Luận văn Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA

Phi gồm có: Angola, Ethiopia, Ghana, Kenya, Libya, Malawi, Mauritius, Morocco, Mozambique, Seychelles, Somalia, Tanzania, Togo, Uganda, Zimbabwe. Ở vùng tây bán cầu có các quốc gia nhƣ: Argentina, Barbados, Bermuda, Bolivia, Brazil, Parana, Canada, British Columbia, Costa Rica, Cuba, Dominica, El Salvador, Guatemala, Haiti, Honduras, Jamaica, Mexico, Nicaragua, Panama, Puerto Rico. Ở nƣớc Mỹ, bệnh xuất hiện ở các bang nhƣ: California, Florida, Georgia, Hawaii, Illinois, Michigan, New York, Washington, Wisconsin. Ở châu Đại Dƣơng bệnh xuất hiện ở American Samoa, New South Wales. Ở Úc, bệnh xuất hiện ở các khu vực nhƣ: Queensland, Nam Úc, Tây Úc. Ngoài ra, bệnh cũng đƣợc ghi nhận là đã có mặt Cook Islands, Fiji New Caledonia, New Zealand, Norfolk Island, Papua New Guinea, Tonga. 5 Nhƣ vậy, chúng ta thấy rằng đây là bệnh phân bố khá rộng rãi, hầu nhƣ chúng có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. 2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh Theo Lowell L. Black (2000), bệnh do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây nên. Bệnh xuất hiện trên tất cả các loại cây trồng thuộc họ thập tự và một số giống cải hoang. Triệu chứng chính của bệnh là đốm trên lá thật, đôi khi bệnh cũng xuất hiện trên lá mầm, bông, cuống lá và bắp của cây cải bắp. Các đốm nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá do sự xâm nhiễm qua lỗ khí khổng của vi khuẩn hoặc rìa mép lá do quá trình xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng. Vết bệnh ban đầu là các lỗ nhỏ sũng nƣớc, về sau khi triệu chứng bệnh điển hình, đƣờng kính vết bệnh có thể lên đến 3 mm và có dạng hình tròn. Bao quanh vết bệnh là vành màu nâu sáng, khi bệnh già ở giữa có vùng hoại tử màu trắng. Vết bệnh trên gân, cuống lá thƣờng có dạng sọc đen dài. Youfu Zhao và ctv (2000, 2002) đã phân lập các vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên các cây trồng họ thập tự ở Oklahoma (cải bắp, cải rổ, cải củ, cải thìa) là Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris, Pseudomonas syringae pv. maculicola. Trong đó hai loài vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris là những tác nhân quan trọng. những vi khuẩn này cùng tồn tại và phát triển trên đồng ruộng. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris thuờng gây triệu chứng cháy lá chữ V (V – shape), đôi lúc cũng có triệu chứng đốm lá, nếu xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây triệu chứng đốm lá. Đối với bệnh đốm lá do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. maculicola gây triệu chứng đốm lá, vết bệnh thƣờng không định hình, kích thƣớc vết bệnh khoảng 2 mm, khi nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau, đƣờng kính vết bệnh có thể lên tới 1 cm. Màu sắc vết bệnh thƣờng có dạng sũng nƣớc, viền úa vàng bao quanh vết bệnh. Trong nghiên cứu của mình về bệnh đốm lá trên cây canola (Brassica napus), một loại cây trồng thuộc họ thập tự, S. Geatan, N. Lopez (2005) đã xác định rằng, tác nhân của bệnh này là do vi khuẩn Xanthomonas campestris gây nên. Vi khuẩn xâm nhiễm qua lỗ khí khổng tạo nên các vết đốm hoại tử. Triệu chứng bệnh đôi lúc có dạng cháy lá chữ V, đó là kết quả của sự xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng ở mép lá. 6 Từ tháng 12 năm 2001, K. Pernezn, E. Dickstein phát hiện dịch bệnh đốm lá cải bắp ở trang trại vùng Everglades thuộc phía nam bang Florida. Triệu chứng là các đốm nhỏ, kích thƣớc khoảng 1 – 2 mm và thƣờng xuất hiện ở phần mặt lá. Tác nhân là do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây nên. Xanthomonas campestris pv. campestris và các chủng khác thuộc loại này nhƣ X. campestris pv. abbrans, raphani, armmoraciae, và incanae đƣợc biết đến nhƣ là những chủng gây bệnh đốm lá hoặc cháy lá chữ V trên các cây trồng họ thập tự (J.G. Vicente, 2001). Cũng theo J.G. Vicente và ctv (2006) phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây củ cải trắng và cây cải ngựa (horseradish), kết quả cho thấy, tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Xanthomonas campesrtis pv. armoraciae hoặc Xanthomonas campesrtis pv. raphani. Ở Queensland, Australia, tác nhân gây bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây nên. Vi khuẩn thƣờng gây hại mạnh trên các giống cải (Moffett, M.L và ctv, 1976). Nhƣ vậy, tác nhân gây bệnh đốm lá họ tập tự cho đến nay bao gồm hai giống chính, giống Xanthomonas bao gồm: Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris, Xanthomonas campesrtis pv. raphani. Và giống Pseudomonas gồm có: Pseudomonas syringae pv. maculicola. 2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh Bệnh đốm lá vi khuẩn họ thập tự phân bố rộng rãi, gây hại nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Ở Oklahoma, hàng năm có khoảng 600 ha rau bị bệnh tấn công. Bệnh làm giảm năng suất và chất lƣợng của một số loại rau ăn lá họ thập tự. Từ 1994 đến 1996 bệnh làm thiệt hại hoàn toàn những cánh đồng trồng cải rổ, cải xanh, củ cải ở bang này (Youfu Zhao và ctv, 2000). Theo CPC (2001), bệnh đốm lá họ thập tự là bệnh quan trọng gây tổn thất đáng kể về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng. Bệnh là đối tƣợng nguy hiểm cho cây trồng họ thập tự ở các bang phía bắc nƣớc Mỹ. Trong những năm 1960 và 1970, bệnh gây hại rất nặng rên cánh đồng trồng cải bắp của bang Texas. Năm 1972 và 1973, bệnh đã gây thành dịch cho các khu vực Đông – Bắc, và các bang phía tây nƣớc Mỹ, khoảng 70% cây con lấy từ típ ƣơm cây đều bị nhiễm bệnh, sự thiệt hại này ƣớc tính là khoảng 7 1 triệu USD. Ở Canada, trong vụ Đông 1979 – 1980, bệnh gây tổn thất khoảng 60% sản lƣợng cải bắp. Ở miền nam tỉnh Buenos Aires – Argentina, tỷ lệ bệnh đốm lá cây canola (Brassica napus) trung bình koảng 59%, những năm bệnh nặng, tỷ lệ bệnh khoảng 90% và làm thất thoát khoảng 20% năng suất (S. Geatan, N. Lopez, 2005). Các loài gây bệnh thuộc giống Xanthomonas spp. Là vi khuẩn gây tổn thất kinh tế nặng nề nhất trên các cây trồng họ thập tự nhƣ cải bông, cải bắp, cải xanh (J.G. Vicente và ctv, 2006). 2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae tồn tại trong tàn dƣ cây trồng ở trong đất, nhƣng không sống trong đất sau khi tàn dƣ cây trồng bị phân hủy. Vi khuẩn cũng có thể tồn tại trên cây cỏ, hạt giống. Bệnh phát triển mạnh khi có ẩm độ lá cao (trên 85%), khoảng nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển tƣơng đối rộng 20 – 30oC. Trong điều kiện thời tiết có sƣơng hoặc mƣa liên tục kết hợp với nhiệt độ cao là điều kiện rất thuận lợi để bệnh phát triển mạnh mẽ. Vi khuẩn có thể lan từ cây này qua cây khác do mƣa, tƣới và các dụng cụ lao động (Lowell L. Black, 2000). Theo Youfu Zhao (2002), vi khuẩn gây bệnh lan truyền qua hạt giống là chủ yếu. nếu bệnh do Xanthomonas campestris pv. campestris gây nên thì vi khuẩn có thể tồn tại cả ở hạt giống, tàn dƣ thực vật và cỏ dại. Chƣa phát hiện đƣợc sự tồn tại và lan truyền qua đất và tồn dƣ cây trồng của vi khuẩn gây bệnh là Xanthomonas campestris pv. armoraciae. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae và Pseudomonas syringae pv. maculicola gây bệnh đốm lá cây rau ăn lá họ thập tự gần nhƣ không tồn tại trong tàn dƣ cây trồng đƣợc chôn vùi sâu, nhƣng chúng tồn tại lâu hơn trong tàn dƣ cây trồng trên mặt đất. Điều này cũng tƣơng tự nhƣ vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Chúng có thể tồn tại lâu hơn trong tồn dƣ thực vật trên mặt đất. Vi khuẩn gây bệnh cũng tồn tại trong tồn dƣ thực vật đã bị hoai mục. Cũng nhƣ các vi khuẩn gây bệnh khác, vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae có quan hệ chặt chẽ với sự xâm nhiễm vào mô lá qua lỗ hở tự nhiên (khí khổng, thủy khổng) và các vết thƣơng tạo nên hiện tƣợng đốm lá (Veronique Hugouvieux, 1998). 8 Theo CPC (2001), Xanthomonas campestris pv. campestris sống sót qua mùa đông trong đất, đặc biệt là các cây kí chủ nhiễm bệnh và các loài cỏ dại mọc gần ruộng trồng cây họ thập tự, vi khuẩn có thể tồn tại tới 3 năm. Vi khuẩn xâm nhập vào hạt, lỗ khí khổng và thủy khổng của cây. Vi khuẩn từ lá mầm ở cây con có thể lan truyền trực tiếp lên các lá thật. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua sự hình thành giọt nƣớc tiết ra từ lỗ thủy khổng trong giai đoạn buổi sáng (Ruisen và Gielink, 1993). Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng của vi khuẩn là 25 – 30oC. Trong những điều kiện nhƣ vậy, triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7 – 14 ngày. Nhiệt độ thấp, triệu chứng bệnh xuất hiện chậm. Triệu chứng bệnh không thể hiện rõ khi nhiệt độ dƣới 18 – 20oC. Vi khuẩn có thể sống sót trên bề mặt lá đến 73 ngày sau khi lá đƣợc chủng bệnh bằng phƣơng pháp phun (Schultz và Gabrielson, 1986). Vi khuẩn có thể lây lan từ cây này qua cây khác nhờ gió, mƣa và công cụ lao động. 2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh Các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas thƣờng có phản ứng Gram âm, háo khí, tế bào hình gậy (0,4 – 0,7 x 0,7 – 1,8 μm), tiêm mao đơn cực, không sản sinh nitrates, phản ứng catalase dƣơng tính, tạo axít yếu từ các nguồn carbonhydrate. Khuẩn lạc có màu vàng, nhầy, lồi và bóng trên môi trƣờng NGA và YDC agar. Đối với các loài Xanthomonas, khuẩn lạc có thể mọc và phát triển ở nhiệt độ 35oC, hóa lỏng gelatin, không tạo urease, sản sinh axit từ arabinose, glucose và manose (N.W. Schaad, 1998). 2.1.6. Phƣơng pháp phân lập tác nhân gây bệnh Theo Youfu Zhao (2000), đối với bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas, việc ly trích vi khuẩn tốt nhất từ các đốm lá mới bị nhiễm bệnh. Sát trùng bề mặt bằng sodium hypochlorite 0,25% trong 30 giây, đốm bệnh đƣợc cắt nhỏ trong giọt nƣớc tiệt trùng và cấy zích zắc dịch khuẩn lên môi trƣờng nutrient agar (NA). Đĩa cấy ủ trong 28oC, sau 3 – 5 ngày đem quan sát khuẩn lạc. Chọn các khuẩn lạc màu vàng, mọc tách rời để nghiên cứu. Theo CPC (2001), vi khuẩn gây bệnh thực vật giống Xanthomonas có thể đƣợc phân lập từ rìa vết bệnh (phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe ). Vi khuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng Yeast dextrose calcium carbonate (YDC), Beef peptone agar + 5% water soluble starch. 9 Theo Shaad, N.W. (1988), vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có thể đƣợc phát hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trƣờng bán chọn lọc (semiselective media). Các loại môi trƣờng bán chọn lọc chuyên biệt đƣợc sử dụng là SX agar, SM agar, NSCAA, BSCAA. Các môi trƣờng này thƣờng dùng phân lập vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. Campestris trong đất và hạt giống. 2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử Để đánh giá sự đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn Xanthomonas campestris gây bệnh đốm lá trên cây họ thập tự, Youfu Zhao và ctv (2000) đã sử dụng kỹ thuật rep-PCR với BOX primer BOXAIR [5’ – ca m p estris ca ro ta e T ra n slu cen s p h a seo li p ru n i vesica to ria o ryza e m a lva cea ru m M a n ih o tis B eg o n ia e p ela m g o n ii fra g a ria M ô i trƣ ờ n g + – – V – V – – – – – + – + S X + – – – V – – V – + V + S M + V – + V – + V – V – V – + + + B S C A A V + (+ ) V + V – V + – V + – (+ ) V + M X P – – – V – + V – – – V V V X P S a + + + + V + – + + (+ ) + + X C S V – + V + (+ ) V N D V V + V M D – 5 + V + (+ ) + + N D + V + + + T w een B ả n g 1 .1 S ự p h á t triển củ a m ộ t số lo à i v i k h u ẩ n X a n th o m o n a s trên m ô i trƣ ờ n g b á n ch o n lọ c 10 CTACGGCAAGGCGACGCTGACG – 3’]. Phản ứng rep – PCR trên các mẫu nghiên cứu tạo sản phẩm là các đoạn DNA có kích thƣớc từ 0,3 – 4 kb cho phép đánh giá sự tƣơng quan về mặt kiểu gen giữa các loài. Hình 2.1 Sản phẩm rep – PCR trong nghiên cứu của Youfu Zhao và ctv. Goncalves, E.R., và Rosato, Y.B (2002), trong nghiên cứu của mình về sự phát sinh loài vi khuẩn Xanthomonas campestris đã dùng kỹ thuật PCR sử dụng cặp primer Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’ Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’ thiết kế dựa trên vùng rDNA 16S và 23S để khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS có kích thƣớc 1,1 kb. 11 Hình 2.2 Cấu trúc vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn Xanthomonas. Said M.S. Massomo và ctv (2003) đã thực hiện nghiên cứu định danh vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris trên cải bắp ở Tanzania bằng phƣơng pháp chủng bệnh, phân tích methyl este acit béo, ELISA gián tiếp và rep – PCR. Vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc tiến hành phân tích sinh hóa; chủng bệnh bằng phƣơng pháp châm kim tạo vết thƣơng, lây nhiễm trên lá mầm, phun dịch khuẩn trên cây trƣởng thành. Acit béo đƣợc methyl hóa, ly trích và phân tích bằng máy sắc ký khí. Vi khuẩn đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu. Các dòng vi khuẩn sau khi xác định đƣợc tiến hành phân tích genomic fingerprinting bằng kỹ thuật rep – PCR với primer BOXAIR (5’ – CTACggCAAggCgACgCTgACg – 3’) và REP – PCR dùng cặp primer: REP 1R (5’ – IIIICgICgICATCIggC – 3’) REP 2I (5’ – ICgICTTATggCCTAC – 3’). Young Jin Park và ctv (2004) đã thực hiện nghiên cứu phát hiện vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris bằng kỹ thuật PCR dựa trên cặp primer XCF (5’ – CGATTCGGCCATGAATGACT – 3’) và XCR (5’ – CTGTTGATGGTGGTCTGCAA – 3’) đƣợc thiết kế từ gen hrpF của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris để khuếch đại đoạn DNA có 12 kích thƣớc 535 bp. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm chứng minh tính chuyên biệt và đặc hiệu của primer XCR, XCF bằng cách thực hiện phản ứng PCR với nhiều thành phần hóa chất mà máy luân nhiệt khác nhau. Ngoài ra, kỹ thuật DNA dot – blot cũng đƣợc thực hiện nhằm kiểm chứng sự hiện diện của gen hrpF trong vi khuẩn, qua đó rút ra kết luận về sự bảo toàn của gen này. 2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc Cho đến nay, những nghiên cứu về bệnh đốm lá họ thập tự nói chung và cây cải ngọt nói riêng còn khá ít. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), bệnh đốm lá súp lơ là do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. maculicola gây nên. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1911. Triệu chứng bệnh trên các lá thật thƣờng là các đốm nhỏ, tròn, góc cạnh, màu nâu tím hoặc đen. Trên lá mầm xuất hiện các đốm trong giọt dầu, mép lá uốn cong. Đƣờng kính vết bệnh từ 1 – 3 mm. Vi khuẩn gây bệnh hình gậy, hai đầu tròn, kích thƣớc khoảng 1,5 – 3 x 0,5 – 1 μm, chuyển động nhờ vài ba lông roi ở một đầu. Khuẩn lạc trắng kem, tròn nhẵn, rìa gợn sóng. Vi khuẩn có khả năng phát huỳnh quang, tạo NH3, khử nitrate, không phân giải đƣờng thành axít, khí, không làm đông váng sữa, phân giải gelatin rất yếu, khả năng yếu tạo H2S và indol. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trƣởng là 24 – 25oC, nhiệt độ tối đa là 29oC, nhiệt độ gây chết là 47oC, nhạy cảm với tác động của ánh sáng mặt trời và khô hạn. Vi khuẩn xâm nhiễm qua lỗ khí khổng, vết thƣơng. Thời kỳ ủ bệnh là khoảng 4 – 6 ngày. Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện ẩm độ cao (90%), nhiệt độ 17 – 25oC. Bệnh có thể lan truyền qua bọ nhảy. Ở trên cây cải bông và một số rau ăn lá nhƣ cải thìa, cải xanh, cải ngọt, bệnh đốm lá do vi khuẩn Xanthomonas spp. gây nên thƣờng xuất hiện trong vụ đông xuân. Trên cải bông, bệnh xuất hiện nhiều hơn so với các giống cải khác (Trần Thanh Tùng, 1997). Theo Phạm Văn Biên và Mai Thị Vinh (1998, 2000), bệnh đốm lá cải bông vùng trồng rau thành phố HCM do vi khuẩn Pseudomonas spp. gây nên. Bệnh thƣờng xuất hiện trên cải bông trồng trong vụ đông xuân. Bệnh phát sinh gây hại nặng vào những năm có thời tiết nóng ẩm. Giống Xanthomonas spp. thƣờng gây bệnh cháy lá chữ V 13 trên cải bắp, cải bông vùng Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh. Bệnh cũng thƣờng xuất hiện trong vụ đông – xuân, khoảng từ tháng 11 – 2. Trong giống Xanthomonas spp. có một loài gây bệnh đốm lá cải bông đƣợc phát hiện trong năm 1998 ở vùng rau Vĩnh Lộc B, Bình Chánh, Tp. HCM. Triệu chứng bệnh ban đầu là các đốm nhỏ vàng sáng ở các lá thấp gần mặt đất, các đốm này trông gần giống với đốm do bọ nhảy gây hại. Bệnh thƣờng nặng hơn vào giai đoạn cuối vụ. Tỷ lệ bệnh giai đoạn phát triển thân lá khoảng 21%, nhƣng ở giai đoạn ra bông , bệnh có thể lên tới 50% (Mai Thị Vinh, 1998). Nhìn chung, số công trình nghiên cứu về tác nhân cũng nhƣ các đặc tính sinh học, sinh lý, sinh hóa, dịch tễ học của bệnh đốm lá cải ngọt nói riêng và bệnh đốm lá cây họ thập tự nói chung ở Việt Nam còn khá ít. 2.3. Vùng 16S – 23S rDNA ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity) 2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity) Để xâm nhập và gây bệnh trên cây kí chủ, các loài vi khuẩn thƣờng có hệ thống riêng tiết ra các loại enzyme (pectinases, cellulases, proteases) và các chất độc (Beattie và Lindow, 1994). Ngoài ra còn có sự tham gia của hệ thống các gen hrp. Gen này hiện diện trong hầu hết các loài vi khuẩn Gram âm ngoại trừ Agrobacterium (Lindgren, 1986). Gen này tạo cho vi khuẩn khả năng xâm nhập và nhân sinh khối trong cây nhiễm (susceptible plant), đồng thời tạo phản ứng siêu nhạy cảm (hypersensitive reaction) ở cây kháng (resistant plant). Phản ứng siêu nhạy cảm là một đáp ứng phòng vệ của cây kí chủ, thể hiện bằng sự hoại tử ở mô bị nhiễm (Klement, 1982). Tổ hợp gen này bao gồm 21 gen và 2 gen điều tiết là hrpX, hrpG nằm bên ngoài. Các gen hrp mã hóa các protein hrp. Các protein này là thành phần của hệ thống phóng tiết loại III (type III secretion system) cho phép tiết ra các loại protein gây độc (Van Gijsegem, 1993 và Van den Ackerveken, 1996). 2. 3.2. Ribosome DNA (rDNA) rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA đƣợc quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom 14 hầu nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tƣơng đối bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và ctv, 1996). Theo Goncalves, E.R., và Rosato, Y.B (2002), rDNA 16S và 23S có tính bảo toàn cao. Ngƣợc lại, vùng ITS tiến hóa nhanh hơn và có nhiều biến động. Do đó, các primer đƣợc thiết kế dựa trên trình tự các vùng bảo toàn để khuếch vùng ITS, dùng trong các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền, nguồn gốc phát sinh cũng nhƣ quan hệ giữa các loài. Ngoài ra, vùng ITS còn đƣợc sử dụng giải trình tự, đối chiếu với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh sinh vật. 15 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1.Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian từ ngày 06/02/2006 đến 30/07/2006 3.1.2. Địa điểm - Tiến hành lấy mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm ở Tp HCM: Củ Chi, Hóc Môn, quận 12. - Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh tại Phòng Nghiên Cứu Bảo Vệ Thực Vật, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam (IAS). - Chủng bệnh trên cây rau cải ngọt trong nhà lƣới thuộc Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, ĐH Nông Lâm Tp HCM. - Ly trích DNA và tiến hành phản ứng PCR, đọc trình tự tại Trung Tâm Phân Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, ĐH Nông Lâm Tp HCM. 3.2. Vật liệu Mẫu bệnh phẩm thu thập từ các vùng trồng rau trọng điểm ở Tp HCM: Củ Chi, Hóc Môn, quận 12. Đề tài sử dụng dòng vi khuẩn đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri gây bệnh ung thƣ trên cây bƣởi. 3.3. Hóa chất Các hoá chất đƣợc sử dụng trong đề tài này đƣợc sản xuất bởi Công ty Sigma, Merk, Amersham Biosence và Bio Rad. 3.3.1. Các hoá chất dùng để ly trích DNA từ vi khuẩn Phenol Chloroform Isoamyl Isopropanol Ethanol 100% Ethanol 70% RNAse 1mg/ml Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1). Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH 8,0 16 – Dung dịch đệm ly trích DNA Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA EDTA: tạo phức Mg++, gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết SDS: 20 % : phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA. - Dung dịch CTAB: dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác. 10 g CTAB. 100 ml NaCl 0,5 M. 3.3.2. Các hoá chất dùng trong điện di Gel agarose, thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1% agarose. Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện di với thành phần nhƣ sau: Tris HCl 4,48 g Na2EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml Glacial acetic acid 1,14 ml Nƣớc cất vừa đủ 1 lít Dung dịch nhuộm gel là Ethidium bromide 1%. Ladder 1 kp. Ladder 1,5 kb. DNA loading buffer. 3.3.3. Hoá chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) Taq DNA polymerase nồng độ 5UI/µl. Dung dịch đệm 10X: đi kèm với Taq. dNTPs 10 mM. MgCl2 50 mM. Primer: đƣợc tổng hợp bởi công ty IDT (Mỹ). Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’ Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’ (nguồn: Young Jin Park và ctv, 2004) XCF 5’ – CGATTCGGCCATGAATGACT – 3’ XCR 5’ – CTGTTGATGGTGGTCTGCAA – 3’ 17 (nguồn: Goncalves, E.R và Rosato, Y.B, 2002) 3.3.4. Môi trƣờng Môi trƣờng PDA. Môi trƣờng YGC. Môi trƣờng lỏng LB. ( thành phần và cách chuẩn bị môi trƣờng: xem phụ lục) 3.4. Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho một phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Kính lúp. Kính hiển vi và kính hiển vi soi nổi. Que cấy, đèn cồn. Tủ mát. Tủ lạnh -20oC. Máy đo pH. Tủ cấy vô trùng. Tủ ủ nhiệt. Máy lắc. Máy ly tâm lạnh. Máy khuấy từ. Bộ điện di. Máy PCR. Máy vortex. Máy chụp hình gel (Bio –Rad). Máy đọc trình tự ABI PRISM 3100. 3.5. Phƣơng pháp 3.5.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vùng trồng rau ở Củ Chi, Hóc Môn và quận 12. Quan sát trên các ruộng rau cải ngọt, khi phát hiện các lá có triệu chứng bệnh (xuất hiện các đốm nhỏ có kích thƣớc 1 – 2 mm màu nâu đen, phân biệt với vết đốm tròn do bọ nhảy gây nên), tiến hành lấy mẫu lá, rửa kỹ bằng nƣớc sạch, bọc trong giấy thấm, cho vào bao ni lông. Mỗi ruộng lấy từ 3 – 4 lá. Mẫu lá lấy từ các ruộng khác nhau đƣợc kí hiệu riêng và đƣợc coi là một dòng bệnh. Mẫu sau khi thu thập đƣợc ủ ẩm tạo ẩm độ thích hợp cho vi sinh vật phát triển trƣớc khi đem phân lập. 3.5.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh Mẫu lá đƣợc rửa sạch đất cát bằng nƣớc vòi, thấm khô bằng giấy lọc. Các vết bệnh mới xuất hiện, còn nhỏ đƣợc chọn để phân lập. Mỗi mẫu bệnh cắt 1 đốm mới xuất hiện 18 triệu chứng (kích thƣớc nhỏ, vết bệnh có màu xanh giọt dầu). Khử trùng bề mặt bằng NaCLO 0,3% và cồn 70% để loại bỏ các sinh vật biểu sinh, sau đó dùng dao mổ cắt nhỏ vết bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng. Để 5 – 10 phút sau cho vi khuẩn đi từ mô lá vào trong nƣớc cất. * Cấy vi khuẩn: Hút 1 ml dịch khuẩn ở trên nhỏ vào đĩa petri, cấy trang trên môi trƣờng bằng trang cấy thủy tinh chữ L. Mỗi đốm bệnh đƣợc cấy 3 lần lặp lại (9 đĩa). Đem các đĩa đã cấy đặt vào tủ định ôn ở 28oC trong 24 – 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, lấy ra quan sát và chọn các khuẩn lạc. Phân loại khuẩn lạc bằng hình dạng, màu sắc và kiểu mọc. Chọn các khuẩn lạc màu vàng, lồi, bóng, nhầy mọc riêng rẽ để cấy ria lên môi trƣờng YGC 3.5.3. Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới 3.5.3.1. Phƣơng pháp trồng cây kí chủ Để chủng bệnh, phải trồng cải ngọt sạch bệnh trong nhà lƣới. Giống cải ngọt để trồng đƣợc mua từ các công ty giống cây trồng bao gồm 3 giống: Số 4, Hai mũi tên đỏ và H&V. Giá thể trồng: vật liệu làm giá thể trồng bao gồm xơ dừa, rơm rạ hoai mục, tro trấu. Các thành phần trộn theo tỷ lệ 1:1:1, hỗn hợp này sau đó trộn với đất trồng theo tỷ lệ 1:1 tạo giá thể hoàn chỉnh. Toàn bộ giá thể đƣợc hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC. Xử lý hạt giống: trƣớc khi gieo, ngâm hạt trong nƣớc ấm 50oC sau đó đem gieo vào khay gieo sạch. Khay gieo có kích thƣớc 50 cm x 30 cm, chứa khoảng 200 lỗ. Cây con sau khi mọc 10 ngày đem trồng ra khay xốp với kích thƣớc lỗ lớn. Khi cây cải 20 ngày tuổi có khoảng 3 – 4 lá thật thì tiến hành chủng bệnh. 3.5.3.2. Chủng bệnh Để xác định dòng vi khuẩn gây bệnh, chủng bệnh tiến hành theo phƣơng pháp châm kim tạo vết thƣơng trên bề mặt lá. Trên mỗi lá châm thành hàng ở phần thịt lá dọc hai bên gân chính, mỗi bên châm khoảng 5 – 7 vết. Một bên sẽ đƣợc chủng vi khuẩn, bên kia không chủng để làm đối chứng so sánh. Các dòng vi khuẩn chọn chủng đƣợc cấy trên môi trƣờng PDA để thu sinh khối. Dùng tăm bông khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc trên đĩa chấm vào vết thƣơng để lây nhiễm vi khuẩn vào mô lá. 19 Khay cải sau chủng đƣợc ủ ẩm bằng cách bọc trong túi ni lông có miệng để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn và tránh sự lẫn tạp các dòng với nhau. Sau 3 – 4 ngày, quan sát triệu chứng và ghi nhận kết quả. Lá nhiễm bệnh khi xung quanh vết châm có sự hoại tử mô tế bào (khác biệt với vết châm đối chứng ở đối diện gân lá). Để quan sát triệu chứng, hình thái và phản ứng của tế bào lá sau khi chủng. Chúng tôi tiến hành nhuộm lá bằng dung dịch Alcohollic lactophenol (thành phần và cách pha dung dịch: xem phần phụ lục). Phƣơng pháp nhuộm lá đƣợc mô tả nhƣ sau: - Cho lá cải cần nhuộm vào ống nghiệm, mỗi ống 2 lá. - Rót dung dịch Alcohollic lactophenol vào ống nghiệm đến khi ngập lá. - Đƣa ống nghiệm vào nồi nƣớc đang sôi, đến khi thấy bọt khí nổi lên thì lấy ra. - Để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng cho đến khi bọt khí ngừng nổi. - Đổ bỏ dung dịch và rửa lá bằng nƣớc cất. - Mẫu lá sau đó đƣợc để khô tự nhiên. - Lƣu mẫu ở 4oC. Mẫu lá xác định có nhiễm bệnh đƣợc đem phân lập vi khuẩn gây bệnh. Các bƣớc phận lập đƣợc tiến hành nhƣ phƣơng pháp đƣợc trình bày ở mục 3.5.2. 3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn Vi khuẩn đƣợc nhân sinh khối trong môi trƣờng LB lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, thu sinh khối và tiến hành ly trích. Ly trích DNA theo phƣơng pháp sử dụng CTAB: 1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC. Rửa sinh khối vi khuẩn đƣợc với 1 ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex (rửa 2 – 3 lần). Ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC. 2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10%, trộn đều bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 h. 3. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex. 4. Thêm 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (1/10 thể tích), pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65oC trong 10 phút. 20 5. Chiết xuất dung dịch DNA với 500 µl dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1). Trộn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4oC. 6. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới . 7. Thêm 780 µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4 oC. 8. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol (2/3 thể tích dung dịch thu đƣợc), ủ ở - 20 oC/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10 phút/4 oC. Lấy kết tủa sau ly tâm. 9. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20 oC, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4 oC. Đổ cồn ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. 10. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4 oC trong suốt thời gian tiến hành đề tài. 3.5.5. Phƣơng pháp PCR 3.5.5.1. Khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn Phản ứng tiến hành với cặp mồi không chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm khuếch đại trình tự vùng ITS (intergenic spacer sequence) nằm giữa vùng rDNA 16S và 23S (Goncalves và Rosato, 2002): - Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’ - Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’ Thành phần của phản ứng đƣợc thiết lập bao gồm: Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Nồng độ sau cùng Thể tích ( l) PCR buffer 10X 1X 2,5 dNTP 1 mM 100 M 0,5 MgCl2 25 mM 1,5 mM 0,75 Primer 5 M 0,25 M 2 DNA 25 ng / l 1,25 ng / l 1 Taq polymerase 5 unit / l 0,1 unit / l 0,2 H2O 18,05 Tổng cộng 25 21 Chu kỳ nhiệt của phản ứng đƣợc thiết lập theo bảng sau: Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan322 Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 58 72 1 phút 45 giây 1 phút 30 Hoàn thành 72 10 phút 1 Giữ mẫu 4 30 phút 1 3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF Với thành phần nhƣ trên, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi chuyên biệt, đƣợc thiết kế dựa vào trình tự gen hrpF (Young Jin Park và ctv, 2004). - XCF 5’ CGATTCGGCCATGAATGACT 3’ - XCR 5’ CTGTTGATGGTGGTCTGCAA 3’ Quy trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau: Bảng 3.3 Quy trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCF và XCR 3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết quả 3.5.6.1. Điện di trên gel agarose Cho 0,125 gram agarose vào 12,5 ml dung dịch 0,5X TAE Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 58 72 15 giây 15 giây 30 giây 35 Hoàn thành 72 5 phút 1 Giữ mẫu 4 30 phút 1 22 Đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò viba (đun 2 lần, mỗi lần 1 phút) Để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C. Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí trên gel. Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel, cho dung dịch 0,5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel khoảng 1 – 1,5 cm. Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng thang chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100 V và 250 mA. 3.5.6.2. Đọc kết quả điện di Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm Quantity one 2000). Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel. 3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA * Tinh sạch sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dƣ thừa cũng nhƣ các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện đƣợc. Quy trình tinh sạch gồm các bƣớc nhƣ sau: Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose). Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lƣợng. Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao tác này đƣợc tiến hành dƣới tia UV trong phòng tối), cắt càng sát band chứa 23 DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã đƣợc cân từ trƣớc, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn. Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lƣợng của miếng gel. Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh sạch là 300 l buffer và 300 mg gel). Vortex nhẹ và ủ ở 600C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thƣờng khoảng 10 – 15 phút. Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube. Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu xuống phần đáy của ependorf. Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy nhẹ theo thành column). Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây. Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào collection tube trở lại. Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây. Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã đƣợc làm lạnh. Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch. * Định lƣợng DNA tinh sạch DNA sau khi tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P. Curran, 2002). Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự Sản phẩm PCR Lƣợng 100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1-3 ng 3-10 ng 5-20 ng 24 1000-2000 bp 10-40 ng 3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) * Thành phần hóa chất Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự đƣợc thể hiện trong bảng sau: Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự Sản phẩm PCR Lƣợng BDT mix Buffer DNA khuôn (580 bp) Primer Nƣớc khử ion 4 l 2 l 1 l 1 l 2 l Tổng số 10 l * Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự Đặt các ống tube vào Thermal cycler và cài đặt thể tích 10 l. Làm nóng các ống tube ở 950C trong 5 phút. Bƣớc 1:950C trong 30 giây Bƣớc 2: 50 - 550C trong 10 giây 25 chu kỳ Bƣớc 3: 600C trong 4 phút Hạ nhiệt độ xuống 40C và duy trì cho tới khi tinh sạch. 3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại Mục đích của việc tinh sạch là để loại bỏ dye terminator còn dƣ trƣớc khi điện di. Sử dụng phƣơng pháp tinh sạch của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh: Bổ sung 5 l EDTA 125 mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm PCR. Spin nhẹ. Thêm vào 60 l ethnol 100 %. Ủ tại nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 4500 vòng/phút trong 45 phút 25 Thu tủa sau đó rửa tủa bằng 60 l ethanol 70 %. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại dịch thu cặn. Làm khô bằng máy speed vac. Thêm vào 10 l Hidiformamide. Biến tính ở 950C trong 3 phút. 3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại đƣợc load vào các cột mao dẫn chứa polymer để điện di phân tích kết quả. Kết quả thu đƣợc từ tín hiệu huỳnh quang sẽ đƣợc ghi nhận bằng phần mềm của máy sequencer. 3.5.7.4. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR Tinh sạch GFX PCR DNA and gel band Purification kit Phản ứng đọc trình tự Hóa chất: BDT mix Buffer DNA khuôn Primer Nƣớc khử ion Chu kỳ nhiệt: 950C/5 phút 950C/30 giây 550C/10 giây 600C/4 phút 25 chu kỳ Tinh sạch Điện di, ghi nhận tín hiệu 26 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh Qua quá trình khảo sát thực tế tại các ruộng trồng rau, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và phân lập đƣợc tổng cộng 8 dòng vi khuẩn nhƣ sau: Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài Tên mẫu Nơi lấy mẫu Cây kí chủ 1 CC1 Huyện Củ Chi Cải ngọt 2 CC2 Huyện Củ Chi Cải ngọt 3 CC3 Huyện Củ Chi Cải ngọt 4 HM1 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 5 HM2 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 6 HM3 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 7 Q12 – 1 Quận 12 Cải ngọt 8 Q12 – 2 Quận 12 Cải ngọt 9 DC vi khuẩn đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri Bƣởi Đốm bệnh do vi khuẩn Đốm do bọ nhảy gây hại trên rau 27 Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau. Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới kính hiển vi soi nổi. Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch (a) vi khuẩn ly trích từ lá bệnh trên môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau khi phân lập trên môi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy. a b 28 4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới Cây kí chủ sạch bệnh trồng trong nhà lƣới sau khi chủng 4 ngày đƣợc tiến hành quan sát triệu chứng. Kết quả cho thấy các dòng CC1, CC2, CC3, HM1, HM2 và Q12 – 1 gây triệu chứng bệnh trên cây cải ngọt trồng trong nhà lƣới. So sánh vết bệnh tạo ra trên lá cải thu thập ngoài ruộng và lá cải đƣợc chủng trong nhà lƣới, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về triệu chứng. Ở những lá cây nhiễm bệnh, qua hình chụp đốm bệnh dƣới kính hiển vi soi nổi, ta có thể thấy rõ triệu chứng: từ vết thƣơng ban đầu, vi khuẩn xâm nhập các mô, gây hoại tử các mô tế bào lá. Vết bệnh phát triển rộng dần tạo thành đốm màu nâu đen rõ rệt. Còn ở những lá không bị nhiễm, những tế bào tại vùng bị tổn thƣơng bị chết tạo thành vết sẹo màu trắng, không có triệu chứng bệnh. a d b c 29 Hình 4.4 Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp dƣới kính hiển vi soi nổi (a) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày; (b) vết thương do kim châm tạo ra trên lá không bị bệnh; (c) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo ở lá chủng không nhiễm bệnh nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol. Đốm bệnh Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và bên trái bị nhiễm (a) lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày; (b) lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol. 4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn a b 30 Quá trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu. DNA thu đƣợc phải đáp ứng đƣợc yêu cầu về hàm lƣợng và độ tinh sạch. Sau khi tiến hành tách chiết theo đúng quy trình 8 mẫu vi khuẩn, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn (genomic DNA) 1: CC1, 2: CC2, 3:CC3, 4: HM1, 5: HM2, 6: Q12-1, 7: DC. Qua kết quả điện di ta thấy DNA ly trích có chất lƣợng tốt, lƣợng mẫu nhiều và ít tạp nhiễm. Tuy nhiên, để chuẩn bị tốt cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành pha loãng nhằm hịêu chỉnh nồng độ mẫu DNA bằng dung dịch TE. Kết qủa thu đƣợc thể hiện qua band diện di: Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA. DNA thu đƣợc Phần tạp nhiễm 31 Thông thƣờng, sản phẩm ly trích phải qua giai đọan tinh sạch bằng enzyme RNAse nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, dựa vào hình trên, chúng tôi nhận thấy DNA thu đƣợc có độ thuần khiết cao, do đó, không cần thiết phải tinh sạch. Hơn nữa, quá trình tinh sạch sẽ làm gãy DNA ở một mức độ nào đó. 4.4. Kết quả phản ứng PCR 4.4.1. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng. Sau khi hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen trong vùng ITS, chúng tôi tiến hành phản ứng trên các mẫu DNA đã ly trích. Kết quả thu đƣợc rất khả quan. So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR từ các dòng thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1kb. Kích thƣớc sản phẩm hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Goncalves, E.R. và Rosato, Y.B. Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA 1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC. Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh. 1,1kb 32 4.4.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Chọn hai mẫu CC1 và HM2 để tiến hành tinh sạch theo quy trình GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham Company). Cf1 HM2 Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR. 4.4.3. Kết quả PCR vùng hrpF Theo Young Jin Park và ctv (2004), primer XCR và XCF thiết kế dựa trên trình tự gen hrpF có tính chuyên biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có kích thƣớc 535 bp. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR dùng cặp mồi trên đối với các dòng vi khuẩn CC1, CC2, HM1, HM2 và Q12 – 1. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Các dòng CC1, CC2, HM2 và Q12 – 1 tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp, hoàn toàn phù hợp với báo cáo của Young Jin Park và ctv (2004). Do đó, có thể kết luận các dòng vi khuẩn này là Xanthomonas campestris pv. campestris. - Dòng đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri không tạo sản phẩm khuếch đại. - Riêng dòng HM2 tạo sản phẩm có kích thƣớc 1 kb. Tuy là kết quả dƣơng tính nhƣng chƣa thể có kết luận định danh đối với dòng vi khuẩn này. 33 Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF 1: HM1, 2: HM2, 3: CC1, 4: Ladder 1kb, 5: CC2, 6: Q12 – 1, 7: DC. Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Kết thúc đề tài, chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm của Tp. HCM: Tiến hành khảo sát trên ruộng rau, thu thập các mẫu lá xuất hiện các đốm nhỏ màu nâu đen, rửa sạch đất cát, ủ ẩm trong bao ni lông cho vi khuẩn phát triển trƣớc khi phân lập. Phân lập vi khuẩn từ các đốm bệnh trên lá: Rửa sạch lá bằng nƣớc vòi, mỗi mẫu bệnh chọn các đốm bệnh còn mới màu xanh giọt dầu để phân lập. Khử trùng bề mặt, cắt nhỏ mẫu bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng 5 – 10 phút. Hút dịch khuẩn cấy trang lên môi trƣờng PDA, ủ ở 28oC trong 24 – 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích. Chủng bệnh trên cây cải ngọt sạch bệnh trồng trong nhà lƣới bằng phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng cách xâm kim và nhiễm vi khuẩn trên vết thƣơng. 535 bp 1 kb 34 Ly trích DNA từ vi khuẩn bằng phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi khuẩn tăng sinh bằng môi trƣờng LB lỏng. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử dụng cặp primer Xan1330 và Xan322 làm vật liệu giải trình tự. Thực hiện phản ứng với thành phần nêu trong Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2. Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF và XCR khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF . Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.3. Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng định vi khuẩn gây bệnh thuộc loài Xanthomonas campestris pv. campestris. Chúng tôi đã xác định đƣợc các dòng CC1, CC2, HM1 và Q12–1 gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris. 5.2. Đề nghị Tiến hành khảo sát, nghiên cứu ở quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn hơn trên các cây rau họ thập tự. Cụ thể là mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long, Lâm Đồng, Long An và các tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu trên phổ kí chủ rộng hơn (cây họ thập tự). Hoàn thành đề tài ở mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn gây bệnh, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có cơ sở. Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật RFLP. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206. 3. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virút hại cây trồng. NXB Giáo Dục Hà Nội. Trang 99 – 100. 4. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng rau ngoại thành Tp Hồ Chí Minh. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. 5. Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996. Sổ tay người trồng rau . Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 114 trang. 6. Trần Thanh Tùng, 1997. Những bệnh hại quan trọng trên một số loại rau trồng phổ biến tại Tp Hồ Chí Minh và biện pháp phòng trừ. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. 36 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 7. Bradbury, J.F., 1986. Guide to plant pathogenic bacteria. Wallingford, UK: CAB International. 8. Gaetan, S., and Lopez, N., 2005. First outbreak of bacterial leaf spot caused by Xanthomonas campestris on Canola in argentina. Plant Disease. 89: 683 – 684. 9. Goncalves, E.R., and Rosato, Y.B., 2002. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer sequences. Inetrnational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52: 355 – 361. 10. John P. Curran, 2002. Automated DNA sequencing (ABI PRISM 3100). Training Manuals/Protocols. 11. Klement, Z., 1982. Hypersensitivity. Phytopathogenic Prokaryotes. Pages 149 – 177. 12. M. S. Krause, M.S., De Ceuster, T.J.J., Tiquia, S.M., Michel Jr.F.C., Madden, L.V., and Hoitink, H.A., 2003. Isolation and characterization of rhizobacteria from composts that suppress the severity of bacterial leaf spot of radish. Phytopathology. 93: 1292 – 1300. 13. Massomo, S.M.S., Hanne Nielsen, Mabagala, R.B., Keld Mansfield – Giese, John Hockenhull, and Mortensen, C.N., 2003. Identification and characterisation of Xanthomonas campestris pv. campestris strains from Tanzania by pathogenicity tests, Biolog, rep – PCR and fatty acid methyl ester analysis. European Journal of Plant Pathology. 109: 775 – 789. 14. Moffett, M.L., Trimboli, D., and Bonner, L.A., 1976. A bacterial leaf spot disease of several Brasssica varieties, Aust. Plant Pathology. Soc. 5: 30 – 32. 15. Pernezny, K., and Dickstein, E., 2003. An outbreak of bacterial leaf spot disease of cabbage in Southrn Florida caused by Xanthomonas campestris pv. armoraciae. Plant Disease. 87: 872 – 873. 16. Ruissen, M.A., and Gielink, A.J.,1993. The development of black rot in cabbage as a result of difference in guttation between cultivars. Proceedings 37 of the Eight International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, 9-12 June 1993, Versailles, France. Pages 178 – 185. 17. Shaad, N.W., 1994. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, second edition. APS PRESS, The American Phytopathological Society. 165 pages. 18. Steven T. Koike, Azad, H.R., and Cooksey, D.A., 2001. Xanthomonas leaf spot of cantip: a new disease caused by pathovar Xanthomonas campestris. Plant Disease. 85: 1157 – 1159. 19. Van den Ackerveken, G.F., Marois, E., and Bonas, U. 1996. Recognition of the bacteria avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell. Cell. 87: 1307 – 1316. 20. Van Gijsegem, F., Genin, S., and Boucher, C.A., 1993. Conservation of secretion pathways for pathogenicity determinants of plant and animal bacteria. Trends Microbiol. 1: 175 – 180. 21. Veronique Hugouvieux, Barber, C.E., and Daniel, M.J., 1998. Entry of Xanthomoas campestris pv. campestris into hydathodes of Arabidopis thalian leaves: a systems in bacterial pathogenis. Molecular Plant – Microbe Interaction. 11: 537 – 543. 22. Vicente, I.G., Everett, B., and Robert, S.J., 2006. Identification of isolates that cause z leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv. raphani and pathogenic and genetic coparison with related pathovars. Phytopathology. 96: 735 – 745. 23. Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of leaf crucifery in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas campestris. Plant disease. 84: 1008 – 1014. 24. Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of leafy crucifer in Oklahoma caused by Pseudomonas syringae pv. maculicola. Plant Disease. 84: 1015 – 1020. 25. Yuong Jin Park, Byuong Moo Lee, Jang Ho-Hahn, Gil Bok Lee, and Dong Suk Park, 2004. Sensitive and specific detection of Xanthomonas 38 campestris pv. campestris by PCR using species specific primer based on HrpF gene sequence. Microbiological Resarch. 159: 419 – 423. PHỤ LỤC 1. Cách thức pha một số hóa chất cần thiết Pha Phenol - Hòa tan 100 g phenol (tinh thể) đặt trong bồn ủ nhiệt ở 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol khi hòa tan). - Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch bazơ 0.5M, pH8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lƣu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy hiểm đến sức khỏe. - Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch tris HCl 0.5M, pH8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên. - Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu đƣợc một lớp TE 1X (50 ml). - Bảo quản phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc). Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH8 Trƣớc hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8. Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nƣớc tinh sạch. Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8. 2. Thành phần môi trƣờng Chuẩn bị môi trƣờng PDA (potato dextrose agar): Nguyên liệu Liều lƣợng - Khoai tây gọt sạch vỏ 500 g - Dextrose 10 g - Agar 15 g - Nƣớc cất 1 lít 2 Khoai tây cắt thành miếng, cho vào 1 lít nƣớc đun sôi trong 40 phút. Lọc, thêm nƣớc cho đủ 1 lít, cho dextrose, agar vào, khuấy tan bằng máy khấy từ, dịch môi trƣờng cho vào bình tam giác 250 ml, đem khử trùng bằng nồi hấp ở 121oC trong 30 phút. Sau khi hấp, để nguội đến 50o C và đổ vào đĩa petri. - Môi trƣờng YGC: Glucose 5g Yeast extract không có agar 5 g Calcium carbonate 40 g Agar 15g Nƣớc 1 lít - Môi trƣờng LB: NaCl 10g Yeast extract 5g Peptone 10g Nƣớc 1 lít Hòa tan lần lƣợt các chất trong nƣớc bằng máy khuấy từ. Hấp ở 121 oC trong 20 phút. 3. Pha dung dịch Alcohollic lactophenol Hóa chất Tỉ lệ thể tích Lactic acid 1 Phenol 1 Glycerol 1 Nƣớc 1 Ethanol 8 3