Luận văn Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học Hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh

1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1) với tỷ lệ 1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Bƣớc 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng cồn tuyệt đối, giữ ở -20 o C trong khoảng 2-3 giờ. Bƣớc 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C, thu tủa DNA. Bƣớc 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C Bƣớc 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này tạo ra bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và được sử dụng phổ biến đến nay. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn. Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, máy PCR v.v. * Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5 µl MgCl2 25 mM 3,0 µl dNTPs 2,5 mM 2.5 µl Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,2 µl H2O 13,3 µl DNA khuôn 1,5 µl Tổng thể tích 25 µl Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Đối với nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và 1492R thì chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: Bƣớc 1 95 o C trong 5 phút Bƣớc 2 94 o C trong 1 phút Bƣớc 3 55 o C trong 1 phút Bƣớc 4 72 o C trong 2 phút Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bƣớc 6 72 o C trong 7 phút Bƣớc 7 4 o C bảo quản mẫu Trong trường hợp nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase sử dụng cặp mồi C23OF và C23OR với chu trình nhiệt dưới đây: Bƣớc 1 94 o C trong 7 phút Bƣớc 2 94 o C trong 1 phút Bƣớc 3 55 o C trong 1 phút Bƣớc 4 72 o C trong 1 phút Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bƣớc 6 72 o C trong 10 phút Bƣớc 7 4 o C bảo quản mẫu 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng Biến nạp: bộ Kit TA Cloning (R) của hãng Invitrogen TM (Mỹ) đã được sử dụng cho quá trình biến nạp. Nguyên tắc: Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được sử dụng để gắn vào vector PCR 2.1 tạo thành vector mang đoạn gen 16S rRNA. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 * Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 1,0 µl Vector pCR2.1 1,5 µl Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết) 1,2 µl Enzyme T4 ligase 1,0 µl Nước 5,3 µl Tổng thể tích 10 µl Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết vào vector được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 14 o C, thời gian 18 giờ. Sau đó sản phẩm này được biến nạp vào tế bào khả biến (vi khuẩn E. coli INV F’). * Quy trình biến nạp: Bƣớc 1: Lấy 4 µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả biến E. coli INV F’ rồi ủ trên đá 30 phút. Bƣớc 2: Sốc nhiệt 42 o C trong thời gian 45 giây. Bƣớc 3: Đặt ống tế bào lên đá trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 250 µl SOC vào ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc 37 o C trong khoảng 1 giờ. Bƣớc 5: Hút dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 50 mg/l ampicilin, và 50 mg/ml X-Gal. Sau đó nuôi ở 37 o C trong khoảng 16-18 giờ. Chọn các dòng khuẩn lạc màu trắng và một dòng khuẩn lạc màu xanh nuôi trên môi trường LB dịch. Trên môi trường LB có X-gal những khuẩn lạc màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai. * Quy trình tách chiết DNA plasmid: Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm dịch nuôi 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, đổ dịch và thu tủa. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Bƣớc 2: Bổ sung 100 µl Sol I rồi vontex kỹ cho tan hết tủa. Bƣớc 3: Thêm 200 µl Sol II và đảo nhẹ, ủ đá khoảng 5 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 150 µl Sol III, đảo đều rồi ủ đá 10 phút. Bƣớc 5: Bổ sung C:I theo tỷ lệ 1:1 v/v, lắc đều rồi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang ống mới và thêm 500 µl isopropanol 100 % tủa DNA, để khoảng 2-3 giờ. Bƣớc 7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.để thu tủa. Bƣớc 8: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng cách ly tâm khô, sau đó tủa được hòa tan trong nước khử ion. * Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI: *Thành phần phản ứng: Đệm EcoRI 10X 2,0 µl Enzyme cắt EcoRI (5 U/µl) 0,2 µl RNase (1 mg/ml) 0,5 µl H2O 15,3 µl DNA plasmid 2,0 µl Tổng thể tích 20 µl Trộn đều các thành phần phản ứng với nhau rồi đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 37 o C trong 16 giờ. 2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động Xác định trình tự hai đoạn gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3- dioxygenase của vi khuẩn BQN31 trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer tự động theo phương pháp của Sanger. Trình Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 tự hai đoạn gen 16S rRNA và đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 được đăng ký trên GenBank. 2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại Sử dụng chương trình Blast so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 với các trình tự gen liên quan trên ngân hàng gen. Tiếp theo, sử dụng phần mềm Clustal X, NJ để xây dựng cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 và các đoạn gen đại diện. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng PAH được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường muối khoáng chứa các nguồn PAH như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. VSV sử dụng PAH trong mẫu nước nhiễm dầu không đa dạng, trên mỗi loại PAH chỉ có từ 1 đến 4 loại khuẩn lạc, trong đó loại vi khuẩn có mầu trắng, trơn, lồi bóng và nhỏ chiếm ưu thế (Bảng 3.1). Khả năng phát triển của vi khuẩn được đánh giá sơ bộ bằng sự thay đổi mầu môi trường. Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH Môi trường chứa PAH và hỗn hợp PAH Số lượng vi khuẩn phân lập Phenanthrene 5 Anthracene 4 Fluorene + Fluoranthene 1 Pyrene + Chrysene 3 Naphthalene 2 Các số liệu trong bảng 3.1 cho thấy, từ mẫu làm giàu vi sinh vật trên hai nguồn phenanthrene và anthracene có số lượng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất. Tổng số 15 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường chứa các nguồn PAH khác nhau đã được phân lập và được ký hiệu từ BQN20-BQN34. Trong số 15 chủng vi khuẩn này, 4 chủng vi khuẩn BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phát triển mạnh hơn cả trên nguồn phenanthrene (Hình 3.1). Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Môi trường trong các bình nuôi cấy vi khuẩn và các PAH có mầu vàng nâu. Trong số 15 chủng vi khuẩn, chủng BQN31 phân hủy phenanthrene mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau 32 giờ nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, sinh khối vi sinh vật ít hơn, môi trường không đổi mầu hoặc đổi màu sau nhiều ngày. Hình thái khuẩn lạc của 4 chủng vi khuẩn sử dụng phenanthrene mạnh được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.2. BQN30 BQN31 BQN32 BQN33 K K K K Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 (Ghi chú: K: mẫu đối chứng) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường muối khoáng chứa phenanthrene BQN30 Tròn, trơn, trắng trong BQN31 Tròn, trơn, bóng, lồi, trắng đục, ánh xanh BQN32 Tròn, trơn, ánh vàng BQN33 Tròn, trơn, bóng, ánh xanh Trong số các chủng vi khuẩn kể trên, chủng vi khuẩn BQN31 có khuẩn lạc to, mọc dầy, dịch nuôi cấy chuyển màu nhanh hơn những chủng khác. Do đó, chủng BQN31 đã được chọn để nghiên cứu và xác định khả năng phân hủy PAH. Sự tồn tại của các vi khuẩn bản địa sử dụng các loại PAH khác nhau cho thấy tiềm năng lớn trong việc áp dụng thành công công nghệ phân hủy sinh học xử lý ô nhiễm dầu và PAH. 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 Chủng vi khuẩn BQN31 được nuôi cấy trên môi trường muối khoáng bổ sung phenanthrene, nuôi ở nhiệt độ 30 o C. Khuẩn lạc chủng BQN31 sau 3-5 ngày nuôi cấy có hình tròn, trắng, trơn, lồi, bóng, có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm (Hình 3.2). Chủng BQN31 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, bề mặt tương đối nhẵn và kích thước khoảng 0,29 - 0,5 m x 0,95 - 1,1 m (Hình 3.3). Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 (Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV với độ phóng đại 15.000 lần) 3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 Trong môi trường tự nhiên, các PAH thường tồn tại ở dạng hỗn hợp và rất độc. Do đó, việc đánh giá khả năng phân hủy PAH bởi các chủng vi sinh vật bản địa có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình làm sạch ô nhiễm dầu nói chung và PAH nói riêng. Sau 5 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng bổ sung các PAH khác nhau, mầu của môi trường chứa các vi sinh vật thay đổi rõ rệt, môi trường chuyển màu nâu vàng. Đặc biệt, trong các bình nuôi cấy chứa phenanthrene và naphthalene môi trường đục hơn và có nhiều sinh khối hơn (Bảng 3.3). 1 µm Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Bảng 3.3: Phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31 Nguồn PAH Phổ UV Hình ảnh minh họa Phenanthrene Naphthalene Hiệu quả sử dụng một số loại PAH của chủng BQN31 được trình bày trong bảng 3.4. ĐC BQN31 ĐC BQN31 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 Các PAH Hiệu suất phân hủy (%) Màu môi trường nuôi cấy Ghi chú Phenanthrene 60,24 vàng nâu Fluorene 18,52 vàng nhạt Fluoranthene vàng chanh không phân tích Pyrene 18,75 nâu nhạt, ánh vàng Naphthalen 69,38 màu vàng Anthracene 25,9 màu nâu Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, chủng BQN31 sử dụng tất cả các PAH thử nghiệm. Đối với mỗi loại PAH, màu môi trường nuôi cấy có sự thay đổi khác nhau. Dựa trên kết quả phân tích, sau 5 ngày nuôi lắc ở nhiệt độ 30 o C và 200 vòng/phút, chủng BQN31 có khả năng sử dụng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene và 18,75% pyrene với nồng độ ban đầu là 100 ppm mỗi loại PAH. Khả năng phân hủy của chủng BQN31 với naphthalen là cao nhất và fluorene là thấp nhất. Kết quả này chứng tỏ với các PAH ít vòng thì khả năng bị phân hủy sinh học càng mạnh. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy các loại PAH của các chủng vi sinh vật. Weissenfels và cộng sự (1991) đã công bố chủng Alcaligenes denitrficans WW1 phân hủy fluoranthene với tốc độ 300 mg/l mỗi ngày, đồng thời chủng này sử dụng các loại PAH khác như pyrene, benzo(a)anthracene theo cơ chế đồng trao đổi chất [53]. Chủng Mycobacterium sp. PYR-1 phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene và benzo(a)pyrene sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó 95% fluoranthren bị loại bỏ sau 24h nuôi cấy, tuy nhiên nồng độ ban đầu chỉ có 17 mg/l [21]. Hai chủng Cycloclasticus N3 và W của Gelsenbrecht và cộng sự không sử dụng được PAH cao phân tử như fluoranthene, pyrene và chrysene như là nguồn carbon và năng lượng duy Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 nhất, tuy nhiên theo cơ chế đồng trao đổi chất chủng Cycloclasticus N3 có thể phân huỷ khoảng 50% các PAH cao phân tử trên với nồng độ ban đầu 1ppm khi bổ sung 10ppm phenanthrene sau 7 ngày [12]. Hiện nay, có nhiều công bố kết quả nghiên cứu về khả năng phân hủy fluoranthene và pyrene như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất của các chủng xạ khuẩn thuộc các chi Gordonia, Mycrobacterium [36] . Theo nghiên cứu của Lors và cộng sự về xử lý sinh học mẫu đất nhiễm PAH từ một khu vực công nghiệp ở miền Bắc nước Pháp tại phòng thí nghiệm với 3 loại hỗn hợp cơ chất PAH gồm các PAH có 3 hoặc 4 vòng thơm cùng với 16 loại PAH (theo quy định của UEPA - Hoa Kỳ) cho kết quả loại bỏ lần lượt là 96%, 80% và 80%, sau 245 ngày [19]. Chủng Rhodococcus sp. được phân lập từ mẫu trầm tích có khả năng phân hủy 53% anthracene sau 24h ở nồng độ 3µg/ml [21]. Xue-Jing Zheng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chuyển hoá sinh học của tập đoàn vi sinh vật hiếu khí có trong bùn cống, bổ sung chất hoạt động bề mặt tween 80 cho hiệu quả loại bỏ PAH trên 95% đối với PAH chứa 3 vòng thơm và tăng tốc độ loại bỏ PAH chứa 4 vòng thơm sau 21 ngày [57]. Cũng bổ sung tween 80 (0,5%), Dhenain và cộng sự đã cho thấy khả năng loại bỏ từ 35 – 50% benzo(a)anthracene, benzo(a)pyrene, benzo(b)fluoranthene, benzo(j)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, fluoranthene trong bùn đen của công nghiệp nhôm [13]. Ở Việt Nam, chủng vi khuẩn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ có khả năng phân hủy 64,5% phenanthrene và 61,4% anthracene sau 7 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu là 12mg/l [8]. Hoàng Thị Mỹ Hạnh và cộng sự (2003) đã phân lập và nghiên cứu khả năng sử dụng PAH của chủng nấm Aspergillus sp. FVX5 phân lập từ thí nghiệm xử lý làm sạch cặn dầu thô của tàu Chí Linh. Chủng nấm này có khả năng phân Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 hủy 266,69 mg/l phenanthrene, 33,34 mg/l anthracene, 19,16 mg/l fluoranthene sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 37 o C [2]. Sau 7 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng có bổ sung glucose, hai chủng xạ khuẩn XKDN12 và XKDN13 phân lập từ đất nhiễm chất độc hoá học có khả năng sử dụng PAH, 32,72% và 45,05% với phenanthrene, 39,01% và 52,22% với anthracene, 23,32% và 41,41% với fluoranthen [7]. Chủng vi khuẩn Chromobacterium sp. BPQ1 phân lập từ nước thải nhiễm dầu ở công ty xăng dầu B12, Quảng Ninh có thể sử dụng phenanthrene và fluorene [5]. Trong một nghiên cứu khác, chủng vi khuẩn KCP8 phân lập tại Khe Chè có khả năng phân hủy hỗn hợp PAH (phenanthrene, anthracene và fluoranthene). Sau 7 ngày nuôi lắc chủng KCP8 phân hủy 76,12% hỗn hợp PAH, trong đó khả năng phân hủy phenanthrene trong hỗn hợp là 79,96%, anthracene là 71,09% và fluoranthene là 41,01% [4]. So sánh với các kết quả đã công bố trên thế giới và Việt Nam, cho thấy rằng, chủng vi khuẩn BQN31 có khả năng phân hủy trung bình các PAH đã công bố. Tuy nhiên, khả năng sử dụng nhiều loại PAH khác nhau chứng tỏ vai trò nhất định của chủng vi khuẩn này trong nước thải nhiễm dầu ở khu vực Quảng Ninh. Chủng này có thể được sử dụng để xây dựng tập đoàn giống vi sinh vật sử dụng trong quá trình làm sạch ô nhiễm PAH ở các điều kiện có kiểm soát. 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR Tách chiết và làm sạch DNA tổng số vi khuẩn là khâu quan trọng vì chất lượng của DNA sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của các thí nghiệm tiếp theo. DNA tổng số của vi khuẩn BQN31 có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, băng gọn không đứt gãy (Hình 3.4). Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Sử dụng DNA tổng số của vi khuẩn BQN31 làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (27F và 1492R) và chu trình nhiệt như đã trình bày ở phần 2.4, sản phẩm PCR thu được là một băng DNA duy nhất, sắc nét và có kích thước khoảng 1.500 bp đúng như lý thuyết (Hình 3.5). 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 Hiện nay, để xác định trình tự gen có thể sử dụng hai phương pháp như xác định trình tự nucleotide trực tiếp từ sản phẩm PCR hoặc gắn sản phẩm PCR vào một vector sau đó biến nạp vào tế bào khả biến như E. coli, nuôi cấy tế bào E. coli tái tổ hợp, tách và làm sạch DNA plasmid và xác định trình tự đoạn DNA đã được chèn vào vector sử dụng các mồi của vector. Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 DNA tổng số Hình 3.5. Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31. M: thang DNA chuẩn 1 kb 1,5 kb M BQN31 1 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Ưu điểm của phương pháp xác định trình tự trực tiếp là tiết kiệm thời gian. Phương pháp xác định trình tự DNA thông qua bước biến nạp cho kết quả rõ ràng hơn. Ngoài ra, tách dòng gen giúp các nhà nghiên cứu chủ động hơn về gen hoặc đoạn gen đã nhân để sử dụng cho các mục đích nghiên cứu khác. Trong nghiên cứu này, sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA từ chủng BQN31 được xác định trình tự theo phương pháp gắn sản phẩm PCR vào một vector sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. *Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 và biến nạp vào E. coli DH5α Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA đã được gắn vào vector pCR 2.1 nhờ enzyme T4 DNA ligase và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Sau khi nuôi ở 37 o C trong 18 giờ trên môi trường LB đặc chứa ampicillin và X-Gal đã xuất hiện những khuẩn lạc trắng xen kẽ những khuẩn lạc xanh (Hình 3.6). Số lượng khuẩn lạc màu trắng nhiều hơn so với khuẩn lạc màu xanh, chứng tỏ hiệu suất biến nạp là tốt. Các khuẩn lạc trắng E. coli DH5α có thể mang plasmid đã được chèn sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA. Các khuẩn lạc trắng E. coli DH5α được chọn lựa, tách DNA plasmid. Sản phẩm DNA plasmid thu được từ các dòng tế bào chọn lựa được điện di kiểm tra trên gel agaros 1%. Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 (Khuẩn lạc trắng: là những khuẩn lạc có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai. Khuẩn lạc xanh: là những khuẩn lạc không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Các khuẩn lạc màu trắng có thể mang vector chứa đoạn DNA cần thiết được lựa chọn để tách DNA plasmid cùng với một vài khuẩn lạc xanh được sử dụng làm mẫu đối chứng. 3.4.3. Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp Các khuẩn lạc lựa chọn được nuôi trên môi trường LB dịch để tách DNA plasmid. Sản phẩm DNA plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose để lựa chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp (Hình 3.7 ). Hình 3.7. Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn C: DNA plasmid dòng khuẩn lạc màu xanh (đối chứng) 1: DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 13 màu trắng Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, DNA plasmid của dòng số 13 nằm ở vị trí cao hơn mẫu đối chứng. Dòng vi khuẩn số 13 này có thể mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen 16S rRNA nhân lên từ DNA tổng số của vi khuẩn BQN31. Enzyme giới hạn EcoRI đã được sử dụng để kiểm tra liệu thực sự DNA plasmid của dòng số 13 có mang sản phẩm PCR hay không. Sản phẩm cắt của dòng 13 cho băng có kích thước phù hợp khoảng 1.500 bp (Hình 3.8). C 1 M 1 1,5 Kb 1 Kb Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Như vậy, sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA đã được chèn vào vector và được biến nạp vào E. coli DH5α. DNA plasmid dòng số 13 được làm sạch để phục vụ cho việc xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn BQN31 (Hình 3.9). Kết quả hình 3.9 cho thấy DNA plasmid dòng số 13 sau khi loại RNA có độ sạch cao, đủ điều kiện sử dụng để xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31. 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 C 1 Hình 3.9. Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31 Giếng C: Mẫu đối chứng (DNA plasmid dòng màu xanh) Giếng 1: DNA plasmid dòng số 13 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng BQN31 được xác định hai chiều với sử dụng cặp mồi M13R và M13F. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, trình tự đầy đủ của đoạn gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn BQN31 được xác định (Hình 3.10) Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 đã được xác định và đăng ký trên GenBank với mã số EU814953. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 với trình tự của các VSV prokaryote đã được công bố trên GenBank cho thấy, chủng BQN31 quan hệ gần gũi với các chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas (Hình 3.11). Chủng BQN31 có độ tương đồng cao với các chủng Sphingomonas sp. JQL4-5 (98%), Sphingomonas sp. A4 (98%), Sphingomonas sp. AMS7 (98%), Sphingomonas sp. VX-MXL9 (97%), 1 AGAGTTTGAT CATGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCATGC CTAATACATG CAAGTCGAAC 61 GAGATCTTCG GATCTAGTGG CGCACGGGTG CGTAACGCGT GGGAATCTGC CCTTGGGTTC 121 GGAATAACAT CGGGAAACTG ATGCTAATAC CGGATGATGA CGTAAGTCCA AAGATTTATC 181 GCCCAGGGAT GAGCCCGCGT AGGATTAGCT AGTTGGTGGG GTAAAGGCTC ACCAAGGCGA 241 CGATCCTTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC 301 TCCTACGGGA GGCAGCAGTA GGGAATATTG GACAATGGGG GCAACCCTGA TCCAGCAATG 361 CCGCGTGAGT GATGAAGGCC TTAGGGTTGT AAAGCTCTTT TACCCGGGAT GATAATGACA 421 GTACCGGGAG AATAAGCTCC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGAG 481 CTAGCGTTGT TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGTAG GCGGCGATCC AAGTCAGRGG 541 TGAAAGCCCG GGGCTCAACC CCGGAATAGC CCTTGAGACT GGATTGCTTG AATCCGGGAG 601 AGGTGAGTGG AATTCCGAGT GTAGAGGTGA AATTCGTAGA TATTCGGAAG AACACCAGTG 661 GCGAAGGCGG CTCACTGGAC CGGCATTGAC GCTGAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA 721 GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGATA ACTAGCTGCT GGGGTGCATG 781 GCACTTCGGT GGCGCAGCTA ACGCATTAAG TTATCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAT 841 TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCTGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA 901 AGCAACGCGC AGAACCTTAC CAACGTTTGA CATCCCCAGT ATGGTTTCCA GAGATGGATT 961 CCTTCAGTTC GGCTGGCTGG GTGACAGGTG CTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA 1021 GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTCGCCT TTAGTTGCCA TCATTCAGTT 1081 GGGTACTCTA AAGGAACCGC CGGTGATAAG CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAGTCC 1141 TCATGGCCCT TACGCGTTGG GCTACACACG TGCTACAATG GCGACTACAG TGGGTAGCGA 1201 CCTCGCGAGG GGAAGCTAAT CTCCAAAAGT CGTCTCAGTT CGGATTGTTC TCTGCAACTC 1261 GAGAGCATGA AGGCGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC 1321 CCAGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATSGGAGTTG GATTCACTCG AAGGCGTTGA 1381 GCTAACCGCA AGGAGGCAGG CGACCACAGT GGGTTTAGCG ACTGGGGTGA AGTCGTAACA 1441 AGGTAACCGT AAA Hình 3.10: Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Sphingomonas paucimobilis EPA 505 (96%). Bốn chủng Sphingomonas sp. A4 , Sphingomonas sp. AMS7, Sphingomonas sp. VX-MXL9, Sphingomonas paucimobilis EPA 505 đều là các chủng vi khuẩn sử dụng PAH được phân lập từ các nguồn ô nhiễm khác nhau. Các vi khuẩn phân hủy PAH chiếm ưu thế trong đất thường thuộc các chi như Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas và Mycobacterium [36]. Trong số các chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường, số lượng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas chiếm tỷ lệ cao trong số các chủng có khả năng phân hủy nhiều loại chất độc hại trong đó có cả PAH, các hợp chất dioxin, các hợp chất phenol chứa clo. Các vi khuẩn Sphingomonas cũng phân bố rộng rãi trong các môi trường không ô nhiễm như các hệ thống phân phối nước và môi trường biển [36]. Sphingomonas sp. AMS7 Sphingomonas sp. JQL4-5 Sphingomonas sp. BQN31 Sphingomonas sp. A4 Sphingomonas sp. P2 S. yanoikuyae B1 Sphingomonas sp. CFO6 Sphingobium sp. 2F5-2 Sphingomonas sp. 3Y S. paucimobilis EPA 505 0.002 Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gien mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. (Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Bảng 3.5: Độ tương đồng các đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện STT Chủng vi khuẩn Số nucleotide tương đồng Mức độ tương đồng (%) 1 Sphingomonas sp. AMS7 1353 * /1374 # 98,47 2 Sphingomonas sp. JQL4-5 1433 * /1456 # 98,42 3 Sphingomonas sp. A4 1392 * /1420 # 98,02 4 Sphingomonas sp. VX- MXL9 398 * /408 # 97,54 5 S. paucimobilis EPA 505 1385 * /1430 # 96,85 Chú thích: *- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA chủng BQN31 #- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA các chủng đại diện Theo một số công trình nghiên cứu đã được công bố ở trong và ngoài nước, các chủng vi khuẩn Sphingomonas sp. A4, Sphingomonas sp. VX- MXL9, S. paucimobilis EPA 505 đều có khả năng phân hủy các hợp chất PAHs khá tốt. Chủng vi khuẩn S. yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ phân hủy phenanthrence và anthracene [8]. Chủng Sphingomonas sp. A4 có khả năng sử dụng acenaphthene và acenaphthylene như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. [41]. Chủng vi khuẩn S. paucimobilis EPA 505 có khả năng sử dụng fluoranthene như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, ngoài ra chúng còn có thể chuyển hóa được nhiều loại PAH khác. Dingyi Ye và cộng sự đã chỉ ra rằng, sau 16h nuôi cấy với nồng độ 10 ppm mỗi PAH, chủng vi khuẩn S. paucimobilis EPA 505 đã phân hủy 80.0, 72.9, 31.5, 33.3, 12.5, và 7.8% của pyrene, benz[a]anthracene Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 (B[a]A), chrysene, benzo[a]pyrene (B[a]P), benzo[b]fluoranthene (B[b]F), and dibenz[a,h]anthracene (DB[a,h]A) [24]. Như vậy, dựa trên một số đặc điểm hình thái và so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn BQN31 được xếp vào chi Sphingomonas và được đặt tên là Sphingomonas sp. BQN31. Chủng vi khuẩn Sphingomonas sp. BQN31 cũng thuộc trong số các vi khuẩn sử dụng PAH thường gặp trên thế giới và ở Việt Nam. 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 Phân hủy sinh học của hydrocarbon thơm ở điều kiện hiếu khí thường xảy ra qua các bước cắt vòng thơm và tạo thành catechol, đây là một sản phẩm trung gian phổ biến nhất của quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm. Quá trình cắt vòng của catechol bởi enzyme dioxygenase có thể xảy ra ở hai vị trí meta và ortho. Tuy nhiên, cắt vòng tại vị trí meta được thực hiện bởi enzyme C23O được coi là quá trình phổ biến nhất ở các giai đoạn tiếp theo của phân hủy sinh học PAH. Xuất phát từ vị trí quan trọng của gen mã hóa enzyme C23O trong việc phân hủy sinh học PAH, gen mã hóa C23O đã được nhiều tác giả nghiên cứu quan trắc. Việc nghiên cứu sự tồn tại của gen này trong tự nhiên cũng như trong các chủng vi khuẩn sử dụng PAH là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, trình tự đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng BQN31 đã được xác định nhằm mục đích tìm hiểu sự đa dạng gen chức năng cũng như bản chất quá trình làm sạch dầu và PAH ô nhiễm ở mức độ phân tử. Các kết quả thu được sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về quá trình làm sạch ô nhiễm dầu cũng như sự đa dạng các gen chức năng trong nước nhiễm dầu tại khu vực Quảng Ninh. Sản phẩm DNA đã được tách sạch như ở phần 3.3.1 được dùng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi C23OF và C23OR. Sản phẩm Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 PCR thu được có kích thước khoảng 750 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.12). Hình 19 là cây phát sinh chủng vi khuẩn đại diện. Hình 3.12. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF và C23OR. M- thang DNA chuẩn 1kb. kb M 1 0,75 0,50 atggatgttatgggtttcaaggtcgccaaggacgcggacttggaccattttaccgagcgc M D V M G F K V A K D A D L D H F T E R ttgctcgatatcggtgtccatgtcgacgtgatcccggcgggggaagatcccggtgtaggc L L D I G V H V D V I P A G E D P G V G cgcaagattcggtttaacacgccgacacagcacgtcttcgaactttacgccgagatggcg R K I R F N T P T Q H V F E L Y A E M A ctgtcggccaccggtccggccgtcaagaaccccgatgtctgggtcgtggagccacgtggc L S A T G P A V K N P D V W V V E P R G atgcgtgccacccgctttgatcactgtgcgctcaacggcgtggatatagccagttcggcc M R A T R F D H C A L N G V D I A S S A aagatttttgtcgatgcgcttgatttctcagtcgccgaggaactggtcgatgaaaccagc K I F V D A L D F S V A E E L V D E T S ggcgcccggctcggcatctttcttagctgcagcaacaaagcacacgatgtcgccttctta G A R L G I F L S C S N K A H D V A F L ggctatcccgaagacggtaagatccaccatacctcgttcaacctggaatcctggcacgat G Y P E D G K I H H T S F N L E S W H D gttggccatgccgccgacatcatcagccgctacgatatttcgctggatatcgggccgacc V G H A A D I I S R Y D I S L D I G P T cgtcatgggatcacccgcgggcagacgatctacttcttcgatccctcgggcaaccgcaac R H G I T R G Q T I Y F F D P S G N R N gaaaccttcagcggcggttacatttattatccggacaatccgcagcgcctgtggcaggca E T F S G G Y I Y Y P D N P Q R L W Q A gagaacgccggcaaggccatcttctactacgaaaaggcgctcaacgaccgcttcctgaca E N A G K A I F Y Y E K A L N D R F L T gt Hình 3.13. Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng Sphingomonas sp. BQN31 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Sản phẩm PCR được gắn vào vector pCR ® 2.1 nhờ enzyme T4 ligase ở 14 o C, biến nạp vào tế bào E. coli INV F’, tách chiết và kiểm tra DNA plasmid theo Sambook và cộng sự. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa C23O trên máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, được xử lý trên phần mềm Bioedit 6.0.7 (5/17/04), và suy diễn ra trình tự axít amin, so sánh mức độ tương đồng bằng chương trình Blast (Hình 3.13). Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn đoạn gen mã hóa C23O của chủng BQN31 đã được đăng ký trình tự các đoạn gen trên GenBank với mã số lần lượt là EU814954 và ACF24468.1 C23O-Sphi- C230 (DQ873681) C23O-Sphi. BQN31 C23O-Pseu- ZP2 (EU082778) phnE-Pseu- DJ77 (U83882) catE-Sphi. agrestis - HV3 (L10655) cmpE-Sphi- HV3 (Z84817) xylE-Sphi- B1 (U23375) xylE-Sphi- KMG425 (AF494100) C23O-Rhiz- ZJF08 (DQ534019) C23O-Sphi. B2-7 (EU596533) C23O-Sphi. A8AN3 (U73127) Hình 3.14. Cây phát sinh chủng loại các đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng Sphingomonas sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện (Thước đo thể hiện một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 So sánh mức độ tương đồng giữa trình tự đoạn gen mã hóa enzyme catechol-2,3 dioxygenase của chủng BQN31 và của các chủng khác trên GenBank và EMBL cho thấy, đoạn gen này ở chủng BQN31 có độ tương đồng rất cao đối với các đoạn gen mã hóa enzyme catechol-2,3 dioxygenase tương tự ở các chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas (Hình 3.14, Bảng 3.6). Đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của chủng BQN31 có mức tương đồng 99 % với các đoạn gen phnE ở chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. DJ77, cmpE ở chủng Sphingomonas sp. HV3, catE ở chủng Sphingomonas agrestis HV3 và C23O ở chủng Pseudomonas sp. ZP2 (Bảng 3.6). Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế Chú thích: *- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA chủng BQN31 #- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA các chủng đại diện Các trình tự nucleotide đã công bố về gen mã hóa C23O của các đại diện thuộc chi Pseudomonas (P. aeruginosa JI104, P. putida CF600, P. putida P 35X, P. putida pDK1, P. putida H, P. putida pW0, P. putida NAH, và Pseudomonas sp. IC) cho thấy mức tương đồng từ 75% đến trên 95% [45]. Trong khi đó, mức tương đồng về trình tự nucleotide của gen này ở các vi STT Chủng vi khuẩn Số nucleotide tương đồng Mức độ tương đồng (%) 1 Sphingomonas sp. strain HV3 716 * /719 # 99,58 2 Pseudomonas sp. DJ77 716 * /719 # 99,58 3 Pseudomonas sp. ZP2 714 * /719 # 99,30 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 khuẩn thuộc nhóm Sphingomonas (Sphingomonas sp. HV3 và S. yanoikuyae B1) là 76,5%. Sự giống nhau về trình tự nucleotide gen mã hóa C23O ở các chủng vi khuẩn của hai chi này vào khoảng 50% [45]. Trình tự C23O của các chi khác như Ralstonia (R. pickettii U20258, R. eutropha JMP 52415, R. rhodochous X69504, R. rhodochous NCIB 13064 và Bacillus (B. stearothermophilus FDTP-3) không đồng nhất. Các trình tự này cũng không hoàn toàn giống nhau giữa các thành viên, với nhóm Sphingomonas và nhóm Pseudomonas. Kết quả thu được trong nghiên cứu của chúng tôi một lần nữa khẳng định sự phân bố rộng rãi của vi khuẩn sử dụng PAH thuộc nhóm Sphingomonas. Chủng vi khuẩn BQN31 có thể là vi sinh vật hữu ích trong quá trình tự làm sạch hoặc xử lý nước thải nhiễm dầu bằng phương pháp phân hủy sinh học hoặc được sử dụng để xây dựng tập đoàn giống phục vụ cho các mục đích xử lý ô nhiễm PAH trong các điểm có thể kiểm soát được. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 KẾT LUẬN 1. Trong số 15 chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn PAH đã được phân lập, chủng BQN31 có khả năng phân hủy mạnh nhất. 2. Chủng BQN31 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, khuẩn lạc hình tròn, trơn, lồi nhẹ, trắng đục có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm. Tế bào vi khuẩn BQN31 có hình que, bề mặt tương đối nhẵn, kích thước khoảng 0,29 – 0,5 m x 0,95 - 1,1 m. 3. Sau 5 ngày nuôi lắc ở nhiệt độ 30 o C và 200 vòng/phút, trong môi trường có nồng độ ban đầu 100ppm cho mỗi loại PAH, chủng BQN31 có khả năng sử dụng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene và 18,75% pyrene. 4. Dựa trên một số đặc điểm hình thái và so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng BQN31 được xếp vào chi Sphingomonas và được đặt tên là Sphingomonas sp. BQN31. Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 được đăng ký trên GenBank với mã số EU814953. 5. Đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase ở chủng BQN31 có độ tương đồng rất cao so với các đoạn gen tương tự ở các chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas. Nó có mức tương đồng 99 % với các đoạn gen phnE ở chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. DJ77, cmpE ở chủng Sphingomonas sp. HV3, catE ở chủng S. agrestis HV3 và C23O ở chủng Pseudomonas sp. ZP2. Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng Sphingomonas sp. BQN31 đã được đăng ký trên GenBank với các mã số lần lượt là EU814954 và ACF24468.1 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt. 1. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thành Đức (2003) ”Phân loại xạ khuẩn XKDN11 sử dụng dibenzofuran, hyđrocarbon thơm đa nhân phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3(1), tr. 377-386. 2. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Đương Nhã, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), ”Nấm sợi phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân phân lập từ cặn dầu thô của giếng khai thác dầu, Vũng Tàu”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(1), tr. 255-264. 3. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trường, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), “Khả năng phân hủy 2,4-D và dibenzofuran của chủng nấm sợi FDN20”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(4), tr. 517-528. 4. Nguyễn Bá Hữu (2002), Nghiên cứu các nhóm vi sinh vật và khả năng phân hủy hydrocacbon thơm đa nhân của một số chủng vi khuẩn trong quá trình xử lý ô nhiễm dầu tại Khe Chè, Quảng Ninh , Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Hà Nội. 5. Nguyễn Bá Hữu, Trần Thị Tường Vi, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), ”Phân huỷ sinh học dầu diesel và hydrocarbon thơm đa nhân của một số chủng vi khuẩn phân lập từ nước thảI nhiễm dầu kho cảng B12, Quảng Ninh”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại Học Thái Nguyên. Số 2 (42). 6. Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thành Đức, (2004), ”Phân loại chủng vi khuẩn HDG1 phân lập từ mẫu nước thải nhà máy giấy Hải Dương”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(2), tr. 245-252. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 7. Nguyễn Đương Nhã (2004). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng phân huỷ dibenzofuran, hydrocarbonthơm đa nhân của hai chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm chất độc hoá học. Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam năm. 8. La Thị Thanh Phương, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), “Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa nhân (PAHs) bởi chủng vi khuẩn MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô của mỏ Bạch Hổ Vũng Tàu”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(1), tr. 109-117. 9. Mai Anh Tuấn, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), “Nghiên cứu phân loại và khả năng sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân bởi chủng xạ khuẩn XKDN19 phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(3), tr. 389-396. Tiếng Anh. 10. Ahn Y, Sanseverino J, Sayler GS (1999), “Analyses of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from contaminated soil”, Biodegradation, 10, pp. 149-157. 11. Albert L., Juhasz, Ravendra Naidu (2000), “Bioremediation of High molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of Benzo[a]Pyren”, International Biodeterioration Biodegradation 45, pp. 57-88. 12. Allison D. Gelsenbrecht, Brian P.Hedlund, Mary A.Tichi và J. T. Staley (1998), “Isolation of Marine Polycyclyc Aromatic Hydrocarbon Degrading Cycloclasticus Strain from Gulf of Mexico and Comparison of Their PAH Degradation Ability with That of Puget Sound Cycloclasticus Strains”, Applied and Environmental Mycrobiology, pp.4703-4710. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 13. A Dhenain , G Mercier , J F Blais , M Bergeron (2006), “PAH removal from black sludge from aluminium industry by flotation using non- ionic surfactants”, Environ Technol. Sep ;27 (9), pp. 1019-30 17067128. Bioinfobank Library. 14. BAQAR R. ZAIDI†* and SYED H. IMAM‡ (1999), “Factors A€ecting Microbial Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Phenanthrene in the Caribbean Coastal Water”, Marine Pollution Bulletin, Vol. 38, No. 8, pp. 737±742. 15. Bidleman T., Walla M., Roura R., et al., (1993), « Organochlorine pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January- March, 1990”. Mar Pollut Bull 26(5), pp. 258- 262. 16. Cerniglia C. E. (1993), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Current Opinion in Biotechnology, vol 4, pp. 331-338. 17. Christian Hamann, Jorg Hegemann, Armin Hildebrandt* (1999), “detection of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation genes in different soil bacteria by polymerase chain reaction and ADN hydridization”, FEMS Microbiology Letters 173, pp. 255-263. 18. Coates, J.D., R.T. Anderson, and D.R. Lovley (1996), “Oxidation of Polycyclic Aromatic Hydro- carbons Under Sulfate-Reducing Conditions”, Applied and Environmental Microbiology, 62, pp. 1099- 1101. 19. C.Lors 1 , A.Ryngaert 2 , F. Perie 3 , L.Diels 2 , Evolution of the bacterial diversity during a biological treatment of PAHs contaminated soils. Centre National de Recherche sur les Sites et Sols Pollues (CNRSSP), 930, Boulervad Lahure, B.P.537, 59505 Douai Cedex, France. 20. Creosote-impregnated waste materials (1993), Canadian Environmental Protection Act, Beauregard Printer Limited, pp. 1-32. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 21. Deborah D, Moody J, Cerniglia CE (2002), “Utilization of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbon by bacteria isolated from contaminated sediment”. FEMS Microbial Ecol 41, pp. 1-7. 22. Des Rosier P.E., (1983). Method detoxication of dioxins and related compound. Am. Occup.Hyg., vol.27, N o 1, pp. 57-72. 23. Diane Farrelly, Jeremy R. Mason, Steve Smith (2000), “The Bio- availability of Polycyclic aromatic hydrocarbons in Soil”, Journal of Conference Abstracts, Vol.5(2), pp. 394. 24. Dingyi Ye; Akmal siddiqi m.; Maccubbin a. e.; Subodh kumar; Sikka h. c. (1996), “Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis”, Environmental science & technology. Issn 0013-936x coden esthag, vol. 30, n o 1, pp. 136-142 (34 ref.) 25. Draper W. M., Stepens R. D., Ruzo L. O. (1987), “Solving hazardous waste problem: learning from dioxin”, Amer. Chem. Soc., pp 350-366. 26. Eliska Komarkova, Jan Paca, Eva Klapkova, Marie Stiborova, Carlos R Socco, Miroslav Sobotka (2003), Brazilian Archives of Biology and Technology, vol 46, no 4, pp. 375-421. 27. Giraud, Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S., (2001) “Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment”, Wat. Res., Vol. 35, No.17, pp. 4126-4136. 28. Gred Deleersnyder, Anita Mirabelli, Amy Boate, Jillian Howarth, Leanne Peck, “Protosal for Soil Bioremediation of PAH and PCP as Proposed by G G Bio. Inc”. 29. Habe Hiroshi and Omori Toshio, (2003), “Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria”, Biosci, Biotechnol. Biochem., 67 (2), pp. 225-243. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 30. Haugland R. A., Schelemm D. J., Lyons R. P. III, Sferra P. R., Chakrabarty A. M. (1990), “Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures”, Appl. Environ. Microbiol, 56, pp. 1357-1362. 31. Hiroshi Awata, Stephanie Bates, David Knaub, Rob Popenka (1998), “Polyluclear Aromatic Hydrocacbons: Properties and Environmental Fate”, Environmental Organic Chemistry, Environmental Engineering Science. 32. Hughes JB., Ward CH., Denise M (1998), “Effect of polycyclic aromatic hydrocarbon and sediment on fluoranthen biodegradation patterns”, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol 17(7), pp. 1246-1251. 33. Jander H., Tanke D., Bohm H., “The growth of Polycyclic aromatic hydrocarbons in Benzene pyrolysis and Benzen/Oxygen Mixtures at High Pressures and Temperatures”. 34. Jang Yun, Yang Xianglong, Liu Bin, Zhoa Huabing, Cheng Qiuxiang and Cai Baoli (2004), “Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas sp. Stain ND6: Gene sequence and Enzyme characterization”, Biosci. Biocechnol. Biochem, 68 (8), pp. 1798 – 1800. 35. Jesus G.M. Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V., (1999), “Use of 16S- 23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Journal Microbiol Methods, vol 36, pp. 55-64. 36. Johnsen AR, Wick LY, Harms H (2005), “Principles of microbial PAH degradation in soil”, Environ Poll 133, 71-84. 37. Josep Guarro, * Josepa Gene, and Alberto M. Stchigel (1999), “Developments in Fungal Taxonomy” Unitat de Microbiologia, Departament de Cie`ncies Me`diques Ba`siques, Facultat de Medicina Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 iCie`ncies de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, 43201 Reus, Spain, 12 (3).pp. 454-500. 38. Juhasz A. L., Naidu R. (2000), “Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromtic hydrocacbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene”, International Biodeterioration Biodegradation, 45, pp. 57-88. 39. Kanaly R. A., Harayama S. (2000), “Biodegradation of high- molecular- weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria”, Jounal of Biotechnology, vol 182 ,pp. 2059-2067. 40. Laha, S. and Luthy, R.G., (1992), "Effects of Nonionic Surfactants on the Solubilization and Mineralization of Phenanthrene in Soil-Water Systems", Biotechnol. Bioeng., 40, pp, 1367-1380. 41. Leen Bastiaens, 1,2 Dirk Springael, 1,* Pierre Wattiau, 3 Hauke Harms, 4 Rupert deWachter, 5 Hubert Verachtert, 2 and Ludo Diels 1 (2000), “Isolation of Adherent Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH)- Degrading Bacteria Using PAH-Sorbing Carriers”. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, No. 5, pp. 1834-1843. 42. Matthias Kastner, Maren Breuer- Jam mali and Bernd Mahro (1998), “Impact of Innoculation Protocols, Salinity anh pH on the Degradation of Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and survival of PAH – degrading Bacteria Introduced into Soil”, Appl. Enviro. Microbial, vol 64(1), pp. 359 - 362. 43. Meckenstock Rainer U., Safinowski Michael, Griebler Christian (2004), “Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons“, Microbiology Ecology, 49, pp. 27-36. 44. Mesarch M. B., C. H. Nakatsu, L. Nies (2000), “Development of catechol 2,3-dioxygenase-specific primers for monitoring bioremediation by Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 competitive quantitative PCR”. Applied and Environmental Microbiology, 66, pp. 678-683. 45. Meyer S., Moser R., Neef A., Stahl U., Kampfer P (1999), “Differential detection of key enzymes of polyaromatic hydrocarbon- degrading bacteria using PCR and gene probes”, Microbiol, 145, pp. 1731- 1741. 46. Okuta A., Ohnishi K., Harayama S., (1998), “PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase fragments from environments samples and their assembly into funtional genes”, Gene, 212, pp. 221-228. 47. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular clonning. A laboratory manual, 3 rd ed. Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork. 48. Sims, R.C., Overcash, M.R., (1983), “Fate of polynuclear aromaticcompounds (PNAs) in soil - plant systems”. Residue Reviews 88, pp. 1-68. 49. Sinkkonen S., Paasivirta J. (2000), “Degradation half-life times of PCDDs, PCDFs and PCBs for environmental fate modeling”, Chemosphere 40, pp. 943-949. 50. Sudip K. Samanta, Om V. Singh and Rakesh K. Jain (2002), “Polycyclic aromatic hydrocarbons: environmental pollution and bioremediation”. TRENDS in Biotechnology. (20) 6, pp. 243-247. 51. Sutherland J. B., F. Rafii, A. A. Khan, C. E. Cerniglia (1995), Mechanics of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation In (Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals), Lily Y. Young & Carl E. Cerniglia (eds.). Willey-Liss, New York. 52. S.Y. Yuan a, S.H. Wei b, B.V. Chang b,* (1999), ”Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a mixed culture “. A National Institute of Environmental Analysis, Environmental Protection Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Administration, Chungli, Taiwan, ROC Department of Microbiology, Soochow University, Taipei, Taiwan, ROC. Received 18 August ; accepted 28 October 1999. 53. Weissenfels WD, Beyer M, Klein J (1991), “Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by our bacteria cultures”, Appl Microbial Biotechnol 32, pp. 479-484. 54. Wilson, S.C., Jones, K.C., (1993), “Bioremediation of soils contami-nated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs): a review”, Environmental Pollution 88, pp. 229-249. 55. Wislocki, P. G. and A. Y. H. Lu. (1988), “Carcinogenicity and mutagenicity of proximate and ultimate carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Polycyclic aromatic hydrocarbon carcinogenesis: structure-activity relationships, vol.1, pp. 1-30. 56. Wikstrom P. (1996), “DNA recovery and PCR quatification of catechol 2,3-dioxygenase genes from diffirenr soil types”, Journal of Biotechnology, 52, pp. 107-120. 57. Xue-Jing Zheng , Jean-Francois Blais , Guy Mercier , Mario Bergeron , Patrick Drogui (2007), “PAH removal from spiked municipal wastewater sewage sludge using biological, chemical and electrochemical treatments”, Chemosphere, Mar 2; : 17337031. Bioinfobank Library. 58. Yuan S. Y., Wei S. H., Chang B. V. (2000), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by mixed culture”, Chemosphere 41, pp. 1463- 1468. 59. Yuan S.Y., Chang J. S., Yen J. H., Chang Bea-Ven (2002), “Biodegradation of phenanthren in river sediments”, Chemosphere, Vol. 43, pp. 273-278. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 60. Yuan S.Y., Chang S. W., Chang B. V. (2003), “Biodegradation of Polyclic Aromatic Hydrocacbon in sludge”, Bull. Environ. Contaim. Toxical., Vol 71, pp. 625-632. 61. Zaidi R., Baquar. and Imam H. S. (1999), “Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Caribbean coastal water”, Marine Pollution Bulletin, vol 38, pp. 737 - 742. 62. Zhongtang Yu and William W. Mohn* (2001), “Bacterial Diversity and Community Structure in an Aerated Lagoon Revealed by Ribosomal Intergenic Spacer Analyses and 16S Ribosomal ADN Sequencing”, Applied and Environmental Microbiology, pp. 1565-1574, Vol. 67, No. 4.