Luận văn Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (cad) và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coa reductase (CCR) từ cây bạch đàn Uro (Eucalyptus urophylla S.t. blake)

MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau cellulose. Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân. Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây bệnh [7]. Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất, .) và là một loại nhiên liệu hoàn hảo. Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay [27]. Vậy làm thế nào để điều chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy. Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin, quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18]. Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake)” làm vật liệu để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen ở thực vật MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHưƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1.1. Tổng quan về cây bạch đàn . 1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam 1.3. Tình hình sinh trưởng của cây bạch đàn ở Việt Nam . 1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật . 1.4.1. Lignin 1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật . 1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 1.5. Tổng quan về promoter . 1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. . 1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter 1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học . 1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark not defined. 1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 2.1. Vật liệu nghiên cứu . 2.1.1. Vật liệu: . 2.1.2. Hoá chất: 2.1.3. Máy móc, thiết bị . 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu . 2.2.1. Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD trên ngân hàng gen quốc tế . 2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter . 2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ 2.3.4. Tổng hợp cDNA 2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng PCR . 2.2.6. Phương pháp tách dòng . 2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error! Bookmark not defined. 2.2.8. Phương pháp xác định trình tự của gen. . 2.2.9. Phương pháp Gateway. CHưƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA bạch đàn . 3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR . 3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD 3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp 3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. 3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. . 3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp . 3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake . 3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết 19 Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết . 21 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA . 22 Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA . 23 Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA . 23 Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA . 24 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR . 24 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 26 Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid 28 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt . 29 Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR .29 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối . 31 Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR . 32 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR . 33 Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR 34 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi . 35 Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R . 52 Bảng 3.3. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng XhoI . 64 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin . 9 Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật 10 Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B) 15 Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR . 25 Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT . 26 Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR . 30 Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO . 31 Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER 32 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn . 34 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 35 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 36 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch .37 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37 Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 39 Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .41 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc 41 Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α . 42 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1 43 Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 . 44 Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 . 45 Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii 46 Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD 48 Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% 51 Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA 51 Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 53 Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% 54 Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR . 56 Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.Coli DH5 56 Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR 58 Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR . 59 Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R 61 Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR 61 Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI 62 .