 lần, cất vào tủ đông cho đến khi đông đá hoàn toàn, sau đó mẫu đƣợc làm khô bằng phƣơng pháp đông khô chân không. Tiếp theo mẫu đƣợc nghiền nhỏ, rồi cân chính xác 0,1g mẫu cho vào bình phản ứng 50ml, thêm 1ml nƣớc cất 2 lần, 2ml hỗn hợp HNO3 : HClO4 đặc (1 : 1), 5ml dung dịch H2SO4 đặc, đun ở nhiệt độ 250 0 C trong vòng 30 phút. Mẫu sau khi phân hủy hết, để nguội, định mức đến 50ml, sau đó chuyển As(V) thành As(III) với 1ml dung dịch KI 10%, khử As(III) thành Asin với 10ml dung dịch HCl 15% 4g kẽm, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ sẽ tác dụng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Qui trình phân tích Asen tổng số được tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 3.7. Quy trình phân tích Asen tổng số Làm sạch Đông khô Nghiền nhỏ 2ml HNO3 và HClO4. 5ml H2SO4. Đun nóng ở 250 0 C trong thời gian 30 phút. Định mức đến 50ml. Dung dịch 1 ml KI 10%, 10ml HCl 15%, 4 g Zn. Asin Mẫu hải sản 0,1g mẫu Mẫu đã đƣợc vô cơ hóa Đo quang 4ml Bạc đietylđithiocacbamat Hợp chất màu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Sau khi đã xác định đƣợc quy trình vô cơ hóa mẫu để phân tích Asen tổng số chúng tôi đã áp dụng để vô cơ hóa và phân tích các mẫu hải sản bao gồm: tôm sú, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, vẹm xanh, sao biển, ngao. Số lần làm với mỗi mẫu là 3 lần, từ các kết quả thí nghiệm thu đƣợc, chúng tôi tiến hành xử lý thống kê để đánh giá độ chính xác của phép đo theo các công thức sau: Giá trị trung bình cộng: n Xi X n i   1 Độ lệch chuẩn của đại lƣợng trung bình cộng: )1( )( 2     nn XX S i X Kết quả phân tích Asen tổng số trong mẫu hải sản đƣợc đƣa ra ở bảng 3.9: Tên mẫu Lƣợng Asen tổng số (  g/g) ( X X S )(n=3) Tên mẫu Lƣợng Asen tổng số (  g/g) ( X X S ) (n=3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Bảng 3.9. Kết quả phân tích Asen tổng số trong mẫu hải sản Từ kết quả thu đƣợc trên bảng 3.9. cho thấy hàm lƣợng Asen tổng số tìm thấy sau mỗi lần thí nghiệm là xấp xỉ nhau và ổn định, trong đó, lƣợng Asen tìm thấy trong ngao là cao nhất và thấp nhất là cá ngừ. Điều này có thể giải thích đƣợc là do ngao là động vật đáy, môi trƣờng sống của ngao là bùn. Qua nhiều tài liệu và công trình nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng Asen trong bùn và trầm tích cao hơn hẳn trong các môi trƣờng khác, do đó mức độ tích tụ dần Asen trong ngao do quá trình trao đổi chất sẽ cao hơn các hải sản khác. Vẹm xanh 11.72  0,068 Cá khoai 8,43  0,035 Sao biển 10,48  0,034 ngao 15,36  0,029 Cá ngân 9,17  0,041 Tôm sú 7,47  0,049 Cá thu 7,21  0,032 Cá ngừ 5,41  0,041 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 3.3.4. Đánh giá độ chính xác của phương pháp. Để đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp đang nghiên cứu, chúng tôi sử dụng mẫu cá chuẩn Dogfish Liver Certified Reference Material for Trace Metals (DOLT-3) để vô cơ hóa theo qui trình trên, sau đó chuyển As(V) thành As(III) với 1ml dung dịch KI 10%, khử As(III) thành Asin với 10ml dung dịch HCl 15% và 4g kẽm, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Kết quả phân tích đƣợc chỉ ra ở bảng 3.10. Bảng 3.10: Kết quả phân tích Asen trong mẫu cá chuẩn TT Kí hiệu mẫu Hàm lƣợng Asen tổng(  /g) Độ thu hồi (%) Giá trị chứng chỉ(  g/g) Kết quả phân tích(  g/g) ( X X S ) (n=3) 1 Mẫu DOLT-3 10,2  0,05 10,05  0,04 98,52% Qua kết quả thu đƣợc ở bảng 3.10. cho thấy: Độ thu hồi của Asen là 98,52%. Điều đó chứng tỏ phƣơng pháp vô cơ hóa mẫu và phân tích Asen chúng tôi đang tiến hành có độ chính xác cao, đáp ứng đƣợc yêu cầu phân tích Asen tổng số trong các mẫu hải sản, do đó các kết quả phân tích Asen tổng số thu đƣợc ở trên là đáng tin cậy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 3.4. Phân tích dạng Asen hữu cơ và vô cơ. 3.4.1 Quy trình phân tích các dạng Asen từ các mẫu hải sản. Dựa trên nguyên tắc các hợp chất Asen hữu cơ không tạo phức với thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat nên để xác định hàm lƣợng Asen hữu cơ từ Asen tổng số trong một số mẫu hải sản, chúng tôi tiến hành chiết các dạng Asen, sau đó tạo phức, rồi đem đo quang tại các điều kiện tối ƣu, xác định đƣợc hàm lƣợng của dạng Asen vô cơ. Lấy hàm lƣợng Asen tổng số xác định đƣợc trừ đi hàm lƣợng dạng Asen vô cơ vừa xác định đƣợc, chúng tôi thu đƣợc hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ. Từ nguyên tắc đó, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm theo quy trình chiết sau: Mẫu hải sản: Cân chính xác 1g mẫu cho vào ống li tâm, thêm 10ml hỗn hợp MeOH : H2O (1:1), cho ống mẫu vào bể rung siêu âm 15 phút, chuyển ống mẫu sang máy li tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, tách phần dung dịch ở trên vào bình định mức 50ml, lặp lại quá trình này 3 lần, sau đó định mức đến 50ml bằng nƣớc cất 2 lần rồi tiến hành tạo Asin với 1ml dung dịch KI 10%, 4g kẽm sạch và 10ml dung dịch HCl 15% trong bình phản ứng, hơi Asin hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ trong mẫu đƣợc tính dựa trên hàm lƣợng Asen tổng số và hàm lƣợng dạng Asen vô cơ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Quy trình phân tích Asen vô cơ ở trên được tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 3.8.: Quy trình phân tích Asen vô cơ. Mẫu hải sản 10ml MeOH-H2O(1:1) Lắc trong vòng 15 phút. Dịch chiết Li tâm trong 10 phút Dịch chiết Chiết ra bình định mức. Dịch chiết (chứa Asen dạng vô cơ+hữu cơ) Định mức đến 50ml. 1ml KI 10% 10ml HCl 15%, 4g Zn Asin Đo quang 4ml bạc Đietylđithiocacbamat Hợp chất màu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 3.4.2. Kết quả phân tích dạng Asen vô cơ, dạng Asen hữu cơ trong một số mẫu hải sản Áp dụng quy trình phân tích trên vào phân tích các mẫu hải sản bao gồm: tôm sú, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, vẹm xanh, sao biển, ngao. Kết quả phân tích Asen vô cơ của các mẫu hải sản đƣợc đƣa ra trên bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả phân tích Asen vô cơ Tên mẫu Hàm lƣợng Asen vô cơ (  g/g) ( X X S ) (n=3) Hàm lƣợng Asen tổng số(  g/g) ( X X S ) (n=3) % Vẹm xanh 0,110  0,046 11,72  0,068 0,938 Sao biển 0,086  0,024 10,48  0,034 0,820 Cá ngân 0,020  0,074 9,17  0,041 0,218 Cá thu 0,262  0,031 7,21  0,032 3,633 Cá ngừ 0,104  0,051 5,41  0,041 1,922 Cá khoai 0,270  0.087 8,43  0,035 3,202 Ngao 0,020  0,085 15,36 0,029 0,130 Tôm sú 0,197  0,012 7,47 0,049 2,637 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 Từ kết quả phân tích hàm lƣợng Asen vô cơ trên bảng 3.10 cho thấy lƣợng Asen vô cơ trong các mẫu hải sản là rất nhỏ, cao nhất cá khoai cũng chỉ là 0,27  g/l. Từ kết quả phân tích dạng Asen vô cơ, chúng tôi tính đƣợc hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ trong các mẫu hải sản trên. Kết quả tính toán đƣợc chỉ ra trên bảng 3.12. Bảng 3.12. Kết quả phân tích dạng Asen hữu cơ Kí hiệu mẫu Hàm lƣợng Asen hữu cơ (  g/g) ( X X S ) (n=3) Hàm lƣợng Asen tổng số (  g/g) ( X X S ) (n=3) % Vẹm xanh 11,61  0,052 11,72  0,068 99,06 Sao biển 10,394  0,077 10,48  0,034 99,17 cá ngân 9,15  0,024 9,17  0,041 99,78 Cá thu 6, 948  0,062 7,21  0,032 96,36 Cá khoai 8,16  0,009 8,43  0,035 96,79 Ngao 15,34  0,012 15,36 0,029 99,86 Tôm sú 7,273  0,087 7,47  0,049 97,36 Cá ngừ 5,306  0,007 5,41 0,041 98,07 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Qua kết quả phân tích thu đƣợc trên bảng 3.12. cho thấy hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ chiếm chủ yếu trong các hải sản đã phân tích. Theo một số tài liệu nhƣ của Langston W.J(1980) và của LieuJ, D.H. O'Brien và K.J. Irgolie(1996)... thì các dạng hữu cơ chủ yếu này là Asennobetan, Asennocholin và Đimetyl Asenic, là những dạng hữu cơ ít độc cho con ngƣời, nhất là Asennobetan- chất này dễ dàng đƣợc đào thải ra ngoải cơ thể. Tôm, ngao, cá... là những thức ăn phổ biến cho con ngƣời và cho các động vật khác trong chuỗi dinh dƣỡng. Vì thế, việc xác định đƣợc Asen trong hải sản là một khâu chủ yếu để qua đó đánh giá chất lƣợng hải sản vì trong hải sản có khả năng tích lũy kim loại nặng cao mà Asen là kim loại chiếm phần lớn. Hàm lƣợng Asen nằm trong các mẫu hải sản đã phân tích nằm trong khoảng từ 5,41 đến 15,36(  g/g) (bảng 2.8). Mức độ Asen tìm thấy trong luận văn nằm trong phạm vi đã đƣợc trình bày trƣớc đó cho các dạng Asen trong một số hải sản [14,15]. Phần tỉ lệ dạng Asen hữu cơ trong các mẫu nghiên cứu của luận văn đã giải quyết một phần về yếu tố độc tính của Asen trong hải sản. Có thể bƣớc đầu kết luận, các mẫu hải sản trên là an toàn với sức khỏe con ngƣời. Trên đây là các thí nghiệm phân tích đã đƣợc thực hiện trong suốt quá trình nghiên cứu và các kết quả thu đƣợc sau khi làm các thí nghiệm phân tích tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 Toàn bộ quy trình đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ sau: Hình 3.9: Quy trình xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang Mẫu hải sản Rửa sạch Đông khô Nghiền nhỏ Mẫu hải sản dạng bột HNO3-HClO4-H2SO4 (1:1:5) Đun ở 2500C trong 30 phút Định mức đến 50ml. 1ml KI 10%, 10ml HCl 15% + 4g Zn, 4ml bạc Đietylđithiocacbamat Đo quang. Định mức đến 50ml. 1ml KI 10%, 10ml HCl 15% + 4g Zn, 4ml Bạc Đietylđithiocacbamat Đo quang Asen tổng số Dạng Asen vô cơ Dạng Asen hữu cơ Mẫu đã vô cơ hóa (dạng dung dịch) Mẫu chiết (dạng dung dịch) MeOH-H2O(1:1) Rung siêu âm Lắc li tâm Chiết lấy phần dung dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 KẾT LUẬN Với đề tài Nghiên cứu, xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang, sau một thời gian nghiên cứu, luận văn đã đạt đƣợc những kết quả sau: 1. Đã khảo sát, nghiên cứu các điều kiện có ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của phức màu của Asen nhƣ: Bƣớc sóng tối ƣu, pH tối ƣu, thời gian tạo phức, tỉ lệ thuốc thử.... Xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn để xác định Asen bằng phƣơng pháp trắc quang. Từ đó, phân tích đƣợc hàm lƣợng Asen trong một số hải sản một cách chính xác, ổn định. - Qua khảo sát cho thấy, độ hấp thụ quang của phức màu tốt nhất tại bƣớc sóng 520nm, pH để tạo phức tốt nhất bằng 1, với thời gian tạo phức là 20 phút, thể tích thuốc thử: 4ml và thể tích mẫu là 50ml, lƣợng chất khử Zn là 4gam. 2. Đã khảo sát nghiên cứu và đƣa ra qui trình xác định hàm lƣợng Asen tổng số trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. Độ sai lệch lớn nhất của phƣơng pháp khi phân tích so sánh với mẫu chuẩn quốc tế không vƣợt quá 3% so với giá trị chứng chỉ. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đạt 0,5  g/l. Mẫu hải sản đƣợc vô cơ hóa sau khi đông khô chân không ở nhiệt độ 250 oC trong hỗn hợp axit HNO3, HClO4, và H2SO4 với tỉ lệ 1:1:5. 3. Xây dựng đƣợc qui trình xác định chính xác và tin cậy hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ và dạng Asen vô cơ trong một số mẫu hải sản với việc chiết tách, làm giàu đạt hiệu suất thu hồi 98% với ba lần chiết khi sử dụng hệ MeOH : H2O (1:1) sau khi rung siêu âm và lắc li tâm. Dung dịch sau khi chiết tách đƣợc tạo phức và đo quang để xác định đƣợc hàm lƣợng dạng Asen vô cơ. Hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ là hiệu của hàm lƣợng Asen tổng số và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 dạng Asen vô cơ đã xác định đƣợc. Sai số của phƣơng pháp khi phân tích với mẫu chuẩn cá quốc tế nhỏ hơn 3%. 4. Từ qui trình phân tích xây dựng đƣợc, chúng tôi đã tiến hành phân tích xác định hàm lƣợng tổng số, dạng Asen hữu cơ và dạng Asen vô cơ trong một số mẫu hải sản, với độ lệch chuẩn của ba lần thí nghiệm mỗi loại là có thể chấp nhận đƣợc. Từ những kết quả thu đƣợc sau khi làm thực nghiệm, bƣớc đâù có thể kết luận các mẫu hải sản đã phân tích là an toàn đối với sức khỏe con ngƣời. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO` Tài liệu tiếng Việt: 1. Đỗ Văn Ái, Mai Trọng Nhuận, Nguyễn Khắc Vinh (2000),  Một số đặc điểm phân bố Asen trong tự nhiên và vấn đề ô nhiễm Asen trong môi trường ở Việt Nam, Hội thảo quốc tế về ô nhiễm Asen. 2. Đặng Văn Can, Đào Ngọc Phong (2000),  Đánh giá tác động của Asen tới môi sinh và sức khỏe con người ở các vùng mỏ nhiệt dịch có hàm lượng Asen cao. Tập san địa chất và khoáng sản. Tập 7, trang 199. 3. Hội thảo quốc tế (2000),  Ô nhiễm Asen: Hiện trạng, tác động đến sức khỏe con người và các giải pháp phòng ngừa, Hà Nội, 12/2000. 4. Hồ Viết Quí, Các phương pháp phân tích quang học trong hóa học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội 1999. 5. Hồ Viết Quí, Các phương pháp phân tích công cụ trong hóa học hiện đại , Nhà xuất bản Đại học sƣ phạm Hà Nội 2007. 6. Hoàng Nhâm, Hóa học vô cơ, tập 2, Nhà xuất bản Giáo Dục 2000. 7. Lâm Ngọc Trâm, Các hợp chất tự nhiên trong sinh vật biển Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật 1999. 8. Tiêu chuẩn Việt Nam (1996), Xác định asen tổng - Phương pháp quang phổ dùng bạc dietyldithiocacbamat, TCVN 6182:1996-Hà Nội (1996). 9. Tiêu chuẩn Việt Nam (2000), Xác định Asen tổng- Phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử (kỹ thuật hydrua hóa), TCVN 6626:2000-Hà Nội (2000). 10. Trần Tứ Hiếu, Phương pháp phân tích quang phổ vùng UV-VIS, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 11. Trần Thắm, Nghiên cứu qui trình định lượng Asen trong động vật đáy bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan catot , Luận văn thạc sĩ khoa học- 2000 Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. 12. Trịnh Bích Hà, Nghiên cứu, phân tích, Đánh giá mức độ ô nhiễm Asen trong nguồn nước sinh hoạt tại khu vực quận Hoàng Mai - Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học- 2008, Đại học Sƣ phạm Hà Nội. 13. Nguyễn Đình Thuất, Nghiên cứu phân tích liên tục (on-line) dạng Asen trong một số đối tượng môi trường biển bằng phương pháp liên hợp sắc ký lỏng và hấp thụ nguyên tử Luận án tiến sĩ hóa học- 2008, Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. 14. Vũ Đức Lợi, Nghiên cứu xác định một số dạng thủy ngân trong các mẫu sinh học và môi trường, Luận án tiến sĩ hóa học- 2008, Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. 66-76. Tài liệu tiếng Anh: 15. Apha, Awwa, WEF(1998) standar Methods forthe Examination of waste water 20th Edition 3500-AsB, 360-361. Editedby Lenores. Clesceri Arnolde. 16. Andreae M.O.,(1978), Distribution and speciation of asenrnic in natural water and some marine algae, Deep sea res.,25,391-402 17. Atkins W. R. G and E. G. Wilson, (1926), the phosphorus and arsenic compounds of sea water, J Mar. Biol. Assoc. UK., 14, 609-614. 18. Beauchemin D., M. E. Bednas, S.S. Berman, J. W. McLaren, I.W. M.Siu, R. E. Sturgeon, (1998), Identification and Quantitation of Arsenic Species in a Dogfish Muscle Reference Material for Trace Elements, Anal.Chem., 60, 2209-2212. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 19. Bostrom K. and S. Valdes, (1969), Arsenic in ocean floors, Lithos,2, 351- 360. 20. Cannon J. R., J. S. Edmonds, K. A. Francesconi, C. L. Raston. J.B. Saunders, B. W. Skelton and A. H. White, (1981), Isolation, crystal structure and synthesis of arsenobetaine, a constituent of the western rocklobster, the dusky shark, and some samples of human urine, Australian Journal of Chemistry, 34, 787-798. 21. Carr P. F., J. W. Pemberton, E. Nunan, (1999), Arsenic contamination at the Mole River mine, northern New South Wales, Australian Journal of Earth Sciences, 46, 861-874. 22.Canon J. R., J. S. Edmonds, K, A. Francesconi, C.L. Raston. J. B. Saunders, B. W. Skelton and A. H. White, (1981), Isolation, crystal structure and synthesis of asenobetaine, a constituent of the western rock lobster, the dusky shark, and some samples of human urine, Australian Journal of Chemistry, 34, 787-798. 23. Ebdon L., A. P. Walton, G. E. Millward and M. Whitfield, (1987), Methylated Arsenic species in estuarine porewwaters, Appl. Organomet. Chem., 1, 427-433. 24. Edmonds J.s., Y. Shibata, K. A. Francesconi, R. J.Rippingale, M. Morita,(1997), Arsenic transformations in short marine food chains studiedby HPLC- ICP- MS,11, 281 - 287. 25. Edmonds J. S and K. A. Francesconi, (1987), Trimethylarsine oxide in estuary catfish ( Cnidoglanis macrocephalus) and school whiting (Sillago basensis) after oral administration of sodium arsenate and as a natural component of estuary catfish, The science of Total Environment, 64, 317-323. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 26. Edmonds J.s. and. A. Francesconi, (1993), Asenic in seafoods: Human Detection in Environmental Sample compounds from marine organisms, nat. Prod, Rep., 10,421-428. 27. Edmonds J. S., M. Morita, and Y. Shibata, (1987), Isolation and identification of arsenic- containing ribofuranosides and inorganic arsenic from Japanese edible seaweed, J. Chem. Soc., 1, 577-580. 28. Fraley D. M., D. Yast and S. E. Manahan, (1979), Inductively coupled plasma emission spectrometric detection of simulated high performance liquid chromatographic peaks, Anal. Chem.,51, 2225-2229. 29. Francesconi K. A., J. S. Edmonds, and M. Morita, (1994), Determination of Arsenic and Arsenic Species in Mariine Environmental Sometiamples, in:J. O. Nriagu (Ed.), Arsenic in the Enviroment, Part I: Cycling and Charaterization, John Wiley & Sons, New York, 189-219. 30. Francesconia K.A and John S. Edmonds, (1998), Arsenic Species in Marine Samples,Croatica Chemmica Acta, 71,343-359. 31. Gleyzes C., S. Tellier, R. Sabrier, P. Le Cloirec, (2001), Arsenic Characterisation in Industral Soils by Chemical Extractions, Environ. Technol. 22,27-28. 32. Gomez-Aria J. L., D. Sanchez-Rodas, R. Beltran, W. Corns, P. Stockwel, (1998), Evaluation of atomic fluorescence spectrometry as a sensitive detection technique for arsenic speciation, Appl. Organomet. Chem., 12, 439-447. 33. Greenwood N.N, Earnshaw A. (1997), Chemistry of the elements (2 nd edition), Elservier, Great Britain. 34. Hanaoka Kenichi, Takashi Matsumoto and Shoji Tagawa Toshikazu Kaise, (1987), Microbial degradation of arsenobetai, the major water Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 soluble organoarsenic compound occurring in marine animals, Chemosphere,16, 2545-2550. 35. Iverson D.C., M.A. Anderson, T. R.Home and R. R. Stanfoth, (1979), An evaluation of coloum chromatography and flameless atomic absorption spectrophotometry for asernic speciation as applied to aquatic symtems, Environ. Sci. Tech., 13, 1491-1494. 36. Jeffer P.Koplan, (2000), Toxicological profile for Arsenic, U.S.Department of health and human services, Public health service Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2-9. 37. Langston W. J., (1980), Arsenic in U.K. estuarine sediments and is availability to depsit feeding bivalves, J. Mar. Biol. Assoc Uk, 60, 869 - 881. 38. Liu j., D. H. O , Brien and K.J. Irgolic, (1996), Sylthesis of 1-O-R-5-deoxy-  -D-ribofuranosides with (CH3)2AsO as substiuents at the 5-position and a methyl or 2 ' ,3 ' - dihydroxypropyl group as the aglycone in the 1- position, Appl. Organomet. Chem.10, 1-11. 39. Mattusch J.,R Wennrich, (1998), Dertamination of Anionnic, Neutral, and Cationic Species of Asenrnic by ion Chromatography with ICPMS 40. Mester Z., A. Woller, P. Fodor, (1996), determination of arsenic Speccies by High- Performance Liquid chromatography- Hydride Generation- (Ultrasonic Nebulizer) - Atomic Fluorescence Spectrometry, Microchem.J., 54,184-194 41. Mukai H. and Y. Ambe, (1987), Determination of methylarsenic compounds in airborne particulate matter by gas chromatography with atomic absorption spectrometry, Anal. Chim. Acta, 193, 219-229 42. Munoz o., D. Velez, R. Montoro, (1999), Optimization of the solubilization, extracction and determination of inorganic arsenic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 [As(III) + As(v)] in seafood products by acid digestion, solvent extraction and hydride generation atomic absorption spectrometry, Analyst, 124, 601-607. 43. Myers H, and J. Osteryoung, (1973), Determination of arsenic(III) at the parts- per-billion level by differential pulse polarography, Anal. Chem., 45, 267-128 44. Nielsen F. H., S. H. Givand and D. R. Myron, (1975), Evidence of a possible requirement for arsenic by the rat, Proceedings of the Federationp of American Societies of Experimental Biology, 34, 923- 946. 45. Rubio R., A. Pradro, J. Alberti, G. Rauret, (1992), Speciation of organic and inorganic arsenic by HPLC- HG - ICP, Mikrochim. Acta, 109, 39-45. 46. Schramel O., B. Michalke, A. Kettrup,(1999), Application of capillary electrophoresis- electrospray ionisation mass spetrometry to arsenic speciation, J. Anal. At. Spectrom., 14,1339-1342 47. Scott D. L., S. Ramanathan, W. Shi, B. P. Roén, S. Daunert, (1997), Genetically Engineered Bacteria: Electrochemical Sensing Systems for Antimonite and Arsenite, Anal. Chem., 69, 16-20. 48. Ten Organoarsenic Compounds Using Microbore High-performance Liquid Chromatography Coupled With Electrospray Mass Spectrometry, J. Anal. At. Spectrom., 12, 531-536. 49. Thomas P., K. Sniatecki, (1995, Determination of trace amounts of asenric species in natural water by high- performance liquid chromatography-inductive coupled plasma mass spetrometry, J. Anal, At. Spectrom., 10, 615-618. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76