Luận văn Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống cây hông Paulownia bằng phương pháp in vitro

ương pháp nhân giống in vitro Tạo cây sạch bệnh Nhân nhanh in vitro với số lượng lớn VII. Quá trình sản xuất cây cấy mô VIII. vàI nét về cây hông Đặc điểm sinh thái Các nghiên cứu về cây hông trên thế giới và trong nước Phần II. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Môi trường nuôi cấy Thí nghiệm Phần III. Kết quả và thảo luận Tạo nguồn nguyên liệu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới hệ số nhân chồi ảnh hưởng của BAP đến vươn chồi của đốt mắt trong môI trường bán lỏng Tạo cây hoàn chỉnh ảnh hưởng của NAA đến ra rễ in vitro ảnh hưởng của NAA kết hợp với giá thể đến hình thành rễ in vivo Đề xuất quy trình cảI tiến Phần IV. Kết luận và đề nghị Kết luận Đề nghị Phần V. TàI liệu tham khảo I. tài liệu trong nước II. tài liệu nước ngoài Mở đầu Đặt vấn đề Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định rằng diện tích rừng trên trái đất đã suy giảm nghiêm trọng trong những năm gần đây chủ yếu do nạn chặt phá rừng bừa bãi và diện tích rừng trung bình hằng năm mất đi bằng diện tích một bang của nước Mỹ. ở việt nam theo thống kê của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn trong vòng hai chục năm trở lại đây diện tích rừng đã mất trên 2 triệu ha. Nạn chặt phá rừng, ô nhiễm môi trường sự nóng lên của trái đất đang đặt toàn nhân loại trước những thảm hoạ về sinh thái. Để có thể từng bước khắc phục và cải thiện tình trạng trên Nhà nước ta đã có các dự án, các chương trình nhằm khôi phục lại diện tích rừng, điển hình như chương trình 5 triệu ha rừng từ nay đến năm 2004. Có 5 loại cây được ưu tiên cho kế hoạch trồng rừng trong đó có cây hông. Cây hông có tên khoa học là Paulownia thuộc họ hoa mõm sói Scrophulariacae có nguồn gốc ở Đông Nam á, Trung Quốc (Nguyễn Tiến Bân, 1997). Cây hông sinh trưởng nhanh, sau 6 năm trồng có thể khai thác gỗ. Gỗ hông rất nhẹ và cứng, chịu được mối mọt, không biến dạng khi thời tiết thay đổi. Nó cũng được làm đồ trang trí nội thất, phần bên trong của máy bay, du thuyền, làm đồ thủ công mỹ nghệ và nhạc cụ rất tốt. Lá hông có hàm lượng đạm cao dùng làm thức ăn gia súc rất hiệu quả. Hoa hông có màu sắc đẹp, thơm dịu dùng để nuôi ong mật hay còn điều chế một số loại thuốc chữa bệnh như bệnh hen xuyễn (Phạm Hoàng Hộ). Ngoài ra cây hông còn là cây giữ đất tốt và có giá trị kinh tế cao nên rất thích hợp cho việc trồng rừng (Nguyễn Nhẫn Hoài và cộng sự, 1999). Cây hông có thể được nhân giống bằng hạt, bằng giâm hom và nhân giống in vitro. Tuy nhiên nhân giống bằng hạt và giâm hom có rất nhiều hạn chế: Đối với nhân giống bằng hạt , cây sau khi sinh trưởng sinh dưỡng 3 đến 4 năm mới bắt đầu ra hoa và hạt nhanh mất sức nảy mầm, thời gian ngủ nghỉ lâu, có sự phân ly quần thể do sinh sản hữu tính. Việc nhân giống bằng giâm hom có hệ số nhân thấp do phụ thuộc kích thước cây và phụ thuộc nhiều vào điều kiện tự nhiên. Phương pháp nhân giống invitro là phương pháp có hiệu quả hơn cả và khắc phục được những hạn chế trên. Nó có thể cho một số lượng cây lớn trong một thời gian ngắn, đồng nhất về mặt di truyền, dễ vận chuyển và có điều kiện quy trình công nghệ cho cơ giới hoá… Việc nhân giống cây hông in vitro đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu tại nhiều nơi. ở Việt Nam đã có các công trình nhân giống in vitro về loài cây này. Tuy nhiên các công trình này còn nặng về nghiên cứu cơ bản và hệ số nhân giống chưa cao. Xuất phát từ thực tế trên nhóm nghiên cứu khoa học chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống cây hông Paulownia bằng phương pháp in vitro” II. Mục đích và yêu cầu của đề tài Mục đích của đề tài Đề tài nhằm nghiên cứu xây dựng quy trình cải tiến nhân giống cây Paulownia Fortunei bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro có hệ số nhân giống cao và dễ ứng dụng vào sản xuất. Yêu cầu của đề tài Xác định của sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy như BAP, hàm lượng agar tới hệ số nhân chồi. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar, BAP, phương pháp nuôi cấy đến vươn chồi hông in vitro. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA) tới sự hình thành rễ in vitro của chồi hông nuôi cấy. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA và giá thể tự tạo đến hình thành rễ in vivo. Phần I: Tổng quan tàI liệu I. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào và ứng dụng Nuôi cấy mô tế bào là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây như: Mô phân sinh của chồi đỉnh, rễ, chồi nách… bằng cách cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối, trong môi trường thích hợp và được kiểm soát hoàn toàn. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật. Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hoá (trừ một số tế bào đã được biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn… ) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện thích hợp sẽ phát triển theo chu trính giống như sự phát triển của phôi dẫn đến việc hình thành cây hoàn chỉnh mới. - Tuổi giai đoạn: Thực vật cũng biến đổi theo thời gian, từ thời kỳ non trẻ tới thành thục và già cỗi. Nuôi cấy mô tế bào có nhiệm vụ là làm thế nào để trẻ hoá các dòng vô tính mà khả năng ra chồi rễ ở các giai đoạn khác nhau là khác nhau. Chính vì thế nuôi cấy ở giai đoạn trẻ sẽ ra đời chồi, rễ tốt hơn ở các bộ phận đã thành thục (thường người ta lấy mẫu ở những phần non). - Sự phân hoá và phản phân hóa: Trong một cơ thể thực vật bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng khác nhau. Các mô có cấu trúc chuyên hoá nhất định là nhờ sự phân hoá. Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhiệm các chức năng khác nhau của cơ thể. Quá trình này được thể hiện như sau: Sự phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa Sự phản phân hoá tế bào Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp chúng lại trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình gọi là quá trình này gọi là quá trình phản phân hoá tế bào (phản biệt hoá). Về thực chất thì sự phân hoá tế bào và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân hoá sẽ được xảy ra theo một chương trình định sẵn. Tuỳ từng đối tượng nuôi cấy ta còn có thể lấy mẫu ở các vị trí như lá, đài hoa, mẩu rễ, phôi non… mẫu lấy ở giai đoạn sinh trưởng mạnh như: các cây non, các chồi nách sát đỉnh thì khả năng tái sinh cao hơn so với lấy ở cây già, chồi già. II. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Haberland (1902) là người đầu tiên đề xuất ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng di truyền của loài đó, vì vậy gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã thí nghiệm với tế bào khí khổng và không thành công. Điều này đã làm cho các nhà khoa học lúc bấy giờ mấ hy vọng về việc xây dựng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong một thời gian dài. Tuy nhiên sau đó Garrison (1904-1907) đã nuôi được tế bào thần kinh của ếch trong huyết tương chứng minh khả năng nuôi cấy tế bào nhân tạo của tế bào động vật. Trên cơ sở thành công của các nhà khoa học nuôi cấy mô tế bào động vật các nhà nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng nuôi cấy tế bào trên môi trường dinh dưỡng tự nhiên nhưng không thành công. Năm 1922 Robins và Kotte đã thành công trong việc nuôi cấy đầu rễ trong 12 ngày. Từ những năm 30 của thế kỷ 20 phương pháp nuôi cấy mô và tế bào đã mang những nét của nuôi cấy mô tế bào hiện đại với kỹ thuật không khác là mấy. Trong thời gian này White- nhà bác học người Mỹ và Gautheret (Pháp) đã có nhiều đóng góp trong việc nghiên cứu các môi trường nuôi cấy, nhiều môi trường đến nay vẫn được sử dụng. Từ năm 1931 phương pháp nuôi cấy mô tế bào mới được coi như chính thức bắt đầu bằng công trình nghiên cứu của White với việc nuôi cấy đầu rễ cây cà chua và ông là người đầu tiên chỉ ra rằng mô phân sinh có thể sinh trưởng trong thời gian dài nếu được cấy chuyển lên môi trường dinh dưỡng mới. Trong cùng thời gian Gautheret cũng đã thành công trong nuôi cấy mô tượng tầng và tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp. Sau đó Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã xác định được vai trò của Kinetin trong sự kích thích sự phát triển của mô. Những thí nghiệm về môi trường dinh dưỡng đã chỉ ra rằng môi trường dinh dưỡng, tính chất vật lý, tính chất hoá học là những điều kiện quan trọng quyết định thành công trong nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào. Những thành phần bắt buộc của môi trường bao gồm chất khoáng từ các muối khác nhau của các nguyên tố đa lượng và vi lượng, thành phần hydrocacbon trong đường và các chất điều hoà sinh trưởng. Cũng từ những năm 30 nuôi cấy mô tế bào đã phát triển theo một số hướng như nuôi cấy phôi, nuôi mô và cơ quan tách rời. Từ những năm 60 trở lại đây, ngoài các hướng trên nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần (protoplast) được phát triển mạnh. Từ những năm 70 đến nay các kỹ thuật lai xoma bằng dung hợp tế bào trần và các kỹ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Vào năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được tái sinh từ mô lá và được đưa vào trồng thử ngoài đồng ruộng đã trở thành một cơ sở không thể thiếu được của công nghệ sinh học thực vật và là công cụ quan trọng trong công tác phục tráng giống cây trồng, nhân giống. III.các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôI cấy mô tế bào thực vật. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường dinh dưỡng, nguồn gốc mẫu cấy, điều kiện vật lý đã ảnh hưởng sâu sắc tới quá trình nuôi cấy Invitro. Môi trường có vai trò rất quan trọng vì nó cung cấp dinh dưỡng đảm bảo cho sự sinh trưởng, phát triển của mô nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển bình thường của mô nuôi cấy rất khác nhau. Tuỳ thuộc từng loài, giống thậm chí các mô được lấy từ các cơ quan khác nhau (Bhojwwani, Razdan, 1993). Cho đến nay, người ta đã tìm ra nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau như: White (1934), Heller (1953), MS (Murashige và Skoog, 1962), LS (Laismener và Shoog, 1963), Ericson (1965), Gamborg (1962), Nitsh (1969), Knop (1977)… trong đó môi trường MS là môi trường nuôi cấy thích hợp cho nhiều loại thực vật. Các công thức môi trường có nhiều điểm khác nhau nhưng chúng gồm các thành phần cơ bản: Nguồn Cacbon Nguồn muối khoáng Vitamin Các chất điều tiết sinh trưởng Các phụ gia hữu cơ Các phương pháp nuôi cấy mô và tế bào Nuôi cấy trên môi trường đặc Thành phần của môi trường đặc có agar với hàm lượng biến đổỉ từ 0,6- 10%. Agar làm cho môi trường đặc lại và có các mẫu thí nghiệm được cấy trên bề mặt của môi trường. Dùng môi trường đặc để cấy các cơ quan tách rời, vi nhân giống, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu đi xa…. nhưng có nhược điểm là mẫu chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng đồng thời những sản phẩm do mẫu tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh làm chậm đi sự phát triển, sinh trưởng của mẫu. Nuôi cấy trên môi trường lỏng Nuôi cấy lỏng có khuấy (Agitated liquid media) Trong phương pháp này mẫu được ngâm một phần hay hoàn toàn trong dung dịch của môi trường. Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc tốc độ 100- 200 vòng/phút tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí. Nuôi cấy lỏng khuấy dùng trong nuôi cấy tế bào đơn, dịch huyền phù tế bào, nuôi cấy để sản xuất các chất trao đổi chất thứ cấp. Nuôi cấy lỏng tĩnh (Stationary liquid media). Bình nuôi cấy được để yên như trong trường hợp nuôi cấy trên môi trường đặc. Mẫu có một phần ngâm trong dung dịch của môi trường và phần kia tiếp xúc với không khí. Trên cơ sở của nuôi cấy lỏng tĩnh người ta phát triển ra một phương pháp sử dụng cầu giấy lọc. Cầu được tạo ra từ giấy lọc được gấp lại nhiều lần, một đầu được nhúng vào dung dịch nuôi cấy để thấm chất đinh dưỡng, đầu phía trên được uốn cong làm nơi đặt mẫu. Sử dụng cầu giấy để nuôi cấy phôi, nuôi cấy tế bào đơn. Ngoài các phương pháp trên, mẫu có thể nuôi cấy trên môi trường bán rắn hoặc bán lỏng hoặc phối hợp cả hai loại môi trường trên như trong trường hợp phủ một lớp dung dịch của môi trường lỏng trên bề mặt môi trường đặc để nuôi cấy. Lựa chọn phương pháp nào là tuỳ theo đối tượng, giai đoạn phát triển của mẫu, mục đích và kỹ thuật nuôi cấy. Đối với những nghiên cứu về dinh dưỡng và trao đổi chất thì môi trường lỏng tỏ ra thích hợp hơn (Naryanaswamy S, 1994). Các kỹ thuật nuôI cấy mô tế bào Hiện nay người ta sử dụng 3 phương pháp kỹ thuật nhân giống Invitro thực vật đó là: Phương pháp nhân chồi đỉnh (Meristem) và các phần khác nhau của thực vật. Phương pháp tái sinh chồi bất định. Phương pháp tạo phôi vô tính. Phương pháp nhân chồi đỉnh và các phần khác nhau của thực vật. Mô phân sinh đỉnh chồi, đỉnh cành, đỉnh rễ… có khả năng tái sinh và phân hoá rất mạnh. Mặt khác ở mô phân sinh hầu như không có virus nên nó được sử dụng để nhân giống cây sạch bệnh. Do kích thước của mô phân sinh khá nhỏ nên trong một vài trường hợp để dễ thu nhận và nuôi cấy người ta thường tách cả phần đỉnh chồi chứa mô phân sinh để nuôi cấy. Chồi phát sinh từ mẫu nuôi cấy được tách ra và chuyển sang môi trường nhân chồi. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi đạt được số lượng chồi đủ lớn theo yêu cầu. Trong quá trình nuôi cấy muốn kích thích tạo chồi cần bổ xung Cytokinin hay tổ hợp Cytokinin với Auxin. Muốn tạo rễ thì bổ xung Auxin. Như vậy trong nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng là rất quan trọng. Ngoài việc sử dụng đỉnh chồi để nhân giống in vitro, một số bộ phận khác của thực vật như: thân, lá, hoa… cũng được nuôi cấy. Các mô và cơ quan tách rời này để đưa vào nuôi cấy phải ở tình trạng sinh lý tốt nhất và đang phát triển. Đó là những phần non của cây, lá mầm, phần trên của lá mầm, chồi bên lá thứ nhất hay lá thứ hai hoặc phôi của hợp tử trưởng thành vì chúng chứa nhiều tế bào mô phân sinh. Tái sinh chồi bất định Tái sinh chồi bất định là một dạng nhân giống in vitro có thể sử dụng để tái sinh các dòng hoặc nhân với số lượng cây lớn. Sự phát sinh các cơ quan bao gồm sự tái tạo mới các chồi bất định trên từ nhiều nguồn mẫu khác nhau. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều cây nông nghiệp, lâm nghiệp, cây cảnh cũng như các loài khó nhân khác. Ngoài việc nâng cao tỷ lệ nhân thì phương pháp này cũng duy trì được đặc điểm của dòng và tỷ lệ nhân cao hơn phương pháp nhân chồi. Kỹ thuật này còn được sử dụng để nhân các dòng bất thụ đực hoặc cái do không có hạt và đối với các dòng nhân theo phương pháp cắt hoặc ghép. Việc hình thành chồi, phát sinh cơ quan phụ thuộc rất lớn vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, nguồn cacbon hydrate và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng. Ví dụ: - ánh sáng: cây Fressia để hình thành được chồi phải để trong bóng tối. - Nhiệt độ: Sự hình thành chồi thích hợp trong khoảng 22- 280C - Môi trường: Giảm nồng độ Nitơ và Kali trong môi trường MS làm cho số chồi được hình thành trên mô cuống lá Senocioxhybrids tăng gấp 3 lần. Tỷ lệ Cytokinin/Auxin cao kích thích tạo chồi. 3. Tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo Sự phát sinh của phôi Somatic là sự hình thành phôi từ một tế bào không phải giao tử hay từ sự dung hợp giao tử thể. Mặc dù là một hiện tượng invitro quen thuộc và có tiềm năng ứng dụng như một hệ thống vi nhân giống nhưng trong tự nhiên nó được biết đến từ lâu là sự phát sinh phôi phụ, một dạng của Apomixis. Apomixis là hiện tượng phát sinh phôi không qua quá trình thụ tinh ở thực vật. Nó thường xuất hiện ở những tế bào đơn Somatic điploi trong túi phôi (Aspospopy) hoặc từ những tế bào đơn của Nucellus (nucellar embryon). Người đặt nền móng đầu tiên cho việc tạo phôi vô tính in vitro là Reinert và Stewars (1958). Hai ông đã tạo được phôi vô tính trong điều kiện phòng thí nghiệm ở huyền phù tế bào cà rốt. Sau đấy một loạt các nghiên cứu tạo phôi vô tính trên các đối tượng khác như cây ăn quả, cây hoa, cây cảnh, … Đến năm 1989 kỹ thuật phôi vô tính đã đạt được những tiến bộ lớn. Hiện nay người ta đã nhân giống vô tính hơn 200 loài thực vật. Việc tạo phôi vô tính ở thực vật đem lại tiềm năng ứng dụng lớn đối với các mục đích: Nhân dòng với số lượng lớn, ví dụ: một mẻ cấy 500 lít cho 200.000 chồi cây cỏ ngọt. Kỹ thuật di truyền, nuôi cấy protoplast, tạo các biến dị Somatic có lợi. Bên cạnh những ưu điểm trên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như: Tần số phôi thấp, tạo các phôi khuyết tật, phôi chín không đều… VI.ứng dụng của phương pháp nhân giống in vitro Tạo cây sạch bệnh Hàng năm sản xuất nông nghiệp chịu thiệt hại rất lớn do các nguồn bệnh nói chung: nấm, vi khuẩn, tuyến trùng… và virus nói riêng. Ví dụ virus Tungro năm 1971 đã cướp đi nửa triệu tấn thóc của nông dân philippin; virus khảm làm giảm tới 20- 30 % sản lượng lúa mì, đại mạch ở các nước Châu âu. Mà virus không thể phòng, chống, tiêu diệt bằng xử lý các chất hoá học như vi khuẩn, nấm, sâu bọ. Cách duy nhất để giảm thiệt hại do virus gây ra là tách chúng ra khỏi cây bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khoẻ mạnh. Phương pháp nhân giống in vitro là phương pháp tạo cây sạch bệnh hữu hiệu nhất. Từ năm 1940 nuôi cấy mô tế bào được sử dụng vào cải thiện giống cây trồng. Từ khi Kassanis (1957) quan sát thấy đỉnh chồi hoặc rễ hoàn toàn không hay có rất ít virus, đỉnh sinh trưởng (meristem) đã được dùng để nuôI cấy tạo cây sạch bệnh. Đỉnh sinh trưởng của cây được dùng để nuôi cấy tạo cây sạch bệnh. Đỉnh sinh trưởng của cây thường có kích thước từ 5- 10mm nhưng với mục đích loại trừ vius thì kích thước mẫu cấy chỉ cần 0,1mm. Phương pháp nuôi cấy này có thể áp dụng ở đối tượng cây hai lá mầm như: khoai tây, thuốc lá, cam, chanh, hoa cúc hay ở cây một lá mầm như dứa sợi… Nhưng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (mô phân sinh đỉnh) vẫn không thể loại trừ hoàn toàn vius. Để tạo giống cây sạch bệnh theo đúng nghĩa Klin Kowski và Shmelze (1974) đã kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và liệu pháp nhiệt: Xử lý ở nhiệt độ 32- 380C trong 7 ngày có thể loại trừ hoàn toàn những virus có ở đỉnh sinh trưởng (Krylova năm 1973 đã quan sát được 12 tiêu bản virus trên 80- 10nm đỉnh sinh trưởng). Hàng loạt các loại cây trồng làm thức ăn gia súc, cây rau, cây ăn quả, cây hoa… đã được làm sạch bằng phương pháp này. Để tạo cây sạch bệnh, hoá chất cũng được sử dụng và cho hiệu quả rất tốt. Kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và sử lý hoá chất giúp cho việc loại bỏ vius có hiệu quả hơn. Các đồng phân của purine và pirimidine, amino acid, hormon sinh trưởng thực vật và các kháng sinh là những hoá chất thường được sử dụng. Nó có tác dụng kìm hãm hoạt động của virus. Gần đây người ta còn sử dụng một số nhóm các chất khác như arabinoside hoặc vidarabine để làm sạch virus trong quá trình nuôi cấy mô phân sinh ở khoai lang cũng cho kết quả rất tốt. Từ năm 1952 các nghiên cứu sinh của Morel ( nhà khoa học Mỹ) đã cho thấy kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ( Meristem) rất có hiệu quả trong việc làm sạch virus. Bằng kỹ thuật này đã làm sạch bệnh cho 55 loài cây trồng, 23 loài cây cảnh, 11 loài cây ăn quả, 8 loài cây có củ và 7 loài cây công nghiệp. Như vậy bằng việc kết hợp giữa biện pháp nhiệt, xử lý hoá chất và nuôi cấy đỉnh trưởng đã tạo ra rất nhiều giống cây sạch bệnh, giảm thiểu sự thiệt hại do các nguồn bệnh nói chung và virus nói riêng đối với sản xuất nông nghiệp. Trung Quốc là nước tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy mô rất sớm (từ thập kỷ 40-50). Năm 1970 Tsui đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh chồi làm sạch virus. Bằng kỹ thuật vi nhân giống đến nay đã nhân được hơn 700 loài. Hàng năm nhân được khoảng 220 triệu cây và trồng trên diện tích hơn 1 triệu ha bao gồm: khoai tây, chuối, táo, nho, cây cảnh, cây lâm nghiệp… 2.Nhân nhanh invitro với số lượng lớn Phương pháp nhân giống in vitro là phương pháp nhân giống vô tính có khả năng tạo nhanh một quần thể có độ đồng đều cao, sạch bệnh. Quần thể vô tính này tránh được sự thoát ly, thoái hoá giống hay gặp trong quần thể cây trồng từ hạt đồng thời sử dụng đầy đủ tiềm năng về di truyền của cả bố và mẹ (additive and non – additive componen). Nhân giốn in vitro hay vi nhân giống thực chất là nhân bản thực vật nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật, bằng việc nuôi cấy mô tế bào trong thời gian ngắn đã cho ra một số lượng lớn cây giống có đủ phẩm chất để đem sản xuất. Để tạo ra một thế hệ các cá thể đồng đều mới từ hạt có ba con đường: Các cá thể mới xuất phát từ hạt của các dòng tự thụ; từ hạt F1 của tổ hợp lai bố mẹ đồng đều; từ hạt Apomitic. Đối với nhiều loại thực vật thời gian sinh trưởng quá dài, hơn nữa hạt thường mất sức sống một cách nhanh chóng. Sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được nhược điểm này. Trong nhân giống in vitro, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương thức rất hữu hiệu để cho ra những giống cây trồng sạch bệnh. Nó đã được áp dụng cho việc phục tráng giống ở các loài hoa, cây cảnh, rau… Đối với các loài thân gỗ, do việc tái tạo lại cơ thể hoàn chỉnh bằng nuôi cấy mô là rất khó nên tới năm 1968 Winton mới lần đầu tiên tạo được một cây hoàn chỉnh bằng kỹ thuật in vitro đó là cây Populus tremiloids. Kể từ đó kỹ thuật nhân giống in vitro đã được áp dụng để nhân thành công nhiều loại cây. Một số nước như ấn Độ, Trung Quốc đã sử dụng thành công kỹ thuật nhân giống in vitro vào việc nhân giống cây bạch đàn. Hiện nay đã nhân giống thành công trên 20 loài bạch đàn khác nhau và Trung Quốc là nước sớm ứng dụng nuôi cấy mô vào trồng trên diện tích rộng. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn nhỏ trên thế giới áp dụng để nhân khoảng 500 triệu giống cây trong nhiều năm ở các giống cây trồng khác nhau. Dự kiến thị trường cây giống nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vào khoảng 15 tỷ USD/năm và tốc độ tăng trưởng hàng năm của thị trường vào khoảng 15%. Công nghệ nuôi cấy mô phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm ở nước ta. Nhân giống thương mại quy mô lớn đã được thực hiện ở một số giống cây trồng như nhân nhanh giống chuối, giống khoai tây sạch bệnh, các giống mới nhập nội, các dòng bạch đàn và keo lai đạt công suất khoảng 3 triệu cây/năm. Quy trình công nghệ nhân giống đã được nhiều viện, trường nghiên cứu hoàn thiện ở nhiều cây trồng khác nhau như cây có múi, đu đủ, các loài lan, các loài thuốc quý, cây cà phê, cây tếch… Việc thương mại hoá các công trình trên đây là chìa khoá quan trọng để mở rộng phạm vi ứng dụng công nghiệp in vitro ở nước ta trong 10 năm tới. Những thành tựu trên vẫn chủ yếu dựa vào các phương pháp nuôi cấy mô truyền thống, trong đó cây hoàn chỉnh được tái sinh trong ống nghiệm, bình tam giác… không đủ đáp ứng nhu cầu của sản xuất trước mắt.Do vậy đã có nhiều nghiên cứu nhằm tăng cường hệ số nhân, nâng cao chất lượng cây giống và tự động hoá quá trình nhân giống vô tính thông qua sử dụng các phương thức nhân giống mới, các hoạt chất sinh học mới… Quá trình sản xuất cây cấy mô Qua trình sản xuất vi nhân giống bao gồm năm giai đoạn chính và mỗi giai đoạn có những đòi hỏi riêng. Giai đoạn I: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc Giai đoạn này gồm các khâu như: Chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu. Cây mẹ thường là những cây ưu viết, khoả mạnh, có giá trị kinh tế cao. Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non… Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị. Tuỳ theo điều kiện giai đoạn này kéo dài từ 3 đến 6 tháng. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy Giai đoạn này bao gồm các khâu như sau: Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo. Giai đoạn này gọi là giai đoạn cấy mẫu in vitro. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm nấm, khuẩn hoặc virus sẽ được lưu giữ trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp về ánh sáng, nhiệt độ. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ), hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Giai đoạn 2 thông thường yêu cầu 2 đến 12 tháng hoặc ít nhất là 4 lần cấy chuyển các mảnh cấy. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi Khi mẫu đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi hoặc các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện phải được tối ưu hoá nhằm đạt được mục đích nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1-2 tháng tuỳ từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần/4 lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn 3 kéo dài trong khoảng 10 đến 36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ vài chồi ban đầu nên không kéo dài quá lâu. Ví dụ đỉnh sinh trưởng của một cây chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000-3000 chồi cây sau 7-8 lần cấy chuyển để tránh biến dị xoma. Đối với các loài cây khác như mía, hoa cúc, hoa phong lan chỉ sau một năm có thể nhân được 1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu. 4.Giai đoạn 4: Tạo rễ Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi được cấy chuyển trực tiếp ra đất. Giai đoạn 4 thông thường cần từ 2-8 tuần. 5.Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng Đây là giai đoạn đầu tiên cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Đối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ ra đất, nhưng đa số các loại cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được cấy chuyển ra ngoài vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu chăm sóc đặc biệt. Vì cây được chuyển từ môi trường bão hoà hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm phải đáp ứng những yêu cầu sau: Cây được che bằng nilon bao phủ và hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát. Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa, bọt biển. Giai đoạn 5 thường đòi hỏi từ 4-16 tuần. VàI nét về cây hông 1.Đặc điểm sinh thái Cây hông hay còn gọi là cây bao đồng có tên khoa học là Paulownia thuộc chi Paulownia họ Scrophulariaceae sinh trưởng tự nhiên ở Trung Quốc, Đài Loan, Campuchia, Việt Nam… Tại Việt Nam cây hông có hai loàI là: p. Fortunei và P. Elougata mọc tự nhiên ở Miền Bắc: Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên (Phạm Hoàng Hộ, 1993; Trần Hợp và Nguyễn Bội Quỳnh, 1993; Vũ Xuân Phương, 1995; Vũ Văn Dũng, 1996). Nó được đưa vào Châu Âu , bắc Mỹ vào giữa thế kỷ 19 và sau này là Nam Mỹ, Australia và New Zealand. Cây hông là cây thân gỗ, cao 20 – 30m. Vỏ thân trắng xám hoặc xám vàng không có lông, phần non có lông, phân nhánh. Lá đơn mọc đối, phiến lá lớn, dài 25cm hoặc hơn hình trứng dài hoặc bầu dục, nhọn dần về phía chóp lá. Cuống lá dài 6 – 2cm. Hoa mọc hợp thành chuỳ dài 8 – 10cm, đài cứng xẻ 5 răng. Tràng hoa hợp thành ống, phía trong có những điểm lấm tấm màu tím, phía trên có 5 thuỳ tròn, có lông; 4 nhị trong đó có 2 nhị dài. Quả nang hình bầu dục, dài 6 – 7cm, vỏ ngoài khá dày, hoá gỗ; quả chứa nhiều hạt nhỏ, khi chín tự nở, hạt dài 6mm, có cán trong suốt. Cây hông là cây ưa sáng, ưa khí hậu mát mẻ, thường thấy mọc ở những vùng đồi núi thấp, ở độ cao 300 – 800m so với mực nước biển. Cây sinh trưởng nhanh ở những nơi có điều kiện thích hợp, mỗi năm có thể tăng trưởng tới 3m về chiều cao. Cây còn non sinh trưởng rất nhanh nhưng đến năm 30 tuổi thì tốc độ sinh trường chậm dần. Do hạt nhỏ, có cánh nên khả năng phát tán theo gió mạnh. Cây mềm yếu, nhỏ, khó đâm qua được tầng cành khô lá rụng, ít gặp tái sinh dưới rừng. 2.Các nghiên cứu về cây hông trên thế giới và Việt Nam Nghiên cứu trên thế giới Năm 1986, Zhu và cộng sự cho rằng cây hông được sử dụng vào nhiều mục đích như thân làm gỗ, lá làm phân bón và thức ăn gia súc, hoa làm thuốc… Năm 1988, Marcotrigiano và Jagnnathan nghiên cứu thấy rằng cây hông có nguồn gốc ở vùng Đông Nam á, được trồng nhiều nơi trên thế giới, có khả năng thích nghi với vùng đất có điều kiện khí hậu không thuận lợi. Cây hông có thể trồng từ hạt, đoạn rễ hay đoạn thân, tuy nhiên phương pháp nuôi cấy mô được xem là phương pháp hữu hiệu nhất để nhân nhanh các dòng hông có đặc tính ưu việt (Rao và cộng sự, 1996; Bergmann và Moon, 1997; Kuman và cộng sự , 1998). Cây hông được nuôi cấy in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng (có 20g/l đường và Vitamin trong MS) tăng trưởng tốt hơn rõ rệt so với cây nuôi cấy trong điều kiện dị dưỡng. Trong điều kiện môi trường quang tự dưỡng, cây hông in vitro tăng trưởng nhanh hơn trong điều kiện nồng độ CO2 của phòng nuôi cấy được tăng đến 160mm/ml dưới cường độ ánh sáng 250mm m-1s-2 (Kozai và Iwanami, 1988; Kozai, 1991; Kirdmanee, 1995). Nghiên cứu ở Việt Nam *Tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc trung tâm nghiên cứu giống cây rừng Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, các nhà khoa học đã tiến hành một số nghiên cứu về vi nhân giống cây hông như sau: - Tạo mẫu nhân giống in vitro bằng chồi ở cây 1- 2 năm tuổi tốt hơn từ hạt và khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút cho tỷ lệ nhiễm bệnh ít nhất. - Tạo chồi chỉ cần dung dịch MS với BAP nồng độ 1,0ml/l. - Sử dụng IBA với nồng độ 1mg/l để tạo rễ và đạt tỷ lệ rễ nhiều nhất (100%) và có chỉ số rễ/hom, chiều dài rễ cao nhất. - Đưa cây từ bình thí nghiệm ra môi trường đất cho tỷ lệ sống cao hơn môi trường cát. * Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cũng tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cây hông theo một số hướng sau: -+ Cây hông có thể được tạo ra và nhân chồi từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi bên và từ cuống lá. Nồng độ BAP 0,5mg/l cùng NAA 0,1mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo chồi từ nuôi cấy chồi đỉnh và cuống lá. + Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là 1/2 hàm lượng dinh dưỡng khoáng MS + 20g/l đường, 0,5mg/l NAA + 1g/l than hoạt tính. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng và phát triển của cây hông in vitro cho kết luận là: + Cây hông phát triển tốt hơn khi sự trao đổi khí của bình nuôi cấy được tăng bằng cách sử dụng nút giấy thay nút cao su đậy bình tam giác hoặc màng millipore trên nắp hộp magenta. + Cây hông phát triển tốt hơn trên môi trường có giá thể xốp như Perlite. Ngoài ra, ở điều kiện này cây hông có thể phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin. - Kỹ thuật ươm cây hông giai đoạn sau ống nghiệm. + Che nilon và tưới phun sương 15 – 30 phút/ lần giúp cho cây có tỷ lệ sống cao (90- 95%). + Giá thể trồng không thích hợp cho cây Paulownia ở giai đoạn đầu và tro trấu tỷ lệ 1:1 cho tỷ lệ sống tốt. + Thời gian ươm tối thiểu cho cây thích nghi môi trường bên ngoài là 14 ngày. + Giá thể chuyển tiếp tốt đối với Paulownia 21 ngày tuổi là đất + tro + phân chuồng tỷ lệ 1:1:1. + Phân bón qua lá RAD – G, KOMIC, HVP, HP – 206G có tác dụng tốt cho cây lớn nhanh, đạt tiêu chuẩn xuất vườn. *Tại phòng nuôi cấy mô và tế bào Viện di truyền Nông nghiệp Hà Nội cũng tiến hành một số thí nghiệm về cây hông được một số kết quả như sau: - Sử dụng HgCl2 0,1% trong 3 phút cho hiệu quả khử trùng cao, không gây độc cho mẫu. - Môi trường cơ bản MS (3% đường + 0,6% agar) có bổ xung 2mg/l BAP là môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi (hệ số nhân đạt 5,1 lần). - Môi trường cơ bản MS (3%đường + 0,6% agar) có bổ xung 2mg/l BAP và nước dừa cho thấy hệ số nhân chồi không đổi nhưng các chồi hông phát triển tốt hơn, lá cây khoẻ, không mọng nước. - Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trong môi trường MS/2 (3%succarose + 0,5mg/l NAA) với thời gian ra rễ 15 ngày. - Giá thể (1đất + 1cát) để ươm cây hoàn chỉnh cho hiệu quả sống sót cao nhất (82%) so với giá thể đất hay cát độc lập. Phần II. Phương pháp nghiên cứu I. Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu: các chồi, mô lá, đốt thân của cây hông (Paulownia) được chọn làm vật liệu nghiên cứu. II.Phương pháp nghiên cứu 1. Môi trường nghiên cứu Đối với toàn bộ thí nghiệm môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962). Môi trường có bổ sung agar, đường, succarose, inositol, than hoạt tính, pH= 5,8. Nuôi cấy ở nhiệt độ là 250C, ánh sáng 2000 lux, chu kỳ chiếu sáng 12h/12h. 2.Thí nghiệm a. Thí nghiệm tạo nguồn nguyên liệu Thí nghiệm được tiến hành với môi trường nuôi cấy bổ sung NAA 0,05 mg/l và BAP với các nồng độ: Công thức 1: BAP 0mg/l Công thức 2: BAP 0,5mg/l Công thức 3: BAP 1,0mg/l Công thức 4: BAP1,5mg/l Công thức 5: BAP 2,0mg/l b. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi Môi trường nuôi cấy là môi trường bán lỏng có 3% succarose và lượng agar bằng 80% so với môi trường đặc. Ngoài ra môi trường còn được bổ sung BAP với các nồng độ như sau: Công thức 1: BAP 0mg/l Công thức 6: BAP 1,0mg/l Công thức 2: BAP 0,1mg/l Công thức 7: BAP 1,3mg/l Công thức 3: BAP 0,3mg/l Công thức 8: BAP 1,5mg/l Công thức 4: BAP 0,5mg/l Công thức 9: BAP 1,8mg/l Công thức 5: BAP 0,7mg/l Công thức 10: BAP 2,0mg/l Mật độ cấy tăng 50% so với các thí nghiệm trước kia (15 mẫu/bình). c. Thí nghiệm vươn chồi Thí nghiệm này chúng tôi tiến hành với môi trường nuôi cấy bổ sung BAP với các nồng độ: Công thức 1: BAP 0 mg/l Công thức 2: BAP 0,1mg/l Công thức 3: BAP 0,3mg/l Công thức 4: BAP 0,5mg/l Công thức 5: BAP 0,7mg/l Môi trường nuôi cấy cũng là môi trường bán lỏng, mật đội cấy tăng 100% (20mẫu/bình), cấy theo phương pháp đặt. d. Thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ in vitro Chúng tôi tiến hành thí nghiệm ra rễ Invitro bằng cách bổ xung vào môi trường nuôi cấy NAA với các nồng độ: Công thức 1: NAA 0mg/l Công thức 2: NAA 0,1mg/l Công thức 3: NAA 0,2mg/l Công thức 4: NAA 0,3mg/l Công thức 5: NAA 0,4mg/l e. Thí nghiệm ra rễ in vivo Với thí nghiệm này chúng tôi sử lý nhúng chồi vào dung dịch NAA với các nồng độ: Công thức 1: NAA 0ppm Công thức 2: NAA 5ppm Công thức 3: NAA 10ppm Công thức 4: NAA 50ppm Công thức 5: NAA 100ppm Và trồng trên các giá thể Giá thể 1: Cát Giá thể 2: Phù sa + cát (tỷ lệ 1:2) Giá thể 3: Phún xuất núi lửa (kích thước 0,3 – 0,5cm). g. Giai đoạn vườn ươm Sau giai đoạn ra rễ cây được trồng vào bầu đất ở vườn ươm. Kích thước bầu là 10x15cm. Hỗn hợp bầu gồm: đất + than bùn + phân chuồng với tỷ lệ 1:1: 0,5. Phần III. Kết quả và thảo luận ở Việt Nam việc nghiên cứu về cây hông còn rất mới mẻ. Với đặc thù là một cây thân gỗ nên việc nhân giống cây hông không hề đơn giản. Chính vì vậy phương pháp nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp hữu ích cho việc nhân số lượng lớn cây trồng. Phương pháp này cho phép tạo ra một quần thể cây con đồng đều giữ nguyên đặc tính của cây mẹ với số lượng lớn, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ sớm khắc phục những bất lợi của điều kiện kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ khắc phục những bất lợi của điều kiện môi trường. Tuy nhiên việc nhân giống bằng phương pháp cấy mô tế bào thực vật hiện nay mới được đặc biệt quan tâm. Thừa hưởng những kết quả trên nhiều loại cây trồng và một số kết quả nghiên cứu về cây hông, chúng tôi tiến hành việc nhân giống cây hông tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật – Viện di truyền nông nghiệp. I. Tạo nguồn nguyên liệu Để có thể tiến hành được công tác nhân giống thì việc đầu tiên chúng ta phải làm là tạo nguồn nguyên liệu. Chỉ khi có được nguồn nguyên liệu tốt và đảm bảo chất lượng thì mới có thể dẫn đến một quy trình nhân giống thành công và hiệu quả. Chúng tôi đã tiến hành tạo nguyên liệu bằng cách lựa chọn những cây sinh trưởng khoẻ có kích thước lớn trong quần thể rồi chọn những chồi non gần ngọn để làm mẫu. Sau đó mẫu được rửa kỹ bằng dung dịch xà phòng 10% trong 5 phút rồi tráng nhiều lần bằng nước cất rồi rửa bằng cồn 700 sau đó tráng sạch bằng nước cất. Tiếp tục khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút. Mẫu được làm sạch lần cuối bằng nước cất nhiều lần. Cắt mẫu thành từng lát mỏng dầy 0,2 – 1,2 mm cấy vào môi trường. Môi trường nuôI cấy là môi trường MS cơ bản có bổ sung NAA 0,5mg/l và BAP với các nồng độ như sau: 0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l. Sau 45 ngày theo dõi chúng tôi thu được các chồi từ callus tốt nhất trên công thức có nồng độ BAP 2mg/l. II.Nhân nhanh Các nghiên cứu thuộc giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi là giai đoạn quyết định hiệu quả của công nghệ nhân giống.. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật BAP là một Cytokinin có tác dụng tạo chồi mạnh, kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra nó còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, tăng cường sự hoạt động của một số enzyme được sử dụng rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh chồi. Những nghiên cứu trước đây người ta sử dụng phối hợp BAP và NAA, BAP phối hợp với nước dừa trong môi trường đặc để tăng hệ số nhân chồi và đạt hệ số nhân là 5,1 trong 25 ngày nuôi cấy. Trong công trình này chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung vào môi trường BAP với hàm lượng thấp:0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3; 1,5; 1,8; 2,0 mg/l. Môi trường nuôi cấy là môi trường bán lỏng với lượng agar bằng 80% lượng agar của môi trường đặc, mật độ nuôi cấy là 15 mẫu/bình (tăng 50% so với trước đây). Sau 25 ngày kết quả theo dõi được như sau: Bảng1: ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi Công thức BAP (mg/l) Số mẫu cấy Số đốt thu được Hệ số nhân đốt Số chồi /mẫu Chiều cao chồi (cm) Trạngthái chồi 1(Đ/C) 0 40 150 3,8 1,2 4,8 Lá xanh đậm 2 0,1 40 201 5,0 1,4 4,3 " 3 0,3 40 229 5,7 1,6 4,1 " 4 0,5 40 258 6,5 1,7 3,7 " 5 0,7 40 298 7,5 1,8 3,7 Lá xanh nhạt 6 1,0 40 304 7,6 1,9 3,5 " 7 1,3 40 320 8,0 2,1 3,4 " 8 1,5 40 316 7,9 2,2 3,1 Lá xanh vàng 9 1,8 40 324 8,1 3,8 3,0 " 10 2,0 40 370 9,4 3,7 2,8 " Qua bảng số liệu trên ta thấy khi bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy hệ số nhân chồi tăng so với đối chứng và từ công thức 3 với nồng độ BAP là 0,3 trở đi gốc đã có callus. Với các công thức thí nghiệm có nồng độ BAP từ 1,5 – 2,0 đã có hiện tượng mọng nước và callus rất lớn. Như vậy trong tất cả các công thức thí nghiệm ta thấy ở công thức 7 với nộng độ BAP bằng1,3 cho ta hệ số nhân cao: 8,0 lần, số đốt, chồi và chiều cao cây đều tốt. Qua thí nghiệm này cũng thấy rằng so với các thí nghiệm trước đây thì thí nghiệm này cho hiệu qua cao hơn: hệ số nhân là 8 lần so với trước đây là 5,1 lần. Không những thế lại có thể tiết kiệm được hoá chất như: BAP nồng độ 1,3mg/l so với 2mg/l và hàm lượng agar là 80% so với lượng agar cần thiết cho môi trường đặc như trước kia. III.Thí nghiệm vươn chồi Theo phương pháp truyền thống sau khi tạo được một số lượng chồi trong giai đoạn nhân nhanh người ta tiến hành đưa chồi vào môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.Từ một chồi cắt trung bình 3-4 đốt một mẫu cho vào môi trường chính vì thế mà số cây thu được giảm từ 3 đến 4 lần. Để có thể tăng được lượng cây chúng tôi đề xuất thêm một khâu trung gian nữa trong quy trình là tiến hành thí nghiệm vươn chồi. Từ một mẫu chồi chúng tôi tiến hành cắt các đoạn mẫu gồm một đốt mắt, bỏ lá và đặt vào môi trường nuôi cấy với số lượng 20 mẫu/bình. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS bán lỏng có bổ sung BAP với các nồng độ: 0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l Kết quả thí nghiệm thu được sau 20 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 2. Bảng 2: ảnh hưởng của BAP đến vươn chồi của đốt mắt nuôi cấy trong môi trường bán lỏng Nồng độ BAP(mg/l) Mẫu cây Số chồi HSN chồi Số đốt Số đốt/mẫu Chiều cao tb Trạng thái chồi 0 Đ/C 80 88 1,1 228 2,8 3,8 Lá xanh đậm cây cứng cáp 0,1 80 129 1,6 435 3,4 4,1 Lá xanh đậm thân cứng 0,3 80 142 1,8 459 3,2 4,6 Lá xanh đậm thân cứng 0,5 80 122 1,5 422 3,4 4 Lá xanh đậm thân cứng 0,7 80 138 1,7 470 3,4 3,8 Lá xanh đậm thân cứng Qua bảng ta thấy việc bổ xung BAP vào môI trường làm tăng hệ số nhân chồ và số đốt/mẫu. ở nồng độ BAP bằng 0,3 cho hệ số nhân chồi cao nhất: 1,8 lần đồng thời các chỉ tiêu như số đốt, chiều cao, trạng thái mẫu đều tốt cho việc ra rễ ở giai đoạn sau. Khâu vươn chồi này làm tăng hệ số nhân do ta tăng mật độ mẫu cấy (20 mẫu/bình) so với trước kia (10 mẫu/bình), tận dụng được số đốt tức là từ 1 đốt thành 1 chồi thay vì 3 - 4 đốt thành 1 chồi như trước đây. Ngoài ra ở giai đoạn này số chồi cũng tăng 1,8 lần. IV.Tạo cây hoàn chỉnh Quá trình hình thành rễ là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh, có đủ thân. lá và rễ chuẩn bị chuyển qua vườn ươm. Cây con phải khoẻ mạnh nhằm nâng cao được sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được thay thế bằng các chất có kích thích quá trình tạo rễ thuộc nhóm Auxin. Chúng tôi đã tiến hành khâu tạo cây hoàn chỉnh theo hai phương pháp: 1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA trong tạo rễ in vitro Phương pháp tạo rễ in vitro là phương pháp truyền thống trong việc tạo cây hoàn chỉnh. Trong phương pháp này người ta tiến hành cấy chuyển cây từ môi trường nhân chồi sang môi trường tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hoá trước khi được tách khỏi điều kiện in vitro. Môi trường tạo rễ được bổ xung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin. Như chúng ta đã biết các chất kích thích sinh trưởng nhóm Auxin (NAA) đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành rễ của nhiều loại cây cũng như trong nhân giống thực vật in vitro vì NAA có độ bền vững hoá học cao, có tác dụng kích thích mạn. Theo Bhojnani và Razdan (1983) thì NAA ở hàm lượng 0,1 – 1mg/l được dùng phổ biến nhất với mục đích tạo rễ cho chồi in vitro ở đa số các loại cây trồng. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành bổ xung NAA ở các nồng độ: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 vào môi trường MS. Sau 15 ngày theo dõi thu được kết quả như sau: Bảng3: ảnh hưởng của NAA tới sự tạo rễ in vitro Công thức Nồng độ NAA(mg/l) Số chồi cấy Tỷ lệ ra rễ(%) Số rễ/chồi Dài rễ (cm) 1 0 30 50 3,7 6,9 2 0,1 30 66 6,3 5,7 3 0,2 30 100 8,1 5,7 4 0,3 30 100 9,4 5,5 5 0,4 30 100 10,7 5,1 Qua bảng số liệu và biểu đồ trên thấy rằng khi bổ xung NAA vào môi trường nuôi cấy làm tăng tỷ lệ ra rễ so với đối chứng. Tỷ lệ ra rễ đạt 100% ở nồng độ 0,2 mg/l. Nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA cũng không làm cho tỷ lệ tạo rễ thay đổi. Cùng với tỷ lệ ra rễ , tỷ lệ số rễ trên chồi nuôi cấy cũng tăng khi có sự bổ xung NAA. Tuy nhiên khi tăng nồng độ NAA độ dài rễ lại giảm. Như vậy ở nồng độ NAA 0,2mg/l thì sự tạo rễ của chồi thích hợp nhất cho việc đưa cây con ra ngoài vườn ươm do số lượng rễ, độ dài rễ đảm bảo cho cây sống và phát triển trong điều kiện vườn ươm. 2. Ra rễ in vivo Phương pháp ra rễ in vivo là một phương pháp mới nhưng đem lại hiệu quả tương đối tốt. Tuy nhiên ở nước ta phương pháp này chưa được áp dụng nhiều mà các nghiên cứu của ta chủ yếu là cho ra rễ in vitro. Đây là phương pháp tốn kém, khó thao tác trong giai đoạn trồng ra khay. Bằng phương pháp in vivo chúng ta chỉ phải cắt gốc của chồi sau khi vươn rồi nhúng vào dung dịch chất kích thích sinh trưởng và cắm trực tiếp vào giá thể. Như vậy sẽ không cần phải cấy chuyển sang môi trường tạo rễ chính vì thế sẽ tiết kiệm được một lượng hoá chất cũng như kỹ thuật thao tác đơn giản hơn rất nhiều. Bên cạnh đó khi ta cho ra rễ in vivo cây sau khi tạo rễ rất dễ thích ứng với môi trường sống tạo nên khả năng sống rất cao. Từ những ưu điểm trên chúng tôi tiến hành sử lý chồi hông bằng NAA với các nồng độ: 0; 5; 10; 50; 100ppm trên các giá thể: cát; phù sa + cát (tỷ lệ 1:2); phún xuất núi lửa. Sau 10 ngày thu được kết quả như sau: Bảng4: ảnh hưởng của việc sử lý NAA trên giá thể tới ra rễ in vivo Giá thể Nồng độ NAA(ppm) Tỷ lệ ra rễ (%) Tỷ lệ sống (%) Trạng thái rễ CáT 0 (Đ/C) 66/98,1* 66 Rễ dài, trắng 5 100 79 Rễ trung bình, trắng 10 100 87 Rễ dài, trắng 50 100 88 Rễ dài, trắng 100 100 80 Rễdài, trắng Phù sa + Cát (Tỷ lệ1:2) 0 (Đ/C) 74/93,4* 73 Rễ trung bình, lá bé 5 100 99 Rễ dài, lá bé 10 100 98 Rễ dài, lá bé 50 92 98 Rễ dài, lá bé 100 83 77 Rễ dài, lá bé Phún xuất núi lửa 0 (Đ/C) 80 80 Rễ trung bình 5 100 100 Rễ dài 10 100 100 Rễ dài 50 100 100 Rễ dài 100 100 100 Rễ dài * Tỷ lệ ra rễ bằng phương pháp in vitro Như vậy qua bảng trên ta thấy khi xử lý NAA với chồi hông thì tỷ lệ ra rễ cao hơn nhiều so với đối chứng. ở nồng độ NAA bằng 5 ppm cho ta tỷ lệ ra rễ và tỷ lệ sống tốt nhất. Bên cạnh đó giá thể tốt nhất để giâm chồi là giá thể phún xuất núi lửa. Giá thể này có ưu điểm là xốp hơn nên dễ thoát nước và thoáng khí hơn vì vậy cây sống tốt hơn. Việc tìm ra phương pháp ra rễ và tìm được giá thể thích hợp cho cây là rất quan trọng. Trước đây chúng ta chủ yếu tạo rễ in vitro và giá thể là xơ dừa tuy nhiên nếu trồng cây có rễ trên xơ dừa không phải là dễ. Mặt khác giá thể này là hợp chất hữu cơ nên dễ làm cho cây bị nhiễm nấm. Giá thể phún xuất núi lửa là một giá thể có thể đáp ứng được nhu cầu cho trồng cây đồng thời cũng rất dễ sản xuất. Các cây đã được ra rễ thành cây hoàn chỉnh được mang ra trồng vào bầu có giá thể là đất + than bùn + phân chuồng với tỷ lệ 1:1:0,5 để chuẩn bị đem ra sản xuất. Như vậy qua công trình khoa học này chúng tôi đã đề ra được một quy trình nhân giống cây hông cải tiến hơn so với phương pháp truyền thồng. Cụ thể là: Phương pháp truyền thống Phương pháp cải tiến Cây chọn lọc Nuôi cấy in vitro Nhân nhanh Ra rễ in vitro Ra khay Vườn ươm Cây chọn lọc Nuôi cấy in vitro Nhân nhanh Vươn chồi Ra rễ in vivo Vườn ươm T=45 ngày T=45 ngày T=25 ngày Mật độ=10 mẫu/bình T=25 ngày Mật độ=15 mẫu/bình Môi trường bán lỏng T=15 ngày Mật độ=10 mẫu/bình Hệ số =A/3 T=10 ngày T=20 ngày Mật độ=20 mẫu/bình Hệ số =A Môi trường bán lỏng T=10 ngày Giá thể phún xuất núi lửa T tổng cộng = 95 ngày T tổng cộng = 100 ngày Hệ số nhân nhanh = 5,1 Hệ số nhân nhanh = 8 Hệ số ra rễ =A/3 Hệ số ra rễ =A Dễ thao tác, giảm chi phí Phần IV: Kết luận và đề nghị I. Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Viện Di Truyền Nông Nghiệp chúng tôi rút ra những kết luận: Tạo nguồn nuôi cấy bằng nuôi cấy đốt thân chồi non của cây hông chọn lọc 1 - 2 năm tuổi trong môi trường MS (3% succarose + 8g agar) có bổ xung NAA 0,05mg/l và BAP 2mg/l. Môi trường có bổ sung BAP 1,3mg/l trong môi trường bán lỏng rất thích hợp cho việc nhân nhanh chồi hông. Với công thức đó ta thu được hệ số nhân chồi cao (8 lần) so với các thí nghiệm trước đây (5,1lần). Với việc thực hiện thí nghiệm vươn chồi ta thu được số chồi lớn. Đây là một khâu trung gian quan trọng góp phần nâng cao lượng cây từ 3 đến 5 lần so với trước đây . Chúng tôi cũng đã tìm được nồng độ BAP thích hợp cho việc vươn chồi là 0,3mg/l trong môi trường bán lỏng với mật độ nuôi cấy tăng 100% (20 mẫu/bình) Môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,2 mg/l NAA rất thích hợp cho việc ra rễ in vitro. Việc sử lý NAA cho ra rễ in vivo kết hợp với ươm cây trên giá thể phún xuất núi lửa cho tỷ lệ ra rễ và tỷ lệ sống rất cao. Nồng độ NAA thích hợp là 5ppm. Có thể nhân giống cây hông Paulownia Fortunei theo quy trình cảI tiến với hệ số nhân giống cao, đơn giản trong khâu ra rễ, dễ thao tác, tỷ lệ sống cao. II. Đề nghị Đề nghị được tiếp tục nghiên cứu để có thể hoàn thiện quy trình cũng như theo dõi kết quả ngoàithực tiễn ngoài sản xuất đồng thời cũng mong muốn được nghiên cứu thêm về phương pháp chồi bất định và hạt nhân tạo để có thể rút ra phương pháp tối ưu cho việc nhân giống cây hông. Phần V: TàI liệu tham khảo I.TàI liệu trong nước 1. Phạm Hoàng Hộ 1993. Cây cỏ Việt Nam tập 2 phần 2, trang 889 – 990 2. Trần Hợp và Nguyễn Bội Quỳnh, 1993. Cây gỗ kinh tế ở Việt Nam, trang 702, nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 3. Nguyễn Tiến Bân, 1997. Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín. NXBNN. Hà Nội. 532 Tr 4. Nguyễn Nhẫn Hoài và cộng sự 2000. Tái sinh trực tiếp cây hồng bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào. Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 1999-2000, Viện sinh học nhiệt đới trang 56 – 62. 5. Nguyễn Thị Bích Liên 2000. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Phytohoormone lên quá trình vi nhân giống. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học tại chức - Đại học khoa hoc tự nhiên Hà Nội. 6. Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự 2000. Nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố của môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng của cây hông 7. Đoàn Thị ái Thuyền và cộng sự 1999- 2000. Nhân giống Invitro cây hông. Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ, Viện sinh học nhiệt đới trang 45 – 50. 8. Nguyễn Văn Uyển 2000. Nhân nhanh giống hông bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Tạp chí khoa học công nghệ, số 2/2001 trang 16 -19. II. tài liệu nước ngoài 1. Bergmann B.A, Moon H.K, 1997. Invitro adventitious shoot production in paulownia. Plant Cell Rep, 16. 315 – 319. 2. Kirdmanee C, Kitay, Kozai T. 1995. Innvitro cell. Dev. Biol – plant, 31, 144- 149. 3. Kurmar P.P et al. 1998 Influence of petiole and lamina on adventitious shoot innitiation from leaf explants of Paulownia. Plant cell tiss.,. 17, 886 – 890. 4. Marcotrigiano M., Jagannathan L.,. 1986 Phenotypic and Ploi Status ò p. tnentosa Trees regenerated from culture hypocotyls. Plant cell tiss. Org. Cult, 7.pp 227- 236. 5. Marcotrigiano M.,. Jagannathan L.,. 1998. Paulowni tomemtosa Somaclonal Snowstorm. Hortcience, 23 pp 226 – 227. 6. Rao, et al 1996. High frequence adventitious shoot regeneration from excised leaves ò paulownia spp, culture invitro. Plant cell reports 16, 204 – 209. 7. Zhu Z.H., et al. 1986. Paulownia ion China: Cultivation and utilivation.Asian netwotk of Biological Siếnc, Singapore and Internation Development Reseacher Center (Canada), Singapore. Pp 1 – 65.