Luận văn Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

chất nhận điện tử cuối cùng, nếu trong môi trƣờng thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên men. Trong môi trƣờng nuôi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) (10). Màng sinh học giúp cho Bacillus subtilis có ƣu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi 12 trƣờng tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trƣờng giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc trực tiếp với oxy trong không khí. Sản xuất các chất diệt khuẩn khác nhau, có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis có khả năng sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn khác nhau có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Clostridium perfringens, Helicobacter pylori, Escherichia coli 078:K80.v.v… (5). Vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau nhƣ amylase, protease đồng thời cũng đƣợc ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống natto của Nhật Bản. Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử, bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn năm và có thể phát triển lại thành tế bào sinh dƣỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang đƣợc quan tâm để sản xuất ra các vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gene qui định độc tố thƣơng hàn vào Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gene này cũng đƣợc biểu hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử (7). 2.5 Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 2.5.1 Giới thiệu Peptide antibiotic là sản phẩm chuyển hóa bậc hai của nhiều loại vi sinh vật khác nhau, giúp chúng có ƣu thế trong cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trƣờng cũng nhƣ trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm. Peptide antibiotic có bản chất là các peptide có trọng lƣợng phân tử nhỏ, depsipeptide, peptidolactone, lipopeptide, đƣợc phân thành hai lớp là peptide đƣợc tổng hợp bằng ribosome còn đƣợc gọi là bacteriosin, còn lại là lớp peptide không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (16). Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau nhƣ subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin có bản chất là bacteriocin còn bacilysin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có tính kháng khuẩn là các antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (20). Bacteriocin đƣợc tổng hợp dƣới dạng tiền peptide có chứa một đoạn tín hiệu giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế bào, dạng tiền peptide sau đó đƣợc chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra 13 các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để thành dạng hoàn chỉnh, sau đó đƣợc tiết ra ngoài bằng phức hợp bơm protein ABC (ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16). Các peptide antibiotic không tổng hợp bằng ribosome thì đƣợc tổng hợp bằng các enzyme có cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc đƣợc chia thành nhiều module khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt, các module đƣợc sắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi peptide (16). Lipopeptide có tính kháng khuẩn đƣợc chia thành 3 họ khác nhau là surfactin, fengycin và iturin, lipopeptide đƣợc cấu tạo bằng vòng peptide có cấu tạo từ 7 (họ surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhóm –COOH và nhóm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhóm amino (họ iturin) tại vị trí β của acid béo. Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C13 đến C16 đối với lipopeptide thuộc họ surfactin, từ C14 đến C17 đối với họ iturin và từ C14 đến C18 trong trƣờng hợp của họ fengycin (20). 2.5.2 Peptipe antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome 2.5.2.1 Subtilin Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những antibiotic thuộc nhóm Lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và clostridia. Cấu tạo của subtilin có chứa các amino acid không bình thƣờng lanthionin, β-methyllanthionin, D- alanin, dehydroalanin, dehydrobutyrin, cầu nối sulfic đƣợc hình thành giữa các amino acid này tạo nên nhiều cấu trúc dạng vòng trong cấu tạo của subtilin. Các amino acid không bình thƣờng đƣợc tạo ra do quá trình biến đổi sau dịch mã của subtilin (28). Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tƣơng tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hƣởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Subtilin đƣợc tổng hợp trong pha tăng trƣởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cân bằng (29). 14 Operon của subtilin gồm có spaS mã hóa cho tiền peptide của subtilin, spaB và spaC mã hóa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hóa cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK mã hóa cho protein điều hòa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hóa cho thành phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hóa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết subtilin ra ngoài môi trƣờng bên ngoài (26). Cấu trúc của subtilin, thứ tự các gene trên operon spaIEFG đƣợc thể hiện ở Hình 2.2 (phụ lục). Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp subtilin đƣợc điều hòa bằng hệ thống điều hòa hai thành phần là protein SpaK và SpaR. SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào chất. Khi nồng độ vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy tăng cao hoặc có sự hiện diện của subtilin hay các antibiotic có cấu trúc tƣơng tự (nisin) trong môi trƣờng nuôi cấy. SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hóa His ở vị trí 247 ở đầu N sau đó sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT, spaC, spaS đồng thời cũng điều hòa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG. Ngoài ra operon của subtilin còn đƣợc điều hòa bởi yếu tố H (27). Subtilin ban đẩu đƣợc tổng hợp ở dạng tiền chất có 56 amino acid, dạng tiền chất này đƣợc SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin đƣợc biến đổi thành dạng subtilin hoàn chỉnh có 32 amino acid. Sau đó subtilin đƣợc chuyển ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành. Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngoài của lớp màng tế bào có tác dụng ngăn chặn sự tác động của subtilin vừa đƣợc tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26). 2.5.2.2 Subtilosin Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vòng, tiền peptide có 43 amino acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N đƣợc cắt để tạo thành cấu trúc dạng vòng, Phe và Thr đƣợc biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự 15 hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hoàn chỉnh dạng vòng có 32 amino acid (25). Cấu trúc của subtilosin đƣợc thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục). Toàn bộ gene chịu trách nhiệm cho toàn bộ quá trình tổng hợp subtilosin đƣợc mã hóa trên cùng 1 operon. Operon sbo-alb đƣợc điều kiển bởi promotor ở upstream của sboA, giữa 2 gene sboA và albA có một cấu trúc terminator cho nên các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp và phân tiết subtilosin đƣợc tổng hợp với số lƣợng ít hơn cơ chất của nó. Operon của subtilosin bao gồm các gene là sboA mã hóa cho dạng tiền chất của subtilosin, albA, albF và albE mã hóa cho protein thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã và hoàn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hóa cho protein chịu trách nhiệm cho sự tự đề kháng của Bacillus subtilis với subtilosin (24). Cấu trúc của operon đƣợc thể hiện ở Hình 2.3B (phụ lục). Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp của subtilosin đƣợc kiểm soát bởi hệ thống điều hòa spo0-abrB, ở pha tăng trƣởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dƣỡng trong môi trƣờng và nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hóa cuối cùng là phosphoryl hóa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo bào tử, SpoA đƣợc phosphoryl hóa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy sự biểu hiện của operon sbo-alb. Quá trình dịch mã đƣợc thực hiện bởi RNA polymerase đƣợc kiểm soát bởi yếu tố điều hòa A, trong điều kiện thiếu oxy operon sbo-abl đƣợc điều hòa bởi hệ thống truyền tín hiệu ResDE (25), (24). Tiền chất của subtilocin đƣợc tổng hợp ở dạng thẳng có 42 amino acid sau đó đƣợc AlbA và AlbF biến đổi thành dạng hoàn chỉnh. Trong cấu tạo của AlbB có hai nhóm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhóm này đƣợc xem là trung tâm S- Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hóa hoặc dehydrate cơ chất, còn AlbF trong cấu trúc có một đoạn peptide tƣơng tự nhƣ là peptidase nằm giữa đầu N còn ở đầu C có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc protein gắn vào peptide cho nên hai enzyme này đƣợc thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre- subtilocin thành dạng hoàn chỉnh (24). 16 Sau khi đƣợc biến đổi thành dạng hoàn chỉnh thì subtilocin đƣợc tiết ra ngoài chủ yếu bằng AlbC có sự tham gia của AlbD. AlbB có tác dụng giữ cho Bacillus subtilis tránh đƣợc sự tác động của subtilocin (24). 2.5.2.3 Sublancin Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu có 1 motif GS kế tiếp nó là một site cắt, do đó sublancin đƣợc tiết ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra môi trƣờng, trong cấu tạo có 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tƣơng tự nhƣ antibiotic thuộc họ lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn gram âm nhƣng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng kể cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thƣờng trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin (21). Operon của sublancin gồm các gene sunA, sunT, bdbA, bdbB, bdbC, và bdbD. SunA là tiền peptide của sublancin có 56 amino acid sau đó đoạn tín hiệu bị cắt đi trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hoàn chỉnh có 37 amino acid, sunT mã hóa cho hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT có 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N tồn tại domain có hoạt tính peptidase, còn ở đầu C là domain liên kết với ATP (21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nó mã hóa cho enzyme xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin, bdbA, bdbC và bdbD thì không có tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin. Cấu trúc của sublancin, trình tự amino acid và cấu trúc operon của sublancin đƣợc trình bài ở Hình 2.4 (phụ lục). 2.5.2.4 TasA TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng khuẩn rộng đƣợc tổng hợp và tiết vào môi trƣờng 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử đƣợc bắt đầu, đồng thời TasA cũng đƣợc chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ƣu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (30). Operon của TasA bao gồm 3 gene là yqxM, sipW và tasA. yqxM là gene mã hóa cho kháng sinh đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng có nồng độ muối cao (32), SipW chịu 17 trách nhiệm cắt đoạn peptide tín hiệu và chuyển TasA ra ngoài môi trƣờng và giữa lớp màng kép của tiền bào tử trong cấu tạo của SipW có 4 đoạn peptide xuyên màng, amino acid serine ở vị trí 47 và Histidin ở vị trí 87 là trung tâm hoạt động của đoạn peptide đóng vai trò là peptidase của SipW (31). Gene tasA mã hóa cho tiền peptide của TasA. Trong cấu trúc của đoạn peptide tín hiệu ở vị trí 7 và 9 là kế tiếp là một đoạn peptide kỵ nƣớc (G ở vị trí 10 đến A ở vị trí 15) cấu trúc bậc 3 có dạng α-helic cho phép đoạn peptide này có thể xuyên màng, kế tiếp là đoạn peptide chứa 3 L, 5 amino acid, kế tiếp là site cắt cho peptidase. Trình tự amino acid tiền chất của TasA và cấu trúc của operon đƣợc đƣợc biểu diễn ở Hình 2.5A (phụ lục). Quá trình điều hòa tổng hợp và phân tiết của TasA. TasA đƣợc tổng hợp ngay đầu phag cân bằng cho nên nó đƣợc điều hòa bởi các yếu tố điều hòa chuyển phag. Tƣơng tự nhƣ subtilosin quá trình tổng hợp TasA đƣợc điều hòa hệ thống spo0-abrB nhƣng RNA polymerase chịu trách nhiệm dịch mã cho operon cùa TasA đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa H (31). Sau khi đƣợc tổng hợp dạng tiền chất của TasA đƣợc chuyển lên màng tế bào chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dƣơng liên kết với màng tế bào chất, sau đó đoạn peptide kỵ nƣớc sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide còn lại xuyên màng sau đó peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phóng TasA hoạt động, đoạn tín hiệu sau đó tiếp tục đƣợc cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36). Cơ chế chuyển TasA vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử cũng xãy ra tƣơng tự. Khác với các loại protein tiết khác TasA sau khi đƣợc chuyển qua màng tế bào chất thì một phần không khuếch tán ra môi trƣờng mà định vị trong lớp peptidoglycan của vách tế bào Bacillus subtilis và bào tử (33). Vị trí của TasA bên trong vách tế bào và bào tử đƣợc thể hiện ở Hình 2.5B (phụ lục). 2.5.3 Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng Ribosome. 2.5.3.1 Surfactin Surfactin có cấu tạo là lipopeptide do sự liên kết của một chuỗi heptapeptide với acid béo có một gốc –OH ở vị trí β tạo nên vòng lacton.Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ 13–16 C (20). Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do đó nó có tính đối kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thƣ nhƣng ít tác động đối với nấm. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp 18 màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase (35). Chuỗi heptapeptide của surfactin có trình tự amino acid là NH2-Gly-Leu-DLeu- Val-Asp-DLeu-Leu-COOH, chuỗi peptide này đƣợc tổng hợp bằng các phản ứng enzyme. Các gene mã hóa cho các enzyme này nằm trên cùng một operon gọi là srf operon. srf operon có tất cả 4 gene là srfA, srfB, srfC và srfD. SrfA (402 kDa) là enzyme hoạt hóa 3 amino acid đó là Gly, Leu, DLeu. SfrB (401 kDa) là enzyme hoạt hóa 3 amino acid kế tiếp, SrfC (144 kDa) hoạt hóa Leu còn lại và tách chuỗi peptide ra ngoài.Trong cấu tạo của các enzyme này đƣợc đƣợc chia thành nhiều modul khác nhau mỗi modul chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt. Bên trong mỗi modul đƣợc chia thành các domain là domain A (adenylation), domain C (condensation), domain T (thiolation), domain E (epimerization) mỗi domain thực hiện một bƣớc trong trong quá trình hoạt hóa amino acid của modul. Domain A thực hiện phản ứng adenyl hóa cơ chất tạo thành aminoacyladenylate, trung tâm hoạt động của domain A liên kết với ion Mg2+. Domain T với cofactor là 4′-phosphopantetheine (ppan) thực hiện phản ứng hoạt hóa liên kết thioeste. Domain C thực hiện phản ứng tạo liên kết este giữa 2 amino acid. Trong những modul thực hiện hoạt hóa amino acid có cấu hình D thì có thêm domain E chịu trách nhiệm chuyển amino acid từ cấu hình L sang cấu hình D (34). Cấu trúc của surfactin, quá trình điều hòa, cấu trúc của operon srf, quá trình tổng hợp chuỗi amino acid của surfactin đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 (phụ lục). Quá trình điều hòa và tổng hợp surfactin. Surfactin đƣợc tổng hợp để đáp ứng với nồng độ cao của vi sinh vật trong môi trƣờng, srf operon đƣợc đƣợc điều hòa dƣơng bởi ComA. Nhƣng quá trình phosphoryl hóa ComA đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau. Các modul của 3 enzyme SrfA, SrfB, SrfC đƣợc xắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự của amino acid của chuỗi peptide. Khi quá trình bắt đầu Gyl sẽ gắn vào domain A của modul 1 để thực hiện phản ứng adenyl hóa sau đó đƣợc chuyển qua domain T để tạo phản ứng thioeste với cofactor 4′-phosphopantetheine. Ở modul thứ 2 Leu đƣợc gắn vào domain A, domain C của modul 2 thực hiện phản ứng tạo liên kết este của Gly với gốc amine tự do của Leu sau đó đƣợc chuyển qua domain T của 19 modul 2 để thực hiện các phản ứng tiếp theo. Ở modul cuối cùng có domain TE nhận biết và tách đoạn peptide ra ngoài (34). Heptapeptide sau khi đƣợc tổng hợp sẽ tồn tại ở dạng vòng hoặc dạng thẳng sau đó sẽ liên kết với β-hydroxyl acid béo cuối cùng là đƣợc tiết ra ngoài. 2.5.3.2 Fengycin (18), (34) Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm. Fengycin bao gồm một peptide có 10 amino acid có trình tự L-Glu · D-Orn · L-Tyr · D-allo-Thr · L-Glu · D-Ala (D-Val) · L-Pro · L-Glu · D-Tyr · L-Ile với một cầu nối lacton giữa L-Tyr và L-Ile liên kết với 1 chuỗi β-hydroxyl acid béo có mạch cacbon dài từ 14 đến 18. Fengycin đƣợc tổng hợp nhiều trong phag tăng trƣởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối phag tăng trƣởng, fengycin vẫn đƣợc duy trì ở nồng độ thấp với hàm lƣợng ổn định trong phag cân bằng. Operon mã hóa cho các enzyme tổng hợp fungycin gồm fenC mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu và D-Orn, fenD mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Tyr và D-allo-Thr, fenE mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu · D-Ala (D-Val), fenA mã hóa cho enzyme hoạt hóa L-Pro, L-Glu và D-Tyr, fenB mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho amino acid cuối cùng là L-Ile, cuối cùng là gene mã hóa cho enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi acid béo. Chuỗi 81 nucleotide trên phần upstream của fenC có 2 điểm khởi đầu dịch mã và 4 promotor, 2 promotor có cấu trúc tƣơng ứng với promotor đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa A, điều này giải thích tại sao fengycin đƣợc tổng hợp trong phag tăng trƣởng, 2 promotor có cấu trúc tƣơng ứng với yếu tố điều hòa F duy trì sự tổng hợp fengycin trong phag cân bằng. Cấu trúc của fengycin, fen operon, trình tự nucleotide của phần upstream của fenC đƣợc trình bày ở Hình 2.7 (phụ lục). 2.5.3.3 Mycosubtilin (19), (34) Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin. Mycosubtilin có cấu tạo là một chuỗi β-amino acid béo có chiều dài từ 14-17 C liên kết với 1 heptapeptide mạch vòng có trình tự amino acid là Asn-DTyr-DAsn-Gln-Pro-DSer-Asn. Các lipopeptide thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhƣng có tác động rất hạn chế với vi khuẩn, trong cấu tạo của chuỗi heptapeptide có DTyr ở amino acid thứ 2 20 đồng thời có thêm 2 amino acid có cấu hình D ở vị trí 3 và 6. Cấu trúc của mycosubtilin đƣợc trình bày ở Hình 2.8A (phụ lục). Operon của mycosubtilin bao gồm các gene fenF mã hóa cho protein FenF (45,2 kDa) có hoạt tính malonyl-CoA transacylases, mycA mã hóa cho protein MycA (449,3 kDa) trong cấu tạo của MycA có 2 modul chịu trách nhiệm hoạt hóa Asn và tổng hợp chuỗi acid béo. Trong modul chịu trách nhiệm tổng hợp acid béo đƣợc chia thành nhiều domain mỗi domain thực hiện một bƣớc chuyên biệt trong quá trình tổng hợp acid béo, thứ tự sắp xếp của các domain này là AL (acyl-CoA ligase), ACP (acyl carrier protein), KS (β -keto acyl synthetase), AMT (amino transferase). Tiếp theo là gene mycB mã hóa cho protein MycB (612,3 kDa) chịu trách nhiệm hoạt hóa 4 amino acid là DTyr, DAsn, Glu, Pro. Gene cuối cùng trong operon là mycC mã hóa cho MycC (297.9 kDa) hoạt hóa cho 2 amino acid cuối cùng là DSer và Asn. Cấu trúc của Mycosubtilin operon đƣợc trình bày chi tiết ở Hình 2.8B (phụ lục). Khác với sự tổng hợp của surfactin, acid béo của mycosubtilin đƣợc tổng hợp kèm với quá trình tổng hợp chuỗi peptide. Acid béo đƣợc tổng hợp trên 1 modul của MycA sau khi tổng hợp, acid béo đƣợc gắn nhóm amino vào vị trí β, modul còn lại hoạt hóa Asn và chuyển vào domain T, sau đó liên kết este đƣợc tạo ra giữa acid béo với gốc amine tự do của Asn. Qúa trình tổng hợp chuỗi peptide xãy ra tƣơng tự với quá trình tổng hợp của surfactin. Các bƣớc của quá trình tổng hợp acid béo, gắn gốc amine, tạo liên kết este đƣợc trình bày chi tiết ở Hình 2.8C (phụ lục). 2.5.3.4 Bacilysocin (17) Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, đƣợc tổng hợp khi bắt đầu phag cân bằng sau đó thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid đƣợc phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của bacilysocin là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol đƣợc thể hiện ở hình bên dƣới. 21 Bacilysocin đƣợc tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis. Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin đƣợc thực hiện bởi enzyme lysophospholypase đƣợc mã hóa bởi gene ytpA. Quá trình tổng hợp bacilysocin đƣợc thể hiện ở Hình 2.9 (phụ lục). 22 5. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Từ 02/2006-05/2006. 3.1.2 Địa điểm Địa điểm thực hiện đề tài tại phòng vi sinh truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Phân heo lớn, khỏe mạnh đƣợc lấy từ các hộ chăn nuôi ở Đồng Nai và Bình Dƣơng Chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo và Bacillus subtilis đối chứng dƣơng đƣợc cung cấp bởi phòng vi sinh truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi Thú y đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2 Hóa chất Hóa chất: môi trƣờng TSB, môi trƣờng Simon Citrate Agar, môi trƣờng nitrate, môi trƣờng đƣờng maltose, môi trƣờng tinh bột, môi trƣờng lòng đỏ trứng, thuốc thử NaOH 40%, α- napton, α-napthilamine, acid sulfonilic, kháng sinh ……….. 3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ ấm, bình điều nhiệt, kính hiển vi, cân điện tử. Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, phễu, bình tam giác,........ 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo Qui trình phân lập Bacillus subtilis trong phân heo. Lấy 0,2g đến 0,3g phân heo cho vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất vô trùng, pha loãng thành 10-2, nung ở nhiệt độ 80°C trong 1 giờ, pha loãng thành 10-3 trang vào đĩa TSA ủ ở 37°C trong 24 giờ, giữ giống những khuẩn lạc đặc trƣng trong ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng TSA ủ ở 37°C trong 24 giờ sau đó đem thử sinh hóa để khẳng định. 23 1ml 1ml 1ml Mẫu votex to = 80oC 0,2g-0,3g 10 -1 10 -2 1 giờ 10-3 0,1ml ủ ở 37oC cấy trang 24giờ Đĩa môi trƣờng TSA chọn khuẩn lạc đặc trƣng giữ giống 3.3.2 Các phản ứng thử sinh hóa Thực hiện các phản ứng sinh hóa sau để khẳng định Phản ứng lecithinase (-), maltose (-), khử nitrate (+), khử citrate (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phản ứng VP (+), catalase (+) kết quả quả thử sinh hóa đƣợc đối chứng với chủng Bacillus subtilis đối chứng dƣơng của phòng thí nghiệm đƣợc gọi là chủng số 1 trong các thí nghiệm bên dƣới. 3.3.3 Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng thạch Cấy E. coli và những chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, thử đối kháng của Bacillus subtilis với các nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli khác nhau: không pha loãng, 10- 24 1 , 10 -2 , 10 -3 , sau đó trang dung dịch vi khuẩn E. coli của từng độ pha loãng lên bề mặt đĩa petri chứa 15 ml môi trƣờng TSA, dùng que cấy vòng lấy 1 vòng canh khuẩn trong ống canh khuẩn Bacillus subtilis cấy thành đốm trên đĩa petri, ủ 37°C trong 24 giờ, dùng compa để đo vòng kháng khuẩn, vòng kháng khuẩn đƣợc tính bằng hiệu số giữa đƣờng kính vòng kháng khuẩn với đƣờng kính khuẩn lạc, chọn 5 chủng cho vòng kháng khuẩn lớn nhất để thực hiện đối kháng trên môi trƣờng TSB. 3.3.4 Đánh giá sự đối kháng với E. coli trong môi trƣờng TSB Cấy E. coli và chủng vi khuẩn Bacillus subtilis vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, lấy 0,5 ml canh khuẩn của từng chủng Bacillus subtilis cho vào mỗi bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng TSB, sau đó cho vào mỗi bình tam giác 0,5ml canh khuẩn E. coli. Đánh giá số lƣợng vi khuẩn E. coli ở khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ bằng phƣơng pháp trang đĩa trên môi trƣờng TSA. Đối chứng âm đƣợc thiết kế bằng cách cho 0,5 ml canh khuẩn E. coli vào bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng TSB. 3.3.5 Thử kháng sinh đồ Nuôi cấy trong ồng TSB 5ml trong 24 giờ ở 37°C, pha loãng để đƣợc nồng độ vi khuẩn ở nồng độ tƣơng ứng với ống McFarland tiêu chuẩn 0.5 dùng tăm bông vô trùng trãi đều vi khuẩn trên đĩa petri chứa 15 ml môi trƣờng TSA, đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh trên bề mặt thạch, ủ ở 37°C trong 24 giờ, đo vòng kháng khuẩn so sánh với chuẩn của từng loại kháng sinh. Kháng sinh đƣợc sử dụng: gentamycin, ciprofoxacin, amoxicillin, colistin, norfloxacin, kanamicin, amox\cla.acid. 3.3.6 Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% Đổ 15 ml môi trƣờng tinh bột 1% vào đĩa petri, sử dụng que cấy, cấy các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ, nhỏ dung dịch iod dùng compa đo vòng phân giải tinh bột, tính vòng phân giải là hiệu số giữa đƣờng kính vòng phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc. 25 6. Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết Quả 4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo Phân heo đƣợc pha loãng ở nồng độ 10-2 nung ở 80oC trong 1 giờ, pha loãng ra 10 -3 , rồi trang trên môi trƣờng TSA kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.1, bắt khuẩn lạc đặc trƣng, khuẩn lạc đặc trƣng của Bacillus subtilis là khuẩn lạc khô rìa nhăn, nằm sát bề mặt thạch. Hình 4.1: Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA Các khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc giữ giống, nhuộm gram, thử sinh hóa. Kết quả thu đƣợc 35 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có kết quả thử sinh hóa là:  Phản ứng lecithinase (-)  Phản ứng khử nitrate (+)  Phản ứng khử citrate (+)  Sử dụng maltose (-)  Phản ứng catalase (+)  Phản ứng VP (+)  Phát triển trong điều kiện yếm khí (+) Tất cả các chủng này đƣợc thử đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo 4.1.2 Kết quả đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA Chúng tôi thực hiện thử đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli ở những nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli khác nhau: không pha loãng, 10-1, 10-2, 10-3. Khi không pha loãng canh khuẩn E. coli hoặc độ pha loãng là 10-1 thì không chủng nào tạo 26 đƣợc vòng kháng khuẩn, ở nồng độ pha loãng 10-2 của canh khuẩn E. coli thì có tất cả 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 4.1, ở nồng độ pha loãng 10-3 thì không thấy tạo vòng kháng khuẩn. Khi không pha loãng canh khuẩn hoặc ở độ pha loãng 10-1 thì nồng độ E. coli quá cao nên có thể chịu đựng đƣợc sự tác động của kháng sinh do Bacillus subtilis tiết ra hoặc có một cơ chế nào đó ức chế sự tổng hợp và phân tiết cuả kháng sinh, ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 đó là nồng độ phù hợp cho sự tổng hợp và phân tiết kháng sinh ức chế E. coli của Bacillus subtilis nên tạo đƣợc vòng kháng khuẩn rõ ràng đƣợc thể hiện ở Hình 4.2. Ở nồng độ pha loãng 10-3 không có chủng nào tạo vòng kháng khuẩn, có thể nồng độ E. coli không đủ lớn để khích thích Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh. Có thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo của các chủng Bacillus subtilis đƣợc thử nghiệm đƣợc kích thích ở một nồng độ E. coli đủ lớn. Bảng 4.1: Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng 10-2 trên môi trƣờng TSA. Chủng Vòng kháng Khuẩn / mm S2 Chủng Vòng kháng khuẩn / mm S2 n = 3 X n = 3 X 1 0 0 14 4,33 0,083 2 0 0 18 5 0 3 0 0 23 2,33 1,083 4 0 0 24 0 0 5 4 0 25 0 0 6 2 0,25 26 1,33 1,33 7 4,33 0,33 27 1,33 1,33 8 0,66 1,33 29 0 0 10 3,83 0,58 33 0 0 11 3,16 0,585 34 0 0 12 0,833 2,08 35 2,5 0,25 13 3,16 0,083 n: Số lần lặp lại X : Giá trị trung bình S2: Biến lƣợng 27 Theo kết quả đối kháng trên thạch TSA ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 thì chủng số 7, 5, 10, 14, 18 tạo vòng kháng khuẩn lớn nhất nên đƣợc sử dụng để đánh giá sự đối kháng trong môi trƣờng TSB. Hình 4.2: Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2. 4.1.3 Kết quả đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trong môi trƣờng TSB Khi cho đối kháng giữa Bacillus subtilis và E. coli trong môi trƣờng TSB sau từng thời điểm đánh giá sự thay đổi của số lƣợng E. coli trong môi trƣờng. Vì Bacillus subtilis phát triển tạo thành màng biofilm trên bề mặt môi trƣờng, trong môi trƣờng lƣợng Bacillus subtilis tự do khoảng 105 vi khuẩn / ml nên giới hạn độ pha loãng để đếm số lƣợng vi khuẩn E. coli ở độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7. Ta có kết quả đƣợc thể hiện ở biểu đồ bên dƣới. 28 0 5 10 15 log 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ chủng 5 chủng 7 chủng 10 chủng 14 chủng 18 đối chứng âm Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi số lƣợng E. coli qua các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ. Bảng 4.2: Bảng số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ. Thời gian Chủng 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 5 4,45.10 10 29,8.10 8 15,75.10 7 < 10 6 7 4,45.10 10 19,95. 10 8 9,55. 10 7 < 10 6 10 4,45.10 10 17,26. 10 8 8,3. 10 7 < 10 6 14 4,45.10 10 19,95. 10 8 13,67. 10 7 < 10 6 18 4,45.10 10 23,4. 10 8 2,6. 10 7 < 10 6 Đối chứng âm 4,45.1010 22,15.1011 61,76.1011 23.1012 Biểu đồ trên cho thấy sự giảm số lƣợng E. coli qua từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, ở thời điểm 36 giờ kết quả không thấy sự hiện diện của E. coli ở độ pha loãng 10-5 ở tất cả các chủng. Kết quả trên cho thấy số lƣợng E. coli giảm dần qua 29 từng thời điểm còn đối chứng âm thì số lƣợng E. coli tăng dần, sự giảm số lƣợng E. coli do Bacillus subtilis sản xuất chất kháng khuẩn tiêu diệt E. coli đồng thời có sự cạnh tranh chất dinh dƣỡng giữa Bacillus subtilis và E. coli cùng với các tƣơng tác khác trong môi trƣờng đã làm giảm số lƣợng vi khuẩn E. coli. Việc số lƣợng vi khuẩn E. coli giảm ngay từ giai đoạn đầu từ 0 giờ đến 12 giờ, cho thấy Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh ức chế E. coli từ giai đoạn rất sớm, sự giảm E. coli trong giai đoạn này chủ yếu là sự tác động của kháng sinh do Bacillus subtilis tiết ra vì trong giai đoạn này nguồn dinh dƣỡng trong môi trƣờng còn nhiều, đồng thời số lƣợng của 2 loài vi khuẩn chƣa cao nên ít xãy ra các tƣơng tác khác với nhau trong môi trƣờng. Kết quả trên cho thấy đƣợc cả 5 chủng mặc dù tạo vòng kháng khuẩn không lớn nhƣng cho thấy sự ức chế một cách hiệu quả E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo trong môi trƣờng TSB. 4.1.4 Kết quả thử kháng sinh đồ Chủng Kháng sinh 7 5 10 18 14 Gentamicin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Ciprofoxacin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Amoricillin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Colistin Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Norfloxacin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Kanamicin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Amox/Clav acid Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Bảng 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng Tất cả 5 chủng đều rất nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc sử dụng trừ colistin, điều này có thể do nguồn gốc phân lập vì các chủng Bacillus subtilis đƣợc phân lập trên những heo khỏe mạnh nuôi trong các hộ gia đình với số lƣợng nhỏ nên ít xuất hiện bệnh, cho nên hầu nhƣ không bị xử lý với kháng sinh nên ít xãy ra hiện tƣợng đề kháng với kháng sinh, đồng thời thức ăn chủ yếu là thức ăn thừa của ngƣời và các loại thức ăn có tính chất tự nhiên khác nên không có kháng sinh đƣợc bổ sung 30 trong thức ăn. Tất cả các chủng đều kháng với colistin vì colistin là kháng sinh chỉ tác động chuyên biệt đối vi khuẩn gram (-). Kết quả kháng sinh đồ cho thấy cả 5 chủng đều an toàn về mặt sinh học vì không chứa plasmid hoặc các gene kháng kháng sinh của các kháng sinh đƣợc sử dụng do đó nó không phải là nguồn truyền những gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật gây bệnh trong đƣờng ruột tuy nhiên cần mở rộng thử nghiệm với các loại kháng sinh khác. Hình 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ của chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc. 4.1.5 Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% Trong 22 chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trong phân heo có 6 chủng tạo đƣợc vòng phân giải lớn là chủng 8 (9,66 mm), 18 (8,66 mm), 24 (14,66 mm), 25 (9,83 mm), 34 (10,66 mm), 29 (9,83). Các chủng này cho thấy đƣợc khả năng phân giải tinh bột cao đặc biệt là chủng 24 tạo đƣợc vòng phân giải là 14,66 mm. Tuy không cho đối kháng với E. coli nhƣng với khả năng phân giải tinh bột cao chủng 24 là ứng cử viên cho việc sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis có tác động làm tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn của thú, tuy nhiên cần phải đánh giá thêm một vài đặc điểm khác nhƣ khả năng tổng hợp protease, tính an toàn đối với thú và các đặc điểm khác yêu cầu đối với chủng vi sinh vật đƣợc chọn để sản xuất probiotic. Trong 6 chủng tạo vòng phân giải lớn có chủng 18 (8,66mm), là chủng đối kháng mạnh với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo cho nên chủng 18 là ứng cử viên để tạo sản phẩm probiotic 2 chức năng. Một là khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, hai là giúp tăng hệ số chuyển hóa thức ăn của thú. 31 Bảng 4.4: Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên môi trƣờng tinh bột 1% Chủng Đƣờng kính vòng Phân giải / mm S2 Chủng Đƣờng kính vòng phân giải / mm S2 n = 3 X n = 3 X 1 6,66 0,33 14 6 1 2 6,66 8,33 18 8,66 0,33 3 8 1 23 6,33 1,33 4 0 0 24 14,66 2,33 5 7,5 5,25 25 9,83 0,083 6 9,33 0,33 26 7 1 7 6,66 1,33 27 7,5 0,75 8 9,66 7,58 29 9,83 0,58 10 4,33 0,33 33 9,33 0,33 11 8,16 1,58 34 10,66 5,33 12 8,5 0,75 35 9 0,25 13 5,33 0,33 n: Số lần lặp lại S2: Biến lƣợng X : Giá trị trung bình đƣờng kính vòng phân giải Hình 4.4: Hình minh họa sự phân giải tinh bột của Bacillus subtilis. 32 4.2 Thảo luận Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy rất phổ biến trên ngƣời và trên heo, do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh khác nhau, cho nên việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát E. coli trở nên kém hiệu quả, bên cạnh đó sử dụng kháng sinh làm xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và xuất hiện ngày càng nhiều các chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đó cần tìm một biện pháp để thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh tiêu chảy nói riêng và các bệnh đƣờng ruột nói chung. Sử dụng probiotic đƣợc là một giải pháp thay thế hiệu quả nhất ở thời điểm hiện nay. Có nhiều sản phẩm probiotic trên thị trƣờng để phòng các bệnh đƣờng ruột, các sản phẩm này đƣợc dán nhãn là bào tử của Bacillus subtilis tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy, phần lớn các sản phẩm là bào tử của của những loài Bacillus khác nhƣ Bacillus clausii, Bacillus pumilus và một số chủng Bacillus cereus (Le H. Duc, 2004). Những nghiên cứu gần đây đã làm gia tăng sự lo ngại của ngƣời tiêu dùng về tính an toàn của những sản phẩm này, nhất là những sản phẩm chứa bào tử của các chủng Bacillus cereus, là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh đƣờng ruột. Bên cạnh đó các chủng này đề kháng đƣợc với nhiều loại kháng sinh do đó nó là nguồn phổ biến gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật trong đƣờng ruột. Trong 22 chủng Bacilus subtilis phân lập đƣợc trong phân heo, có 5 chủng đối kháng mạnh với E. coli trên môi trƣờng TSA và TSB, kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng này nhạy cảm với đa số kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin có tác động chuyên biệt với vi khuẩn gram (-). Các chủng này là ứng cử viên để tạo sản phẩm probiotic có tác dụng khống chế E. coli gây bệnh. 33 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Có sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trong phân heo. Có thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế sự phát triển E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo của Bacillus subtilis đƣợc kích thích bởi một nồng độ vi khuẩn E. coli đủ lớn Kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc tổng hợp từ giai đoạn đầu của sự phát triển. Năm chủng Bacillus subtilis cho thấy khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli và đều nhạy cảm với tất cả kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin. Chủng 18 là ứng cử viên để tạo ra sản phẩm probiotic có 2 chức năng: Một là khống chế E. coli gây bệnh, hai là tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn của thú.  5.1. Đề nghị Sự tổng hợp kháng sinh ức chế sự phát triển của Bacillus subtilis có thể đƣợc kích thích bởi sự hiện diện của E. coli trong môi trƣờng đây là điều khác biệt so với quá trình điều hòa tổng hợp của các kháng sinh khác do Bacillus subtilis tiết ra. Chúng tôi có một số đề nghị sau.  Đánh giá hàm lƣợng kháng sinh tiết ra trong môi trƣờng nuôi cấy qua từng thời điểm.  Đánh giá khả năng đối kháng với nhiều loại vi sinh vật khác.  Kiểm tra sự an toàn của các chủng trên chuột.  Đánh giá khả năng chống chịu của bào tử với pH thấp và enzyme pepsin của dạ dày, khả năng đề kháng với muối mật. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Trần Linh Thƣớc, 2003. Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật trong nƣớc, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục, 232 trang 2. PGS.TS.Trần Thị Dân, 2005.Công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, NXB Nông Nghiệp Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 3. Gabriella Casula and Simon M. Cutting, 2002. Bacillus Probiotics: Spore Germination in the Gastrointestinal Tract. Appl Environ Microbiol 68(5): 2344– 2352 American Society for Microbiology, American. 4. Ngo Thi Hoa, Loredana Baccigalupi, Ashley Huxham, Andrei Smertenko, Pham Hung Van, Sergio Ammendola, Ezio Ricca, and Simon M. Cutting, 2000. Characterization of Bacillus Species Used for Oral Bacteriotherapy and Bacterioprophylaxis of Gastrointestinal Disorders. Appl Environ Microbiol 66(12): 5241–5247. American Society for Microbiology.American 5. Irina V. Pinchuk, Philippe Bressollier, Bernard Verneuil, Bernard Fenet, Irina B. Sorokulova, Francis Mégraud, and Maria C. Urdaci,2001. In Vitro Anti- Helicobacter pylori Activity of the Probiotic Strain Bacillus subtilis 3 Is Due to Secretion of Antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 45(11): 3156–3161. American Society for Microbiology.American 6. Teresa M. Barbosa, Cláudia R. Serra, Roberto M. La Ragione, Martin J. Woodward, and Adriano O. Henriques,2005. Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract. Appl Environ Microbiol. 71(2): 968–978. American Society for Microbiology.American 7. Le H. Duc, Huynh A. Hong, Neil Fairweather, Ezio Ricca, and Simon M. Cutting, 2003. Bacterial Spores as Vaccine Vehicles. Infect Immun. 2003 71(5): 2810–2818. American Society for Microbiology.American 8. Dennis J. Henner AND James A. Hoch,1980. The Bacillus subtilis Chromosome.Microbiological Review, p. 57-82. American Society for Microbiology. American 35 9. Rial D. Rolfe, 2000. The Role of Probiotic Cultures in the Control of Gastrointestinal Health. Journal of Nutrition.130:396S-402S. The American society for nutritional sciences.American 10. Steven S. Branda, José Eduardo González-Pastor, Sigal Ben-Yehuda, Richard Losick, and Roberto Kolter, 2001. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A . 98(20): 11621–11626. The National Academy of Sciences 11. Emil M. Berberov, You Zhou, David H. Francis, Michael A. Scott, Stephen D. Kachman, and Rodney A. Moxley,2004. Relative Importance of Heat-Labile Enterotoxin in the Causation of Severe Diarrheal Disease in the Gnotobiotic Piglet Model by a Strain of Enterotoxigenic Escherichia coli That Produces Multiple Enterotoxins. Infection and Immunity, p. 3914-3924 Vol. 72, No. 7. American society for microbiology.American 12. James P. Nataro and James B. Kaper,1998. Diarrheagenic E. Coli. Clin Microbiol, 11(1): 142–201 American Society for Microbiology 13. WIM GAASTRA AND FRITS K. DE GRAAF,1982. Host-Specific Fimbrial Adhesins of Noninvasive Enterotoxigenic Escherichia coli Strains MICROBIOLOGICAL REVIEWS, p. 129-161 Vol. 46, No. 2 14. Ronggai Sun, Timothy J. Anderson, Alan K. Erickson, Eric A. Nelson, and David H. Francis, 2000. Inhibition of Adhesion of Escherichia coli K88ac Fimbria to Its Receptor, Intestinal Mucin-Type Glycoproteins, by a Monoclonal Antibody Directed against a Variable Domain of the Fimbria. Infection and Immunity, p. 3509-3515, Vol. 68, No. 6. American society for microbiology.American 15. Le H. Duc, Huynh A. Hong, Teresa M. Barbosa, Adriano O. Henriques, và Simon M.Cutting, 2004. Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use. Appl Environ Microbiol, 70(4): 2161–2171. American society for microbiology.American 16. Robert E. W. Hancock and Daniel S. Chapple, 1999. Peptide Antibiotics. Antimicrob Agents Chemother, 43(6): 1317–1323. American society for microbiology.American 36 17. Norimasa Tamehiro, Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, Makoto Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi Naganawa, and Kozo Ochi, 2002. Bacilysocin, a Novel Phospholipid Antibiotic Produced by Bacillus subtilis 168. Antimicrob Agents Chemother, 46(2): 315–320. American society for microbiology.American 18. Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming Tschen, and Shih-Tung Liu, 1999. Functional and Transcriptional Analyses of a Fengycin Synthetase Gene, fenC, from Bacillus subtilis. J Bacteriol, 181(16): 5060–5067. American society for microbiology.American 19. Erwin H. Duitman, Leendert W. Hamoen, Martina Rembold, Gerard Venema, Harald Seitz, Wolfram Saenger, Frank Bernhard, Richard Reinhardt, Manuel Schmidt, Christian Ullrich, Torsten Stein, Frank Leenders, and Joachim Vater, 1999. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase. Proc Natl Acad Sci U S A, 9; 96(23): 13294–13299. The National Academy of Sciences 20. Valérie Leclère, Max Béchet, Akram Adam, Jean-Sébastien Guez, Bernard Wathelet, Marc Ongena, Philippe Thonart, Frédérique Gancel, Marlène Chollet- Imbert, and Philippe Jacques, 2005. Mycosubtilin Overproduction by Bacillus subtilis BBG100 Enhances the Organism's Antagonistic and Biocontrol Activities. Appl Environ Microbiol, 71(8): 4577–4584, American society for microbiology.American 21. Sun H. Paik, Anu Chakicherla, and J. Norman Hansen, Identification and Characterization of the Structural and Transporter Genes for, and the Chemical and Biological Properties of Sublancin 168, a Novel Lantibiotic Produced by Bacillus subtilis 168 22. Ronald Dorenbos, Torsten Stein, Jorrit Kabel, Claude Bruand, Albert Bolhuis, Sierd Bron, Wim J. Quax, and Jan Maarten van Dij, 2002. Thiol-Disulfide Oxidoreductases Are Essential for the Production of the Lantibiotic Sublancin 168, J. Biol. Chem, doi:10.1074/jbc.M201158200. American society for microbiology.American 37 23. Torsten Stein, Stefanie Düsterhus, Anke Stroh, and Karl-Dieter Entian, 2004, Subtilosin Production by Two Bacillus subtilis Subspecies and Variance of the sbo-alb Cluster, Appl Environ Microbiol, 10.1128/AEM.70.4.2349-2353.2004. American society for microbiology.American 24. Guolu Zheng, Robin Hehn, and Peter Zuber, 2000. Mutational Analysis of the sbo-alb Locus of Bacillus subtilis: Identification of Genes Required for Subtilosin Production and Immunity, J Bacteriol, 182(11): 3266–3273. American Society for Microbiology 25. Guolu Zheng, Liang Z. Yan, John C. Vederas, and Peter Zuber, 1999. Genes of the sbo-alb Locus of Bacillus subtilis Are Required for Production of the Antilisterial Bacteriocin Subtilosin, Journal of Bacteriology p. 7346-7355, Vol. 181, No. 23 0021-9193/99/$04.00+0. American Society for Microbiology 26. Torsten Stein, Stefan Heinzmann, Stefanie Düsterhus, Stefan Borchert,1 and Karl-Dieter Entian, 2005. Expression and Functional Analysis of the Subtilin Immunity Genes spaIFEG in the Subtilin-Sensitive Host Bacillus subtilis MO1099, Journal of Bacteriology, No.3 0021-9193/05/$08.00+0. American Society for Microbiology. American 27. C. KLEIN, C. KALETTA, AND K.-D. ENTIAN, 1993. Biosynthesis of the Lantibiotic Subtilin Is Regulated by a Histidine Kinase/Response Regulator System, Applied and Enviromental Microbiology, 0099-2240/93/010296- 08$02.00/0. American Society for Microbiology. American 28. C. KLEIN AND K.-D. ENTIAN, 1994. Genes Involved in Self-Protection against the Lantibiotic Subtilin Produced by Bacillus subtilis ATCC 6633, Applied and Enviromental Microbiology No. 8 0099-2240/94/$04.00+0. American Society for Microbiology. American 29. YONG JOON CHUNG, MARK T. STEEN, AND J. NORMAN HANSEN, 1992. The Subtilin Gene of Bacillus subtilis ATCC 6633 Is Encoded in an Operon That Contains a Homolog of the Hemolysin B Transport Protein, Journal of Bacteriology, o. 4, 21-9193/92/041417-06$02.00/0, Journal of Bacteriology. American Society for Microbiology. American 38 30. Axel G. Stöver and Adam Driks, 1999. Regulation of Synthesis of the Bacillus subtilis Transition-Phase, Spore-Associated Antibacterial Protein TasA. Journal of Bacteriology. No. 17 0021-9193/99/$04.00+0. American Society for Microbiology. American 31. Harold Tjalsma, Axel G. Stöver, Adam Driks, Gerard Venema, Sierd Bron, and Jan Maarten van Dijl, 2000. Conserved Serine and Histidine Residues Are Critical for Activity of the ER-type Signal Peptidase SipW of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 33, 25102-25108,. American Society for Microbiology. American 32. Axel G. Stöver and Adam Driks, 1999. Control of Synthesis and Secretion of the Bacillus subtilis Protein YqxM. Journal of Bacteriology, No. 22 0021- 9193/99/$04.00+0. American Society for Microbiology. American 33. Axel G. Stöver and Adam Driks, 1999. Secretion, Localization, and Antibacterial Activity of TasA, a Bacillus subtilis Spore-Associated Protein. J Bacteriol. 181(5): 1664–1672. American Society for Microbiology. American 34. Stephan A. Sieber and Mohamed A. Marahiel, 2003. Learning from Nature's Drug Factories: Nonribosomal Synthesis of Macrocyclic Peptides. J Bacteriol, (24): 7036–7043. American Society for Microbiology. American 35. DIRK VOLLENBROICH,1 GEORG PAULI,2 MUHSIN OZEL,2 AND JOACHIM VATER1, 1997. Antimycoplasma Properties and Application in Cell Culture of Surfactin, a Lipopeptide Antibiotic from Bacillus subtilis. Appied and enviromental microbiology. No. 1 0099-2240/97/$04.0010. American Society for Microbiology. American 36. Harold Tjalsma, Albert Bolhuis, Jan D. H. Jongbloed, Sierd Bron, and Jan Maarten van Dij, 2000. Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. Microbiol Mol Biol Rev, 64(3): 515–547. American Society for Microbiology. American 39 PHỤ LỤC A B CHình 2.2 : A , cấu trúc của subtilin , B, thứ tự các gene trên operon spaIFEG 40 Hình 2.3A : A , cấu trúc của subtilocin . B , trình tự các amino acid của presubtilocin Hình 2.3B: Cấu trúc operon của subtilocin . Operon của subtilocin gồm 1 gene sboA mã hóa cho tiền peptide của subtilocin và 7 gene albA , albB , albC , albD , albE , albF , albG mã hóa cho các protein tổng hợp và phân tiết subtilocin . Giữa 2 gene sboA và albA có một cấu trúc terminator 41 Hình 2.4A : Cấu trúc của sublancin . Có 4 Cys trong chuỗi peptide của sublancin hình thành 2 cầu nối disulfic , một cầu nối sulfic giữa -methyllanthionine và dehydrobutyrine .Trong cấu tạo của sublancin còn có một dehydroxyalanine ở vị trí amino acid ở vị trí 16 . Hình 2.4 B: Trình tự của chuỗi amino acid của pre-sublancin . Trên trình tự của chuỗi tín hiệu có 1 motif GS giúp cho phần peptide có hoạt tín peptidase của SunT nhận biết và cắt đoạn tín hiệu để giải phóng sublancin ở dạng hoàn chỉnh 42 Hình 2.5 : A , trình tự amino acid tiền chất của TasA . B , cấu trúc operon của TasA Hình 2.5B : Vị trí của TasA trong quá trình hình thành bào tử 43 A B C Hình 2.6 : A , cấu trúc của surfactin . B , cấu trúc và quá trình điều hòa của srf operon . C , quá trình tổng hợp chuỗi peptide của surfactin : Cầu nối lacton 44 A B C Hình 2.7 : A, cấu trúc của fengycin . B, cấu trúc operon của fengycin . C . trình tự nucleotide trên phần upstream của operon fen . 2 promotor ở vị trí -35 và -10 có điểm khởi đầu dịch mã là TATGG +1(6) đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa A , 2 promotor ở vị trí -35F và -10F có điểm khởi đầu dịch mã là CTTTT +1(20) đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa : Cầu nối macrolacton 45 A Hình 2.8A : Cấu trúc của mycosubtilin : Cầu nối Macrolactam B Hình 2.8B : Cấu trúc của Mycosubtilin operon Hình 2.8C : Qúa trình tổng hợp acid béo , gắn nhóm amine vào vị trí và tạo liên kết với Asn 46 Hình 2.9 : Quá trình tổng hợp bacilysocin , phản ứng 1 đƣợc thực hiện bởi enzyme CDP diglyceride synthase , phản ứng 2 đƣợc xúc tác bởi phosphatidylglycerol- phosphate synthase , phản ứng 3 đƣợc xúc tác bởi phosphatidylglycerol-phosphate phosphatase.