Luận văn Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

lôùn nhaát. Loaøi ñöôïc nhaéc ñeán nhieàu nhaát laø Lc. lactis vôùi khaû naêng saûn xuaát nisin. Vì vi khuaån lactic laø moät vi khuaån ñöôïc söû duïng roäng raõi neân noù ñöôïc phaân laäp töø raát nhieàu nguoàn khaùc nhau. Nguoàn phaân laäp vi khuaån lactic thöôøng laø söõa töï leân men, caùc saûn phaåm töø söõa nhö fromage hoaëc laø caùc saûn phaåm leân men lactic truyeàn thoáng cuûa caùc nöôùc, nhö kim chi cuûa Haøn Quoác, bushera cuûa Uganda, vaø ñoâi luùc nguoàn phaân laäp laø caùc nguyeân lieäu cuûa caùc saûn phaåm leân men nhö rau caûi, giaù ñoã,… hay nöôùc hoà, nöôùc gieáng, nöôùc boït cuûa ngöôøi. [21, 23] Caùc phöông phaùp phaân laäp döïa treân caùc ñaëc tính hình thaùi vaø sinh tröôûng cuûa chuûng caàn phaân laäp. Taát caû goàm 3 böôùc: Taùch loaïi caùc chuûng töø nguoàn phaân laäp ra thaønh töøng chuûng rieâng reõ Moâi tröôøng maø ta phaân laäp thöôøng chöùa raát nhieàu loaøi vi sinh vaät khaùc nhau bôûi noù laø nhöõng moâi tröôøng giaøu dinh döôõng. Trong moät toå hôïp nhieàu chuûng loaøi nhö vaäy, nhieäm vuï ñaàu tieân cuûa chuùng ta laø phaûi taùch rieâng bieät chuùng ra thaønh caùc chuûng thuaàn khieát. Ta coù theå deã daøng laøm ñieàu naøy vôùi caùc ñieàu kieän moâi tröôøng ñaëc hieäu khaùc nhau seõ cho ra caùc nhoùm loaøi khaùc nhau. Vôùi naám men, ta söû duïng moâi tröôøng malt hay moâi tröôøng RBCA (Rose Bengal Chloramphenicol agar) nuoâi caáy ôû 25oC trong voøng 1 – 2 ngaøy. Coliforms ñöôïc phaân laäp treân beà maët thaïch cuûa moâi tröôøng VRBA (Violet Red Bile agar) trong tuû aám coù nhieät ñoä 37oC sau 24h. Coøn vôùi caùc chuûng LAB ñöôïc nuoâi treân moâi tröôøng thaïch MRS hay M17 ôû nhieät ñoä 30o trong voøng 48h. Duø ñaõ nuoâi caáy ñuùng moâi tröôøng vaø ñuùng thôøi gian ñaëc hieäu nhöng treân beà maët moâi tröôøng vaãn coù nhieàu loaïi khuaån laïc cuûa nhieàu loaøi khaùc nhau vì vaäy ta phaûi tieán haønh taùch loaïi theâm vaøi laàn nöõa ñeå coù theå thu töøng chuûng thuaàn khieát. [7, 22] Nhận danh döïa vaøo ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa chuûng Khi ñaõ taùch loaïi ra thaønh töøng loaøi rieâng reõ, ta seõ döïa vaøo caùc ñaëc tính hình thaùi, nhuoäm Gram ñeå phaân loaïi, saøng loïc laïi caùc chuûng coù ñaëc tính gioáng loaøi maø ta caàn phaân laäp. Ñaëc tính hình thaùi ôû ñaây laø hình daùng teá baøo, khaû naêng di chuyeån, söï sinh baøo töû… [20, 23] Nhaän danh nhôø vaøo caùc hoaït ñoäng sinh hoùa cô baûn Vôùi caùc böôùc saøng loïc ôû treân ñaõ loaïi bôùt caùc chuûng khoâng caàn thieát, ta seõ tieán haønh nuoâi caáy trong caùc ñieàu kieän khaùc nhau, thaønh phaàn moâi tröôøng ñaëc bieät khaùc nhau ñeå kieåm tra möùc ñoä sinh tröôûng, phaùt trieån cuûa töøng loaøi. Tieáp theo ta seõ khaûo saùt khaû naêng chuyeån hoùa caùc chaát ñaëc tröng cuûa loaøi hay saûn xuaát ra caùc hôïp chaát ñaëc bieät. [7, 23] Ví duï nhö trong LAB, chuûng Lc. lactis coù khaû naêng sinh tröôûng trong moâi tröôøng coù noàng ñoä muoái NaCl leân ñeán 4%, nhieät ñoä cuûa moâi tröôøng coù theå leân tôùi 40oC, ngoaøi ra noù coøn coù khaû naêng saûn xuaát ra khí töø glucose, dextran töø sucrose vaø ammonia töø arginine. Ñaëc bieät hôn heát laø chuûng naøy coù khaû naêng saûn sinh ra bacteriocin maø cuï theå laø nisin coù theå öùc cheá ñöôïc moät soá vi khuaån G+. [22] Vôùi caùc phoøng thí nghieäm lôùn vaø hieän ñaïi, caùc chuûng phaân laäp coøn coù caùc böôùc nhaän danh phöùc taïp vaø yeâu caàu kó thuaät cao hôn nhö kieåm tra gen, kieåm tra voøng plasmid… [23] Söõa vaø caùc saûn phaåm leân men töø söõa laø nguoàn thöïc phaåm dinh döôõng ñöôïc söû duïng roäng raõi treân toaøn theá giôùi. Trong moâi tröôøng giaøu dinh döôõng nhö söõa thì coù raát nhieàu loaøi vi sinh vaät phaùt trieån, vaø noåi baät nhaát laø caùc loaøi LAB do trong söõa chöùa nhieàu lactose, nguoàn carbon chính cuûa loaøi. Töø laâu ngöôøi ta ñaõ tieán haønh phaân laäp caùc chuûng vi khuaån lactic khaùc nhau trong söõa vaø söõa leân men ñeå thu ñöôïc caùc chuûng thuaàn khieát, söû duïng trong caùc saûn phaåm rieâng bieät. Trong söõa töôi coù raát nhieàu loaøi vi sinh vaät nhö: Brevibacterium linens, Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis subsp. lactis, subsp. cremoris, subsp. diacetylactis, Leuconostoc lactis, Propionibacterium spp., Steptococcus thermophilus, Candida kefir, Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti, Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus… [11] Hình 1.6: Heä thoáng caùc loaøi vi khuaån phaân loaïi theo nhuoäm Gram quan troïng trong leân men söõa [11] Chöông 2: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 2.1 NGUYEÂN LIEÄU 2.1.1 Chuûng vi sinh vaät vaø moâi tröôøng nuoâi caáy, giöõ gioáng Chuûng vi sinh vaät chæ thò (duøng trong phöông phaùp kieåm tra bacteriocin – phöông phaùp Agar Well Diffusion) laø chuûng cuûa vi khuaån Listeria monocytogenes ñöôïc cung caáp bôûi phoøng thí nghieäm Coâng ngheä sinh hoïc, boä moân Coâng ngheä sinh hoïc, khoa Kyõ thuaät Hoùa hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa thaønh phoá Hoà Chí Minh. Vi khuaån ñöôïc löu tröõ gioáng trong oáng thaïch nghieâng treân moâi tröôøng TSA–YE (xem phuï luïc) ôû nhieät ñoä 4oC. Canh tröôøng ñöôïc chuaån bò baèng caùch laáy khuaån laïc cuûa chuûng cho vaøo oáng nghieäm chöùa 10 ml moâi tröôøng dòch theå tryptic soy coù boå sung chaát chieát naám men (TSB – YE) (Xem phuï luïc) nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 30oC trong voøng 24h. Vi khuaån lactic caàn phaân laäp coù moâi tröôøng phaân laäp vaø giöõ gioáng laø moâi tröôøng thaïch MRS (Man, Rogosa, Sharpe) (Xem phuï luïc) vaø ñöôïc nuoâi ôû 30oC trong voøng 48h. Sau khi coù ñöôïc caùc khuaån laïc thuaàn khieát, ta seõ laáy khuaån laïc cho vaøo oáng nghieäm chöùa 10 ml moâi tröôøng dòch theå MRS (Xem phuï luïc) vaø nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 30oC trong voøng 24h. 2.1.2 Nguoàn nguyeân lieäu phaân laäp Nguoàn 1: Söõa töôi leân men Chuaån bò: söõa töôi sau khi mua töø traïi boø söõa ôû quaän 9 veà phoøng thí nghieäm seõ ñöôïc ly taâm taùch beùo vaø cho töï leân men ôû nhieät ñoä 28oC trong voøng 17h. Trong khoaûng thôøi gian töï leân men, söõa seõ tieán haønh ñoâng tuï nhôø vaøo caùc enzyme vaø acid maø lactococci vaø caùc vi sinh vaät khaùc saûn sinh ra. Vaø hieän töôïng ñoâng tuï naøy baét ñaàu xaûy ra töø giôø thöù 10 cuûa quaù trình leân men. Canh tröôøng naøy ñöôïc söû duïng laø nguoàn phaân laäp vi khuaån. [31] Nguoàn 2: Caùc saûn phaåm rau caûi muoái chua (caûi muoái chua, caø phaùo muoái chua, döa giaù) Ba loaïi saûn phaåm naøy ñöôïc mua ôû chôï Hoøa Höng vaø laáy tröïc tieáp nöôùc leân men laøm canh tröôøng ñeå phaân laäp chuûng vi khuaån caàn thieát maø khoâng caàn theâm thao taùc leân men hay xöû lyù naøo khaùc trong phoøng thí nghieäm. [12, 23] Nguoàn 3: Kim chi Nguoàn nguyeân lieäu söû duïng ñöôïc mua töø sieâu thò Big C. Nöôùc leân men cuûa kim chi ñöôïc pha loaõng vaø phaân laäp ra caùc chuûng vi khuaån. Nguoàn 4: Giaù Giaù ñöôïc mua ôû chôï Hoøa Höng, ñem veà xay nhuyeãn vaø pha loaõng vaøo nöôùc voâ khuaån ñeå laøm canh tröôøng chöùa vi sinh vaät phaân laäp. [35] Caùc chuûng vi khuaån trong caùc saûn phaåm leân men laø do trong baûn thaân nhöõng loaïi rau quaû ñaõ coù saün. Chuùng söû duïng caùc nguoàn dinh döôõng trong rau quaû ñeå phaùt trieån leân. Vì vaäy maø ta seõ duïng chính nhöõng rau quaû töï nhieân naøy ñeå laøm nguoàn phaân laäp. 2.2 THIEÁT KEÁ THÍ NGHIEÄM Choïn nguoàn phaân laäp Taùch loaïi thaønh töøng loaøi vi sinh vaät thuaàn khieát Phaân bieät baèng ñaëc tính hình thaùi chuûng vi khuaån Xaùc ñònh baèng ñaëc tính sinh lyù cuûa chuûng vi khuaån Kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin Khaûo saùt khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng Khaûo saùt caùc yeáu toá ñieàu kieän nuoâi caáy aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin Thuyeát minh tieán trình thí nghieäm Töø caùc nguoàn ñaõ choïn, ta tieán haønh caùc thao taùc chuaån bò ñeå coù theå phaân laäp toát nhaát. Pha loaõng caùc canh tröôøng, taùch loaïi caùc chuûng vi sinh vaät rieâng reõ ra khoûi nhau baèng phöông phaùp daøn ñeàu vaø caáy ria. Töø caùc nhoùm vi sinh vaät thuaàn khieát, ta laøm caùc böôùc phaân loaïi baèng ñaëc tính hình thaùi nhôø vaøo hình thaùi khuaån laïc, hình thaùi cuûa vi sinh vaät khi quan saùt döôùi kính hieån vi vaø qua khoùa nhuoäm Gram. Sau ñoù xaùc ñònh chuûng vi khuaån lactic baèng khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin baèng phöông phaùp Agar Well Diffusion. Vôùi chuûng vi khuaån phaân laäp ñöôïc, tieán haønh khaûo saùt söï sinh tröôûng baèng phöông phaùp ño quang O.D.600 nm vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Töø keát quaû ñoù xaây döïng ñöôïc ñöôøng cong sinh tröôûng vaø moái lieân heä giöõa söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc ñieàu kieän nuoâi caáy (pH, nhieät ñoä) ñeán söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin nhaèm caûi thieän haøm löôïng chaát öùc cheá trong dòch nuoâi caáy thu ñöôïc. 2.3 PHÖÔNG PHAÙP 2.3.1 Phöông phaùp daøn ñeàu, caáy ria Töø canh tröôøng chöùa vi sinh vaät ñaõ chuaån bò, tieán haønh pha loaõng baèng dung dòch nöôùc peptone 0,1% theo caùc caáp 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109. Duøng pipet laáy 0,1ml canh tröôøng ñaõ pha loaõng coù chöùa vi sinh vaät trong caùc oáng nghieäm theo töøng caáp ñoå vaøo töøng hoäp Petri chöùa saün moâi tröôøng thaïch MRS. Laáy que trang ñaõ ñöôïc voâ khuaån daøn ñeàu treân khaép beà maët thaïch. Hoäp Petri ñaõ caáy vi sinh vaät ñöôïc cho vaøo tuû aám ôû nhieät ñoä 30oC, nuoâi caáy trong voøng 48 giôø ñeå thu ñöôïc caùc khuaån laïc moïc treân beà maët thaïch. [6] Choïn nhöõng hoäp coù maät ñoä khuaån laïc vöøa phaûi, khoâng daøy ñaëc, khoâng choàng leân nhau. Treân beà maët thaïch luùc naøy seõ coù nhieàu loaïi khuaån laïc do nhieàu loaøi vi sinh vaät khaùc nhau phaùt trieån leân neân ñeå bieát roõ ñaâu laø chuûng caàn phaân laäp, phaûi tieán haønh caáy daøn ñeàu theâm 2,3 laàn nöõa. Ñeå phaân loaïi sô boä, khuaån laïc ñöôïc phaân loaïi döïa theo caùc hình thaùi beân ngoaøi töông töï nhau thaønh töøng nhoùm vaø tieán haønh laøm tieâu baûn quan saùt treân kính hieån vi, loaïi boû bôùt naám men vaø naám moác. Caùc khuaån laïc coøn laïi laø vi khuaån, ta cuõng seõ phaân loaïi theo hình thaùi beân ngoaøi nhö ñoä trong, ñoä nhaùm, maøu saéc cuûa khuaån laïc ñeå pha loaõng töøng loaïi moät vaøo trong dòch peptone 0,1%, cuõng tieán haønh pha loaõng theo caùc caáp roài ñoå hoäp Petri theo phöông phaùp daøn ñeàu nhö treân. Sau vaøi laàn ñoå hoäp daøn ñeàu taùch loaïi caùc chuûng vi khuaån ra khoûi hoãn hôïp, ta thu ñöôïc caùc khuaån laïc thuaàn khieát. [12] Song song vôùi vieäc phaân laäp daøn ñeàu ta coøn coù theå caáy ria ñeå thu ñöôïc caùc khuaån laïc thuaàn khieát maø khoâng toán coâng quaù nhieàu vaøo vieäc pha loaõng vaø daøn ñeàu treân hoäp Petri. Phaân laäp caáy ria vôùi caùc loaïi khuaån laïc ta ñaõ taùch loaïi sô boä. Sau khi phaân laäp caáy ria, vi khuaån seõ ñöôïc taùch ra khoûi hoãn hôïp vaø phaùt trieån thaønh moät khuaån laïc rieâng leû, thuaàn khieát. [6] Sau khi ñaõ phaân laäp thaønh caùc khuaån laïc thuaàn khieát cuûa töøng loaøi moät, chuûng seõ ñöôïc giöõ gioáng trong oáng thaïch nghieâng tröôùc khi tieán haønh caùc khaûo saùt khaùc. Caùc oáng gioáng ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä 4oC caáy chuyeàn ñònh kì 3 tuaàn/laàn ñeå ñaûm baûo caùc hoaït tính sinh hoïc cuûa chuûng. [6, 23] 2.3.2 Phöông phaùp ñònh danh teá baøo vi khuaån 2.3.2.1 Ñònh danh baèng ñaëc ñieåm hình thaùi Vì chuûng Lc. lactis laø coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát neân trong quaù trình phaân laäp, ta döïa vaøo caùc ñaëc tính cuûa loaøi naøy ñeå nhaän danh vaø kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Vôùi khuaån laïc hoaøn toaøn rieâng reõ töø caáy ria, laøm tieâu baûn ñeå quan saùt ñoä ñoàng nhaát cuõng nhö hình thaùi beân ngoaøi cuûa loaøi. Tröôùc tieân ta seõ döïa vaøo caùc ñaëc tính hình thaùi cuûa chuûng vi khuaån phaân laäp ñöôïc vôùi ñaëc tính cuûa loaøi Lc. lactis. Vôùi caùc ñaëc tính hình thaùi cuûa chuûng vaø cuûa khuaån laïc nhö sau: vi khuaån coù teá baøo hình tröùng coù kích thöôùc 0.5–1.0 µm, ôû daïng rieâng reõ, xeáp thaønh ñoâi hay chuoãi ngaén, laø teá baøo vi khuaån G+, khoâng sinh baøo töû, khoâng coù khaû naêng chuyeån ñoäng. Khuaån laïc cuûa chuûng Lc. lactis coù maøu traéng söõa, hôi trong, kích thöôùc nhoû, hình troøn, coù beà maët mòn boùng. [20, 31] Sau khi loaïi caùc loaøi khoâng phuø hôïp, tieán haønh caáy thaïch nghieâng ñeå giöõ gioáng, vaø söû duïng cho caùc böôùc tieáp theo. Nhuoäm Gram Laáy canh tröôøng vi khuaån ñöôïc nuoâi caáy ôû 30oC trong voøng 24h, ñem quan saùt khaû naêng sinh tröôûng vaø tieán haønh nhuoäm Gram ñeå nhaän daïng loaøi vi khuaån maø ta caàn phaân laäp. [6] Vì loaøi Lactococci laø G+ neân khi nhuoäm Gram seõ cho caùc teá baøo giöõ maøu tím cuûa dung dòch tím tinh theå. 2.3.2.2 Kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng Ñaây cuõng laø böôùc xaùc ñònh ñaëc tính hoùa sinh cuûa chuûng phaân laäp. Khuaån laïc rieâng reõ ñöôïc cho vaøo moâi tröôøng dòch theå MRS nuoâi caáy ôû 30oC trong voøng 24h. Canh tröôøng sau khi nuoâi caáy ñöôïc ly taâm laïnh ñeå taùch teá baøo vi khuaån taän thu dòch bacteriocin (ôû 4oC, 4000 voøng/phuùt trong 20 phuùt). Dòch ly taâm thu ñöôïc seõ söû duïng ñeå thöû hoaït tính bacteriocin baèng phöông phaùp Agar Well Diffusion. [43]. Cuï theå nhö sau: Chuaån bò hoäp Petri voâ khuaån vaø moâi tröôøng thaïch nuoâi caáy ñaõ tieät truøng. Ta cho 20ml moâi tröôøng thaïch MRS vaøo hoäp Petri 90. Tieán haønh caáy chuûng chæ thò ñaõ ñöôïc ñieàu chænh veà noàng ñoä 106 cfu/ml vaøo hoäp vôùi theå tích 1%. Ñeå khoâ trong voøng 30 phuùt, ta seõ ñuïc loã thaïch 6mm treân moãi ñóa thaïch. Cho 40 µl dòch ly taâm coù chöùa chaát khaùng sinh vaøo trong moãi loã thaïch. Ta seõ nuoâi caáy caùc hoäp Petri ôû nhieät ñoä 30oC trong voøng 16 giôø. Vaø sau ñoù ta seõ quan saùt hoaït tính khaùng khuaån döïa treân caùc voøng öùc cheá ño ñöôïc treân hoäp. [19] Ñoä chuaån hoaït ñoä cuûa dòch khaùng sinh AU.ml-1 ñöôïc tính theo coâng thöùc AU.ml-1= (1000/40).D.10(R/r) Trong ñoù: AU.ml-1 laø ñoä chuaån. AU (Arbitrary Unit): ñôn vò töï do. D: ñoä pha loaõng cuûa dòch chöùa bacteriocin R: ñöôøng kính voøng öùc cheá (mm) r: ñöôøng kính ban ñaàu cuûa loã thaïch (mm) (ôû ñaây r = 6) [19] 2.3.3 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy leân khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng vi khuaån môùi phaân laäp 2.2.3.1 Khaûo saùt söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng theo thôøi gian nuoâi caáy Ta tieán haønh nuoâi caáy chuûng ôû moâi tröôøng MRS ôû ñieàu kieän nhieät ñoä 30oC vaø pH cuûa moâi tröôøng laø 6.0. Sau khi caáy chuûng vi khuaån lactic vaøo moâi tröôøng maãu seõ ñöôïc laáy theo töøng giôø moät cho ñeán khi ñuû 24h. Khi ñaõ nuoâi caáy vi khuaån trong khoaûng thôøi gian thích hôïp, ñem ly taâm laïnh moâi tröôøng nuoâi caáy ôû 4oC, 4000 voøng/phuùt trong voøng 20 phuùt ñeå thu ñöôïc sinh khoái cuûa vi khuaån lactic. Taùch dòch loûng ra ñeå kieåm tra khaû naêng saûn sinh bacteriocin theo phöông phaùp Agar Well Diffusion coøn phaàn sinh khoái laéng xuoáng ta ñem pha vaøo nöôùc peptone roài ñem ly taâm laïi. Tieán haønh ly taâm nhö vaäy 2 laàn ñeå keát quaû ño quang khoâng bò aûnh höôûng bôûi maøu cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy cuõ. Pha loaõng laïi phaàn laéng trong oáng ly taâm ñeå roùt vaøo cuvet vaø ñem ño maät ñoä quang OD ôû böôùc soùng 600 nm. Maãu traéng kieåm chöùng laø maãu dung dòch peptone 0,1%. [6] Vôùi soá lieäu thu ñöôïc trong ño quang, ta döïng ñöôøng cong sinh tröôûng cho chuûng vi khuaån. 2.2.3.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä vaø pH tôùi söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng Tröôùc tieân chuûng seõ ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng dòch theå MRS ôû pH = 6.0 vôùi caùc ñieàu kieän nhieät ñoä khaùc nhau: 25, 30, 37oC vaø ôû nhieät ñoä 30oC vôùi caùc giaù trò pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy khaùc nhau: 5.0, 6.0, 7.0. Trong khi nuoâi caáy, maãu canh tröôøng ñöôïc laáy ra ñeå kieåm tra theo caùc khoaûng thôøi gian thích hôïp. Caùc maãu naøy ñöôïc ly taâm laïnh, ño quang vaø kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Töø caùc keát quaû thu ñöôïc ta seõ coù ñöôïc nhieät ñoä vaø pH moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp cho chuûng vi khuaån maø ta phaân laäp ñöôïc. Chöông 3 KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN 3.1 PHAÂN LAÄP 3.1.1 Hình thaùi khuaån laïc Nguoàn 1: Söõa töï leân men Trong laàn daøn ñeàu ñaàu tieân töø canh tröôøng söõa töôi töï leân men, hoäp Petri ñöôïc uû ôû nhieät ñoä 30oC, sau 48 giôø coù beà maët thaïch MRS xuaát hieän 3 loaïi khuaån laïc khaùc nhau maøu traéng söõa: (1a) Khuaån laïc coù maøu traéng ñuïc, lôùn, beà maët khuaån laïc boùng mòn, meùp xung quanh khuaån laïc troøn ñeàu khoâng coù raêng cöa. (1b) Khuaån laïc coù maøu traéng hôi trong, khaù lôùn, beà maët khuaån laïc khaù boùng mòn, meùp xung quanh khuaån laïc troøn ñeàu khoâng coù raêng cöa. (1c) Khuaån laïc maøu traéng ñuïc, nhoû, beà maët khuaån laïc nhaùm, khoâng boùng mòn, meùp xung quanh khuaån laïc khoâng bo troøn maø coù hình raêng cöa. Töø 3 loaïi khuaån laïc ñoù, ta pha loaõng vaøo dung dòch peptone 0.1% ñeå daøn ñeàu, thu ñöôïc caùc chuûng thuaàn thieát hôn. Qua hai laàn daøn ñeàu, caùc chuûng ñöôïc phaân bieät döïa treân ñaëc tính hình thaùi beân ngoaøi khi quan saùt ôû kính hieån vi coù ñoä phoùng ñaïi 40x. Keát quaû ñaït ñöôïc nhö sau: (1a) Teá baøo coù daïng hình troøn, rieâng reõ hay keát ñoâi, ôû giöõa teá baøo coù nhaân, kích thöôùc teá baøo lôùn, khoâng chuyeån ñoäng. (1b) Teá baøo coù daïng hình troøn keát thaønh chuoãi daøi, kích thöôùc teá baøo nhoû, khoâng chuyeån ñoäng. (1c) Teá baøo coù daïng hình troøn, khoâng chuyeån ñoäng, ôû daïng rieâng reõ hay keát ñoâi, chuoãi ngaén, kích thöôùc teá baøo nhoû. Caùc ñaëc tính hình thaùi beân ngoaøi cuûa chuûng Lc. lactis caàn phaân laäp cho thaáy raèng nhoùm (1a) vaø (1b) khoâng phuø hôïp. Nhoùm (1a) coù kích thöôùc raát lôùn, laïi coù nhaân roõ raøng neân coù theå ñoù laø naám men, khoâng phaûi chuûng vi khuaån lactic. Nhoùm (1b) vaø (1c) coù kích thöôùc gaàn nhau nhöng laïi coù kieåu saép xeáp teá baøo khaùc nhau. Qua quan saùt nhoùm (1b) coù theå thuoäc loaøi Streptococcus. Nguoàn 2: Caùc loaïi rau quaû muoái chua (caûi muoái chua, caø phaùo muoái chua, döa giaù) vaø kim chi Trong laàn daøn ñeàu ñaàu tieân, sau 48 giôø nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 30oC, treân beà maët thaïch MRS cuõng xuaát hieän 3 loaïi khuaån laïc ñeàu coù maøu traéng söõa vaø beà maët khuaån laïc ñeàu boùng mòn, meùp xung quanh troøn ñeàu, khoâng coù raêng cöa: (2a) Khuaån laïc coù maøu traéng ñuïc, coù kích thöôùc nhoû. (2b) Khuaån laïc coù maøu traéng trong, coù kích thöôùc hôi lôùn. (2c) Khuaån laïc coù maøu traéng ñuïc, coù kích thöôùc lôùn. (2d) Rieâng trong hoäp Petri daøn ñeàu töø canh tröôøng cuûa kim chi coù khuaån laïc maøu traéng trong, beà maët hôi môø, kích thöôùc raát nhoû. Qua nhieàu laàn daøn ñeàu taùch loaïi sau ñoù, keát quaû quan saùt treân kính hieån vi vôùi ñoä phoùng ñaïi 40x cho thaáy: (2a) Teá baøo coù kích thöôùc nhoû, hình troøn, keát chuoãi ngaén, khoâng chuyeån ñoäng. (2b) Teá baøo coù kích thöôùc nhoû, hình que daøi, khoâng chuyeån ñoäng. (2c) Teá baøo coù kích thöôùc lôùn, hình troøn rieâng reõ hoaëc keát ñoâi, giöõa teá baøo coù theå quan saùt thaáy roõ nhaân, khoâng chuyeån ñoäng. (2d) Teá baøo coù kích thöôùc nhoû, hình troøn rieâng reõ hoaëc keát chuoãi ngaén, khoâng chuyeån ñoäng. Loaïi boû bôùt nhoùm (2c) vì teá baøo coù kích thöôùc lôùn nhö vaäy coù theå keát luaän laø naám men. Nhoùm (2b) coù hình daïng daøi neân coù theå laø loaøi Bacillus. Nhoùm (2a), (2b) vaø (2d) duø khoâng coù ñaëc ñieåm gioáng nhö loaøi Lc. lactis nhöng ta vaãn laáy khuaån laïc cuûa chuùng cho vaøo moâi tröôøng dòch theå MRS ñeå nuoâi caáy vaø thöû khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Nguoàn 3: Giaù Trong laàn daøn ñeàu ñaàu tieân, sau 48 giôø nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 30oC, treân beà maët thaïch MRS chæ xuaát hieän moät loaïi khuaån laïc duy nhaát coù maøu traéng söõa, coù kích thöôùc nhoû, beà maët boùng mòn, meùp khoâng coù raêng cöa. Sau khi daøn ñeàu theâm laàn nöõa, beà maët hoäp Petri vaãn chæ coù moät loaïi khuaån laïc (3a). Quan saùt treân kính hieån vi cho thaáy caùc teá baøo hình troøn, xeáp rieâng reõ hay thaønh töøng ñoâi, coù kích thöôùc nhoû, khoâng chuyeån ñoäng. Caùc chuûng coøn laïi (1b, 1c, 2a, 2b, 2d, 3a) maëc duø coù chuûng khoâng phuø hôïp vôùi caùc ñaëc ñieåm hình thaùi cô baûn cuûa chuûng caàn phaân laäp nhöng taát caû vaãn ñöôïc ñem ñi nuoâi caáy trong moâi tröôøng dòch theå MRS ôû 30oC trong voøng 24 giôø ñeå nhuoäm Gram vaø kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin baèng phöông phaùp Agar Well Diffusion. Keát quaû thu ñöôïc trong baûng 3.1. Baûng 3.1: Keát quaû phaân loaïi baèng nhuoäm Gram vaø kieåm tra hoaït tính bacteriocin cuûa caùc chuûng thu nhaän ñöôïc trong quaù trình phaân laäp Phaân bieät nhôø nhuoäm Gram Kieåm tra hoaït tính bacteriocin Keát quaû 1a G+ Khoâng coù voøng öùc cheá Loaïi 1c G+ Theå hieän voøng öùc cheá Nhaän 2a G+ Khoâng coù voøng öùc cheá Loaïi 2b G+ Khoâng coù voøng öùc cheá Loaïi 2d G+ Khoâng coù voøng öùc cheá Loaïi 3a G+ Khoâng coù voøng öùc cheá Loaïi Chæ coù moät chuûng vi khuaån coù caùc hình thaùi beân ngoaøi phuø hôïp vôùi caùc ñaëc tính cuûa loaøi caàn phaân laäp vaø theå hieän vuøng öùc cheá ñoái vôùi chuûng chæ thò trong phöông phaùp Agar Well Diffusion. Khuaån laïc cuûa chuûng vi khuaån lactic phaân laäp töø nguoàn söõa leân men töï nhieân ñöôïc theå hieän ôû hình 3.1 vaø hình thaùi cuûa chuûng ñöôïc quan saùt döôùi kính hieån vi ñoä phoùng ñaïi 40x trong hình 3.2. Keát quaû thöû hoaït tính khaùng vi sinh vaät cuûa chuûng phaân laäp ñöôïc treân loaøi L. monocytogenes ñöôïc theå hieän treân hình 3.3. Caùc hình aûnh caùc voøng öùc cheá chöùng toû coù söï hieän dieän cuûa bacteriocin. Hình 3.1: Khuaån laïc cuûa chuûng phaân laäp töø söõa leân men ñöôïc treân hoäp Petri Hình 3.2: Hình thaùi cuûa chuûng döôùi kính hieån vi coù ñoä phoùng ñaïi 40x Hình 3.3: Voøng öùc cheá cuûa dòch ly taâm ñoái vôùi L. monocytogenes (1) Söõa: ta choïn nguoàn phaân laäp naøy döïa treân keát quaû nghieân cöùu cuûa L.G. Stoyanova et al. (2005). Nghieân cöùu naøy phaân laäp ñöôïc chuûng vi khuaån Lc. lactis töø söõa töôi taùch beùo töï leân men, do hoï coù nhöõng ñieàu kieän toát hôn neân hoï ñònh danh vaø xaùc ñònh ñöôïc chính xaùc loaïi bacteriocin maø chuûng sinh toång hôïp. Trong khi ñoù, nghieân cöùu treân kim chi cuûa Sang Hee Park et al., 2003 hay nghieân cöùu treân giaù soáng naûy maàm töø ñaäu xanh cuûa M. Nomura et al., 2007 ñeàu phaân laäp ra ñöôïc chuûng vi khuaån lactic coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin nhöng trong thí nghieäm chuùng ta ñaõ khoâng laøm ñöôïc. Nguyeân nhaân ôû ñaây coù theå laø do nguoàn nguyeân lieäu ban ñaàu khaùc nhau giöõa caùc quoác gia, nguoàn rau cuû söû duïng trong nöôùc khoâng coù saün chuûng caàn phaân laäp. Caùc nghieân cöùu phaân laäp khaùc cuõng coù keát quaû toát, raát nhieàu chuûng vi khuaån phaân laäp ñöôïc coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin nhö nghieân cöùu phaân laäp Lc. lactis töø nguoàn thöùc uoáng, rau quaû leân men truyeàn thoáng Malaysia cuûa Ahmad Faris Mohd Adnan vaø Irene K.P. Tan, 2006, hay nghieân cöùu phaân laäp Lc. lactis töø thöùc uoáng leân men truyeàn thoáng cuûa Uganda – bushera cuûa C.M.B.K. Muyanja et al., 2003 nhöng do chuùng ta khoâng coù ñieàu kieän ñeå khaûo saùt caùc nguoàn nguyeân lieäu naøy. Ñoåi laïi, caùc nghieân cöùu ñöôïc tieán haønh treân nguoàn nguyeân lieäu laø caùc saûn phaåm muoái chua truyeàn thoáng cuûa nöôùc ta nhö caûi muoái chua, caø phaùo muoái chua, döa giaù nhöng khoâng thu ñöôïc keát quaû khaû quan. Töø caùc nguoàn naøy ta khoâng thu ñöôïc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin, cuõng chöa coù keát quaû nghieân cöùu naøo treân nhöõng nguoàn phaân laäp naøy neân chöa theå coù keát luaän roõ raøng naøo. Coù raát nhieàu nghieân cöùu phaân laäp vi khuaån lactic sinh bacteriocin töø fromage vaø caùc saûn phaåm töø söõa khaùc maø thôøi gian thí nghieäm haïn heïp ñaõ khoâng cho pheùp quaù nhieàu khaûo saùt. Nhö nghieân cöùu phaân laäp Lactobacillus plantarum sinh toång hôïp plantaricin C cuûa Gonzalez B et al., 2002 töø nguoàn laø caùc saûn phaåm töø söõa hay nghieân cöùu cuûa L. Aquilanti et al., 2006 phaân laäp vi khuaån lactic töø fromage Canestrato Pugliese. 3.2 KHAÛO SAÙT SÖÏ SINH TRÖÔÛNG VAØ SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN CUÛA CHUÛNG MÔÙI PHAÂN LAÄP THEO THÔØI GIAN NUOÂI CAÁY Hình 3.4: Söï sinh tröôûng ( )vaø sinh toång hôïp bacteriocin ( ) cuûa chuûng theo thôøi gian khi nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 30oC vaø pH 6.0 Söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa chuûng vi khuaån lactic trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh ñöôïc theå hieän treân hình 3.4. Pha lag cuûa chuûng keùo daøi töø giôø ñaàu tieân ñeán giôø thöù 6, O.D.600 nm taêng khoâng nhieàu töø 0.756 ñeán 0.79. Pha log baét ñaàu töø giôø thöù 7 trôû ñi vaø keát thuùc ôû giôø thöù 19 ñeå ñeán giôø thöù 20, O.D.600 nm ñaït 1.437 vaø böôùc vaøo pha oån ñònh. Pha oån ñònh keùo daøi heát thôøi gian khaûo saùt cuûa thí nghieäm. Keát quaû khaûo saùt khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng theo thôøi gian döïa treân phöông phaùp Agar Well Diffusion cuõng ñöôïc theå hieän treân hình 3.4. Töø ñoà thò cho thaáy khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin tæ leä thuaän vôùi söï sinh tröôûng cuûa chuûng. Thôøi gian ban ñaàu chuûng coøn ôû giai ñoaïn pha lag, canh tröôøng khoâng coù söï hieän dieän cuûa chaát choáng vi sinh vaät, hoaït tính bacteriocin baèng 0 AU/ml. Töø thöù 8 trôû ñi löôïng bacteriocin trong canh tröôøng môùi ño ñöôïc baèng 52.9 AU/ml. ñeán khi nuoâi caáy ñöôïc 20 giôø thì löôïng bacteriocin môùi sinh toång hôïp cao nhaát (2250 AU/ml) truøng vôùi thôøi ñieåm ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa chuûng ñi vaøo pha oån ñònh. Cuõng töø ñoù maø ta nhaän thaáy raèng hoaït tính choáng vi sinh vaät cuûa bacteriocin khoâng bò aûnh höôûng nhieàu trong moâi tröôøng nuoâi caáy luùc baáy giôø ñaõ coù pH thaáp do acid lactic cuûa quaù trình leân men ñaõ nhieàu. Hoaït tính naøy vaãn oån ñònh ôû möùc cao cho heát thôøi gian khaûo saùt cuûa thí nghieäm. Töø nhöõng keát quaû thu nhaän ñöôïc, thôøi gian nuoâi caáy ñeå thu ñöôïc dòch coù chöùa haøm löôïng bacteriocin cao nhaát laø sau 20 giôø, ñoàng thôøi cuõng laø thôøi gian ñöôøng cong sinh tröôûng chuyeån töø pha log sang pha oån ñònh. Keát quaû naøy hoaøn toaøn töông töï vôùi keát quaû nghieân cöùu treân chuûng vi khuaån Lc. lactis subsp. lactis phaân laäp töø kim chi cuûa H. J. Choi et al. (2000) vaø nghieân cöùu cuûa Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks, 2004 treân chuûng Lc. lactis subsp. lactis phaân laäp töø “bia barley”. Trong hai nghieân cöùu ñoù, ñieàu kieän nuoâi caáy gioáng vôùi thí nghieäm cuûa luaän vaên, töùc laø cuõng nuoâi caáy treân moâi tröôøng dòch theå MRS coù pH ban ñaàu 6.0 ôû 30oC coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cao nhaát vaø ñöôøng cong sinh tröôûng coù pha log keát thuùc ôû 20 giôø. Trong khi ñoù, nghieân cöùu cuûa Suranjita Mitra et al., 2005 khaûo saùt chuûng Lc. lactis phaân laäp töø söõa leân men treân moâi tröôøng TGE (tryptone – glucose – yeast extract) coù pH ban ñaàu 6.5 ôû nhieät ñoä 37oC cho keát quaû laø söï sinh tröôûng cao nhaát sau 6 giôø vaø khaû naêng sinh toång hôïp chaát choáng vi sinh vaät cao nhaát sau 7 giôø. Hay ít hôn laø nghieân cöùu cuûa L.G. Stoyanova et al., 2005, thôøi gian toát nhaát thu nhaän canh tröôøng nuoâi caáy chuûng Lc. lactis phaân laäp töø söõa leân men trong moâi tröôøng MRS coù pH ban ñaàu 7.0 ôû 30oC laø sau 12 giôø. Beân caïnh ñoù cuõng coù nghieân cöùu cuûa E. P. Knoshaug et al., 2000 treân chuûng Lc. lactis subsp. lactis phaân laäp töø nguoàn thöùc uoáng söõa leân men nheï cuûa vuøng Scandinavi cho keát quaû thôøi gian nuoâi caáy toái thích laø 16 giôø. Moâi tröôøng nuoâi caáy ôû laø moâi tröôøng M17 coù boå sung glucose (xem phuï luïc) coù pH ban ñaàu laø 7.0. M17 laø moâi tröôøng thích hôïp hôn cho chuûng Lc. lactis subsp. lactis vì vaäy maø chuûng phaùt trieån vaø sinh toång hôïp bacteriocin nhanh hôn. Chính vì vaäy maø thôøi gian toái öu ôû nghieân cöùu naøy ngaén hôn thí nghieäm cuûa chuùng ta. 3.3 AÛNH HÖÔÛNG CUÛA NHIEÄT ÑOÄ ÑEÁN SÖÏ SINH TRÖÔÛNG VAØ SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN CUÛA CHUÛNG Nhieät ñoä nuoâi caáy raát quan troïng ñoái vôùi caùc chuûng vi sinh vaät, vì vaäy khaûo saùt ñöôïc nhieät ñoä toái thích cuûa chuûng raát caàn thieát. Ñöôøng cong sinh tröôûng vaø ñoà thò bieåu dieãn khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng trong moâi tröôøng MRS coù pH ban ñaàu 6.0 vaø nuoâi ôû nhieät ñoä 25oC ñöôïc theå hieän trong hình 3.5. Hình 3.5: Khaû naêng sinh tröôûng ( ) vaø sinh toång hôïp bacteriocin ( ) cuûa chuûng trong moâi tröôøng nuoâi caáy coù pH ban ñaàu 6.0 ôû nhieät ñoä 25oC ÔÛ nhieät ñoä naøy, chuûng vi khuaån phaùt trieån khoâng maïnh meõ nhö ôû nhieät ñoä 30oC. Thôøi gian ñaàu chuûng sinh tröôûng raát keùm O.D. 600 nm khoâng taêng ñaùng keå töø 0.715 ñeán 0.765, pha lag keùo daøi ñeán giôø thöù 10 cuûa quaù trình nuoâi caáy. Töø giôø thöù 10 ñeán giôø thöù 19 laø pha log ñoä O.D. 600 nm taêng leân möùc cöïc ñaïi ôû giaù trò 0.945 (so vôùi 1.437 cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy 30oC). Sau 23 giôø nuoâi caáy, ñöôøng cong sinh tröôûng coù chieàu höôùng ñi xuoáng. Khaû naêng sinh toång hôïp cuûa chuûng ôû nhieät ñoä 25oC cuõng gioáng nhö ôû nhieät ñoä 30oC ôû choã taêng vaø giaûm theo chieàu höôùng taêng giaûm cuûa söï sinh tröôûng cuûa chuûng. Haøm löôïng bacteriocin cuõng ñaït giaù trò cao nhaát 707.8 AU/ml sau giôø nuoâi caáy thöù 19. Hình 3.6: Söï sinh tröôûng ( ) vaø sinh toång hôïp bacteriocin ( ) cuûa chuûng trong moâi tröôøng nuoâi caáy coù pH ban ñaàu 6.0 ôû nhieät ñoä 37oC Ñieàu kieän nuoâi caáy ôû 37oC cuõng thu ñöôïc keát quaû laø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin coù lieân quan maät thieát ñeán söï sinh tröôûng cuûa chuûng. Pha lag keùo daøi 7 giôø ñaàu tieân, O.D. 600 nm taêng raát chaäm töø 0.711 leân ñeán 0.727, hoaït tính bacteriocin cuõng khoâng coù theå hieän. Pha lag thaät söï baét ñaàu töø giôø thöù 8 vaø ñeán giôø thöù 20 thì ñaït giaù trò O.D. 600 nm cöïc ñaïi ôû 1.234 vaø hoaït tính bacteriocin lôùn nhaát laø 1453.2 AU/ml vaø giöõ nguyeân ñeán heát thôøi gian khaûo saùt. Nhöõng giaù trò cöïc ñaïi ôû ñieàu kieän naøy luoân nhoû hôn ôû 30oC O.D. 600 nm =1.234 so vôùi 1.437 vaø 1453.2 AU/ml so vôùi 2250 AU/ml. Vôùi keát quaû naøy thì nhieät ñoä nuoâi caáy 25oC vaø 37oC khoâng toái thích baèng 30oC vì giaù trò cöïc ñaïi cuûa O.D. 600 nm vaø hoaït tính bacteriocin khi nuoâi caáy chuûng ôû nhieät ñoä 25oC vaø 37oC khoâng cao baèng khi nuoâi caáy ôû 30oC. (P < 0.05) Keát quaû naøy gioáng vôùi keát quaû cuûa thí nghieäm cuûa Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks (2004) vaø nghieân cöùu cuûa H. J. Choi et al. (2000). Caùc thí nghieäm cuõng tieán haønh khaûo saùt Lc. lactis nuoâi caáy moâi tröôøng MRS coù pH ban ñaàu 6.0 ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau vaø ruùt ra ñöôïc nhieät ñoä thích hôïp cho sinh toång hôïp bacteriocin laø 30oC. Song song ñoù, nghieân cöùu cuûa Suranjita Mitra et al., 2005 vaø nghieân cöùu cuûa L.G. Stoyanova et al., 2005 laïi cho keát quaû khaùc laø nhieät ñoä 37oC laø toái thích nhaát cho chuûng Lc. lactis nuoâi caáy trong moâi tröôøng TGE (tryptone – glucose – yeast extract) coù pH ban ñaàu laø 7.0. Ñieàu khaùc bieät naøy ñöôïc lyù giaûi raèng chuûng vi khuaån maø caùc nghieân cöùu naøy khaûo saùt coù nhieät ñoä toái öu cao hôn vaø ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng khaùc do caùc chuûng töø caùc nguoàn phaân laäp khaùc nhau. Qua caùc thí nghieäm vaø caùc nghieân cöùu baøn luaän ta thaáy ñöôïc nhieät ñoä laø yeáu toá quan troïng trong caùc ñieàu kieän nuoâi caáy cuûa chuûng, quyeát ñònh ñeán ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa chuûng cuõng nhö khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Vaø coù theå ruùt ra ñöôïc nhieät ñoä nuoâi caáy thích hôïp ñeå chuûng phaùt trieån vaø sinh toång hôïp ra löôïng bacteriocin nhieàu nhaát laø ôû 30oC. 3.4 AÛNH HÖÔÛNG CUÛA pH ÑEÁN SÖÏ SINH TRÖÔÛNG VAØ SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN CUÛA CHUÛNG Chuûng môùi phaân laäp ñöôïc nuoâi caáy ôû 30oC trong moâi tröôøng MRS coù pH ban ñaàu khaùc nhau ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Hình 3.7 bieåu dieãn ñöôøng cong sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp chaát choáng vi sinh vaät cuûa chuûng trong moâi tröôøng coù pH ban ñaàu 5.0 vaø hình 3.8 laø ôû pH ban ñaàu 7.0. Hình 3.7: Söï sinh tröôûng ( )vaø sinh toång hôïp bacteriocin ( ) cuûa chuûng ôû pH 5.0, nhieät ñoä 30oC Vôùi pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng laø 5.0, chuûng phaùt trieån khoâng maïnh meõ. Pha lag vaø pha log khoâng roõ raøng, ñoä taêng vôùi toác ñoä log cuûa chuûng cuõng khoâng theå hieän roõ. Chæ soá O.D. 600 nm cao nhaát ñaït ñöôïc laø 0.926 ôû giôø nuoâi caáy thöù 20 (so vôùi ôû pH 6.0 laø 1.437). Löôïng bacteriocin sinh toång hôïp ra cuõng thaáp. Chuûng baét ñaàu sinh chaát öùc cheá töø giôø thöù 11 (52.9 AU/ml) vaø ñaït ñoä cao nhaát ôû giôø thöù 20 (540.6 AU/ml), nhöng haøm löôïng naøy thaáp hôn khi nuoâi caáy ôû pH 6.0 raát nhieàu (540.6 AU/ml so vôùi 2250 AU/ml). Hình 3.8: Söï sinh tröôûng ( ) vaø sinh toång hôïp bacteriocin ( ) cuûa chuûng ôû pH 7.0, nhieät ñoä 30oC Khi nuoâi caáy chuûng vi khuaån lactic trong moâi tröôøng MRS coù pH ban ñaàu 7.0 ôû nhieät ñoä 30oC, ñöôøng cong sinh tröôûng coù pha lag keùo daøi ñeán 7 giôø, O.D. 600 nm trong khoaûng 0.702 ñeán 0.739. Sau giôø thöù 7, söï sinh tröôûng taêng theo haøm muõ leân ñeán giaù trò cöïc ñaïi (.D. 600 nm =1.256) ôû giôø nuoâi caáy thöù 20 roài sau ñoù oån ñònh ñeán heát thôøi gian khaûo saùt. Söï sinh toång hôïp bacteriocin dieãn tieán chaäm hôn moät chuùt, dòch nuoâi caáy theå hieän ñöôïc voøng öùc cheá ôû giôø thöù 12 (194.6 AU/ml) vaø taêng nhanh ñeán giaù trò cöïc ñaïi (1155.9 AU/ml) sau giôø thöù 20. ÔÛ thí nghieäm naøy, chuûng maát moät thôøi gian khaù daøi ñeå thích öùng vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy môùi phaùt trieån vaø sinh toång hôïp bacteriocin neân haøm löôïng sinh khoái vaø chaát öùc cheá toái ña khoâng cao baèng ôû pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng MRS baèng 6.0 (O.D. 600 nm = 1.256 so vôùi 1.437, vaø hoaït tính bacteriocin 1155.9 AU/ml so vôùi 2250 AU/ml). Vì vaäy maø pH 6.0 thích hôïp cho nuoâi caáy chuûng vi khuaån lactic ñöôïc phaân laäp hôn. Keát quaû ñaït ñöôïc hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi nghieân cöùu cuûa Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks, 2004 treân chuûng Lc. lactis subsp. lactis phaân laäp töø “bia barley”. Nghieân cöùu naøy khaûo saùt caùc giaù trò pH cuûa moâi tröôøng MRS nuoâi caáy khaùc nhau (4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5). Vaø nghieân cöùu cuûa H.J. Choi et al., 2000 khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng M17 ban ñaàu leân söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa Lc. lactis subsp. lactis A164 phaân laäp töø kim chi, caùc giaù trò pH thí nghieäm laø: khoâng ñieàu chænh pH ban ñaàu, pH = 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0. Caû hai nghieân cöùu ñeàu keát luaän raèng pH toái thích nhaát laø 6.0. Trong nghieân cöùu cuûa L.G. Stoyanova et al., 2005 treân Lc. lactis subsp. lactis phaân laäp töø söõa leân men thì nhieät ñoä toái thích cho chuûng phaùt trieån vaø sinh toång hôïp bacteriocin treân moâi tröôøng TGE (tryptone – glucose – yeast extract), nhieät ñoä nuoâi caáy laø 37oC laïi ôû pH = 7.0. Hay nghieân cöùu cuûa Suranjita Mitra et al., 2005 khaûo saùt caùc giaù trò pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng TGE laø 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5, 11 treân chuûng Lc. lactis phaân laäp töø söõa leân men. Sau khi nuoâi caáy chuûng Lc. lactis ôû 37oC trong 10 giôø, caùc maãu ñöôïc laáy ra vaø ño hoaït tính bacteriocin, keát luaän cuûa nghieân cöùu laø pH toái öu = 11.0. pH coù giaù trò toái thích khaùc nhau vôùi nhöõng chuûng phaân laäp khaùc nhau vì vaäy maø duø hai nghieân cöùu naøy coù nguoàn phaân laäp töông töï nhau, moâi tröôøng nuoâi caáy gioáng nhau nhöng keát quaû thu ñöôïc laïi khaùc xa nhau. Vì vaäy thí nghieäm cuûa chuùng ta duø coù nguoàn phaân laäp gioáng hai nghieân cöùu naøy nhöng keát quaû thu ñöôïc khaùc chuùng cuõng laø ñieàu hoaøn toaøn coù theå giaûi thích ñöôïc. pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa chuûng vi sinh maø nhö caùc keát quaû ôû treân cho thaáy söï taêng sinh khoái luoân ñi ñoâi vôùi söï taêng löôïng bacteriocin sinh toång hôïp ñöôïc. Do ñoù pH cuûa moâi tröôøng thích hôïp chuûng nuoâi caáy raát quan troïng ñeå chuûng sinh toång hôïp bacteriocin. Töø caùc thí nghieäm vaø nghieân cöùu baøn luaän ôû treân ta ruùt ra ñöôïc pH moâi tröôøng MRS ban ñaàu toái öu cho chuûng laø 6.0. Chöông 4: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 4.1 KEÁT LUAÄN Qua quaù trình thí nghieäm vaø khaûo saùt, ta thu ñöôïc keát quaû sô boä maø luaän vaên ñaët ra. Em ñaõ phaân laäp ñöôïc chuûng vi khuaån coù nhöõng ñaëc tính thoûa maõn chuûng yeâu caàu vaø ñaëc bieät laø coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin, theå hieän voøng öùc cheá ñoái vôùi caùc loaøi vi khuaån G+ nhö loaøi L. monocytogenes trong phöông phaùp kieåm tra Agar Well Diffusion. Caùc böôùc khaûo saùt sô boä cho thaáy ñöôïc söï aûnh höôûng maïnh meõ cuûa caùc ñieàu kieän nuoâi caáy nhö thôøi gian nuoâi caáy, nhieät ñoä, pH leân söï sinh tröôûng cuûa chuûng cuõng nhö khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Töø ñoù ñaët nhöõng cô sôû caàn thieát cho quaù trình nghieân cöùu caûi thieän khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng. Qua nhöõng keát quaû thu ñöôïc trong quaù trình khaûo saùt bieåu dieãn ñöôïc ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa chuûng vi khuaån lactic phaân laäp ñöôïc vaø ruùt ra ñöôïc ñieàu kieän nuoâi caáy ñeà nghò thích hôïp cho söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng seõ laø nuoâi caáy 20 giôø ôû nhieät ñoä 30oC trong moâi tröôøng dòch theå MRS coù pH ban ñaàu baèng 6.0. Dòch sau khi nuoâi caáy trong ñieàu kieän thích hôïp ñoù seõ cho keát quaû ño quang O.D.600 nm = 1.437 vaø hoaït tính choáng vi sinh vaät laø 2250 AU/ml. 4.2 KIEÁN NGHÒ Bacteriocin laø moät böôùc phaùt trieån môùi ñoái vôùi ngaønh baûo quaûn thöïc phaåm, vaø chuùng ta coù theå thaáy ñöôïc tieàm naêng lôùn cuûa höôùng ñi môùi naøy. Tuy nhieân, nhöõng nghieân cöùu cuûa luaän vaên chæ laø nhöõng sô khôûi ban ñaàu trong lónh vöïc naøy. Trong khuoân khoå cuûa luaän vaên, thôøi gian khoâng cho pheùp em tieán haønh nhöõng nghieân cöùu saâu hôn. Chuûng vi khuaån lactic phaân laäp ñöôïc môùi chæ qua khaûo saùt sô boä ñieàu kieän nuoâi caáy veà thôøi gian, nhieät ñoä vaø pH cuûa moâi tröôøng. Chuûng phaân laäp ñöôïc chöa ñöôïc thuaàn hoùa ñeå coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cao. Em xin ñöôïc kieán nghò nhöõng vaán ñeà caàn ñöôïc nghieân cöùu nhieàu hôn ñeå coù theå nhanh choùng öùng duïng vaøo trong ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm trong nöôùc. - Nhaän danh chuûng vi khuaån phaân laäp ñöôïc baèng caùc phöông phaùp gen, xaùc ñònh roõ loaøi vaø loaøi phuï cuûa chuûng. - Toái öu caùc ñieàu kieän nuoâi caáy khaùc, khaûo saùt theâm söï phaùt trieån, sinh tröôûng cuõng nhö söï sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng vi khuaån lactic khi thay ñoåi moâi tröôøng nuoâi caáy. - Toái öu hoùa thaønh phaàn moâi tröôøng nhaèm thu ñöôïc haøm löôïng bacteriocin cao nhaát trong dòch canh tröôøng nuoâi caáy. - Khaûo saùt caùc ñieàu kieän aûnh höôûng ñeán dòch bacteriocin thu ñöôïc, laøm theá naøo thu nhaän vaø tinh saïch dòch canh tröôøng maø khoâng laøm bieán ñoåi hay ñaùnh maát hoaït tính khaùng khuaån cuûa hôïp chaát. - Toái öu quaù trình thu nhaän vaø tinh saïch bacteriocin. - Ñònh danh vaø xaùc ñònh caáu truùc phaân töû cuûa loaïi bacteriocin maø chuûng phaân laäp sinh toång hôïp. - ÖÙng duïng bacteriocin trong baûo quaûn thöïc phaåm, trong bao bì thöïc phaåm, nghieân cöùu khaû naêng öùc cheá vi sinh vaät treâân caùc saûn phaåm cuï theå. Em hy voïng keát quaû thu ñöôïc seõ goùp nhöõng cô sôû coù yù nghóa trong nhöõng khaûo saùt sau naøy. Töø nhöõng keát quaû ñoù, nhöõng khoùa sau seõ tieáp tuïc caùc nghieân cöùu saâu hôn vaø hoaøn thieän hôn ñeå coù nhöõng öùng duïng coù giaù trò trong ngaønh thöïc phaåm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyeãn Laân Duõng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, NXB Giaùo Dục, 2002. [2]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Vi sinh vaät hoïc coâng ngheä, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia Thaønh phoá Hoà Chí Minh, 2004. [3]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia Thaønh phoá Hoà Chí Minh [4]. Leâ Vaên Vieät Maãn, Coâng ngheä saûn xuaát söõa vaø caùc saûn phaåm töø söõa, Taäp 1, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia Thaønh phoá Hoà Chí Minh, 2004. [5]. Leâ Vaên Vieät Maãn, Laïi Mai Höông; Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm; NXB Ñaïi hoïc Quoác gia Thaønh phoá Hoà Chí Minh, 2006. [6]. Trần Thủy Tieân , Luận văn tốt nghiệp Thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn Lactococcus lactis vaø thử ứng dụng trong bảo quản thịt, Trường Đại học Khoa học Tự Nhieân Thaønh phố Hồ Chí Minh, 2007. [7]. Ahmad Faris Mohd Adnan and Irene K.P. Tan; Isolation of lactic acid bacteria from Malaysian foods and assessment of the isolates for industrial potential; Bioresource Technology, Vol. 98, Issue 7, pp. 1380-1385, 2007 [8]. Allison, G.E. and Klaenhammer, T.R; Phage resistance mechanisms in lactic acid bacteria; International Dairy Journal, Vol. 8, pp. 207–226, 1998 [9]. Amechi Okereke and Thomas J. MonTville; Bacteriocin- mediated inhibition of Clostridium botulinum spores by Lactic acid bacteria at refrigeration and abuse temperatures; Applied and environmental microbiology, Vol 57, No. 12. [10]. Andreja Miklic and Irena Rogelj; Screening for natural defence mechanisms of Lactococcus lactis strains isolated from traditional starter cultures; International Journal of Food Science and Technology, Vol. 42, pp. 777–782, 2007 [11]. Barbara M. Lund, Tony C. Baird-Parker and Grahame W. Gould; The Microbiological Safety and Quality of Food, Volume I & II; Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland, 2000 [12]. C.M.B.K. Muyanja, J.A. Narvhus, J. Treimo, T. Langsrud; Isolation, characterisation and identification of lactic acid bacteria from bushera: a Ugandan traditional fermented beverage; International Journal of Food Microbiology, Vol. 80, pp. 201– 210, 2003 [13]. Donoghue, H.D; Properties and comparative starch-gel electrophoresis of megacins from several Bacillus megaterium strains. J. Gen; Microbiol, Vol 72, 1972. [14]. D. Pridmore, N. Rekhif, A.C. Pittet, B. Suri, B. Mollet; Variacin, a new lanthionine-containing bacteriocin produced by Micrococcus varians: comparison to Lacticin 481 of Lactococcus lactis; Applied and environmental microbiology, pp. 1799 – 1802 , 1996. [15]. Dubravka Samarija, Neven Antunac, Jasmina Luka_Havranek. Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review; Mljekarstvo 51 (1), pp. 35-48, 2001. [16]. D.G. Hoover; Bacteriocins: Activities and Applications; Encyclopedia of Microbiology, Vol. 1, pp. 181-190, 1992, Academic Press, Inc. [17]. E. Parente A. Ricciardi; Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria; Apply Microbiol Biotechnol , Vol. 52; pp. 628-638, 1999 [18]. E. Sablon, B. Contreras, E.Vandamme; Antimicrobial Peptides of Lactic Acid Bacteria: Mode of Action, Genetics and Biosynthesis; Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 68, 2000. [19]. Eugenio Parente, Carla Brienza, Marcella Moles, Annamaria Ricciardi; A comparison of the methods for the measurement of bacteriocin activity; Journal of Microbiological Methods 22, pp. 95 – 108, 1995. [20]. Fujitoshi Yanagida, Yi-Sheng Chen and Masatoshi Yasaki; Isolation and characterization of lactic acid bacteria from lakes; Journal of Basic Microbiology, Vol. 47, pp. 184–190, 2007 [21]. Gonzalez B, Arca P, Mayo B, Suarez JE; Detection, purification, and partial characterization of plantaricin C, a bacteriocin produce by Lactobacillus plantarum strain of dairy orginin; Applied and environmental microbiology, Vol. 60, No.21. [22]. H. Chen vaø D.G.Hoover; Bacteriocin and orther food applications; Comprehensive reviews in food science ang food safety, Vol 2, 2003. [23]. H.J. Choi, C.I. Cheigh, S.B. Kim and Y.R. Pyun; Production of a nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis A164 isolated from Kimchi; Journal of Applied Microbiology, Vol. 88, pp.563-571, 2000 [24]. Igor Mierau, Michiel Kleerebezem; 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis; Apply Microbiol Biotechnol, Vol. 68, pp. 705–717, 2005 [25]. Jack RW, Wan J, Gordon J, Harmark K, Davidson PE, Hillier AI, Wettenhal REH, Hickey MW, Coventry MJ; Characterization of the chemical and antimicrobial properties of piscicolin 126, a bacteriocin produced by Carnobacterium piscicola JG126; Applied and environmental microbiology, No 62. [26]. J.A. Vzquez, M.L. Cabo, M.P. Gonzlez, M.A. Murado; The role of amino acids in nisin and pediocin production by two lactic acid bacteria. A factorial study; Enzyme and Microbial Technology, Vol. 34, pp. 319–325, 2004 [27]. J. Delves-Broughton, P. Blackburn, R. J. Evans & J. Hugenholtz; Applications of the bacteriocin, nisin; Antonie van Leeuwenhoek, Vol. 69: pp. 193-202, 1996 [28]. John R. Tagg, Adnan S. Dajani, and Lewis W. Wannamaker; Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria; American Society for Microbiology, Vol. 40, No. 3. [29]. L. Aquilanti, L. Dell’Aquila, E. Zannini, A. Zocchetti and F. Clementi; Resident lactic acid bacteria in raw milk Canestrato Pugliese Cheese; The Applied Microbiology, Vol. 43, pp. 161–167, 2006 [30]. Larsen AG, Vogensen FK, Josephen J; Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from sour doughs: purification and characterization of bavaricin A, a bacteriocin produced by Lactobacillus bavaricus MI401; Applied and environmental microbiology, Vol 75, No.11. [31]. L. G. Stoyanova, T. D. Sul’timova, S. G. Botina, and A. I. Netrusov; Isolation and Identification of New Nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis from Milk; Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 42, No. 5, pp. 492–499, 2006 [32]. Ljubisa Topisirovic, Milan Kojic, Djordje Fira, Natasa Golic, Ivana Strahinic and Jelena Lozo; Potential of lactic acid bacteria isolated from specific natural niches in food production and preservation; International Journal of Food Microbiology, Vol. 112, Issue 3, pp. 230-235, 2006 [33]. Luchansky JB, Glass KA, Harsono KD, Degnan AJ, Faith NG, Cauvin B. Baccustaylor G, Arihara K, Bater B, Maurer AJ, Cassens RG; Genomic analysis of Pediococcus starter cultures used to control s in Turkey summer sausage; Applied environmental microbiology, Vol 58, 1992. [34]. M.A. Riley, M.A. Chavan (Eds.); Bacteriocins: Ecology and Evolution. Springer-Verlag Berlin Heidelber 2007 [35]. M. Nomura, M. Kobayashi, T. Narita, H. Kimoto-Nira and T. Okamoto; Phenotypic and molecular characterization of Lactococcus lactis from milk and plants; Microbial Ecology 54: 2, pp. 324, 2007 [36]. N. Rekhif, A. Atrih, and G. Lefebvre; Selection and Properties of Spontaneous Mutants of Listeria monocytogenes ATCC 15313 Resistant to Different Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria Strains; Current Microbiology Vol. 28, pp. 237-241, 1994 [37]. Olivia McAuliffe, Maire P. Ryan, R. Paul Ross, Colin Hill, Pieter Breeuwer, Tjakko Abee. Lacticin 3147, a broad-spectrum bacteriocin which selectively dissipates the membrane potential. Applied and environmental microbiology, vol 64. No.2 [38]. Rollema HS, Kuipers OP, Both P. de Vos WM, Siezen RJ. Improvement of solubility and stability of the antimicrobial peptide nisin by protein engineering. Appl Environ Microbial 61, pp. 2873 – 2878, 1995. [39]. Rongguang Yang, Monty C. Johnson, and Bibek Ray; Novel Method To Extract Large Amounts of Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria; Applied And Environmental Microbiology, Vol. 58, No. 10, pp. 3355-3359, American Society for Microbiology, 1992 [40]. R. Yang and B.Ray; Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria; Food Microbiology, Vol.11, pp. 281-291, 1994 [41]. Soomro, A.H., T. Masud and Kiran Anwaar. Role of Lactic acid Bacteria (LAB) in food Preservation and Human Health – A Review. Pakistan Journal of Nutrition 1(1), pp. 20 – 24, 2002. [42]. Suranjita Mitra, Pran Krishna Chakrabartty, Swadesh Ranjan Biswas; Production and Characterization of Nisin-Like Peptide Produced by a Strain of Lactococcus lactis Isolated from Fermented Milk; Current Microbiology, Vol. 51, pp. 183–187, 2005 [43]. Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks; Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis ST34BR, a strain isolated from barley beer; J. Basic Microbiol, Vol. 44, pp. 305–316, 2004 [44]. Thomas Senn, Hans Joachim Pieper, Product of primary metabolism, 2002. [45]. [46]. [47]. [48]. PHUÏ LUÏC Nhöõng moâi tröôøng söû duïng trong quaù trình thí nghieäm Coâng thöùc ñeà nghò cho 1000ml dòch Moâi tröôøng thaïch MRS (Man, Rogosa, Sharpe) [30] Peptone 10g Glucose 20g Cao thòt 5g Cao naám men 5g Natri acetate 2g Diamonicitrate 2g Tween 80 1ml MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.2g KH2PO4 2g Agar (2%) 20g Nöôùc caát 1000ml pH= 6,2-6,5 Moâi tröôøng dòch theå MRS (Man, Rogosa, Sharpe) [30] Peptone 10g Glucose 20g Cao thòt 5g Cao naám men 5g Natri acetate 2g Diamonicitrate 2g Tween 80 1ml MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.2g KH2PO4 2g Nöôùc caát 1000ml pH= 6,2-6,5 Moâi tröôøng dòch theå tryptic soy coù boå sung chaát chieát naám men (TSB-YE) [6, 34] Tryptone 15 g Peptoneđñaäu naønh 5 g NaCl 5 g Chaát chieát naám men 6g K2HPO4 2,5 g Glucose 2,5 g Nöôùc caát 1000 ml pH cuoái 7,3 ± 0,2 Moâi tröôøng thaïch tryptic soy coù boå sung chaát chieát naám men (TSA – YE) [6, 34] Tryptone 15 g Peptoneđñaäu naønh 5 g NaCl 5 g Chaát chieát naám men 6g Glucose 2,5 g Nöôùc caát 1000 ml pH cuoái 7,3 ± 0,2 Moâi tröôøng dòch theå M17 coù boå sung glucose (H. Matsusaki et al., 2001) Pepton (1%) 10g Cao naám men (0.25%) 5g Cao thòt (0.5%) 5g Lactose (glucose 1%) 5g Natri glycerophosphate (1.9%) 19g MgSO4.7H2O (0.025%) 0,25g Acid ascorbic (Natri ascorbate- 0.05%) 0,5g Agar 15g Nöôùc caát 1000ml pH= 6,9-7,3