Luận văn Nguồn gốc, ứng dụng và các phương pháp sản xuất protein y sinh học

LỜI MỞ ĐẦU Cùng với glucid và lipid, protein đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại, sinh trưởng và phát triển của mọi sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã làm sáng tỏ các tính chất, chức năng của protein, từ đó mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi protein trong dinh dưỡng, công nghệ thực phẩm, sản xuất hoá chất, y học, dược phẩm Bản luận văn này sẽ đi vào giới thiệu về nguồn gốc, ứng dụng và các phương pháp sản xuất protein y sinh học. TÓM TẮT LUẬN VĂN Bản luận văn này gồm 5 chương:  Chương 1: Giới thiệu. Nội dung chính của chương 1 gồm có: Khái quát về protein y sinh học và phân loại các dẫn xuất protein y sinh học.  Chương 2: Khả năng ứng dụng của protein y sinh học. Nội dung chính của chương 2 gồm có: Giới thiệu về các ứng dụng của protein y sinh học trong điều trị, chẩn đoán, phân tích, trong thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.  Chương 3: Phương pháp sản xuất protein y sinh học. Nội dung chính của chương 3 gồm có: Phương pháp tổng hợp hoá học, phương pháp sản xuất collagen, phương pháp tái tổ hợp DNA, phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng, phương pháp sản xuất enzyme và một số biện pháp nâng cao chất lượng protein.  Chương 4: Tinh sạch protein y sinh học. Nội dung chính của chương 4 gồm có: Các phương pháp xử lý sơ bộ và tinh sạch protein.  Chương 5: Xử lý và tồn trữ protein y sinh học. Nội dung chính của chương 5 gồm có: Tính ổn định của protein, hoàn nguyên và tồn trữ protein. MỤC LỤC Đề mục Trang Trang bìa i Nhiệm vụ luận văn Nhận xét của giáo viên hướng dẫn Nhận xét của giáo viên phản biện Lời cảm ơn ii Tóm tắt luận văn iii Mục lục iv Danh mục hình viii Danh mục bảng . x LỜI MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU . 2 1.1. KHÁI QUÁT . 2 1.2. PHÂN LOẠI CÁC DẪN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC 2 1.2.1. Theo cấu tạo hoá học . 2 1.2.2. Theo chức năng sinh học . 3 1.2.3. Theo khả năng ứng dụng . 3 CHƯƠNG 2 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA PROTEIN Y SINH HỌC . 4 2.1. TRONG ĐIỀU TRỊ 4 2.1.1. Insulin . 4 2.1.2. Hormone tăng trưởng . 7 2.1.3. Kích tố sinh dục 11 2.1.4. Oxytocin 14 2.1.5. Cytokine 16 2.1.5.1. Các interferon (IFN) . 20 2.1.5.2. Các interleukin (IL) 25 2.1.5.3. Yếu tố hoại tử khối u (TNF) . 27 2.1.5.4. Yếu tố kích thích tạo khuẩn lạc (CSF) .29 2.1.6. Kháng thể . 31 2.1.6.1. Cấu trúc điển hình 32 2.1.6.2. Tính đặc hiệu của phản ứng kháng thể-kháng nguyên . 33 2.1.6.3. Vai trò của kháng thể . 34 2.1.6.4. Các lớp kháng thể (isotype) . 35 2.1.6.5. Sự tổng hợp kháng thể 39 2.1.6.6. Ứng dụng của kháng thể 42 2.1.7. Các chất liên quan đến quá trình đông máu . 45 2.1.7.1. Yếu tố VIII 45 2.1.7.2. Chất hoạt hoá plasminogen tPA . 47 2.2. TRONG CHẨN ĐOÁN . 48 2.2.1. PSA và ung thư tiền liệt tuyến 50 2.2.2 AFP và ung thư gan . 51 2.2.3. hCG và ung thư tinh hoàn 52 2.3. TRONG PHÂN TÍCH . 53 2.3.1. Glucose oxidase . 53 2.3.2. Cholesterol oxidase 56 2.3.3. Alcohol dehydrogenase . 56 2.4. TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG 57 2.5. TRONG MỸ PHẨM 59 2.6. MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC . 60 2.6.1. Kháng thể đơn dòng . 60 2.6.2. Protease 60 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC 62 3.1. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HOÁ HỌC . 62 3.1.1. Bảo vệ nhóm amino . 63 3.1.2. Bảo vệ nhóm carboxyl . 63 3.1.3. Phương pháp tổng hợp peptide pha rắn . 66 3.1.3.1. Giới thiệu 66 3.1.3.2. Nguyên tắc 66 3.1.3.3. Chất mang rắn . 67 3.1.3.4. Ví dụ 68 3.1.4. Phương pháp tổng hợp peptide pha lỏng . 70 3.2. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT COLLAGEN 71 3.3. PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP DNA 72 3.3.1. Thu nhận gene 72 3.3.1.1. Tách các đoạn DNA từ bộ gene . 73 3.3.1.2. Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học . 73 3.3.1.3. Lập ngân hàng c-DNA 73 3.3.2. Vector chuyển gene . 75 3.3.2.1. Plasmid 76 3.3.2.2. Phage 76 3.3.2.3. Plasmid Ti 76 3.3.2.4. Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC . 77 3.3.3. Enzyme cắt restriction endonuclease 78 3.3.4. Tạo plasmid tái tổ hợp . 79 3.3.4.1. Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết 79 3.3.4.2. Phương pháp dùng các đoạn nối 80 3.3.4.3. Phương pháp dùng enzyme terminal transferase 81 3.3.5. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận . 82 3.3.5.1. Hóa biến nạp . 82 3.3.5.2. Điện biến nạp 82 3.3.5.3. Vi tiêm . 83 3.3.5.4. Bắn DNA vào tế bào 83 3.3.6. Hệ thống tế bào nhận . 83 3.3.6.1. Vi khuẩn Escherichia coli 83 3.3.6.2. Nấm men Sacchromyces cerevisiae 84 3.3.6.3. Tế bào thực vật . 85 3.3.6.4. Tế bào động vật 85 3.3.7. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gene 86 3.3.7.1. Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp 86 3.3.7.2. Sự biểu hiện của gene được tạo dòng . 87 3.3.8. Ví dụ . 87 3.3.8.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa cho MPI biểu hiện trong E.coli bằng phương pháp PCR . 89 3.3.8.2. Tạo plasmid tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào E.coli 91 3.3.8.3. Nuôi cấy E.coli biểu hiện MPI bằng hệ thống lên men tự động 92 3.4. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG . 95 3.5. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ENZYME TỪ VI SINH VẬT . 97 3.5.1. Thu nhận enzyme sạch từ phương pháp nuôi cấy bề mặt 99 3.5.1.1. Chiết rút enzyme từ canh trường nuôi cấy bề mặt 99 3.5.1.2. Tinh chế enzyme . 99 3.5.2. Thu nhận enzyme sạch từ phương pháp nuôi cấy bề sâu . 99 3.5.2.1. Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ hoặc muối trung tính . 99 3.5.2.2. Phương pháp hấp phụ hoàn toàn bởi silicagen 100 3.6. NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG PROTEIN . 100 CHƯƠNG 4: TINH SẠCH PROTEIN Y SINH HỌC . 102 4.1. Xử lý sơ bộ để làm tăng nồng độ protein mong muốn 102 4.2. Tinh sạch protein . 103 4.3. Đánh giá kết quả tinh sạch . 105 CHƯƠNG 5: XỬ LÝ VÀ TỒN TRỮ PROTEIN Y SINH HỌC . 107 5.1. Tính ổn định của protein . 107 5.2. Hoàn nguyên và tồn trữ protein .107 KẾT LUẬN 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110

111 trang | Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1842 | Lượt tải: 1

Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nguồn gốc, ứng dụng và các phương pháp sản xuất protein y sinh học, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

å hôïp coù söï oån ñònh laâu daøi.  Traùnh söï thuyû giaûi protein do caùc enzyme cuûa teá baøo. 3.3.8. Ví duï: Naêm 1982, insulin ngöôøi saûn xuaát töø phöông phaùp taùi toå hôïp ñaõ ñöôïc thöông maïi hoùa bôûi taäp ñoaøn Eli Lilly. Phöông phaùp saûn xuaát naøy bieåu hieän chuoãi A vaø chuoãi B rieâng bieät baèng caùch söû duïng hai heä thoáng bieåu hieän Escherichia coli, tinh saïch roài troän hai chuoãi vôùi nhau in vitro taïo caàu noái disulfide nhôø caùc daãn xuaát cuûa S-sulfonate ñeå hình thaønh insulin coù hoaït tính. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø khoâng phaûi söû duïng caùc enzyme ñaét tieàn ñeå loaïi boû ñoaïn peptide C nhöng nhöôïc ñieåm laø hieäu suaát thaáp, ñoä chính xaùc cuûa quaù trình taïo caáu noái S-S khoâng cao, coøn laãn daïng insulin gaáp cuoän khoâng chính xaùc, gaây ñaùp öùng mieãn dòch ñaëc bieät nghieâm troïng cho beänh nhaân khi söû duïng. Do ñoù, Eli Lilly phaùt trieån moät phöông phaùp khaùc caûi tieán hôn, bieåu hieän proinsulin thay vì bieåu hieän hai chuoãi A vaø B rieâng bieät nhö phöông phaùp cuõ, taïo caàu noái disulfide in vitro, sau ñoù phaân caét ñoaïn peptide C khoûi hai ñoaïn A vaø B baèng trypsin vaø carboxypeptidase, taïo thaønh insulin. Moät phöông phaùp khaùc ñöôïc phaùt trieån bôûi taäp ñoaøn Novo Nordisk, bieåu hieän mini-proinsulin bao goàm chuoãi A vaø chuoãi B noái vôùi nhau baèng 2 amino acid, ñöôïc bieåu hieän trong naám men, sau ñoù xöû lí mini-proinsulin in vitro baèng trypsin taïo thaønh insulin. Phöông phaùp naøy coù nhieàu thuaän lôïi nhö caàu noái disulfide ñöôïc hình thaønh trong quaù trình bieåu hieän vaø quaù trình tieát mini-proinsulin, mini-proinsulin naøy ñöôïc chieát taùch vaø tinh saïch deã daøng do ñöôïc tieát thaúng ra moâi tröôøng nuoâi caáy. Hieän taïi, ngöôøi ta vaãn tieáp tuïc phaùt trieån nhöõng phöông phaùp saûn xuaát insulin taùi toå hôïp. Coâng ty Hoechst ñaõ ñöa ra moät phöông phaùp saûn xuaát insulin bao goàm: Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -88- bieåu hieän moät daïng daãn xuaát môùi cuûa insulin hoaëc bieåu hieän preproinsulin trong E.coli; taïo caàu noái disulfide in vitro; sau ñoù xöû lyù baèng lysylendopeptidase hoaëc clostripain/carboxypeptidase; cuoái cuøng taïo ra insulin. Gaàn ñaây, coâng ty Bio-Technology Geneeral ñaõ ñöa ra moät phöông phaùp môùi. Trong phöông phaùp naøy, moät daïng protein dung hôïp bao goàm superoxide dismutase (SOD) gaén vôùi proinsulin ñöôïc bieåu hieän trong teá baøo E.coli. Baèng caùch naøy, hieäu suaát cuûa quaù trình bieåu hieän protein vaø hieäu quaû cuûa quaù trình hình thaønh caùc caàu noái ñöôïc cao hôn. Sau ñoù, proinsulin ñöôïc chuyeån thaønh insulin nhôø xöû lyù vôùi trypsin vaø carboxypeptidase. Baèng nhöõng caùch töông töï nhö theá, ngöôøi ta ñaõ ñöa ra ngaøy caøng nhieàu caùc phöông phaùp saûn xuaát insulin taùi toå hôïp vaø caûi tieán nhieàu hôn ñeå naâng cao hieäu quaû cuûa quaù trình bieåu hieän protein, hình thaønh caàu noái disulfide, chuyeån proinsulin thaønh insulin [20]. Muïc ñích cuûa nhöõng nghieân cöùu, phaùt minh hieän taïi laø muoán phaùt trieån moät heä thoáng bieåu hieän vaø moät phöông phaùp saûn xuaát insulin coù naêng suaát cao, hieäu quaû saûn xuaát phaûi ngang baèng hay vöôït troäi so vôùi nhöõng heä thoáng saûn xuaát insulin tröôùc ñaây. Caùc nghieân cöùu trong giai ñoaïn naøy nhaèm caûi tieán phöông phaùp coå ñieån chuyeån caùc tieàn chaát cuûa insulin thaønh insulin; nghieân cöùu ra moâi tröôøng toái öu cho vieäc hình thaønh caùc caàu noái caàn thieát cho vieäc bieåu hieän hoaït tính cuûa insulin; tìm ra heä thoáng bieåu hieän insulin cho naêng suaát cao, saûn löôïng cao. Sau ñaây xin giôùi thieäu phöông phaùp nuoâi caáy Escherichia coli ñeå toång hôïp mini-proinsulin (MPI) baèng heä thoáng leân men töï ñoäng [14,15,16]. Mini-proinsulin (MPI) coù caáu truùc töông töï vôùi proinsulin, chæ khaùc laø thay theá ñoaïn peptide C töï nhieân cuûa proinsulin goàm 31 amino acid baèng moät ñoaïn peptide ngaén hôn (9 amino acid), giuùp deã daøng cho vieäc tinh cheá vaø gia taêng hieäu quaû gaáp cuoän daãn ñeán taêng hieäu suaát hình thaønh insulin coù hoaït tính hôn moâ hình proinsulin. Ñoaïn peptide C trong MPI laø moät trình töï 9 amino acid bao goàm Arg-Arg, moät trình töï mini: Tyr-Pro-Gly-Asp-Val vaø Lys-Arg. Trong ñoù trình töï mini seõ taïo neân caáu truùc -turn naèm giöõa 2 vò trí amino acid Arg-Arg vaø Lys-Arg, ñöôïc nhaän dieän vaø phaân caét bôûi trypsin cuøng carboxypeptidase. Caáu truùc -turn seõ “gaáp ñoâi” caáu truùc MPI giuùp cho hai chuoãi A vaø B ñöôïc tieáp xuùc vôùi nhau toát hôn neân vieäc hình thaønh caùc caàu noái disulfide cuõng seõ chính xaùc hôn. 3.3.8.1. Toång hôïp gene mpi maõ hoaù cho MPI bieåu hieän trong E.coli baèng phöông phaùp PCR: Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -89- Thoâng thöôøng caùc gene cuûa teá baøo Eukaryote bieåu hieän keùm hieäu quaû trong caùc heä thoáng bieåu hieän ôû vi khuaån (Prokaryote). Moät nguyeân nhaân gaây ra söï bieåu hieän keùm naøy laø do caùc codon treân boä gene cuûa teá baøo Eukaryote khoâng ñöôïc “öa thích” ôû teá baøo vi khuaån. Do ñoù ngöôøi ta thieát keá moät gene toång hôïp ñöôïc duøng ñeå bieåu hieän protein cuûa Eukaryote coù mang caùc codon ñöôïc “öa thích” ôû Prokaryote. Ñieàu naøy ñöôïc thöïc hieän nhanh choùng baèng phöông phaùp PCR hai böôùc (two-step PCR). Trong phöông phaùp naøy, caàn bieát tröôùc trình töï gene caàn toång hôïp, toång hôïp caùc caëp moài coù trình töï töông öùng vôùi gene caàn toång hôïp vaø coù khaû naêng baét caëp vôùi nhau trong khoaûng 10-20 nucleotide (ôû ñaây moài cuõng ñoàng thôøi laø maïch khuoân cho söï khueách ñaïi). Hai phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän lieân tieáp, phaûn öùng thöù nhaát taïo ra DNA baûn maãu ñuùng vôùi gene caàn toång hôïp maø sau ñoù ñöôïc khueách ñaïi trong phaûn öùng thöù hai. Trong tröôøng hôïp gene mpi, döïa vaøo trình töï gene insulin ngöôøi ñöôïc coâng boá treân ngaân haøng gene (GeneBank NM_000207), boä maõ cuûa E. coli, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ thieát keá hai caëp moài Ins1F/Ins2R vaø Ins3F/Ins4R. Phaûn öùng PCR thöù nhaát ñöôïc thöïc hieän rieâng reõ cho töøng caëp moài. Saûn phaåm thu nhaän cuûa moãi phaûn öùng ñöôïc troän chung vôùi nhau theo tæ leä 1:1 ñeå laøm khuoân maãu cho phaûn öùng PCR keá tieáp vôùi caëp moài Ins1F/Ins4R. Saûn phaåm thu ñöôïc cuûa laàn PCR thöù hai chính laø gene mpi. Baûng 3.4. Moài duøng ñeå toång hôïp gene mpi Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -90- Hình 3.11. Sô ñoà minh hoïa vieäc toång hôïp gene mpi baèng phöông phaùp PCR hai böôùc Chuù thích: 1 – Moài Ins1F; 2 – Moài Ins2R; 3 – Moài Ins3F; 4 – Moài Ins4R  Phaûn öùng PCR1: dNTP (2mM moãi loaïi) 10L  Ñeäm PCR (10X) 10L  Moài Ins1F/ Ins3F (100 pmol) 1L  Moài Ins2R/ Ins4R (100 pmol) 1L  Pfu DNA polymerase 2,5U  Nöôùc caát ñuû 100L Saûn phaåm PCR thu ñöôïc töông öùng vôùi moãi caëp moài ñöôïc ñaët teân laø SP12, SP34, ñöôïc tinh cheá qua coät GFX vaø ñöôïc duøng laøm khuoân cho phaûn öùng PCR2.  Phaûn öùng PCR2: dNTP (2mM moãi loaïi) 10L  Ñeäm PCR (10X) 10L  SP12 (100ng/L) 1L  SP34 (100ng/L) 1L  Moài Ins1F (10 pmol) 2L  Moài Ins4R (10 pmol) 2L  Pfu DNA polymerase 2,5U  Nöôùc caát ñuû 100L Saûn phaåm thu ñöôïc töø PCR2 chính laø gene mpi, ñöôïc ñieän di kieåm tra treân gel agarose 1,5% vaø tinh cheá giöõ laïi cho muïc ñích taïo doøng. Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -91- 3.3.8.2. Taïo plasmid taùi toå hôïp, bieán naïp vaøo teá baøo E.coli:  Plasmid pET 43.1.a coù kích thöôùc 7275bp bao goàm trình töï sao cheùp ori, gene khaùng ampicillin, trình töï promoter T7 lac, gene lacIq, vuøng MCS, ñöôïc cung caáp töø coâng ty Novagene. Heä thoáng pET laø heä thoáng taïo doøng vaø bieåu hieän protein taùi toå hôïp raát maïnh trong E.coli.  Moät trong nhöõng chuûng E.coli ñöôïc öùng duïng roäng raõi cho muïc tieâu bieåu hieän caùc protein taùi toå hôïp laø E.coli BL21. Taát caû caùc chuûng E.Coli BL21 ñeàu khoâng coù protease ñöôïc maõ hoaù bôûi gene lon vaø thieáu protease maøng ngoaøi ñöôïc maõ hoaù bôûi gene ompT. Vì vaäy, protein taùi toå hôïp seõ toàn taïi beàn vöõng trong teá baøo BL21 so vôùi nhöõng chuûng chuû khaùc coù nhöõng proteae naøy. E.coli BL21(DE3) laø chuûng chuû E.coli BL21 coù chöùa theå tieàm tan cuûa thöïc khuaån theå DE3 (moät chuyeån theå cuûa thöïc khuaån theå) mang ñoaïn DNA chöùa gene lacI, promoter lacUV5 vaø gene maõ hoaù T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase ñöôïc ñaët döôùi söï kieåm soaùt phieân maõ cuûa promoter lacUV5. Ñaây laø moät promoter ñöôïc caûm öùng bôûi lactose hoaëc thio--D-galactosidase (IPTG). Do vaäy, khi boå dung IPTG vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy, gene maõ hoaù cho T7 RNA polymerase seõ ñöôïc hoaït hoaù, T7 RNA polymerase taïo thaønh xuùc taùc vieäc phieân maõ gene muïc tieâu treân vector bieåu hieän. Chuûng chuû E. coli BL21(DE3) ñöôïc duøng ñeå bieåu hieän gene trong plasmid pET 43.1.a cuõng ñöôïc cung caáp bôûi Novagene.  Caét plasmid pET 43.1.a baèng enzyme caét EcoRV. Thu nhaän plasmid DNA qua gel agarose 0,8% vaø tinh cheá. Ñoaïn DNA cuûa gene mpi thu nhaän ôû treân ñöôïc noái vaøo pET 43.1.a taïo plasmid taùi toå hôïp ñaët teân pET43Ins. Ñieän bieán naïp hoãn hôïp dòch noái vaøo teá baøo E. coli BL21(DE3).  Khi ñoaïn gene maõ hoaù cho MPI ñöôïc cheøn vaøo vuøng MCS cuûa vector pET 43.1.a thì söï bieåu hieän cho gene maõ hoaù cho MPI chòu söï kieåm soaùt cuûa T7 promoter. Promotor naøy seõ hoaït ñoäng khi T7 RNA polymerase cuûa teá baøo chuû E.coliBL21(DE3) baùm vaøo. Treân caùc vector pET 43.1.a cuõng chöùa gene lacI maõ hoaù cho moät protein öùc cheá gaén vaøo vuøng operator lac treân promotor T7, ngaên caûn söï phieân maõ cho ñeán khi coù söï caûm öùng bôûi IPTG. Protein MPI seõ ñöôïc bieåu hieän theo cô cheá kieåm soaùt aâm cuûa heä thoáng operon lac khi chaát caûm öùng IPTG ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. 3.3.8.3. Nuoâi caáy E.coli bieåu hieän MPI baèng heä thoáng leân men töï ñoäng: Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -92- Heä thoáng leân men töï ñoäng BioTron – LiFlusGX 05-08GX-05 laø moät loaïi bioreactor ñöôïc öùng duïng ñeå nuoâi caáy nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau nhö: teá baøo vi sinh vaät, teá baøo thöïc vaät vaø teá baøo ñoäng vaät. Heä thoáng naøy coù theå thöïc hieän caùc kieåu nuoâi caáy nhö: nuoâi caáy meû (batch culture), nuoâi caáy lieân tuïc (continuous culture) vaø nuoâi caáy fed-batch döôùi söï ñieàu khieån cuûa heä vi xöû lyù, coù theå kieåm soaùt vaø ñieàu chænh caùc giaù trò nhieät ñoä, pH, ñoä oxy hoøa tan… trong quaù trình nuoâi caáy. Hình 3.12. Caùc boä phaän chính cuûa heä thoáng leân men töï ñoäng BioTron-LiFlus GX 05-08GX-08 Sô löôïc moät quy trình leân men mini-proinsulin trong moâi tröôøng loûng hieáu khí- coù khuaáy troän, coù kieåm soaùt bao goàm caùc böôùc sau:  Chuaån bò gioáng, moâi tröôøng vaø thieát bò leân men.  Leân men.  Ly taâm thu dòch nuoâi caáy.  Tinh saïch mini-proinsulin baèng ñieän di mao quaûn. 3.3.8.3.1. Chuaån bò gioáng:  Giöõ gioáng: Ñaây laø böôùc quan troïng trong hoaït ñoäng vaän haønh moät heä thoáng leân men. Giöõ gioáng phaûi baûo ñaûm moät soá yeâu caàu sau nhö: duy trì hoaït tính gioáng trong thôøi gian daøi (khoâng xaûy ra hieän töôïng thoaùi hoùa, khoâng laøm giaûm khaû naêng taêng tröôûng vaø naêng löïc saûn xuaát cuûa gioáng) vaø khoâng bò taïp nhieãm.  Caáy chuyeàn: Böôùc naøy nhaèm hoaït hoùa gioáng sau thôøi gian caát giöõ ôû nhieät ñoä thaáp, tröôùc khi ñöa vaøo caùc böôùc nhaân gioáng. Caáy chuyeàn thöôøng ñöôïc thöïc hieän treân moâi tröôøng thaïch nghieâng, uû trong tuû aám ôû nhieät ñoä thích hôïp ñeán khi vi sinh vaät phaùt trieån thaønh moät lôùp treân maët thaïch. Moâi tröôøng nuoâi caáy trong giai ñoaïn naøy phaûi Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -93- baûo ñaûm caùc yeáu dinh döôõng caàn thieát, ñieàu kieän nuoâi caáy nhö nhieät ñoä, ñoä pH, ñoä thoaùng khí phaûi ñaït giaù trò toái öu cho chuûng.  Nhaân gioáng: Muïc ñích cuûa nhaân gioáng laø taïo moät löôïng sinh khoái ñuû lôùn ñeå ñöa vaøo qui trình saûn xuaát. Quaù trình nhaân gioáng thöôøng döøng laïi ôû giai ñoaïn cuoái cuûa log phase, khi ñoù hoaït tính cuûa gioáng laø maïnh nhaát. Quaù trình nhaân gioáng thöôøng chia thaønh hai giai ñoaïn:  Nhaân gioáng caáp 1: Thöôøng laø thoâng qua hoaït ñoäng nuoâi caáy laéc trong bình tam giaùc. Nhaân gioáng caáp 1 vôùi muïc ñích laø taêng sinh khoái vaø ñaùnh giaù chuûng tröôùc khi ñöa vaøo thöïc teá saûn xuaát.  Nhaân gioáng caáp 2: Thöïc hieän trong noài caáy maàm vôùi theå tích baèng khoaûng 1020% theå tích noài leân men chính. Giai ñoaïn naøy cung caáp ñaày ñuû caùc ñieàu kieän toái öu nhaát (thaønh phaàn dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoái caáy, pH, nhieät ñoä, …) ñeå taêng tröôûng ñaït µmax. 3.3.8.3.2. Chuaån bò moâi tröôøng vaø thieát bò leân men  Thieát keá moâi tröôøng nuoâi caáy: Tuøy theo chuûng vi sinh vaät vaø phöông phaùp leân men maø choïn moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp. Vieâc thieát keá thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät phaûi ñaûm baûo ñuû löôïng ñeå phuïc vuï cho vieäc taêng sinh khoái, taïo caùc chaát trao ñoåi vaø cung caáp naêng löôïng cho vieäc duy trì teá baøo vaø söï sinh toång hôïp. Caên cöù vaøo thaønh phaàn vaø haøm löôïng caùc chaát trong teá baøo maø thieát keá ñuû thaønh phaàn vaø löôïng caàn thieát nhaèm thu nhaän ñöôïc sinh khoái theo yeâu caàu vaø ñaûm baûo saûn xuaát. Thaønh phaàn moâi tröôøng duøng nuoâi caáy E.coli ñeå saûn xuaát MPI theo kieåu leân men fed-batch: 1,5g (NH4)2SO4, 211g cao naám men, 5g MgSO4.7H2O vaø 274g glucose.  Thanh truøng moâi tröôøng vaø thieát bò: Muïc ñích cuûa thanh truøng moâi tröôøng vaø thieát bò leân men laø loaïi boû caùc yeáu toá gaây taïp nhieãm sinh hoïc (nhö naám moác, naám men, vi khuaån, phage). 3.3.8.3.3. Leân men Trong quaù trình tieán haønh nuoâi caáy E.coli ñeå saûn xuaát MPI taùi toå hôïp chuùng ta caàn kieåm soaùt chaët cheõ caùc thoâng soá sau:  Kieåm soaùt toác ñoä naïp lieäu trong quaù trình leân men: Quaù trình leân men saûn xuaát MPI taùi toå hôïp ñöôïc tieán haønh theo kieåu leân men fed-batch do vaäy kieåm soaùt toác ñoä naïp lieäu trong quaù trình leân men laø moät trong Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -94- nhöõng vaán ñeà quan troïng. Toác ñoä naïp lieäu caàn ñöôïc kieåm soaùt sao cho haøm löôïng dinh döôõng cuûa caùc chaát trong moâi tröôøng leân men khoâng quaù thöøa hoaëc quaù thieáu, ñaëc bieät laø caùc cô chaát giôùi haïn vaø phaûi luoân baûo ñaûm moät soá yeáu toá caên baûn sau:  Chæ naïp theo yeâu caàu söû duïng cuûa chuûng, khoâng naïp quaù daãn ñeán vieäc thieáu oxy cung caáp.  Khoâng naïp thieáu laøm haïn cheá toác ñoä taêng tröôûng vaø toác ñoä saûn xuaát cuûa chuûng.  Kieåm soaùt taêng tröôûng teá baøo: Laø hoaït ñoäng nhaèm haïn cheá söï taêng tröôûng cuûa chuûng trong nhöõng giai ñoaïn caàn thieát cuûa quaù trình. Trong thöïc teá, ngöôøi ta thöôøng söû duïng caùc phöông phaùp theo doõi taêng tröôûng nhö ñeám teá baøo, phaân tích troïng löôïng teá baøo khoâ (DCW) hay thoâng qua maùy ño quang phoå (OD). Ñoä haáp thu cuûa aùnh saùng ôû böôùc soùng 600nm (OD600) phaûn aùnh maät ñoä teá baøo vi khuaån E.coli trong dòch leân men. Neáu maät ñoä teá baøo vi khuaån E.coli cao thì OD600 cao. Do ñoù coù theå ño OD600 ñeå xaùc ñònh maät ñoä teá baøo E.coli. Kieåm soaùt taêng tröôûng teá baøo baèng caùch: boå sung caùc chaát öùc cheá taêng tröôûng (Tween 40, 60, penicilin), thay ñoåi yeáu toá sinh lyù (nhieät ñoä), haïn cheá haøm löôïng cô chaát giôùi haïn.  Kieåm soaùt pH: Vi sinh vaät noùi chung vaø E.coli noùi rieâng raát nhaïy caûm vôùi söï thay ñoåi pH cuûa moâi tröôøng. Khi teá baøo sinh tröôûng, nhöõng saûn phaåm trao ñoåi chaát ñöôïc phoùng thích vaøo moâi tröôøng, trong ñoù coù nhöõng chaát laøm thay ñoåi pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy. Do ñoù, pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy phaûi ñöôïc ño vaø ñieàu chænh baèng caùch theâm acid hoaëc base ñeå duy trì pH thích hôïp nhaèm baûo ñaûm pH sinh lyù cuûa teá baøo trong quaù trình phaùt trieån vaø sinh toång hôïp caùc chaát. Ñoái vôùi leân men saûn xuaát protein taùi toå hôïp söû duïng E.coli laøm teá baøo chuû, caàn phaûi kieåm soaùt pH töø 7,0 0,2 vaø noàng ñoä acid acetic khoâng ñöôïc lôùn hôn 0,9gL-1 . Taùc nhaân duøng ñeå chænh pH laø acid (H2SO4, HCl, …) hoaëc base (NaOH, KOH, NH3, urea, …). Trong qui trình leân men MPI baèng heä thoáng leân men töï ñoäng BioTron – LiFlusGX 05-08GX-05 thì giaù trò pH ñöôïc kieåm soaùt töï ñoäng. Heä thoáng naøy bao goàm:  Ñieän cöïc ño pH (electrode) gaén tröïc tieáp vaøo boàn leân men trong quaù trình nuoâi caáy.  Heä thoáng trung chuyeån vaø khuyeách ñaïi tín hieäu (transmiter). Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -95-  Heä thoáng ñieàu khieån (controller): cho pheùp caøi ñaët giaù trò pH caàn kieåm soaùt, hieån thò giaù trò pH hieän taïi ôû trong boàn leân men, so saùnh söï cheânh leäch naøy vaø ñöa tín hieäu ñieàu khieån ñeå môû hay ñoùng van naïp taùc nhaân (H+, OH-) hieäu chænh pH vaøo.  Van töï ñoäng (control valve): cho pheùp naïp hay ngaét taùc nhaân chænh pH vaøo boàn leân men.  Kieåm soaùt nhieät ñoä: Nhieät ñoä nuoâi caáy aûnh höôûng ñeán taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät vaø hình thaønh saûn phaåm. E.coli coù nhieät ñoä taêng tröôûng toái öu ôû 37oC. Trong nuoâi caáy caàn ñaûm baûo nhieät ñoä toái öu cuûa chuûng, tuy nhieân trong töøng giai ñoaïn, nhieät ñoä coù theå thay ñoåi trong giôùi haïn cho pheùp. Trong thöïc teá, ngöôøi ta thöôøng duøng nöôùc laïnh (5-27oC) ñeå giaûi nhieät. Thieát bò trao ñoåi nhieät coù theå laø daïng oáng ñaët trong noài leân men.  Kieåm soaùt haøm löôïng oxy hoaø tan trong moâi tröôøng leân men: E.coli laø vi khuaån hieáu khí tuøy tieän nhöng trong nuoâi caáy E.coli ñeå saûn xuaát MPI taùi toå hôïp thì caàn cung caáp oxy trong caû quaù trình. Haøm löôïng oxy caàn ñöôïc duy trì lôùn hôn 30% khoâng khí baõo hoaø. Oxy ñöôïc cung caáp baèng caùch khuaáy troän. 3.3.8.3.4. Ly taâm thu dòch nuoâi caáy Dòch sau nuoâi caáy, tieán haønh ñem li taâm thu sinh khoái, boû dòch noåi. Sinh khoái sau li taâm ñöôïc tinh saïch, thu mini-proinsulin baèng phöông phaùp ñieän di mao quaûn. 3.4. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT KHAÙNG THEÅ ÑÔN DOØNG: Naêm 1975, kó thuaät taïo khaùng theå ñôn doøng hybridoma ra ñôøi ñaõ taïo neân moät cuoäc caùch maïng trong vieäc saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng. Phöông phaùp naøy ñöôïc tieán haønh nhö sau:  Tieâm khaùng nguyeân vaøo chuoät. Taùch teá baøo laù laùch chuoät (laø nôi khaùng theå ñöôïc taïo thaønh) troän vôùi teá baøo myeloma (teá baøo baïch caàu ung thö). Boå sung polyethylene glycol vaøo dòch huyeàn phuø chöùa hoãn hôïp 2 loaïi teá baøo treân. Hoãn hôïp nuoâi caáy taïo ra teá baøo lai.  Nuoâi hoãn hôïp treân trong moâi tröôøng choïn loïc chöùa HAT (moät hoãn hôïp cuûa hypoxanthine, amionpterin vaø thymidine). Teá baøo laù laùch chuoät (khaùng ñöôïc HAT) seõ phaùt trieån bình thöôøng trong moät thôøi gian, coøn teá baøo myeloma (khoâng khaùng ñöôïc HAT) seõ cheát ngay. Teá baøo lai phaùt trieån bình thöôøng do coù 2 ñaëc ñieåm: phaân chia voâ haïn (nhaän ñöôïc töø teá baøo myeloma) vaø coù caùc chaát trao ñoåi caàn thieát (nhaän ñöôïc töø teá baøo laù laùch chuoät). Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -96-  Thu nhaän teá baøo lai noåi treân beà maët moâi tröôøng. Tieán haønh taïo doøng ôû qui moâ in vitro hoaëc tieâm teá baøo lai vaøo khoang buïng cuûa chuoät. Chuoät seõ saûn xuaát ra nhöõng khoái u coù chöùa chaát dòch giaøu khaùng theå. Ngaøy nay, beân caïnh söï phaùt trieån cuûa coâng ngheä di truyeàn, con ngöôøi vaãn söû duïng phöông phaùp naøy ñeå saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng. Hình 3.13. Sô ñoà kó thuaät taïo khaùng theå ñôn doøng hybridoma  Ví duï: Saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng ñaëc hieäu vôùi-glytamyl transpeptidase. -glytamyl transpeptidase (EC 2.3.2.2) laø enzyme xuùc taùc cho söï thuyû phaân vaø chuyeån vò cuûa nhoùm -glytamyl. Noù coù lieân quan ñeán quaù trình khöû ñoäc ôû maøng teá baøo, söï vaän chuyeån amino acid, peptide ôû gan vaø söï hình thaønh ammoniac ôû thaän. Ñeå ñònh löôïng enzyme naøy, ngöôøi ta söû duïng khaùng theå ñôn doøng ñaëc hieäu vôùi - glytamyl transpeptidase trong phöông phaùp ELISA [17]. Caùc böôùc tieán haønh:  Taùch enzyme töø thaän cuûa töû thi, sau ñoù hoaø tan trong papain, xöû lyù baèng dung dòch ammonium sulfate 60%, tinh saïch baèng phöông phaùp saéc kyù coät haáp phuï (chaát haáp phuï laø Sephadex G-150). Enzyme thu nhaän sau cuøng ñöôïc duøng laøm khaùng nguyeân trong phöông phaùp hybridoma. Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -97-  Trong tuaàn ñaàu tieân, moãi con chuoät ñöïc ñöôïc tieâm vaøo döôùi da vaø gan baøn chaân 100g khaùng nguyeân cuøng vôùi 1 löôïng thích taù döôïc Freund thích hôïp (taù döôïc Freund laø moät heä nhuõ töông trong daàu thoâ taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï hình thaønh khaùng theå, coù chöùa Mycobacterium tuberculosis ñaõ voâ hoaït vaø saáy khoâ). Sau ñoù, chuùng tieáp tuïc ñöôïc tieâm 3 laàn trong 2 tuaàn tieáp theo, moãi laàn tieâm 60 g khaùng nguyeân vaø taù döôïc. Laàn tieâm cuoái cuøng seõ thöïc hieän 3 ngaøy tröôùc khi tieán haønh taùch teá baøo laù laùch.  Troän 4x108 teá baøo laù laùch chuoät vaø 8x107 teá baøo myeloma, boå sung theâm PEG. Tieán haønh nuoâi caáy treân moâi tröôøng DMEM (1 loaïi moâi tröôøng coù chöùa glucose, muoái KCl, NaCl, MgSO4, vitamin B2, B3, B9 vaø moät soá amino acid) coù boå sung 20% huyeát thanh baøo thai beâ vaø HAT (100M hypoxanthine, 400M aminopterin vaø 16M thymidine). Sau moät thôøi gian tieán haønh thu nhaän teá baøo lai noåi leân treân beà maët moâi tröôøng roài taïo doøng. Nhaân teá baøo lai seõ saûn xuaát ra khaùng theå ñôn doøng ñaëc hieäu vôùi-glytamyl transpeptidase. 3.5. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT ENZYME TÖØ VI SINH VAÄT: Coù 2 phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät ñeå thu nhaän enzyme [7]:  Nuoâi caáy beà maët: moâi tröôøng nuoâi caáy coù cô chaát chuû yeáu laø caùm mì, caùm gaïo, boät ñaäu, boät ngoâ, boät saén… ñaõ ñöôïc haáp chín vaø laøm aåm, phoái troän theâm traáu, muøn cöa ñeå taêng ñoä xoáp. Trong nhieàu tröôøng hôïp, ngoaøi moâi tröôøng baùn raén, ngöôøi ta coøn söû duïng moâi tröôøng loûng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät (chuû yeáu laø naám moác) theo phöông phaùp beà maët.  Nuoâi caáy beà saâu: moâi tröôøng nuoâi caáy laø moâi tröôøng loûng. Thaønh phaàn dinh döôõng cho caùc loaïi vi sinh vaät khaùc nhau seõ khaùc nhau, thöôøng chöùa tinh boät, caùc daïng boät vaø moät soá vaät lieäu khaùc laøm nguoàn carbon. Nguoàn nitô ñöôïc cung caáp bôûi nöôùc chieát ngoâ, nöôùc chieát malt, dòch töï phaân naám men. Thaønh phaàn khoaùng cuûa moâi tröôøng cuõng coù yù nghóa quan troïng trong vieäc taïo ra enzyme mong muoán. Baûng 3.5. So saùnh ñaëc ñieåm cô baûn cuûa 2 phöông phaùp nuoâi caáy Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -98- STT Ñaëc ñieåm kó thuaät Nuoâi caáy beà maët Nuoâi caáy beà saâu 1 Nhu caàu oxi Caàn oxi trong quaù trình nuoâi caáy. Caàn oxi trong quaù trình nuoâi caáy. 2 Nhu caàu khuaáy troän moâi tröôøng Khoâng caàn. Caàn khuaáy troän ñeå ñaûo troän moâi tröôøng vaø taêng khaû naêng hoaø tan cuûa oxi. 3 Söï thay ñoåi pH pH ban ñaàu raát coù yù nghóa trong quaù trình leân men. pH chæ thay ñoåi cuïc boä do moâi tröôøng khoâng bò ñaûo troän. Khoâng coù khaû naêng ñieàu chænh pH. pH ban ñaàu ít coù aûnh höôûng vì pH thay ñoåi raát nhanh vaø ñeàu khaép trong loøng moâi tröôøng. Coù khaû naêng ñieàu chænh pH. 4 Nöôùc trong moâi tröôøng 58-60% 100% 5 Nhieät ñoä leân men Toái öu 28-32oC. Nhieät ñoä taêng trong quaù trình leân men neân caàn tieán haønh ñieàu hoaø nhieät ñoä. Toái öu 28-32oC. Trong quaù trình leân men, khaû naêng taêng nhieät chaäm do söï ñieàu hoaø bôûi löôïng khi cung caáp vaøo moâi tröôøng lieân tuïc. 6 Thôøi gian nuoâi caáy 32-72 giôø 48-96 giôø 7 Voâ truøng moâi tröôøng Khoâng caàn voâ truøng tuyeät ñoái. Voâ truøng tuyeät ñoái. 8 Khaû naêng cô giôùi hoaù, töï ñoäng hoaù Thaáp Cao 9 Khaû naêng sinh toång hôïp enzyme Cao Thaáp 10 Khaû naêng thu nhaän cheá phaåm Deã thu nhaän, deã laøm khoâ ñeå baûo quaûn, chi phí tinh cheá thaáp. Thu nhaän khoù, baûo quaûn khoù, chi phí tinh cheá cao. 11 Chi phí nuoâi Thaáp vì tieâu toán ít ñieän Cao vì tieâu toán nhieàu ñieän Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -99- caáy naêng. naêng vaø thieát bò. 12 Dieän tích xaây döïng Dieän tích lôùn. Dieän tích nhoû. 3.5.1. Thu nhaän enzyme saïch töø phöông phaùp nuoâi caáy beà maët: 3.5.1.1. Chieát ruùt enzyme töø canh tröôøng nuoâi caáy beà maët:  Phöông phaùp thuû coâng: cheá phaåm enzyme thoâ ñöôïc nghieàn nhoû baèng coái vôùi caùt thaïch anh hay boät thuyû tinh sau khi ñöôïc xöû lyù saïch hoaëc baèng maùy nghieàn. Muïc ñích cuûa quaù trình naøy laø laøm taêng khaû naêng thu nhaän enzyme trong dòch chieát töø teá baøo vi sinh vaät. Dòch chieát thu ñöôïc töø phöông phaùp naøy raát ñuïc do chöùa nhieàu chaát khaùc nhau.  Phöông phaùp chieát ruùt baèng thieát bò khueách taùn: enzyme ñöôïc chuyeån töø teá baøo vaøo nöôùc do söï cheânh leäch noàng ñoä enzyme. Caùc thieát bò khueách taùn ñöôïc ñaët noái tieáp nhau. Trong quaù trình khueách taùn, nhieät ñoä duy trì ôû 25-28oC, cho theâm focmalin ñeå traùnh nhieãm truøng. Dòch chieát enzyme ñöôïc coâ ñaëc döôùi aùp suaát thaáp trong chaân khoâng ñeå haøm löôïng chaát khoâ khoâng ít hôn 50-55%. 3.5.1.2. Tinh cheá enzyme:  Phöông phaùp keát tuûa baèng dung moâi höõu cô: thöôøng duøng caùc dung moâi höõu cô nhö etanol, izopropanol, acetone , cho theâm 0,2% CaCl2 ñeå laøm taêng khaû naêng keát tuûa cuûa enzyme vaø laøm beàn caáu truùc cuûa chuùng. Khi caàn taùch rieâng bieät moät enzyme naøo ñoù ra khoûi hoãn hôïp enzyme keát tuûa treân, ta seõ döïa vaøo ñoä hoaø tan khaùc nhau trong hoãn hôïp etanol vaø caùc enzyme ñoù ñeå taùch.  Phöông phaùp keát tuûa baèng muoái trung tính: thöôøng duøng sulfat amon, sulfat natri, sulfat magie. Toát nhaát laø duøng sulfat amon vì ñoä hoaø tan cao, phaûn öùng keát tuûa khoâng phuï thuoäc nhieät ñoä, khoâng laøm bieán tính enzyme, keát tuûa enzyme thu ñöôïc coù hoaït tính cao hôn so vôùi phöông phaùp duøng dung moâi höõu cô. 3.5.2. Thu nhaän enzyme saïch töø phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu: 3.5.2.1. Phöông phaùp keát tuûa enzyme baèng dung moâi höõu cô hoaëc muoái trung tính: Dung dòch leân men töø phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu, sau khi taùch sinh khoái vi sinh vaät coù haøm löôïng chaát khoâ raát thaáp (khoaûng 1-3%). Do ñoù ñeå giaûm chi phí dung moâi hoaëc muoái trung tính trong quaù trình keát tuûa, ta phaûi coâ ñaëc chaân khoâng dòch naøy ôû nhieät ñoä thaáp. Thao taùc töông töï nhö thu nhaän enzyme töø phöông phaùp nuoâi caáy beà maët. 3.5.2.2. Phöông phaùp haáp phuï hoaøn toaøn bôûi silicagen: Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -100- Ñöôïc thöïc hieän ôû pH 4,7-4,9. Cho dòch enzyme chaûy qua coät naïp ñaày silicagen. Ñeå taêng quaù trình haáp phuï coù theå cho theâm 6-20% NaCl. 3.6. NAÂNG CAO CHAÁT LÖÔÏNG PROTEIN: Moät trong nhöõng thaønh quaû quan troïng cuûa kó thuaät taùi toå hôïp DNA laø söû duïng ñoät bieán ñieåm ñònh höôùng (site-directed mutagenesis) thay theá caùc amino acid then choát ñeå naâng cao chaát löôïng protein. Ñeå choïn ñuùng ñieåm thay theá, söï can thieäp cuûa ñieän toaùn laø khoâng theå thieáu, daãn ñeán caùc thí nghieäm in silico (thí nghieäm treân maùy ñieän toaùn) maø ñeán nay ñaõ phaùt trieån thaønh chuyeân ngaønh môùi laø tin-sinh hoïc (bioinformatics) [8]. Ví duï ñieån hình laø bieän phaùp thay ñoåi tính oån ñònh vaø ñaëc hieäu cuûa t-PA (Tissue Plasminogen Activator). t-PA ñöôïc öùng duïng laøm tan cuïc maùu ñoâng. Tuy nhieân, noù deã daøng bò thaûi ra khoûi doøng maùu neân phaûi taêng noàng ñoä ban ñaàu trong xöû lyù, maø ñieàu naøy coù theå gaây thöông toån. Do vaäy t-PA môùi ra ñôøi vôùi thieát keá nhö sau:  Thay threonine 103 baèng asparagine laøm taêng tính beàn vöõng leân gaáp 10 laàn trong doøng maùu.  Thay ñoaïn amino acid 296-299 töø lysine-histidine-arginine-arginine thaønh alanine-alanine-alanine-alanine laøm enzyme coù tính ñaëc hieäu cao hôn vôùi fibrin cuûa cuïc maùu.  Thay asparagine 117 laøm hoài phuïc hoaït tính phaân huyû fibrin nhö enzyme töï nhieân. Söï toå hôïp cuûa caû 3 ñoät bieán ñieåm treân taïo ra t-PA môùi coù ñoàng thôøi 3 hoaït tính. Ngoaøi ra coù theå naâng cao chaát löôïng protein baèng caùch caûi tieán caáu taïo phaân töû. Tröôøng hôïp tieâu bieåu laø interferon alfa. Gioáng nhö nhieàu loaïi protein laï khaùc, interferon alfa nhanh choùng bò thoaùi hoaù khi tieâm vaøo cô theå. Haäu quaû laø noù chæ toàn taïi trong heä tuaàn hoaøn moät thôøi gian ngaén, nhö vaäy chuùng ta caàn tieâm nhieàu laàn trong tuaàn nhaèm duy trì taùc duïng cuûa thuoác. Bieän phaùp naøy taïo ra noàng ñoä interferon alfa trong maùu cao ngay sau khi tieâm – gaén lieàn vôùi vieäc taêng caùc taùc duïng phuï - vaø caùc möùc noàng ñoä thaáp trong khoaûng thôøi gian giöõa caùc laàn tieâm – gaén lieàn vôùi hieäu quaû ñieàu trò bò giaûm suùt. Baèng caùch gaén theâm nhaùnh PEG, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ giaûi quyeát ñöôïc khoù khaên treân [18]. PEG (polyethylene glycol) laø moät polymer trô, hoaø tan trong nöôùc, khoâng gaây ñoäc, ñöôïc taïo ra baèng caùch keát noái nhieàu tieåu ñôn vò ethylene oxide. Khi gaén keát PEG vaøo protein coù taùc duïng ñieàu trò, noù laøm taêng khaû naêng hoaø tan trong Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC -101- nöôùc, baûo veä phaân töû protein vaø khoâng sinh mieãn dòch. Phaàn taän cuøng cuûa phaân töû PEG thöôøng laø nhoùm hydroxyl –OH. Ñeå traùnh keát dính cheùo vaø keát tuï, ta bieán ñoåi 1 nhoùm hydroxyl taän cuøng thaønh methoxy khoâng phaûn öùng, taïo neân monomethoxy PEG (mPEG). 2 nhaùnh mPEG coù phaân töû löôïng 20 kilodalton sau khi ñöôïc hoaït hoaù baèng hydroxyl succinimide seõ keát dính vaøo interferon alfa thoâng qua töông taùc vôùi amino acid lysine, taïo ra loaïi thuoác môùi PEG interferon alfa 40KD coù hieäu quaû ñieàu trò vieâm gan C cao hôn haún. Hình 3.14. Sô ñoà caáu taïo PEG interferon alfa 40 KD Böôùc vaøo theá kæ XXI, vôùi söï phaùt trieån maïnh meõ cuûa khoa hoïc kó thuaät, coâng ngheä cheá taïo protein döïa treân neàn taûng Genomics, Proteomics, coâng ngheä RNA, Bioinformatics ñang taïo ra theá heä protein thöù hai, ñoù laø caùc protein ñöôïc bieán ñoåi nhaèm caûi tieán caáu truùc, söï oån ñònh vaø caùc ñaëc tính sinh hoïc coù lôïi ñeå naâng cao hieäu quaû söû duïng, ñaùp öùng toát hôn nhu caàu cuûa con ngöôøi. Chöông 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC -102- CHÖÔNG 4 : TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC Ñeå thöïc hieän baát cöù quaù trình taùch thu nhaän cheá phaåm naøo thì vieäc nghieân cöùu vieäc tinh saïch ôû möùc ñoä phaân tích luoân laø böôùc ñaàu tieân, noù duøng ñeå toái öu hoùa quaù trình taùch thu nhaän cheá phaåm. Duø protein ñöôïc taïo baèng phöông phaùp naøo thì noù cuõng coù laãn taïp chaát. Muoán saûn phaåm coù haøm löôïng protein cao, ta phaûi traûi qua quaù trình tinh saïch. Ta coù theå chia laøm 2 möùc ñoä tinh saïch:  Möùc ñoä phaân tích (analytical level): duøng ñeå phaân tích ñònh tính, ñònh löôïng caùc caáu töû trong maãu.  Möùc ñoä taùch cheá phaåm (preparative level): duøng ñeå taùch, laøm saïch vaø thu nhaän caùc caáu töû. Haàu heát vieäc tinh saïch protein hay peptide lieân quan tôùi raát nhieàu giai ñoaïn. Ñaàu tieân, thoâng thöôøng ngöôøi ta seõ taùch choïn loïc baèng phöông phaùp keát tuûa, sieâu loïc, saéc kyù hoaëc trích ly pha raén ñeå coù ñöôïc moät hoãn hôïp (giaøu protein mong muoán hôn ban ñaàu). Hoãn hôïp naøy sau ñoù seõ tieáp tuïc ñöôïc tinh saïch ôû möùc ñoä cao hôn (thöôøng söû duïng phöông phaùp RP-HPLC) ñeå coù ñöôïc protein mong muoán. 4.1. XÖÛ LYÙ SÔ BOÄ ÑEÅ LAØM TAÊNG NOÀNG ÑOÄ PROTEIN MONG MUOÁN: Töø hoãn hôïp protein ban ñaàu khoâng theå taùch laáy ngay moät protein cuï theå naøo ñoù maø caàn phaûi qua vaøi böôùc xöû lyù ban ñaàu ñeå laøm taêng daàn noàng ñoä protein mong muoán, hay laøm giaûm löôïng taïp chaát.  Keát tuûa: vieäc keát tuûa caùc peptide lôùn vaø protein ñöôïc thöïc hieän vôùi dung moâi höõu cô (methanol, ethanol hay acetone) hoaëc acid (trichloroacetic acid), hoaëc muoái noàng ñoä cao (ví duï ammonium sulphate, muoái naøy coù theå keát tuûa ñöôïc nhieàu protein maø khoâng laø aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa chuùng), hoaëc bôûi ñieàu chænh pH ñeán ñieåm ñaúng ñieän. Phöông phaùp naøy ñôn giaûn vaø hieäu quaû, tuy nhieân noù seõ gaëp nhieàu khoù khaên ñoái vôùi nhöõng peptide khoù keát tuûa (nhöõng peptide nhoû töø pentapeptide trôû xuoáng)  Phöông phaùp sieâu loïc: duøng nhöõng maøng loïc coù loã loïc raát nhoû, coù theå duøng laøm taêng noàng ñoä dung dòch peptide vaø protein, khoù coù khaû naêng taùch 1 peptide hay 1 protein cuï theå naøo ñoù.  Phöông phaùp saéc kyù baûn moûng (Thin-Layer Chromatography): laø kyõ thuaät taùch peptide ñôn giaûn nhaát, noù thöôøng ñöôïc noái tieáp baèng phöông phaùp ñieän di. Chöông 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC -103- Trong tröôøng hôïp coù nhieàu taïp chaát trong hoãn hôïp thì noù caàn phaûi ñöôïc xöû lyù theâm.  Saéc kyù trao ñoåi ion (Ion-Exchange Chromatography: IEC): thöôøng duøng ñeå tinh saïch protein. Coù theå coi ñaây laø 1 daïng ñaëc bieät cuûa saéc kyù haáp phuï maø trong ñoù caùc caáu töû maãu mang ñieän coù khaû naêng töông taùc tónh ñieän 1 caùch thuaän nghòch vôùi pha tónh laø caùc haït nhöïa mang ñieän traùi daáu, coøn pha ñoäng laø caùc dung dòch ñieän ly. Löïc lieân keát phuï thuoäc vaøo baùn kính ion vaø maät ñoä ion cuûa pha tónh (soá ñieän tích treân 1 ñôn vò theå tích phaân töû). Phöông phaùp naøy coù tieàm naêng trong vieäc öùng duïng ôû quy moâ lôùn. Trong tröôøng hôïp muoán coùù dung dòch cuûa protein noäi baøo thì tröôùc tieân teá baøo phaûi ñöôïc phaù vôõ ñeå laøm thoaùt dòch beân trong. Nhöõng phaàn khoâng tan, bao goàm caû membrane, coù theå ñöôïc loaïi boû baèng quaù trình ly taâm hoaëc baèng caùc phöông phaùp khaùc. Protein hoøa tan coù theå ñöôïc taùch ra vaø tinh saïch töø dung dòch thoâ naøy. Quaù trình giaûi laáy nhöõng protein lieân keát vôùi membrane ñoâi khi coù theå thöïc hieän baèng caùc chaát taåy röûa. 4.2. TINH SAÏCH PROTEIN: Sau khi xöû lyù sô boä, hoãn hôïp ban ñaàu seõ ñöôïc xöû lyù theâm ñeå coù ñöôïc protein mong muoán. Moät soá phöông phaùp thöôøng söû duïng:  Saéc kyù loûng cao aùp pha ñaûo (Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography: RP-HPLC): laø phöông phaùp thoâng duïng nhaát ñeå taùch vaø tinh saïch protein, thuoäc loaïi saéc kyù coät coù pha ñoäng laø chaát loûng. Hieäu quaû phaân tích cao cuûa HPLC ñaït ñöôïc laø do vaät lieäu nhoài coät coù kích thöôùc haït raát beù (5-10 m) vaø ñoä ñoàng nhaát cao laøm taêng ñaùng keå soá ñóa lyù thuyeát. Vieäc söû duïng bôm cao aùp duy trì aùp suaát cao ôû ñaàu coät nhaèm ñieàu chænh vaø oån ñònh vaän toác doøng, taêng toác quaù trình phaân tích. RP-HPLC duøng pha tónh keùm phaân cöïc hôn pha ñoäng. Khi ñoù caùc dung moâi söû duïng laø dung moâi phaân cöïc, thöôøng ít ñoäc haïi hôn, reû hôn vaø khoâng gaây oâ nhieãm moâi tröôøng.  Saéc kyù loûng cao aùp pha thuaän (Normal-Phase HPLC): töông töï treân, nhöng pha tónh phaân cöïc hôn pha ñoäng. Thöôøng duøng ñeå taùch caùc protein öa nöôùc.  Saéc kyù aùi löïc (Affinity Chromatography: AC): phöông phaùp naøy döïa treân khaû naêng giöõ protein baèng nhöõng chaát neàn khoâng hoøa tan, ñöôïc nhoài vaøo trong caùc coät saéc kyù.  Phöông phaùp ñieän di mao quaûn (Capillary Electrophoresis – CE): hieän nay ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå taùch protein. Chöông 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC -104- Xeùt veà maët lyù thuyeát, taát caû caùc phöông phaùp ñieän di (CE, ITP- Isotachophoresis: ñieän di ñaúng toác, IEF-Isoelectric Focusing: ñieän di ñaúng ñieän), ñeàu coù theå ñöôïc tieán haønh vôùi coät mao quaûn, treân cuøng 1 loaïi thieát bò ñieän di. Hieän nay phöông phaùp ñieän di mao quaûn ñöôïc söû duïng phoå bieán nhaát laø phöông phaùp ñieän di mao quaûn vuøng (Capillary Zone Electrophoresis- CZE). Khi aùp ñaët ñieän aùp, hai hoaït ñoäng ñieän ñoäng seõ xaûy ra döôùi taùc ñoäng cuûa ñieän tröôøng, ñoù laø söï ñieän di vaø söï ñieän thaåm (Electroosmotic Flow-EOF: söï di chuyeån cuûa 1 lôùp chaát loûng coù ñieän tích döôùi taùc duïng cuûa ñieän tröôøng). Chòu taùc ñoäng ñoàng thôøi cuûa quaù trình ñieän di vaø ñieän thaåm, caùc phaàn töû trong maãu mang ñieän tích döông, ñieän tích aâm hoaëc trung hoøa veà ñieän seõ di chuyeån veà phía catode vôùi vaän toác khaùc nhau. Caùc phaàn töû mang ñieän tích döông seõ ñeán catode nhanh nhaát, hay noùi caùch khaùc, peak cuûa caùc cation treân ñieän di ñoà seõ xuaát hieän tröôùc EOF. Caùc anion coù linh ñoä ñieän di nhoû hôn EOF seõ ra sau EOF vaø caùc anion coù linh ñoä ñieän di lôùn hôn EOF seõ khoâng phaùt hieän ñöôïc vì di chuyeån veà phía anode. Caùc phaàn töû trung hoøa veà ñieän seõ ñi cuøng vôùi EOF vaø xuaát hieän treân ñieän di ñoà ôû cuøng vò trí cuûa EOF. Löôïng maãu ñöôïc söû duïng khi taùch thöôøng raát nhoû (döôùi 20nL), do ñoù seõ raát khoù khaên neáu muoán phaùt hieän nhöõng thaønh phaàn coù tæ leä nhoû trong 1 hoãn hôïp phöùc taïp, chính vì vaäy, tröôùc khi phaân tích ta caàn phaûi laøm giaøu thaønh phaàn caàn phaân tích trong maãu (baèng caùc phöông phaùp xöû lyù sô boä ôû phaàn 4.1).  Saéc kyù raây phaân töû (Size-Exclusion Chromatography: SEC): laø phöông phaùp taùch döïa treân söï khaùc nhau veà kích thöôùc phaân töû cuûa caùc chaát. Vieäc taùch moät protein cuï theå khoâng theå thöïc hieän baèng phöông phaùp naøy, noù chæ cho ta moät nhoùm caùc protein coù kích thöôùc phaân töû gaàn nhau. Ngöôøi ta cho dung dòch phaân tích ñi qua caùc vaät lieäu coù khaû naêng taïo thaønh boä khung gel hoaëc caùc raây phaân töû. Pha tónh trong saéc kyù gel laø dung moâi ôû trong caùc loã cuûa gel, coøn pha ñoäng cuõng chính laø dung moâi chaïy qua. Noùi caùch khaùc, pha tónh vaø pha ñoäng trong saéc kyù gel ñöôïc caáu taïo töø 1 chaát hay töø 1 hoãn hôïp caùc chaát. Caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn hôn loã gel khoâng haáp phuï leân gel maø chæ khueách taùn vaøo caùc khe hôû giöõa caùc haït raén xoáp, coøn caùc phaân töû coù kích thöôùc beù hôn coù theå ñi xuyeân vaøo caùc loã cuûa gel vaøo saâu beân trong. Khi pha ñoäng ñi ngang qua, caùc phaân töû seõ ñöôïc röûa giaûi ra khoûi gel theo thöù töï khaùc nhau. Caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn hôn loã gel seõ theo pha ñoäng ñi ra ñaàu tieân, caùc phaân töû coù kích thöôùc Chöông 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC -105- beù nhaát seõ ñi ra sau cuøng. Ñoái vôùi caùc phaân töû coù caáu truùc khoâng gian gaàn gioáng nhau, thöù töï röûa giaûi seõ giaûm theo chieàu giaûm troïng löôïng phaân töû. 4.3. ÑAÙNH GIAÙ KEÁT QUAÛ TINH SAÏCH: Sau khi tinh saïch thì caàn phaûi kieåm chöùng veà möùc ñoä ñoàng nhaát (homogeneity) vaø nhöõng tính chaát veà caáu truùc (structural characterization) ñeå coù ñöôïc saûn phaåm theo yeâu caàu. Coù nhieàu phöông phaùp phaân tích ñöôïc söû duïng. Hình 4.1. Moái lieân heä giöõa caùc phöông phaùp phaân tích Hình treân cho ta thaáy moái lieân heä giöõa caùc phöông phaùp phaân tích. Caùc phöông phaùp phaân tích amino acid (amino acid analysis) thích hôïp ñeå phaân tích caáu truùc hoùa trò cuûa phaân töû; trong khi ñoù phöông phaùp phaân tích thöù töï (sequence analysis) cho pheùp ñaùnh giaù caû möùc ñoä ñoàng nhaát laãn caáu truùc phaân töû. Phöông phaùp khoái phoå (mass spectrometry) cuõng laø moät phöông phaùp quan troïng ñeå phaân tích protein. Phöông phaùp coäng höôûng töø haït nhaân (nuclear magnetic resonance- NMR) laø moät trong nhöõng phöông phaùp chính ñeå phaân tích caáu truùc cuûa protein trong dung dòch. Phöông phaùp quang phoå töû ngoaïi (ultraviolet spectroscopy) thöôøng duøng ñeå phaân tích amino acid coù chöùa voøng thôm, ñoàng thôøi cuõng laø coâng cuï ñeå ñaùnh giaù, kieåm soaùt vieäc tinh saïch protein. Tuy nhieân nhöõng thoâng tin veà caùc lieân keát hoùa trò cuûa protein thì vaãn coøn nhieàu haïn cheá. Keát quaû ñaùnh giaù ñònh löôïng quaù trình tinh saïch protein ñöôïc goïi laø “hoaït tính”. Thuaät ngöõ naøy thöôøng ñöôïc söû duïng cho enzyme. Söï phaân tích enzyme döïa treân nhöõng phaûn öùng xuùc taùc ñaëc hieäu cuûa enzyme, trong khi ñoù, protein thì döïa treân nhöõng tính chaát vaät lyù cuûa noù, ví duï döïa treân coäng toá coù khaû naêng sinh maøu cao (highly chromogenic cofactor) ta coù theå bieát ñöôïc thoâng qua phöông phaùp quang phoå. Hoaït tính rieâng laø thöôùc ño cho möùc ñoä tinh saïch, noù ñöôïc ñònh nghóa laø tæ soá giöõa löôïng protein theå hieän hoaït tính trong dung dòch so vôùi toång soá protein trong dung dòch. Hoaït tính rieâng gia taêng trong quaù trình tinh saïch do ta ñaõ loaïi boû nhöõng Chöông 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC -106- protein khaùc khoâng coù hoaït tính naøy. Moät protein hoaøn toaøn tinh saïch neáu noù theå hieän hoaït tính rieâng cuûa protein aáy cao nhaát. Chöông 5: XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN Y SINH HOÏC -107- CHÖÔNG 5 : XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN Y SINH HOÏC 5.1. TÍNH OÅN ÑÒNH CUÛA PROTEIN: Noùi chung, protein thu ñöôïc töø quaù trình tinh saïch thöôøng giöõ laïi moät löôïng nöôùc vaø acid. Trong quaù trình toàn tröõ moät soá bieán ñoåi coù theå dieãn ra nhö söï oxi hoùa, söï haáp phuï, söï haáp thuï hay giaûi phoùng aåm, bieán ñoåi do tieáp xuùc vôùi aùnh saùng, nhieät…. Nhìn chung, traïng thaùi raén beàn hôn so vôùi traïng thaùi dung dòch töông öùng. ÔÛ traïng thaùi dung dòch, baûn chaát cuûa dung moâi, noàng ñoä, pH vaø nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán tính oån ñònh. Söï haáp phuï leân beà maët vaät chöùa, söï voâ hoaït, söï racemic hoùa, oxi hoùa, deamin hoùa, phaù maïch vaø söï saép xeáp laïi maïch laø nhöõng hieän töôïng xaûy ra cho protein neáu noù khoâng oån ñònh trong dung dòch. Coù moät vaøi tröôøng hôïp maø khi ôû daïng raén ngöôøi ta laïi nhaän thaáy noù keùm beàn hôn so vôùi khi ôû daïng dung dòch. Ñoái vôùi daïng raén, söï khoâng oån ñònh neáu xaûy ra thì cuõng töông töï nhö daïng dung dòch (phaù maïch, hình thaønh caùc lieân keát, söï saép xeáp laïi, thay theá…). Nhöõng bieán ñoåi thöôøng xaûy ra trong quaù trình toàn tröõ protein nhö:  Söï deamin hoùa cuûa asparagine vaø glutamine.  Söï oxi hoùa nguyeân töû löu huyønh cuûa cysteine vaø methionine.  Söï thay ñoåi caàu disulide ôû cysteine.  Söï phaân huûy lieân keát peptide.  Söï dimer hoùa hoaëc söï keát hôïp caùc phaân töû. Vieäc nhöõng phaûn öùng phaân huûy vaãn coù theå xaûy ra ôû trong caû daïng raén (ít aåm) vaãn chöa ñöôïc hieåu roõ raøng. Söï huùt aåm, nhieät ñoä vaø söï hình thaønh caùc hôïp chaát (ví duï nhö polymer) ñöôïc xem laø nhöõng nhaân toá chính aûnh höôûng ñeán söï khoâng oån ñònh cuûa protein ôû daïng raén. 5.2. HOAØN NGUYEÂN VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN: Caùc protein khaùc nhau coù nhöõng tính chaát hoøa tan khaùc nhau. Söï khoù khaên trong vieäc hoøa tan protein coù lieân quan ñeán söï hình thaønh caáu truùc baäc 2. Söï hình thaønh caáu truùc baäc 2 xuaát hieän vôùi haàu heát caùc protein, ñaëc bieät laø nhöõng protein coù chöùa nhieàu amino acid öa beùo. Söï hình thaønh naøy coù theå ñöôïc thuùc ñaåy bôûi muoái. Khi söû duïng, tröôùc tieân ta caàn hoøa tan protein trong nöôùc caát. Soùng sieâu aâm coù theå giuùp taêng khaû naêng hoøa tan cuûa protein. Chöông 5: XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN Y SINH HOÏC -108- Khi caàn toàn tröõ protein trong thôøi gian daøi, ta tieán haønh saáy laïnh protein. Protein ñöôïc saáy laïnh coù theå baûo quaûn vaøi naêm ôû nhieät ñoä -20oC hoaëc thaáp hôn maø haàu nhö khoâng coù söï phaân huûy. So vôùi daïng toàn tröõ naøy thì protein ôû trong daïng dung dòch ít beàn hôn. Protein deã bò taùc ñoäng bôûi vi sinh vaät, do ñoù chuùng caàn ñöôïc hoøa tan trong nöôùc caát. Protein thöôøng ñöôïc baùn döôùi daïng boät mòn ñöôïc saáy laïnh, ñöïng trong caùc loï nhoû. Caàn phaûi tröõ laïnh chuùng sau khi mua veà. Ñeå hoaøn nguyeân (reconstitute) protein thì neân duøng nöôùc caát hoaëc dung dòch ñeäm, coù theå duøng dung dòch acetic acid hoaëc ammonium bicarbonate ñoái vôùi protein khoù hoøa tan. Moät soá dung moâi khaùc coù theå ñöôïc söû duïng ñeå hoøa tan protein nhö acetonitrile, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl formamide (DMF), hoaëc isopropanol. Nhöõng dung moâi naøy neân duøng vôùi moät löôïng toái thieåu, sau ñoù theâm nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm ñeán theå tích yeâu caàu. Sau khi protein ñöôïc hoaøn nguyeân, chuùng caàn phaûi ñöôïc söû duïng ngay ñeå traùnh bò phaân huûy trong dung dòch. Phaàn protein coøn dö thì neân tieán haønh saáy laïnh trôû laïi, giöõ ôû -20oC. Caàn traùnh vieäc laïnh ñoâng, raõ ñoâng nhieàu laàn. Caùch toát nhaát ñeå hoøa tan protein laø duøng nöôùc. Ñoái vôùi caùc protein khoâng tan trong nöôùc thì ta coù theå duøng nhöõng caùch sau:  Protein coù tính acid (tích ñieän aâm): duøng moät löôïng nhoû base, ví duï ammonium bicarbonate 10% ñeå hoøa tan protein, theâm nöôùc vaøo ñeán noàng ñoä theo yeâu caàu.  Protein coù tính base (tích ñieän döông): söû duïng moät löôïng khoaûng acid acetic 30%, theâm nöôùc ñeán noàng ñoä yeâu caàu.  Protein raát kò nöôùc, coá gaéng hoøa tan protein trong moät löôïng nhoû DMSO, theâm nöôùc ñeán noàng ñoä yeâu caàu.  Protein coù khuynh höôùng keát tuûa (thöôøng laø nhöõng protein coù chöùa cysteine), theâm urea 6M vôùi acid acetid 20% vaøo protein, theâm nöôùc tôùi noàng ñoä yeâu caàu. KEÁT LUAÄN -109- KEÁT LUAÄN Caùc protein y sinh hoïc ñöôïc ñöa ra thò tröôøng trong giai ñoaïn 1982-1994 moãi naêm chæ laø 2-7 loaïi. Nhöng töø naêm 1995 ñeán nay taêng leân 16-32 loaïi moãi naêm vaø naêm 2005 coù ñeán 85 saûn phaåm môùi. Toång soá caùc protein duøng trong döôïc phaåm ñaõ leân ñeán 300 loaïi, mang laïi giaù trò kinh teá raát cao. Naêm 1999 caû theá giôùi chæ saûn xuaát ñöôïc hôn 1,17 taán nhöng coù giaù trò tôùi 30 tyû USD; naêm 2004 thu ñöôïc hôn 6,4 taán vôùi trò giaù 43 tyû USD. Töø caùc soá lieäu noùi treân, ta deã daøng nhaän ra moät xu höôùng môùi trong ngaønh y döôïc theá giôùi: chuyeån sang saûn xuaát, söû duïng caùc saûn phaåm coù baûn chaát laø protein vôùi khaû naêng öùng duïng roäng raõi, ñem laïi hieäu quaû cao. Ñoù cuõng laø con ñöôøng ñi taát yeáu cuûa caùc nhaø nghieân cöùu sinh hoïc, döôïc hoïc vaø caùc coâng ty döôïc phaåm cuûa nöôùc ta. Chuùng ta ñang bò boû caùch moät khoaûng quaù xa, nhöng tính ña daïng sinh hoïc ôû nöôùc ta chaúng thua keùm baát kyø quoác gia naøo, thieát bò saûn xuaát cuõng khoâng phaûi laø quaù ñaét tieàn. Döïa treân neàn taûng hieän coù, chuùng ta coù theå taäp trung nghieân cöùu kó thuaät taùi toå hôïp DNA treân vi sinh vaät vaø teá baøo thöïc vaät. Chæ caàn coù moät caùi nhìn khaùch quan vaø khaån tröông veà chieán löôïc, moät quyeát taâm cao trong ñaàu tö vaø ñaøo taïo, moät ñònh höôùng ñuùng ñaén trong hôïp taùc quoác teá, nhaát ñònh chuùng ta seõ saûn xuaát ñöôïc ngaøy caøng nhieàu caùc saûn phaåm protein y sinh hoïc, thay theá daàn cho vieäc nhaäp khaåu vôùi giaù raát cao nhö hieän nay. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO -110- TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 1. Leâ Ngoïc Tuù (chuû bieân), Hoaù sinh coâng nghieäp, NXB Khoa hoïc & Kó thuaät, 2002, 443p. 2. Nguyeãn Höõu Chaán (chuû bieân), Hoaù sinh, NXB Y hoïc, 2001, 742p. 3. Phaïm Ñình Löïu (chuû bieân), Sinh lyù hoïc y khoa taäp 2, NXB Y hoïc, 2003, 401p. 4. Phaïm Hoaøng Phieät, Mieãn dòch – Sinh lyù beänh, NXB Y hoïc, 2004, 327p. 5. Nguyeãn Baù Ñöùc, Hoaù chaát ñieàu trò beänh ung thö, NXB Y hoïc, 2003, 428p. 6. Nguyeãn Vaên Uyeån (chuû bieân), Nhöõng kieán thöùc cô baûn veà coâng ngheä sinh hoïc, NXB Giaùo duïc, 1996, 230p. 7. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä sinh hoïc, NXB ÑHQG TPHCM, 2001, 344p. 8. Phaïm Thaønh Hoå, Di truyeàn hoïc, NXB Giaùo duïc, 2006, 613p. 9. Leâ Xuaân Phöông, Vi sinh vaät coâng nghieäp, NXB Xaây döïng, 2001, 377p. 10. Norbert Sewald, Hans-Dieter Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, 2002, 543p. 11. Daniel Rudman, Axel G.Feller, Hoskote S.Nagraj, Gregory A.Gergans, Effects of human growth hormone in men over 60 years old, The New England Journal of Medicine, Vol.323, 1990, pp.1-6. 12. Maria Fragiadaki, Vassiliki Magafa, Paul Cordopatis, Synthesis and biological activity of oxytocin analogues containing conformationally-restricted residues in position 7, European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.42, 2007, pp.799-806. 13. A.A.Antonov, A.K.Ivanov, V.P.Pakhomov, Solid-phase synthesis of oxytocin and its analysis by high performance liquid chromatography, Chemistry of Natural Compounds, Vol.23, 1988, pp.746-751. 14. Linda M.Keefer, Marie-Agneøs Piron & Pierre De Meyts, Human insulin prepared by recombinant DNA techniques and native human insulin interact identically with insulin receptors, Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.78, 1981, pp.1391- 1395. 15. Saran A.Narang, Chemical synthesis, cloning and expression of human preproinsulin gene, J.Biosci., Vol.6, 1984, pp.739-755. 16. Hoaøng Vaên Quoác Chöông, Nguyeãn Vaên Nhung, Traàn Linh Thöôùc, Nghieân cöùu thaønh phaàn vaø ñieàu kieän nuoâi caáy ñeå toång hôïp mini-proinsulin ngöôøi taùi toå hôïp trong Escherichia coli ôû quy moâ pilot, Nhöõng vaán ñeà nghieân cöùu cô baûn trong khoa hoïc vaø söï soáng, Vol.10., 2005, pp.1157-1159. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO -111- 17. Masahide Shiozawa, Shuji Yamashita, Sadakazu Aiso, Kenjiro Yasuda, A monoclonal antibody against human kidney gamma-glutamyl transpeptidase: preparation, immunochemical and immunohistochemical characterization, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry , Vol.37, 1989, pp.1053-1061. 18. J.Milton Harris, Robert B.Chess, Effect of pegylation on pharmaceuticals, Nature Publishing Group, 2003, Vol.2, pp.214-221. 19. www.wikipedia.org 20. www.hcmbiotech.com.vn 21. www.ivftudu.com.vn 22. www.vietsciences.org

Các file đính kèm theo tài liệu này:

BAO CAO HOAN CHINH.pdf
MUC LUC.pdf