Luận văn Nuôi cấy mô trai Nam Bộ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.)

min, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng 21 nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trƣờng và nút đậy. - Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy. Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trƣờng bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phƣơng pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy. Các chất kháng sinh ít đƣợc sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hƣởng xấu lên sự sinh trƣởng của mô cấy. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Street (1974), đƣa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy nhƣ sau (Trần Văn Minh, 2005): Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochlorite canxi 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochlorite natri 2 5 – 30 Rất tốt Hydroperoxid (H2O2) 10 – 12 5 – 15 Tốt Nƣớc Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt 22 Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn, với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trƣớc khi xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nƣớc máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa sạch nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vô trùng trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng nhằm tránh ảnh hƣởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy (Trần Văn Minh, 2005). Sơ đồ xử lý mẫu thực sinh: Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nƣớc máy Cho vào bình tam giác Ngâm trong cồn 700C khoảng 30 – 60 giây Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25% trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80 Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm trắng Đặt lên môi trƣờng nuôi cấy 23 2.5.3 Điều kiện nuôi cấy  Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hƣởng sâu sắc đến sinh trƣởng và phát triển cây in vitro qua các tiến trình sinh lý nhƣ hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ thích hợp nhất thƣờng đƣợc dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 270C (Trần Văn Minh, 2005). Còn theo Hughes (1981), nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy mô là 32 – 350C, trong khi những báo cáo khác ghi nhận nhiệt độ thích hợp cho Streptocapus là 120C (Appelyren và Heide, 1972), với nhiều loài cây Begonia nhiệt độ thích hợp là 15 – 240C (Heide, 1965; Fonnesbad, 1974). Tuy nhiên nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm cho chức năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm. Hầu hết, những thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đƣợc thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế nhiệt độ, một vài loài cây nhƣ Lily sự hình thành thể giò đƣợc thực hiện bằng tăng cƣờng sử dụng chu kỳ nhiệt độ ngày và đêm. Những ngƣời trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trì khả năng sinh trƣởng khi yêu cầu nhiệt cho cây non còn thấp. Nuôi cấy ở ngăn lạnh làm giảm sinh trƣởng và làm giảm giá thành cần thiết do cấy truyền, những cây nuôi cấy này đƣợc di chuyển từ ngăn lạnh đến nơi bắt đầu nhân chồi lại khi yêu cầu nhân giống tăng (Hartmann và ctv, 1997).  Ánh sáng: Ảnh hƣởng của ánh sáng có thể đƣợc chia ra trong sự tác động của cƣờng độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ) và chất lƣợng ánh sáng đến sinh trƣởng, phát triển của thực vật. Cƣờng độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hƣởng đến khả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cƣờng độ ánh sáng điển hình cho vi nhân giống là từ 40 – 80 µmol/m2/giây trong nuôi cấy vƣơn thân, nhƣng cƣờng độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều. Kiểu nút đậy kín có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy, các loài cây khác nhau thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200 µmol/m2/giây). Bức xạ ánh sáng cao hơn trong nuôi cấy dị dƣỡng có thể làm mất diệp lục (Chlorophyll) và hoại tử lá (Hartmann và ctv, 1997). Rất nhiều nghiên cứu có hệ thống về tác động của 24 quang chu kỳ trong sự phát triển mô nuôi cấy, nhƣng chiều dài ngày dài hơn từ 12 – 16 giờ thƣờng là thích hợp nhất. Phản ứng quang chu kỳ của hoa có thể đƣợc tạo ra trong in vitro, chồi cây cẩm chƣớng có thể ra hoa bằng cách xử lý 16 giờ chiếu sáng, nhƣng các thực vật còn lại chỉ 12 giờ là đã có thể ra hoa (Hartmann và ctv, 1997). Chất lƣợng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và kiểu bình cấy đƣợc sử dụng. Thông thƣờng trong các phòng nuôi cấy mô sử dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ, chất lƣợng ánh sáng bị ảnh hƣởng bởi chất lƣợng đƣờng truyền của bình và kiểu nút đậy. Bình thủy tinh không truyền đƣợc ánh sáng có bƣớc sóng ngắn hơn 290 nm, trong khi đó bình polycarbonate không truyền đƣợc ánh sáng có bƣớc sóng ngắn hơn 390 nm, mặc dù đây là những số đo khác nhau, nhƣng ánh sáng có bƣớc sóng quang trọng nhất cho quang hợp và sự phát sinh quang hình thái là từ 400 – 800 nm. Chất lƣợng ánh sáng cũng làm thay đổi phản ứng sinh trƣởng của chồi in vitro. Nuôi cấy cây phong lữ (Pelargonium) trong ánh sáng đỏ làm tăng chiều dài chồi hơn so với ánh sáng trắng, trong khi đó ánh sáng xanh làm giảm sự kéo dài chồi, ngƣợc lại khả năng quang hợp cao nhất khi chồi cây Bulo (Betula) đặt trong ánh sáng xanh so với ánh sáng trắng hoặc đỏ, ánh sáng xanh cũng kích thích phát sinh diệp lục và gia tăng kích thƣớc lá. Ngƣời ta cho rằng chất lƣợng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và có thể bị kích thích bởi xử lý ánh sáng xanh trƣớc khi di chuyển cây từ nuôi cấy. Chất lƣợng ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triển chồi, là nguyên nhân làm các yếu tố môi trƣờng phát triển trong nuôi cấy thay đổi (Hartmann và ctv, 1997). Nhìn chung ánh sáng kiềm hãm sự phát triển của rễ và có vài chỉ dẫn rằng ngăn không cho ánh sáng từ vùng rễ thì có lợi cho việc hình thành rễ (Hartmann và ctv, 1997).  Không khí: Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao gồm oxy, carbon dioxide và ethylene. Các nhà trồng cây thƣơng mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí đƣợc ở một vài mức độ khác nhau, thƣờng có sự thúc đẩy tăng trƣởng thông qua lỗ thông khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997). 25 2.5.4 Môi trƣờng nuôi cấy Trong tất cả các môi trƣờng nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính sau đây:  Các muối khoáng đa lƣợng  Các muối khoáng vi lƣợng  Các Vitamin  Đƣờng làm nguồn cacbon  Các chất điều hòa sinh trƣởng Ngoài ra, ngƣời ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định nhƣ acid amin, EDTA, hoặc không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm men…vào trong môi trƣờng tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tƣợng nuôi cấy. Trong hàng trăm môi trƣờng do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trƣờng: - Môi trƣờng nghèo chất dinh dƣỡng: White, Knop. - Môi trƣờng có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trung bình: B5, Gamborg. - Môi trƣờng giàu chất dinh dƣỡng: MS (Mura shige – Skoog). 2.5.5 Nƣớc dừa F Mariat là ngƣời đầu tiên công bố sử dụng thành công nƣớc dừa trong gieo hạt hoa Lan invitro. Nƣớc dừa (coconut water) là một dƣỡng chất có chứa đầy đủ các ion hữu cơ, các thành phần nitrogen, các amino acid, enzyme, các aicd vô cơ, các vitamin, các đƣờng đơn alcohol, các chất điều hoà sinh trƣởng và các chất khác. Nhƣ vậy, nƣớc dừa là một chất dinh dƣỡng cung cấp tất cả các thành phần cần thiết cho nhu cầu sinh trƣởng của tế bào nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô việc bổ sung nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy sẽ hạn chế bớt (hay không cần) sử dụng chất điều hoà sinh trƣởng, hạn chế xảy ra các biến dị bất lợi do quá trình nuôi cấy in vitro trong thời gian dài (Trần Văn Minh, 2004). Cũng có một số tác giả cho rằng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy 10 – 20 % nƣớc dừa tƣơng đƣơng với tác dụng của việc bổ sung lƣợng BA 1 – 2 mg/l. 26 Kết quả phân tích thành phần của nƣớc dừa từ non đến già: - Amino aicd tự do: đạt nồng độ từ 190,5 – 685,0 ppm trong nƣớc dừa tính theo tuổi của quả từ non đến già. Khi hấp ở nhiệt độ cao chỉ còn 70 ppm. - Amino acid dạng liên kết có trong protein và peptid. - Axit hữu cơ. - Đƣờng. - RNA và DNA. - Ngoài ra nƣớc dừa còn chứa các hợp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập nhƣ: Myo inositol, các chất có hoạt tính auxin, các cytokinin dạng glucoside (Trần Văn Minh, 2004). 2.5.6 Vai trò của chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy Chất điều hoà sinh trƣởng là những chất với liều lƣợng thấp hiệu ứng sinh học cao, đƣợc tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hƣởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh trƣởng là sản phẩm trao đổi chất bình thƣờng của cơ thể thực vật. Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trƣởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng nhƣ trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trƣờng (Bùi Trang Việt, 2000).  Auxin: Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trƣởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trƣởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trƣởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2000). Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trƣởng và phân hoá, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tƣợng hƣớng động, ƣu thế ngọn, lão suy, rụng, đậu, tăng trƣởng và chín của quả….(Nguyễn Văn Kế, 2000). Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu. Sự kéo dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ƣu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao. 27 Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng. Ngay từ khi chất auxin đƣợc nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tƣơng tự nhƣ các đặc tính của chất auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA. Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai tính chất đƣợc nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ (Trần Văn Minh, 2004). Auxin chẳng những kích thích sự tăng trƣởng của chồi non mà còn khởi phát cho sự tạo mới. Ở nồng độ thấp và thƣờng dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vƣợt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000).  Cytokinin: Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin. Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thƣớc tế bào và sinh tổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhƣng lại ức chế sự tạo rễ (Dƣơng Công Kiên, 2002). Sự sinh trƣởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ). Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ. Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thƣơng thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với auxin (Trần Văn Minh, 2004). Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hoá (Trần Văn Minh, 2004).  Gibberellin: Hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì. 28 Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin. Xử lý gibberellin làm tăng năng suất mía cây và đƣờng (do kích thích sự kéo dài lóng). Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trƣởng lá. Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin (Bùi Trang Việt, 2000). 2.5.7 Ảnh hƣởng của than hoạt tính Nồng độ sử dụng thƣờng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có những tác dụng sau: Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác. Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…). Thúc đẩy sự tạo phôi soma. Ổn định độ pH. 2.5.8 Ảnh hƣởng của pH và Agar pH của môi trƣờng nuôi cấy thƣờng ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô. Nếu pH môi trƣờng thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Agar xuất phát từ rong biển, đƣợc sử dụng nhƣ là chất keo trong hầu hết môi trƣờng dinh dƣỡng. Agar là polysaccharide, trọng lƣợng phân tử cao có khả năng làm đông môi trƣờng. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nƣớc và hấp thụ hoá chất. Nồng độ agar thƣờng sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %. Trong những năm gần đây sử dụng môi trƣờng hai pha (pha rắn và pha lỏng) trở nên khá phổ biến vì tốc độ nhân giống cao và giảm hiện tƣợng thuỷ tinh thể. Đầu tiên mẫu cấy đƣợc đặt trên môi trƣờng rắn, sau đó thêm vào một lớp môi trƣờng lỏng. Một phần mẫu cấy ở trong môi trƣờng lỏng, một phần ở trong môi trƣờng rắn, một phần ở trong không khí. Nếu nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng cần phải cung cấp oxy tạo sự thoáng khí bằng cách sử dụng máy lắc. Tế bào, mô nuôi cấy có thể bị tổn thƣơng nhƣng thƣờng sinh trƣởng và phát triển tốt vì mẫu cấy hấp thu dinh dƣỡng dễ dàng trên toàn bộ mẫu cấy. 29 Hình 2.1: Thân cây Trai trƣởng thành (A). Hoa (B), cành mang quả cây Trai (C). A B C 30 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU  Mẫu nuôi cấy Sử dụng cành non khoảng 30 – 45 ngày tuổi dài khoảng 5 – 7 cm, rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng 0,1 % trong 15 phút và đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy bình thƣờng. Sau đó mẫu này đƣợc ngâm trong dung dịch cồn 700 trong 30 – 60 giây. Rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần trƣớc khi ngâm trong dung dịch diệt khuẩn với vài giọt Tween 80. Những phần mô bị tẩy trắng bởi tác nhân diệt khuẩn đƣợc cắt bỏ. Cuối cùng mẫu đƣợc cắt thành những đoạn dài 1 – 2 cm đặt trong môi trƣờng nuôi cấy ống nghiệm.  Dụng cụ nuôi cấy Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, ống nghiệm 25 x 100 mm, bình tam giác dung tích 300ml, đƣợc đậy kín bằng nắp cao su hoặc bông gòn, đĩa nhôm đƣờng kính 20 cm, cốc, ống đong, pippet, cân điện tử,….  Môi trƣờng nuôi cấy MS (Murashige – Skoog, 1962), WPM (Lloyd – Mc Cown, 1980), đƣợc bổ sung đƣờng, agar và các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BA (6 – amino purine), IBA (Indol butyric acid), NAA(α- napthalene acetid acid), nƣớc dừa (CW – coconut water) tùy theo yêu cầu của từng thí nghiệm.  Thể tích môi trƣờng nuôi cấy Ban đầu cấy trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng vô trùng, sau 7 – 10 ngày mẫu nuôi cấy đƣợc chuyển sang bình tam giác 300 ml có chứa 65 ml môi trƣờng.  Điều kiện nuôi cấy Môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy đƣợc hấp vô trùng bằng nồi hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C và áp suất 1 atm trong 23 phút. Cƣờng độ chiếu sáng: 3000 lux. 31 Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày. Nhiệt độ phòng: 26 – 300C. Độ ẩm: 60 – 80%. 3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Vi nhân giống cây Trai Nam Bộ in vitro theo hƣớng tạo cụm chồi có sử dụng cytokinin với mẫu là chồi ngọn hay chồi bên có chứa nhiều mô phân sinh. Sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng không có cytokinin thì chồi phát triển vƣơn dài. Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (Completely randommized design, CRD), 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức ở từng lần lặp lại cấy ba bình tam giác thể tích 300 ml có chứa 65 ml môi trƣờng nuôi cấy, mỗi bình cấy ba mẫu. Đối với môi trƣờng ống nghiệm thì thể tích sử dụng khoảng 10 ml. Khi xử lý thống kê số liệu của các chỉ tiêu sinh trƣởng là sử dụng các trị trung bình của từng lần lặp lại. Các số liệu đƣợc thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel, Mstat-C. Phân tích ANOVA, sau đó kiểm tra trắc nghiệm phân hạng bằng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan’s cho từng chỉ tiêu của thí nghiệm, với mức xác suất có ý nghĩa P = 0,05. Các số liệu trong bảng là các trị trung bình của ba lần lặp lại sau khi xử lý thống kê có đƣợc. Các chỉ tiêu theo dõi:  Số lá/mẫu: đơn vị là lá.  Hiện tƣợng phù gốc/gốc bình thƣờng: +/-.  Số chồi/cụm: đo số chồi phát sinh, thao tác đƣợc thực hiện trong tủ vô trùng, đơn vị là số lƣợng.  Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%).  Chiều cao chồi: đo chiều cao thân chồi của chồi có chiều cao thân cao nhất, thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng, đơn vị tính là mm.  Sự phát triển lá (+/ -) đƣợc đánh giá bằng mắt. 32 3.2.1 Thí Nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây Trai thực sinh Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt theo từng đốt đều nhau dài khoảng 0,5 – 1 cm, loại bỏ những phần bị ngấm chất khử trùng rồi cấy vào các ống nghiệm có chứa 10 ml môi trƣờng làm việc, mỗi lần cấy 30 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 1 mẫu thực sinh. Thời gian nuôi cấy: 7 – 10 ngày. Môi trƣờng vô mẫu: MS. Hóa chất đƣợc sử dụng là Natri hypochlorit (10 – 30 %) và HgCl2 (0,05 %). Bảng 3.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorite và thời gian xử lý vô trùng mẫu NT Nồng độ Na – Hypo (%) Thời gian (phút) 1 10 15 2 10 20 3 10 30 4 20 15 5 20 20 6 20 30 7 25 15 8 25 20 9 25 30 10 30 15 11 30 20 12 30 30 33 Bảng 3.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorit, HgCl2 và thời gian xử lý vô trùng mẫu NT Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) Nồng độ HgCl2 (%) Thời gian (phút) 1 10 15 0,05 10 2 10 20 0,05 10 3 10 30 0,05 10 4 20 15 0,05 12 5 20 20 0,05 12 6 20 30 0,05 12 7 25 15 0,05 15 8 25 20 0,05 15 9 25 30 0,05 15 10 30 15 0,05 15 11 30 20 0,05 15 12 30 30 0,05 15 Chỉ tiêu theo dõi: 3.2.2 Thí Nghiệm 2: Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu CRD (hoàn toàn ngẫu nhiên) đơn yếu tố, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác có chứa 65 ml môi trƣờng nuôi cấy. Mỗi bình cấy 3 mẫu. Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự phát sinh chồi của cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ bản. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) Số mẫu sống không bị nhiễm khuẩn, nấm Tổng số mẫu cấy = X 100 34 Bảng 3.2: Khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l) NT Môi trƣờng Nồng độ BA (mg/l) 1 MS 0,1 2 WPM 0,1 Thời gian lấy số liệu: 1 tháng 3.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro. Môi trƣờng khoáng cơ bản nuôi cấy là WPM và bổ sung BA nồng độ thay đổi từ 0 – 1 mg/l. Thí nghiệm gồm có 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu CRD đơn yếu tố, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác có chứa 65 ml môi trƣờng nuôi cấy. Mỗi bình cấy 3 mẫu. Thời gian lấy số liệu 1 tháng. Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định nồng độ BA nào thích hợp cho nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro. Dựa vào tài liệu tham khảo và quá trình thí nghiệm thăm dò nồng độ BA đƣợc chia theo các mức sau: Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi cây Trai in vitro Nghiệm thức Môi trƣờng BA 1 WPM 0 2 WPM 0,1 3 WPM 0,3 4 WPM 0,5 5 WPM 1 3.2.4 Thí Nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro. Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự ảnh hƣởng của BA ở những nồng độ khác nhau lên mẫu nuôi cấy (0 mg/l; 0,01 mg/l; 0,03 mg/l; 0,05 mg/l 0,1 mg/l; 0,5 mg/l). Và kết luận ở nồng độ nào của BA thì hiệu quả nhân cụm chồi cao nhất và chồi phát triển nhiều nhất. 35 Thí nghiệm này có 6 nghiệm thức bố trí theo kiểu CRD (hoàn toàn ngẫu nhiên), đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần và mỗi nghiệm thức cấy vào ba bình tam giác 300 ml chứa 65 ml môi trƣờng WPM. Trong mỗi bình tam giác cấy ba mẫu. Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro NT Môi Trƣờng Nồng độ BA (mg/l) 1 WPM - 2 WPM 0,01 3 WPM 0,03 4 WPM 0,05 5 WPM 0,1 6 WPM 0,5 - Chỉ tiêu khảo sát: + Số chồi/cụm. + Chiều cao chồi. - Thời gian theo dõi lấy số liệu:1 tháng 3.2.5 Thí Nghiệm 5: Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro. Thí nghiệm có 2 nghiệm thức bố trí theo kiểu CRD với ba lần lập lại. Mỗi lần lập lại cấy vào ba bình tam giác chứa 65 ml môi trƣờng nuôi cấy. Mỗi bình cấy ba cụm chồi. Mục đích thí nghiệm là xác định đƣợc môi trƣờng khoáng cơ bản nào thích hợp cho tái sinh cụm chồi ở thí nghiệm 4. Bảng 3.5: Tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro NT Môi trƣờng nuôi cấy 1 MS 2 WPM Chỉ tiêu theo dõi: - Số chồi/cụm. - Chiều cao chồi. - Sự phát triển lá (+/-). Thời gian lấy số liệu: 1 tháng 36 3.2.6 Thí Nghiệm 6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) trong nhân giống cây Trai in vitro. Thí nghiệm có 3 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu CRD (hoàn toàn ngẫu nhiên). Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và mỗi lần lặp lại đƣợc cấy vào 3 bình tam giác 300 ml chứa 65 ml môi trƣờng WPM có bổ sung BA ở nồng độ 0,1 mg/l. Mỗi bình cấy ba mẫu. Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in vitro NT Môi Trƣờng Nồng độ BA (mg/l) Cw (%) 1 WPM 0,1 0 2 WPM 0,1 5 3 WPM 0,1 10 - Chỉ tiêu khảo sát: +Số chồi/cụm. +Số lá/mẫu. +Chiều cao chồi (mm). - Thời gian theo dõi lấy số liệu: 1 tháng. 3.2.7 Thí Nghiệm 7: Nuôi cấy tạo rễ cây trai in vitro. Mục đích của thí nghiệm này là tạo ra đƣợc cây Trai in vitro với đầy đủ thân, lá, và rễ để đƣa ra vƣờn ƣơm. Ngoài ra, nhiều tác giả còn cho rằng sự tạo rễ chịu ảnh hƣởng auxin, chất lƣợng chồi, tuổi sinh lý, từng giống cây và nhiệt độ. Để tạo rễ cây đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung auxin nhƣ IBA, NAA hay cả hai với nồng độ 0,1 – 5 mg/l (IBA) và 0,1 – 5 mg/l (NAA). Thí nghiệm này có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu CRD (hoàn toàn ngẫu nhiên). Mỗi nghiệm thức lặp lại cấy vào bình tam giác 300 ml chứa 65ml môi trƣờng WPM bổ sung IBA ở những nồng độ khác nhau. 37 Bảng 3.7: Nuôi cấy tạo rễ cây Trai in vitro NT Môi trƣờng IAA (mg/l) IBA (mg/l) 1 MS 2 1 2 WPM - 0,1 3 WPM - 0,3 4 WPM - 0,5 Thời gian theo dõi lấy số liệu: 1 tháng 3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Cây Ăn Trái, Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại TP.HCM. Thời gian thực hiện từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2006. 38 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí Nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây Trai thực sinh Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Đây là bƣớc quan trọng trong nuôi cấy mô cây Trai Nam Bộ. Mục tiêu đạt đƣợc của thí nghiệm này là xác định nồng độ của hóa chất diệt khuẩn (Natri hypochlorit và HgCl2) và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. Kết quả thí nghiệm cho thấy: Từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 9, tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng theo tỉ lệ thuận với nồng độ Natri hypochlorit (10 – 25 %) trong thời gian từ 15 – 30 phút. Từ nghiệm thức thứ 10 trở đi thì tỷ lệ mẫu sống vô trùng giảm theo tỷ lệ nghịch với nồng độ Natri hypocholorit (30 %) và thời gian ngâm trong dung dịch Natri hypochlorit tăng từ 15 – 30 phút. Vì nồng độ sử dụng Natri hypochlorit quá cao làm cho mẫu bị ngộ độc chất khử trùng.. Trong bảng 4.1a , ở nồng độ Natri hypochlorite là 10 % ngâm trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng thấp nhất (1,1 %) và ở nồng độ 25 % ngâm trong 30 phút cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất (4,4 %). Do đó, ngoài việc sử dụng Natri hypochlorit để diệt nấm thì cần kết hợp thêm với một dung dịch diệt khuẩn khác nhƣ HgCl2 … để tăng thêm tỷ lệ mẫu sống vô trùng trong quá trình vô mẫu. 39 Nhƣ vậy, việc sử dụng riêng rẽ dung dịch Natri hypochlorite để vô trùng mẫu Trai thực sinh chƣa đạt hiệu quả cao. Trong bảng 4.1b, chúng ta thấy khi sử dụng kết hợp giữa Natri hypochlorit và HgCl2 thì tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng lên theo tỷ lệ thuận với nồng độ Natri Hypochlorite sử dụng (10 – 25 %) trong thời gian từ 10 – 30 phút. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng lên là do dung dịch Natri hypochlorite có khả năng diệt nấm tốt đồng thời dung dịch HgCl2 lại có khả năng diệt khuẩn khá tốt. Đây là hai yếu tố quyết định sự thành công trong quá trình vô trùng mẫu. Việc kết hợp sử dụng dung dịch Natri hypochlorite kết hợp với dung dịch HgCl2 làm cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao hơn so với khi chỉ sử dụng riêng rẽ dung dịch Natri hypochlorit trong vô trùng mẫu mô ban đầu từ cây Trai thực sinh (6,2 % so với 4,4 %). Trong trƣờng hợp này, nghiệm thức thứ 9 cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất (6,2 %). Nghĩa là nồng độ Natri hypochlorit sử dụng là 25 % ngâm trong thời gian 30 phút, sau đó ngâm trong dung dịch HgCl2 0,05 % trong 15 phút. Nghiệm thức thứ 1 cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng thấp nhất (2,5 %). Nồng độ Natri hypochlorit sử dụng ở nghiệm thức này là 10 % ngâm trong 15 phút và kết hợp ngâm với dung dịch HgCl2 0,05 % trong 10 phút. Từ nghiệm thức thứ 10 trở đi thì tỷ lệ mẫu sống vô trùng giảm vì nồng độ sử dụng Natri hypochlorit quá cao (30 %) làm cho mẫu mô bị ngộ độc chất khử trùng và chết. Đồng thời chúng ta cũng biết rằng HgCl2 là chất khử trùng khá độc cho mẫu cấy, cho ngƣời sử dụng và cho cả môi trƣờng sống. Do đó, chúng ta nên hạn chế sử dụng chất này nhiều và nên sử dụng khi thật sự cần thiết. Nhƣ vậy, để vô trùng mẫu Trai thực sinh tốt nhất chúng ta dùng dung dịch Natri hypochlorit nồng độ 25 % ngâm trong 20 – 30 phút kết hợp với ngâm trong dung dịch HgCl2 nồng độ 0,05 % trong thời gian 15 phút. Đây là phƣơng pháp có hiệu quả tốt nhất để vô trùng mẫu Trai thực sinh. 40 Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorit và thời gian xử lý vô trùng mẫu NT Nồng độ Na – Hypo (%) Thời gian ( phút) Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) 1 10 15 1,1 H 2 10 20 1,5 G 3 10 30 2,2 F 4 20 15 2,4 F 5 20 20 3,4 D 6 20 30 3,7 C 7 25 15 4,1 B 8 25 20 4,1 B 9 25 30 4,4 A 10 30 15 3,7 C 11 30 20 3,3 D 12 30 30 2,8 E CV (%) LSD0,05 4,0 0,206 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. 41 Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorit, HgCl2 và thời gian xử lý vô trùng mẫu. NT Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) Nồng độ HgCl2 (%) Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) 1 10 15 0,05 10 2,5 H 2 10 20 0,05 10 3,4 G 3 10 30 0,05 10 3,8 F 4 20 15 0,05 12 4,3 E 5 20 20 0,05 12 4,9 C 6 20 30 0,05 12 5,5 B 7 25 15 0,05 15 5,7 B 8 25 20 0,05 15 6,0 A 9 25 30 0,05 15 6,2 A 10 30 15 0,05 15 4,9 C 11 30 20 0,05 15 4,6 D 12 30 30 0,05 15 3,4 G CV (%) LSD0,05 3,01 0,232 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05. 42 Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây Trai đƣợc vô trùng phát sinh chồi (A), (B) từ đốt thân; (C), (D) từ đốt ngọn. A B C D 43 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự phát sinh chồi của cây Trai trên các môi trƣờng khoáng cơ bản. Tuy nhiên, tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây Trai không nhiều, ít công bố. Do đó thí nghiệm đƣợc thực hiện mang tính chất thăm dò. Mặt khác đa số cây rừng thì khả năng phát sinh chồi trên môi trƣờng khoáng cơ bản gặp khó khăn. Đó là lý do tại sao phải bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy BA nồng độ 0,1 mg/l. Khả năng phát sinh chồi của cây Trai sẽ có hiệu quả hơn dƣới tác dụng của BA vì mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh in vitro chứa nhiều nhu mô phân sinh có khả năng tạo chồi cao. Đây là bƣớc quan trọng tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả thực nghiệm (Bảng 4.2) cho thấy: Môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) kích thích phát sinh chồi/cụm là 8,6 chồi. Trong khi đó môi trƣờng WPM bổ sung BA (0,1 mg/l) cho phát sinh chồi là 15,4 chồi. Cả hai nghiệm thức đều có dấu hiệu phù gốc là do mẫu cấy có sự nhạy cảm dƣới tác dụng của BA. Nhƣ vậy, môi trƣờng WPM bổ sung BA (0,1 mg/l) cho phát sinh chồi cao, thích hợp cho tạo cụm chồi cây Trai in vitro. BA đóng vai trò quan trọng trong phát sinh cụm chồi. Và cụm chồi đƣợc sử dụng là nguồn nguyên liệu trong thí nghiệm tiếp sau. Bảng 4.2: Khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). NT Môi trƣờng Nồng độ BA (mg/l) Số chồi/cụm Phù gốc 1 MS 0,1 8,6 + 2 WPM 0,1 15,4 + CV (%) 0,83 Kết quả này có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học với mức xác suất P = 0,05. 44 Hình 4.2: Khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro từ nuôi cấy chồi đỉnh trên môi trƣờng MS (A), và WPM (B) có bổ sung BA (0,1 mg/l). A B 45 4.2 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro. Sử dụng kết quả từ các thí nghiệm trƣớc, thí nghiệm này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng cơ bản WPM bổ sung BA nồng độ 0 – 1 mg/l. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 4.3 cho thấy: Tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều phát sinh cụm chồi. Đồng thời giữa các nghiệm thức thí nghiệm khả năng phát sinh cụm chồi có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học ở mức xác suất 0,05. Nồng độ BA càng tăng lên thì khả năng tạo cụm chồi cũng tăng theo. Khi nồng độ BA đạt 1 mg/l thì các chồi mới hình thành có dạng li ti rất nhiều, rất nhỏ và chiều cao thấp. Mẫu này đƣợc sử dụng cho thí nghiệm nhân cụm chồi trong thí nghiệm tiếp theo. Kết quả thí nghiệm này cho thấy nồng độ BA tối ƣu cho tạo cụm chồi là 1 mg/l. Nhƣ vậy, để nhân giống cây Trai in vitro nên nhân nhanh bằng phƣơng pháp cụm chồi. Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro Nghiệm thức Môi trƣờng BA Số chồi/cụm Chiều cao chồi 1 WPM 0 3,1 E 20,5 A 2 WPM 0,1 15,8 D 14,5 B 3 WPM 0,3 17,5 C 12,6 C 4 WPM 0,5 19,5 B 11,5 D 5 WPM 1 30,2 A 10,2 E CV (%) 0,58 0,72 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức suất p = 0,05 bởi trắc nghiệm LSD. 46 Hình 4.3: Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro. Cụm chồi trên môi trƣờng có nồng độ BA 0,1 mg/l (A); nồng độ 0,5 mg/l (B); nồng độ 1 mg/l (C). C A B 47 4.3 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro. Kết quả thực nghiệm (Bảng 4.4) cho thấy nồng độ BA càng cao cho số chồi phát sinh càng tăng và chiều cao thân chồi giảm dần ở các nghiệm thức. Ở nghiệm thức thứ 6 nồng độ BA là 0,5 mg/l cho số chồi phát sinh là 20,5 chồi cao nhất so với các nghiệm thức còn lại nhƣng chiều cao thì thấp nhất (10,9 mm). Nhƣ vậy, BA ảnh hƣởng mạnh đến khả năng nhân cụm chồi của cây Trai in vitro. Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro. NT Môi Trƣờng Nồng độ BA (mg/l) Số chồi/cụm Chiều cao chồi (mm) 1 WPM - 3,4 F 21,5 A 2 WPM 0,01 11,3 E 16,7 B 3 WPM 0,03 12,6 D 15,1 C 4 WPM 0,05 14,3 C 13,7 D 5 WPM 0,1 16,4 B 12,7 E 6 WPM 0,5 20,5 A 10,9 F Cv (%) 0,76 0,66 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức suất p = 0,05 bởi trắc nghiệm LSD. 48 Hình 4.4: Nhân cụm chồi cây Trai in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA. (A) nồng độ 0,01 mg/l; (B) nồng độ 0,1 mg/l ; (C) nồng độ 0,5 mg/l. C B A 49 4.4 Thí nghiệm 5: Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro. Mục đích của thí nghiệm này là nâng cao chiều cao thân chồi và có lá phát triển mạnh mẽ là yếu tố cơ bản trong nghiên cứu nuôi cấy phát sinh rễ và thuần hóa. Kết quả thí nghiệm 4 cho thấy cụm chồi cây Trai in vitro phát sinh mạnh nhƣng chiều cao thân chồi thấp, nên cần có giai đoạn trung gian tái sinh cụm chồi. Kết quả thực nghiệm (Bảng 4.5) cho thấy khả năng tái sinh của cụm chồi cây Trai in vitro trong môi trƣờng WPM có chiều cao chồi đạt đƣợc cao (17,5 mm). Đồng thời số chồi trên cụm cũng đạt cao (6,5 chồi) và lá cũng rất phát triển (+). Trong khi đó môi trƣờng MS cho khả năng tái sinh cụm chồi thấp hơn. Chiều cao chồi chỉ đạt 15,3 mm và số chồi/cụm là 4,3 chồi, lá kém phát triển hơn (-). Nhƣ vậy, môi trƣờng WPM thích hợp cho khả năng tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro nhằm làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm nhân giống sau. Bảng 4.5: Tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro NT Môi trƣờng nuôi cấy Số chồi/cụm Chiều cao chồi (mm) Phát triển lá (+/-) 1 MS 4,3 15,3 - 2 WPM 6,5 17,5 + Cv (%) 1,85 0,61 Kết quả này có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05. 50 Hình 4.5: Tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro trên môi trƣờng khoáng cơ bản MS (A), WPM (B). A B 51 4.5 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in vitro. Nƣớc dừa (coconut water) là một dƣỡng chất có chứa đầy đủ các ion hữu cơ, thành phần nitrogen, các amino acid, enzyme, các acid vô cơ, các vitamin, các loại đƣờng nhất là đƣờng đơn gốc alcohol, các chất điều hòa sinh trƣởng và các chất khác. Nhƣ vậy, nƣớc dừa là một chất dinh dƣỡng cung cấp tất cả các thành phần cần thiết cho nhu cầu sinh trƣởng của tế bào trong nuôi cấy. Trong khi nuôi cấy sự bổ sung nƣớc dừa sẽ giảm bớt sử dụng hay không sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng, là nguyên nhân hạn chế thấp nhất biến dị do quá trình nuôi cấy in vitro trong một thời gian dài. Mục đích của thí nghiệm này là nghiên cứu ảnh hƣởng của việc bổ sung nƣớc dừa có phối hợp với các chất điều hòa sinh trƣởng trong nhân giống cây Trai Nam Bộ. Trong thí nghiệm này, chồi non in vitro đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM có bổ sung BA ( 0,1 mg/l) và nƣớc dừa (0 – 10 %). Kết quả (Bảng 4.6) cho thấy các nghiệm thức thí nghiệm đều có khả năng phát sinh chồi. Song, số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lá sai biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học với mức xác suất P = 0,05. Nghiệm thức 1 không có bổ sung nƣớc dừa thì khả năng phát sinh chồi kém hơn so với hai nghiệm thức còn lại. Nhƣng khi bổ sung nƣớc dừa hàm lƣợng từ 5 – 10 % vào trong môi trƣờng nuôi cấy thì số chồi/cụm,chiều cao chồi, số lá tăng lên rõ rệt. Hàm lƣợng nƣớc dừa (10 %) thì phát sinh chồi cao nhất 15,5 (chồi), kích thích vƣơn thân chồi (32,4 mm) và phát triển lá (8,4 lá). Với hàm lƣợng bổ sung nƣớc dừa 10 % này cũng thích hợp trong nuôi cấy mô nhiều cây khác nhƣ dó bầu (Aquiliria crassna Pierre ex. Lecomte) (Đinh Trung Chánh, 1998), cây nhãn (Euphoria longan L.) (Trần Văn Minh, 2004), Caribê (Pinus caribaea) (Hà Thị Loan, 2003). Mặt khác, một số loài cây không cần bổ sung nƣớc dừa trong nuôi cấy vẫn cho kết quả tốt nhƣ cây xoài (Mangifera india L.), cây sầu riêng (Duriozibethinus Mur) (Trần Văn Minh, 2004). 52 Nhƣ vậy, môi trƣờng WPM + BA (0,1 mg/l) bổ sung thêm nƣớc dừa (10 %) cho kết quả vƣơn thân tốt nhất trong nhân giống cây Trai in vitro. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in vitro NT Môi Trƣờng Nồng độ BA (mg/l) Cw (%) Số chồi/cụm Số lá/mẫu Chiều cao chồi (mm) 1 WPM 0,1 0 7,6 C 6,4 C 15,7 C 2 WPM 0,1 5 13,2 B 7,6 B 22,6 B 3 WPM 0,1 10 15,5 A 8,4 A 32,4 A CV (%) 0,83 1,34 0,42 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức suất P = 0,05 bởi trắc nghiệm LSD. 53 Hình 4.6: Cây Trai in vitro vƣơn thân trên môi trƣờng có chứa nƣớc dừa (A) 5% nƣớc dừa; (B) 10% nƣớc dừa. B A 54 4.6 Thí nghiệm 7: Nuôi cấy tạo rễ cây Trai in vitro. Mục tiêu là xác định môi trƣờng ra rễ nhanh chóng và hiệu quả nhất. Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt (Banerjee và Delanghe, 1985). Kết quả thực nghiệm (Bảng 4.7) cho thấy cây Trai ra rễ trong môi trƣờng WPM + IBA (0,3 mg/l) sau 30 ngày nuôi cấy. Các nghiệm thức còn lại không có dấu hiệu ra rễ. Nhƣ vậy, môi trƣờng thích hợp cho tạo rễ cây Trai là WPM + IBA (0,3 mg/l). Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của các auxin đến sự ra rễ cây Trai in vitro NT Môi trƣờng IAA (mg/l) IBA (mg/l) Ra rễ 1 MS 2 1 - 2 WPM - 0,1 - 3 WPM - 0,3 + 4 WPM - 0,5 - 55 Hình 4.7: Cây Trai in vitro ra rễ trong môi trƣờng WPM bổ sung IBA (0,3 mg/l). Hình 4.8: Cây Trai in vitro ra rễ đƣợc thuần hóa và ra bầu đất trong điều kiện vƣờn ƣơm. 56 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:  Mẫu Trai thực sinh đƣợc vô trùng tốt nhất trong dung dịch Natri hypochlorit 25 % trong thời gian 20 – 30 phút kết hợp với dung dịch HgCl2 0,05 % trong 15 phút.  Môi trƣờng khoáng cơ bản WPM bổ sung BA (0,1 mg/l) kích thích phát sinh chồi cây Trai in vitro.  Môi trƣờng khoáng cơ bản WPM bổ sung BA (1 mg/l) thích hợp tạo cụm chồi cây Trai in vitro.  Môi trƣờng WPM bổ sung BA (0,5 mg/l) thích hợp cho nhân cụm chồi cây Trai in vitro.  Môi trƣờng WPM thích hợp cho tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro.  Môi trƣờng WPM + BA (0,1 mg/l) + CW (10 %) thích hợp cho vƣơn thân cây Trai in vitro.  Cây Trai in vitro ra rễ dễ dàng trong môi trƣờng WPM + IBA (0,3 mg/l). 5.2 ĐỀ NGHỊ  Nghiên cứu tiếp điều kiện đƣa cây mô từ bình nuôi cấy in vitro ra môi trƣờng ngoài và theo dõi sinh trƣởng trong giai đoạn ra vƣờn ƣơm đến khi đạt tiêu chuẩn trồng rừng.  Xây dựng tiếp quy trình nhân giống cây Trai in vitro và trên vƣờn ƣơm. 57 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Xuân Ái, 2003. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc bảo tồn in vitro nguồn gen quý hiếm cây lát hoa (Chukrasia tabucaris. A.Juss) tại Côn đảo. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 2. Đinh Trung Chánh, 1998. Vi nhân giống cây Dó bầu (Aquilqria crasna Pierreex Lecomte) bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3. Trần Thị Dung, 2005. Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 4. Trần Văn Định, 2005. Bảo tồn nguồn gen cây thông đỏ (Taxus bacata var wallichiana Zucc.) bằng kỹ thuật nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng in vitro. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Thƣợng Hiền, 1998. Thực vật và đặc sản rừng. Đại học nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 6. Phạm Hoàng Hộ, 1972. Cây cỏ Miền Nam Việt Nam, tập 2. Trang 137. Bộ Giáo Dục Trung Tâm học liệu. 7. Trƣơng Mai Hồng, 1997. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cẩm lai Bà rịa (Dalbergia bariensis Pierre). Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 8. Trần Hợp, 2002. Tài nguyên cây gỗ Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Trang 658. 9. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại Học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 58 10. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 11. Vƣơng Lợi, 2002. Tìm hiểu các yếu tố thích hợp để nhân nhanh cây Giá Tỵ (Tectona grandis Linn.F) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô”. Luận văn tốt nghiệp cử nhân khoa học. Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGTPHCM. 12. Trần Văn Minh, 1997 (a). Những phương pháp nâng cao tính đa dạng di truyền cây ăn trái. Nhà xuất bản trẻ. Viện sinh học nhiệt đới, 225 trang. 13. Trần Văn Minh, 1997(a). Công nghệ sinh học cây ăn trái. Nhà xuất bản trẻ. Viện sinh học nhiệt đới, 578 trang. 14. Trần Văn Minh, 2004. Công nghệ sinh học – Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 933 trang. 15. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997 (a). Bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật rừng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 115 trang. 16. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997 (b). Nhân giống vô tính và trồng rừng dòng vô tính. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 120 trang. 17. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Kết quả nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây rừng. Thông tin chuyên đề Lâm Nghiệp số 1 – 2005. Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam. 18. Ly Meng Seang, 2003. Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong nhân nhanh cây giá tỵ (Tectoni grandis Linn.F.) in vitro. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học nông lâm TP. Hô Chí Minh. 19. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, tập 1, 2. 20. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương. Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 333 trang. 20 Viện sinh học nhiệt đới, 2001. Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học và công nghệ (1999 - 2000). Nhà xuất bản nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, 441 trang. 59 21 Viện sinh học nhiệt đới, 2001. Công nghệ sinh học và Nông nghiệp sinh thái bền vững. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 82 – 91. 22 Lu, C., 1993. The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro cell. Dev. Biol.29:92-96 INTERNET 1. 2. www.forestlight.co.uk/galleries/11/126.jpg 3. rmbr.nus.edu.sg/.../pg17_plantf.jpg 4. 5. 6. http:www.forest.go.th/botany/Flora/species%20list/volume6/Longaniaceae.htm 7. etail.asp?SpecID=1474 8. botany.cs.tamu.edu/FLORA/schoepke/fag-fr-2.jpg 9. www.acs.ac.th/.../stories/botanic/fagraea03.jpg 10. 11. hueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx%3Furl%3D/thuocdongy/T/Trai.htm%26 key%3D%26char%3DT+Fagraea&hl=vi&gl=vn&ct=clnk&cd=2 12. mlam/phanloaigo/Phanloai_go2.htm+Fagraea&hl=vi&gl=vn&ct=clnk&cd=4 a Phần 7. PHỤ LỤC Các môi trƣờng khoáng cơ bản dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô cây Trai in vitro. Thành phần (1) Hàm lƣợng (mg/l) (2) MS (3) WPM (4) Nguyên tố đa lƣợng CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O KNO3 K2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O NH4NO3 NaH2PO4 440 - 1900 - 170 370 1650 - 96 556 - 990 170 370 400 - Nguyên tố vi lƣợng CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O FeSO4.7H2O H3BO3 KI MnSO4.H2O MnSO4.4H2O Na2EDTA Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O Sodium Ferric 0,025 0,025 27,8 6,2 0,83 - 23,3 37,3 0,25 8,6 - 0,025 0.025 - 6,2 - 22,3 - - 0,25 8,6 30 Vitamin và amino acid Biotin Glycine Myo – inositol - 2,0 100 - 2,0 100 b Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamin HCl 0,5 0,5 0,1 0,5 0,5 0,1 Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cây ban đầu từ cây Trai thực sinh a) Vô trùng bằng Hypo – Natri: Bảng phân tích ANOVA về tỷ lệ mẫu sống vô trùng Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 11 37.407 3.401 226.712 0.0000 Within 24 0.360 0.015 --------------------------------------------------------------------------- Total 35 37.767 Coefficient of Variation = 4.00% b) Vô trùng bằng Hypo – Natri kết hợp với HgCl2 Bảng phân tích ANOVA về tỷ lệ mẫu sống vô trùng Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 11 44.220 4.020 209.739 0.0000 Within 24 0.460 0.019 --------------------------------------------------------------------------- Total 35 44.680 Coefficient of Variation = 3.01% c Thí nghiệm 2: Khả năng tạo cụm chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). Bảng phân tích ANOVA về số chồi/cụm Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 1 69.360 69.360 6936.013 0.0000 Within 4 0.040 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 5 69.400 Coefficient of Variation = 0.83% Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến khả năng tạo cụm chồi cây Trai in vitro. Bảng phân tích ANOVA số chồi/cụm Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 4 1125.444 281.361 28136.087 0.0000 Within 10 0.100 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 14 1125.544 Coefficient of Variation = 0.58% d Bảng phân tích ANOVA chiều cao chồi (mm) Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 4 195.156 48.789 4878.881 0.0000 Within 10 0.100 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 14 195.256 Coefficient of Variation = 0.72% Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro. Bảng phân tích ANOVA số chồi/cụm Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 5 494.005 98.801 9880.083 0.0000 Within 12 0.120 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 17 494.125 Coefficient of Variation = 0.76% e Bảng phân tích ANOVA chiều cao chồi (mm) Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 5 206.640 41.328 4132.808 0.0000 Within 12 0.120 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 17 206.760 Coefficient of Variation = 0.66% Thí nghiệm 5: Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro. Bảng phân tích ANOVA sồ chồi/cụm Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 1 7.260 7.260 726.000 0.0000 Within 4 0.040 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 5 7.300 Coefficient of Variation = 1.85% f Bảng phân tích ANOVA chiều cao chồi (mm) Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 1 7.260 7.260 725.998 0.0000 Within 4 0.040 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 5 7.300 Coefficient of Variation = 0.61% Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in vitro. Bảng phân tích ANOVA số chồi/cụm Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 99.060 49.530 4952.994 0.0000 Within 6 0.060 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 99.120 Coefficient of Variation = 0.83% g Bảng phân tích ANOVA chiều cao chồi (mm). Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 422.540 211.270 21126.906 0.0000 Within 6 0.060 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 422.600 Coefficient of Variation = 0.42% Bảng phân tích ANOVA số lá /mẫu Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 6.080 3.040 304.001 0.0000 Within 6 0.060 0.010 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 6.140 Coefficient of Variation = 1.34%