Luận văn Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR

assay) Kỹ thuật Tissue Blot Enzym Immunoassay (TBIA) là một dạng thay đổi của kỹ thuật dot - blot assay, trong đó vi khuẩn đƣợc tách ra khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm và dính lên màng nitrocellulose (NCM). Sau đó vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dƣơng tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.  Dot Blot Assay Thu dịch chiết từ đốt mía (50 μl) trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS đƣợc lọc qua màng màng lọc NCM kích thƣớc lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80OC trong 60 phút trƣớc khi đem nhuộm bằng phƣơng pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dƣơng tính đƣợc nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.  Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA) Phƣơng pháp EB - ELISA do Croft và ctv đƣa ra năm 1994 để chẩn đoán RSD. Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm. Mẫu phân tích đƣợc cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 350C. Sau khi ủ mẫu đƣợc đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể. Phƣơng pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trƣờng với mật độ thấp hơn 105 tế bào/ml và 5.105 tế bào/trong dịch nhiễm.  Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA) Leaman và ctv (1991) sử dụng phƣơng pháp LT- EIA để chẩn đoán RSD và so sánh phƣơng pháp này với phƣơng pháp FADCF. LT - EIA phát hiện đƣợc Lxx ở mật độ 5.101 tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98%. FADCF có khả năng phát hiện 5.10 1 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100%. Tuy nhiên, FADCF khó có khả năng thực hiện đƣợc trên nhiều mẫu cùng lúc. Phƣơng pháp LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lƣợng mẫu lớn. 19 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) Cắt chéo vào mắt mía của một cây mía trƣởng thành bị nhiễm Lxx để xử lý với dung dịch thuốc nhuộm có chứa Safranin. Quan sát sự chuyển màu bên trong thân mía: vùng chuyển thành màu đỏ là không có vi khuẩn Lxx và vùng chuyển màu vàng là có chứa vi khuẩn Lxx. 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử  Chẩn đoán dựa vào việc sử dụng các đầu dò DNA Chung và ctv (1994) đã sử dụng kỹ thuật lai tại vết bệnh (dot blot hybridization) với 7 đầu dò DNA đặc hiệu cho Lxx.  Kỹ thuật PCR. Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển nhằm phát hiện Lxx (Pan và các cộng sự, 1998; Taylor và các cộng sự, 2003). Mồi cho các phản ứng này đƣợc thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx. 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới  Bệnh khảm lá mía - Năm 1927, bệnh khảm virus ở Australia làm giảm năng suất khoảng 39 - 46%, thiệt hại trên giống Q28 là năng suất vụ tơ giảm 27% và ở vụ gốc giảm 67% (Koike và Gillaspie,1989). - Theo Koike và Gillaspie (1989), dòng A của virus gây bệnh khảm lần đầu tiên đƣợc phát hiện năm 1943 trên giống SP34-120 ngoài sản xuất, và cho đến nay ngƣời ta đã tìm thấy 13 dòng virus gây bệnh khảm này tại Mỹ. Trong lịch sử Hawaii là vùng bị bệnh virus tàn phá nặng nề nhất. - Theo nghiên cứu của Salomon và ctv (2000), bệnh khảm virus làm giảm năng suất mía 30 - 40% tại quốc gia này. - Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc bằng phƣơng pháp RT - PCR.  Bệnh cằn mía gốc - Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia. - Năm 1980, Davis tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx 20 - Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đoán Lxx dựa vào cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuôi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía. - Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch chiết nƣớc mía có tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là có độ nhạy cao. - Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía. - Viện khoa học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR. 2.5.2. Trong nƣớc  Bệnh khảm lá mía Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nói chung và bệnh khảm lá mía nói riêng còn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực, cụ thể là: - Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm. Bệnh sau đó đƣợc công bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) - Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía, trong đó có bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phòng trừ. - Gần đây có một nghiên cứu sơ về thành phần bệnh hại trên cây mía ở vùng Đông Nam Bộ (Hà Đình Tuấn, 2004) cũng có đề cập đến sự xuất hiện không nhiều của bệnh khảm lá mía. - Trƣơng Lê Bạch Liên (2005) cũng đã thực hiện việc điều tra trên quy mô nhỏ các giống mía trồng tại TTNCMĐ và một số vùng lân cận. Kết quả chỉ ra rằng tình hình nhiễm bệnh là rất ít.  Bệnh cằn mía gốc RSD là một loại bệnh đã đƣợc phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại năng nề do RSD gây ra. Tuy nhiên tình hình nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trên cây mía của nƣớc hiện nay vẫn chƣa đƣợc chú ý đi sâu nghiên cứu nhiều. Cụ thể là: - Năm 1967 – 1986, đã có cuộc điều tra về bệnh học của cây mía ở miên Bắc và lúc này ngƣời ta phát hiện có 22 bệnh (Nguyễn Huy Ƣớc, 1999). 21 - Năm 1963 trạm thực nghiệm mía Quảng Ngãi xác đinh đƣợc 11 loại bệnh hại mía, trong đó bệnh đốm vàng và cháy lá gây thiệt hại nặng nhất. - Tổng kết của Hoàng Thị Mỹ năm 1966 thì ở khu vực phía Nam có 13 loại bệnh trên mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv, 1987). - Theo Phan Gia Tân (1999) thì có 12 loại bệnh xuất hiện phổ biến trên cây mía do tác nhân virus, vi khuẩn, và nấm và 6 loại bệnh khác do yếu tố dinh dƣỡng. - Tổng kết của Rott và ctv (2000) qua điều tra sơ bộ năm 1999, ở Việt Nam có 21 bệnh phổ biến gây hại trên cây mía. - Mới đây, ngƣời ta thống kê lại lần nữa số bệnh trên các giống mía miền Đông Nam Bộ là 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chƣa biết tác nhân và một số bệnh khác do yếu tố môi trƣờng gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004). 22 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm có 2 nội dung chính sau: - Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng. - Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực. + Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. + Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy. + PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006. Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu 6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427, ROC26. 10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92, K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2. 5 giống mía tại nông trƣờng Thọ Vực: My55-14, VN84-4137, QĐ368, VĐ85-177, VN85-1427. 3.3.2. Virus gây bệnh Virus Sugarcane Mosaic (SCMV) gây bệnh khảm lá mía. 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây bệnh cằn mía gốc. 23 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm - Các hóa chất nằm trong kít DAS-ELISA (Biorad) gồm: Dung dịch đệm li trích, dung dịch đệm cho kháng thể, kháng thể, đối chứng âm, đối chứng dƣơng, kháng thể gắn enzym, P-nitrophenyl phosphate (pNPP). - Dung dịch đệm rửa PBS- Tween. - Dầu khoáng dùng để xem kính ở độ phóng đại 1000 lần. - Hóa chất pha môi trƣờng nuôi cấy Lxx gồm: Bacto agar, pepton đậu nành, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, glucose, bovine serum albumin (BSA), cysteine, nalidixic acid, methionine. - Hóa chất cho phản ứng PCR gồm: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm (buffer), MgCl2, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2. - Hóa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích). 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ - Cối chày, eppendorf, bình cồn, bông gòn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm. - Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại). - Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in. - Nồi hấp vô trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow). - Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sóng, máy ly tâm. - Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vô trùng (0,2 và 0,45 μm) - Máy PCR, bồn điện di, lò viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì công tác điều tra lấy mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Liên hệ bộ môn Bảo vệ thực vật và bộ môn giống ở TTNCMĐ để xác định các giống mía cần thu thập và lấy mẫu. - Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát. - Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên 24 từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5 hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1). 5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo góc H1 x x … o x H3 o x … x x H5 x x … o x Chọn ngẫu nhiên 3 cây trên 3 hàng để lấy mẫu điều tra Tại 1 điểm điều tra Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi không điều tra. - Mẫu thân mía sau đó đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf có ghi nhãn cẩn thận về mẫu nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng. - Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ ở TTPT Đại học Nông Lâm. 3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khô ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra bằng kéo (có sự vô trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ thể quy trình làm đƣợc tóm tắt ở Sơ đồ 3.2. 1 2 5 4 3 25 Mẫu lá mía Cân 0,5 g Cắt nhỏ Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml) Nghiền Cho dịch nghiền vào eppendorf Li tâm ở 4OC, 3 phút, 7000 vòng/phút Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới Trữ ở tủ mát 4OC Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2, 3,.v.v.: Mẫu chẩn đoán; NC: Negative control 26 Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền (substrate), còn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tôi chỉ tiến hành vô mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3). 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA  Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Bƣớc 1: Pha loãng kháng thể đa dòng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1/100. Cho hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Các giếng substrate đƣợc thay bằng nƣớc cất siêu lọc với thể tích tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37OC trong vòng 2 giờ. Sau đó rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho 100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4OC qua đêm. Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37OC trong vòng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 4: Hòa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng substrate, BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Ủ đĩa ở 37OC trong 30 phút, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA hoặc quan sát sự đổi màu của giếng bằng mắt thƣờng. Sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ đọc lại kết quả ELISA.  Các mẫu lá mía đƣợc chẩn đoán có nhiễm bệnh hay không dựa vào: - Sự đổi màu trong phản ứng DAS-ELISA: giếng nào nếu màu vàng giống mẫu đối chứng dƣơng thì mẫu đó dƣơng tính (+), bị nhiễm SCMV. Các giếng không màu trùng với giếng đối chứng âm là mẫu âm tính (-), sạch bệnh khảm lá mía. - Kết quả đọc bằng máy đọc ELISA. 27  Cách tính kết quả: - Giá trị OD của mẫu = giá trị OD thô - giá trị OD trung bình của các giếng Substrate. - Mẫu dƣơng tính: Nếu giá trị OD của mẫu > giá trị ngƣỡng. - Mẫu âm tính: Nếu giá trị OD của mẫu < giá trị ngƣỡng. (Giá trị ngƣỡng = 2 x giá trị OD trung bình của các giếng đối chứng âm). - Một số mẫu có giá trị OD gần ngƣỡng thì không chắc chắn là dƣơng tính vì vậy cần đọc kết quả sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ để có đƣợc kết quả chính xác. 3.4.7. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng Quan sát đồng ruộng, trên từng ruộng mía, với thời gian trồng và chặt sau khi thu hoạch xong thì sự sinh trƣởng của các cây không đều, có cây cao, có cây thấp. Kiểm tra các cây thấp chậm phát triển này có bị bệnh cằn mía gốc hay không bằng cách dùng dao bén chặt dọc thân cây mía và quan sát sự đổi màu của các bó mạch.  Chỉ tiêu quan sát - Cây sinh trƣởng và phát triển chậm hơn bình thƣờng, nếu cây bị bệnh đứng gần cây khỏe mạnh thì rất dễ dàng nhận diện. - Có hay không sự đổi màu của các bó mạch bên trong thân cây mía. - Đốt thân ngắn, đƣờng kính thân giảm so với bình thƣờng. 3.4.8. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng pháp nhuộm STM Dịch nƣớc mía sau khi chiết đƣợc đem kiểm tra bằng kính hiển vi. Làm tiêu bản mẫu dịch chiết nƣớc mía trên lam kính. Đậy lamen và quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại là 1000 lần (xem dƣới giọt dầu). Vi khuẩn Lxx có hình gậy, chiều rộng từ 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, nổi lên trên nền tối của kính hiển vi. Cây mía đƣợc 10 tháng tuổi thì mới có thể kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp STM, quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nhổ cây mía sau đó chặt sát gốc cắm vào dung dịch thuốc nhuộm safranin (thành phần gồm Safranin 10%, cồn 96O và nƣớc cất). Để khoảng 30 phút lấy ra và gọt lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Gọt mỏng ngang thân mía đem soi trên kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần, thu đƣợc kết quả các mạch dẫn có màu đỏ hoặc màu vàng. Chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau: - < 70 % mạch đỏ: Giống nhiễm nặng. 28 - 70 – 84,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm trung bình. - 85 – 99,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm nhẹ. - 100 % mạch đỏ: Giống khỏe mạnh. (Trích dẫn: Hà Đình Tuấn, 2004). 3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lxx gồm các thành phần sau: Thành phần hấp - Nƣớc cất = 1000 ml - Bacto agar = 17 g - Pepton = 8 g - K2HPO4 = 1 g - KH2PO4 = 1 g - MgSO4.7H2O = 0,2 g Thành phần lọc - Glucose = 0,5 g - Methionine = 1 g - Nalidixic acid = 0,01 g - BSA = 2 g - Cysteine = 0.1 g Albumin huyết thanh bò, cysteine, methionine, nalidixic acid và glucose đƣợc lọc vô trùng và thêm vào các thành phần môi trƣờng trên sau khi chúng đã đƣợc hấp vô trùng (thêm vào khi nhiệt độ < 50OC), pH chỉnh về 6,6 với NaOH hay HCl. Đổ môi trƣờng vào đĩa petri (khoảng 15 ml/đĩa). Cấy vi khuẩn bằng cách dùng pipet hút 1ml mẫu dịch chiết nƣớc mía nhiễm bệnh đem cấy lên đĩa môi trƣờng. Dịch chiết nƣớc mía nuôi cấy đƣợc chiết bằng cách đẩy khí và xác định sự hiện diện của vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và nhuộm STM. Dịch chiết sau đó đƣợc trải rộng khắp đĩa nhằm mục đích thu đƣợc khuẩn lạc đơn lẻ cấy chuyền sang môi trƣờng khác. Mẫu dịch chiết đƣa vào nuôi cấy đƣợc pha loãng ở mức độ 0 lần, 2 lần, 4 lần, 6 lần, 8 lần, và 10 lần. Đĩa cấy sau đó đƣợc ủ ở 28OC trong thời gian 3 tuần. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn hàng ngày.  Chỉ tiêu theo dõi - Thời gian hình thành khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng nuôi cấy (20-22 ngày). - Khuẩn lạc Lxx sau 20 ngày nuôi cấy có màu trong suốt, kích thƣớc khuẩn lạc là từ 0,1 – 0,3 mm (Davis, 1980). - Kiểm tra hình dạng Lxx dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần. 29 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx  Phƣơng pháp chuẩn bị DNA mẫu cho PCR trực tiếp: Dịch chiết từ thân mía (100 μl) đƣợc đem ly tâm 20.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch lắng thu đƣợc rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng (100 μl) trƣớc khi tái huyền phù lại với nƣớc cất vô trùng (100 μl). Toàn bộ dung dịch đƣợc đun sôi trong vòng 5 phút và làm lạnh nhanh trong vòng 10 phút. Một thể tích khoảng 2 μl của dịch này đƣợc nhƣ mẫu để chạy phản ứng PCR  PCR phát hiện Lxx dựa vào cặp mồi và quy trình của Stevens Brumbley (2003) gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt Sản phẩm PCR sau phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 1,5 % (w/v), với ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE 1X , hiệu điện thế là 90V trong 20 phút. Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuyếch đại chuyên biệt (520 bp) của vi khuẩn trên gel điện di.  Thực hiện phản ứng PCR - Thí nghiệm 1: PCR sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu, thành phần các chất phản ứng, và chu kỳ nhiệt do S. Brumbley (2003) đƣa ra. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích/ phản ứng( μl) Chu kỳ nhiệt Bufer MgCl2 dNTPs Primer F Primer R PVP Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 10X 25 mM 25 mM 2,5 μM 2,5 μM 5U/1 μl 1X 3 mM 0,24 mM 0,25 μM 0,25 μM 1% w/v 1 U 2,5 3 0,24 2,5 2,5 2,5 0,2 2 9,56 96 – 5 phút – 1 chu kỳ 94 – 15 giây 57 – 30 giây 40 chu kỳ 72 – 30 giây 72 – 10 phút – 1 chu kỳ Tổng thể tích 25 μl 30 - Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Đo OD sản phẩm dịch chiết biến tính và thêm vào thành phần phản ứng PCR Lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,4 μm trƣớc khi biến tính Thực hiện li trích DNA Lxx trong dịch chiết theo quy trình ly trích vi khuẩn. - Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía. Tăng nồng độ PVP trong phản ứng PCR lên 1,5 – 2 lần. - Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR. Tăng lƣợng mẫu DNA đƣa vào. Tăng nồng độ primer. Tăng nồng độ primer kết hợp với tăng nồng độ Taq polymerase. Giảm nhiệt độ bắt cặp của primer xuống 2OC. Giảm nồng độ MgCl2. Giảm nồng độ MgCl2 kết hợp với giảm nhiệt độ bắt cặp.  Phƣơng pháp đổ gel agarose điện di + Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%. + Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50 – 60OC, sau đó đổ vào khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc. + Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TAE. + Bƣớc 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 4 µl mẫu. + Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4 µl mẫu + dung dịch đệm. + Bƣớc 6: Chạy điện di ở ở hiệu điện thế 90V/20 phút, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1 cm. + Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/ml) trong 20 phút. + Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel dƣới vòi nƣớc chuyên dụng. + Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker. + Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả. 31 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA Kiểm tra và phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên 6 giống mía sản xuất và 10 giống nhập nội tại TTNCMĐ.  Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhìn trực tiếp bằng mắt thƣờng: quan sát sự đổi màu của các giếng tuy nhiên trong 5 đĩa phân tích thì chỉ thấy giếng đối chứng dƣơng xuất hiện màu vàng, còn tất cả các giếng còn lại đều không có màu. Kết quả lập lại tƣơng tự sau khi kiểm tra lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ (hình 4.1). - Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đoán đều âm tính (-) với SCMV. A B Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. Chú thích: A: 2 giếng đối chứng dương có màu vàng B: 2 giếng đối chứng âm không màu.  Kiểm tra bằng máy đọc ELISA: Kết quả cho ra âm tính với tất cả các mẫu phân tích, ngoại trừ đối chứng dƣơng (PC) là ra kết quả dƣơng tính (+). Kết quả cho tƣơng tự khi đọc lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ. - Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đoán đều âm tính (-) với SCMV. Từ kết quả phân tích ELISA là âm tính cho tất cả các mẫu này, ta có thể kết luận rằng, các giống mía đƣợc điều tra có kết quả âm tính với bệnh khảm lá mía. Điều này chứng tỏ bệnh khảm lá mía không xuất hiện trên các giống khảo sát. Kết quả này cũng phù hợp với những điều tra trƣớc đây về sự phân bố của bệnh là diễn ra ít hơn tại các vùng nhiệt đới (Lê Lƣơng Tề, 1999), và thực tế là các cuộc khảo sát gần đây tại TTNCMĐ đều cho kết quả là có rất ít giống bị bệnh khảm (Hà Đình Tuấn, 2004; 32 Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005). Kết quả góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống mía sản xuất khảo sát. Đặc biệt là, kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong công tác kiểm định các giống mía Thái Lan mới nhập nội năm 2005. Theo kết quả kiểm tra ELISA thì tất cả các giống mía Thái Lan nhập nội đều không bị nhiễm SCMV, từ đó cho phép tiến hành những nghiên cứu sâu hơn trong công tác lai tạo và chọn giống để thu đƣợc các giống mới năng xuất cao và sạch bệnh. Tuy nhiên kết quả trên vẫn chƣa khẳng định đƣợc trên tất cả các giống đã đƣợc kiểm tra ở trên nói riêng và các giống mía khác tại TTNCMĐ nói chung là không bị nhiễm bệnh đƣợc. Nguyên nhân có thể giải thích là do: - Kỹ thuật ELISA chỉ có tác dụng định tính chứ không có tác dụng định lƣợng, do đó nếu trong mẫu có hàm lƣợng virus tồn tại ở nồng độ thấp, không đủ độ nhạy cho ELISA phát hiện thì kết quả khi phân tích ELISA sẽ là âm tính (-). Cho nên kết quả ELISA này chỉ có ý nghĩa trong một mức độ giới hạn nào đó và để có kết quả chính xác hơn cần tiến hành phân tích với số lƣợng mẫu nhiều hơn trong cùng một giống cũng nhƣ kiểm tra bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT- PCR). - Quá trình khảo sát chỉ giới hạn trong 16 giống mía gồm 6 giống sản xuất và 10 giống Thái Lan nhập nội tại TTNCMĐ, trong khi giống mía tại đây thì có rất nhiều. Do vậy chƣa thể kết luận đƣợc toàn bộ các giống mía đƣợc trồng tại đây là không bị nhiễm bệnh. Do vậy để chứng minh chính xác tác nhân gây bệnh là SCMV cần phải có những nghiên cứu sâu hơn bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể là kỹ thuật RT - PCR. Để tiến hành nghiên cứu này cần phải thực hiện ly trích RNA virus từ lá cây mía bị bệnh khảm lá mía, sau đó tiến hành tổng hợp cDNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm phát hiện SCMV. 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR 4.2.1. Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. Công tác điều tra và phát hiện bệnh cằn mía gốc đƣợc thực hiện trên 6 giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và 5 giống mía tại nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi (Hình 4.2) và nhuộm màu STM (Hình 4.3). 33 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần). Kết quả quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía dƣới kính hiển vi cho kết quả: trong 6 giống mía sản xuất đƣợc khảo sát tại TTNNCMĐ thì chỉ có giống VN84-1437 và R570 là không nhiễm bệnh, còn lại 4 giống mía khác là C90-127, DLM24, VN85-1427 và ROC26 đều thấy đƣợc sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (xem Bảng 4.1). Tuy nhiên, phƣơng pháp chẩn đoán này cho tỉ lệ kết quả dƣơng tính giả và âm tính giả khá cao. Nguyên nhân ở đây là sự phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần là rất khó khi nồng độ vi khuẩn nhiễm bệnh hiện diện trong dịch chiết thấp. Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi. TTNCMĐ Nông trƣờng Thọ Vực STT Giống Kết quả STT Giống Kết quả 1 2 3 4 5 6 C90-127 VN84-4137 DLM24 R570 VN85-1427 ROC26 + - + - + + 1 2 3 4 5 Mi55-14 VN84-4137 QĐ368 VĐ85-177 VN85-1427 + - + + + Chú thích: - : Mẫu âm tính +: Mẫu dương tính. Thân mía đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm safranin, sau 30 phút làm tiêu bản xem dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100 lần, ta sẽ thấy có sự nhuộm màu 34 hay không nhuộm màu của các bó mạch khoẻ mạnh và bị nhiễm Lxx. (xem hình 4.3). Mạch đƣợc nhuộm màu đỏ của safranin là kết quả của sự thẩm thấu dung dịch thuốc nhuộm lên trên thân, còn mạch không đƣợc nhuộm màu là do vi khuẩn Lxx tồn tại trong bó mạch làm tắt nghẽn sự lƣu thông của dung dịch thuốc nhuộm đi lên lên trên. Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ là không có vi khuẩn. Chẩn đoán bằng phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả: tất cả các giống mía sản xuất khảo sát tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với các mức độ nhiễm bệnh khác nhau. (xem bảng 4.2). Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc dựa trên phƣơng pháp nhuộm STM. Chú thích: Tb: Trung bình TTNCMĐ Nông trƣờng Thọ Vực TT Giống Tỉ lệ mạch nhuộm đỏ (%) Mức độ nhiễm bệnh TT Giống Tỉ lệ mạch nhuộm đỏ (%) Mức độ nhiễm bệnh 1 2 3 4 5 6 C90-127 VN84-4137 DLM24 R570 VN85-1427 ROC26 79,18 54,67 54,67 75,28 80,42 78,82 Tb Nặng Nặng Tb Tb Tb 1 2 3 4 5 My55-14 VN84-4137 QĐ368 VĐ85-177 VN85-1427 68,11 82,82 79,18 79,88 65,90 Nặng Tb Tb Tb Nặng Trung bình tỉ lệ mạch nhuộm đỏ 70,50 Trung bình 75,18 Trung bình a b 35 Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ mạch đƣợc nhuộm màu có sự khác nhau giữa các giống: cao nhất ở giống VN84-4137 (82,82%) tại nông trƣờng Thọ Vực, thấp nhất là giống VN84-4137 và DLM24 (54,67%) tại TTNCMĐ. Điều này tƣơng đƣơng với giống VN84-4137 tại Thọ Vực bị nhiễm trung bình, giống VN84-4137 và DLM24 bị nhiễm nặng với bệnh cằn mía gốc. Về kết quả phát hiện vi khuẩn Lxx thì phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả ở Bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. Chú thích: STM: Nhuộm Safranin mô cây mía - : Mẫu âm tính KHV: Chẩn đoán dựa vào kính hiển vi +: Mẫu dương tính Nhận xét: Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm STM trên các giống cho thấy rằng hầu nhƣ tất cả các giống sản xuất đƣợc kiểm tra tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm RSD. Nguyên nhân của tình hình trên có thể là do thiếu sự nghiên cứu thống kê về tình hình bệnh, cũng nhƣ thông kê số liệu về mức độ thiệt hại do bệnh cằn mía gốc gây ra ở nƣớc ta nói chung và các giống mía ở TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực nói riêng. Từ đó ngƣời dân vẫn chƣa quan tâm đúng mức đến việc phòng chống tác nhân gây bệnh. Mặt khác, nguyên nhân cũng có thể là do triệu chứng của bệnh cằn mía gốc không đặc trƣng và khó có thể phân biệt đƣợc cây bị bệnh. Vì vậy ngƣời nông dân sẽ không biết đƣợc ruộng mình bị nhiễm bệnh cằn mía gốc khi nào và đôi khi lầm lẫn TTNCMĐ Nông trƣờng Thọ Vực STT Giống Phƣơng pháp chẩn đoán STT Giống Phƣơng pháp chẩn đoán KHV STM KHV STM 1 2 3 4 5 6 C90-127 VN84-4137 DLM24 R570 VN85-1427 ROC26 + - + - + + + + + + + + 1 2 3 4 5 My55-14 VN84-4137 QĐ368 VĐ85-177 VN85-1427 + - + + + + + + + + 36 rằng ruộng mình bị thiếu dinh dƣỡng hay bị sâu bệnh phá hoại. Kết quả có ý nghĩa thực tiễn trong việc thống kê tình hình nhiễm bệnh RSD trên các giống mía khảo sát. 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy Vi khuẩn Lxx là vi khuẩn rất khó nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo, khuẩn lạc vi khuẩn theo nghiên cứu là phải mất đến khoảng 22 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng đặc trƣng mới hình thành đƣợc (Stevens Brumbley, 2003). Do vậy thời gian 2 tháng để nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn Lxx trên môi trƣờng nhân tạo là quá ngắn và kết quả thu đƣợc cũng hạn chế, không có bào tử của vi khuẩn Lxx hình thành. Tuy nhiên, sau quá trình nghiên cứu chúng tôi cũng thu đƣợc một số kết quả nhất định cụ thể nhƣ sau: - Quan sát và theo dõi quá trình hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx trên môi trƣờng nuôi cấy hàng ngày kể từ lúc bắt đầu cấy đến khoảng 15 - 22 ngày (ủ ở 28 OC). Theo đó thì chỉ sau khi cấy mẫu dịch chiết vào môi trƣờng nuôi cấy 1 ngày thì các vi khuẩn đã bắt đầu mọc trên môi trƣờng nuôi cấy. Đặc biệt là vào những ngày đầu tiên, đã có sự xuất hiện của các khuẩn lạc giống nhƣ khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx đƣợc Davis (1980) mô tả ,đó là khuẩn lạc nhỏ đƣờng kính từ 0,1 - 0,3 mm, không màu. Tuy nhiên sau vài ngày nuôi cấy các khuẩn lạc này lớn dần lên và có màu vàng (Hình 4.4). Thậm chí sau 15 - 20 ngày nuôi cấy vẫn còn một số vùng trên đĩa nuôi cấy có các khuẩn lạc có kích thƣớc và hình dạng tƣơng tự, tuy nhiên khi phân lập ra môi trƣờng trên đĩa khác thì lại không phải Lxx mà vẫn là loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng này. A B Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B). 37 - Theo quan sát thì có khoảng 3 loại vi khuẩn tồn tại trên môi trƣờng nuôi cấy và một số loài nấm. Các loại này đều phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy đôi lúc nhanh (sau vài ngày) nhƣng cũng có lúc chậm (nhiều đĩa nuôi cấy có vi khuẩn mọc lên với hình dạng và kích thƣớc giống mô tả, khuẩn lạc này giữ nguyên hình dạng và kích thƣớc cho đến 20 ngày sau nuôi cấy). Tuy nhiên đây không phải là vi khuẩn Lxx, mà vẫn là loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng. Do hạn chế về mặt tài liệu nghiên cứu nên môi trƣờng mà chúng tôi sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Lxx là môi trƣờng SC (Davis, 1980) và có bổ sung thêm một số thành phần theo Stevens Brumbley (2003) là chƣa hoàn chỉnh. Theo nghiên cứu mới đây của Stevens Brumbley thì môi trƣờng thích hợp hơn và thời gian hình thành bào tử ngắn hơn (khoảng 15 ngày) là do vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MSC (Teakle, 12992) có bổ sung thêm methionine (L. E.Camargo và ctv, 2004). Có sự tạp nhiễm trên là do thành phần môi trƣờng nuôi cấy không thích hợp, các kháng sinh và acid amin không tinh nên khó tan trong dung dịch nƣớc. Mặt khác dịch vi khuẩn đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy là dịch không vô trùng nên sẽ có rất nhiều vi khuẩn hình thành trên môi trƣờng rất giàu dinh dƣỡng cho vi khuẩn Lxx này. Do vậy cần thiết lập một quy trình chuẩn bị mẫu vô trùng dành cho nuôi cấy vi khuẩn mới có hiệu quả đƣợc. 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx Song song với việc nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi cũng tiến hành chạy PCR trực tiếp trên dịch chiết của cây mía bị bệnh. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy trình và sử dụng các chất bổ sung khác nhau vào phản ứng PCR, nhƣng kết quả PCR dựa vào cặp mồi của Stevens Brumbley (2003) đều không đạt đƣợc kết quả mong đợi. - Kết quả thí nghiệm 1: PCR theo protocol của Stevens Brumbley (2003). Kết quả điện di: Không có sản phẩm trên gel điện di. Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình của Stevens Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR. Primer đƣợc đặt mới tại công ty Biorad với trình tự đƣợc blast trên NCBI có kết quả cho bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn Lxx trên ngân hàng gen. Tuy nhiên kết quả điện di không có thì nguyên nhân có thể là do quy trình thực hiện chƣa tối ƣu hoặc do DNA mẫu 38 đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt. - Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu. Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Chạy PCR theo thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ ở thí nghiệm 1. Mẫu đƣợc chuẩn bị và đem đi đo OD, tính kết quả lƣợng DNA có trong mẫu và thêm vào trong thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng là 0,5 μM. Kết quả: không có băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: Do OD không có tác dụng trong trƣờng hợp này vì dịch chiết nƣớc mía có chứa nhiều nhân tố ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc không chính xác với thực tế DNA mẫu vi khuẩn trong mẫu. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 và 2 lần cũng không cho kết quả vì điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng các nhân tố ức chế phản ứng PCR. Hút DNA từ lớp trên của dịch biến tính đem chạy PCR. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, 2 lần. Kết quả: không có băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: DNA sau khi biến tính sẽ nằm ở lớp trên dung dịch vì vậy chúng tôi sử dụng lớp này chạy PCR nhằm thu lƣợng DNA sạch, Tuy nhiên kết quả PCR không cho sản phẩm khuyếch đại thì có thể là do biến tính Lxx. Có lẽ trong quá trình biến tính vi khuẩn bằng cách gia nhiệt, thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ và DNA vi khuẩn Lxx thoát ra ngoài, tuy nhiên quá trình này cũng giải phóng ra các enzym phân hủy hoặc làm hƣ hỏng DNA vốn tồn tại trong tế bào. Do vậy chúng tôi thử nghiệm ly trích DNA vi khuẩn từ dịch chiết nƣớc mía. Thực hiện lọc mẫu dịch vi khuẩn ở màng lọc 0,4 μm; chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR, tƣơng tự nhƣ quy trình của Stevens Brumbley (2003). Nhận xét: Dùng màng lọc 0,4 μm lọc Lxx và kiểm tra vi khuẩn có qua lỗ lọc không bằng cách quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi kiểm tra không thấy có sự hiện diện của vi khuẩn Lxx trong dịch lọc. Chúng tôi nhận định rằng có thể màng lọc 0,4 μm có kích thƣớc nhỏ nên vi khuẩn Lxx không qua đƣợc, hoặc có qua nhƣng ít và không thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi. Do vậy chúng tôi vẫn tiếp tục thực hiện cách biến tính mẫu nhƣ quy trình của Stevens Brumbley và đem do OD sản phẩm, hút DNA mẫu ở lớp trên dịch biến tính để chạy PCR nhƣng vẫn không đạt đƣợc kết quả. Kết luận: Không 39 thể loại bỏ đƣợc các nhân tố ức chế phản ứng PCR trực tiếp trong dịch chiết nƣớc mía bằng cách ly tâm đƣợc. Li trích vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía theo quy trình ly trích vi khuẩn thông thƣờng. Kết quả: Không có băng DNA vi khuẩn trên gel điện di sau li trích. Nhận xét: Có thể do lƣợng vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía có ít nên thực hiện li trích DNA không có kết quả. - Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía. Kết quả: không có sản phẩm PCR đích. Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng khử các nhân tố ức chế phản ứng PCR, tuy nhiên có lẽ khi nồng độ PVP cao thì nó cũng quay lại ức chế phản ứng PCR do đó chúng tôi không tăng nồng độ PVP trong các thí nghiệm tiếp theo nữa. Do vậy chúng tôi tiếp tục làm thí nghiệm theo hai hƣớng. Thứ nhất là giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) và thay đổi quy trình phản ứng. Thứ hai là thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR. - Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình của Stevens Brumbley. Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt. Kết quả thí nghiệm: Không có sản phẩm trên gel điện di. Tóm lại, PCR là một hệ thống tƣơng thích các thành phần hóa chất và chu trình nhiệt. Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực hiện từ dịch DNA mẫu ly trích với mồi chuyên biệt nhƣng vẫn không ra kết quả. Vì vậy PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía là một vấn đề rất khó thực hiện vì nguồn mẫu ban đầu là dịch chiết nƣớc mía không sạch, có chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm sau các lần chạy PCR mà không có băng DNA đích trên gel điện di thì có thể là do rất nhiều nguyên nhân: - Có thể là nguồn DNA mẫu đƣa vào trong phản ứng PCR không tinh sạch. Chúng tôi tiến hành ở đây là do trong dịch chiết có quá nhiều chất lơ lửng, ức chế phản ứng PCR. Nguồn mẫu dịch chiết mà chúng tôi dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc thu từ những cây có triệu chứng điển hình ngoài đồng ruộng, kết hợp với kiểm tra quan sát sự xuất hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết mía dƣới kính hiển vi và dƣơng tính khi nhuộm STM. Tuy nhiên mặc dù đã xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa 40 vào là có vi khuẩn đích nhƣng còn quá nhiều yếu tố không thể kiểm soát đƣợc nhƣ các chất ức chế phản ứng có trong dịch chiết nƣớc mía, lƣợng mẫu DNA thích hợp đƣa vào phản ứng. - Có thể hóa chất mà chúng tôi sử dụng sau nhiều lần thực hiện phản ứng đã làm đông lạnh và rã đông nhiều lần dẫn đến sự mất hoạt tính của hóa chất đặc biệt là Taq DNA polymerase và primer. - Mặt khác các máy PCR khác nhau cũng cho kết quả khác nhau. Hiện TTPT có 3 loại máy PCR và mỗi máy có một chế độ lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt khác nhau (nhanh hay chậm) do vậy đây cũng là một nguyên nhân không thể loại trừ. Tuy nhiên sau khi thực hiện PCR luân phiên trên cả 3 loại máy vẫn không có kết quả. 41 Phần 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Các giống mía đƣợc khảo sát không bị nhiễm SCMV. - Tỉ lệ mô cây không bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khảo sát trong phƣơng pháp nhuộm STM tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx chƣa thu đƣợc khuẩn lạc. - Phát hiện vi khuẩn Lxx dựa vào kỹ thuật PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía chƣa đạt đƣợc kết quả mong muốn. 5.2. Đề nghị - Tiến hành điều tra khảo sát tình hình bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên nhiều giống mía ở các giai đoạn tăng trƣởng khác nhau, và thực hiện tại các vùng mía lận cận để có cái nhìn tổng quát và chính xác hơn về tình hình diễn biến của bệnh tại 2 khu vực này. Đặc biệt là đối với bệnh cằn mía gốc, cần tiến hành bố trí thí nghiệm trên nhiều giống khác nhau đối chứng với giống không bị bệnh, để cuối cùng có con số thống kê chính xác về tình hình và mức độ gây hại của bệnh hiện nay, từ đó có những khuyến cáo thích hợp trong việc phòng trừ và kiểm soát bệnh. - Qua quá trình tìm hiểu về bệnh cùng với sự hỗ trợ về kiến thức của GS. Stevens Brumbley (Australia), ngƣời đã có kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Lxx, chúng tôi xin đề nghị về quy trình nuôi cấy thu khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, cũng nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía nhƣ sau trong các thí nghiệm tiếp theo nhƣ sau:  Quy trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx  Xác định triệu chứng ngoài đồng ruộng.  Xác định cây nhiễm bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp nhuộm STM.  Thu dịch chiết (tiến hành vô trùng), kiểm tra sự hiện diện của Lxx dƣới kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1).  Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng MCS có bổ sung các thành phần theo Stevens Brumbley (2003) và L. E Camargo (2004). 42  Tăng sinh trong môi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần môi trƣờng nuôi cấy cho ở Bảng phụ lục 2).  Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Lxx:  Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực hiện li trích DNA vi khuẩn Lxx theo quy trình cho ở Phụ lục 3.  Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Lxx  Sau khi ổn định quy trình rồi thì tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía dựa trên đối chứng dƣơng là vi khuẩn Lxx đã nuôi cấy đƣợc. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 8/2006. Báo cáo tổng kết mía đường năm 2005-2006. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. 3. Đỗ Ngọc Diệp, 2002. Nghiên cứu sâu đục thân hại mía và biện pháp phòng trừ ở vùng Đông Nam Bộ. Luận án tiến sỹ, Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội. 4. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 5. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 6. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo dục. 7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Huy Ƣớc, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 9. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 10. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nông Lâm. 12. Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005. Điều tra và phát hiện bệnh khảm lá (Sugarcane Mosaic Virus) trên cây mía (Sacccharum spp) bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 14. Andreas Westphal and T. Eril Mirkov, 2003. Need for improved detection of Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas. Phytopathology 7: p 133 - 136. 44 15. Alfred. Hercules, 2000. Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad Laboratories, p 26-27. 16. Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590, Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 17. Damann. K.E, Jr. 1988. Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane. Phytopathology 78: p 233 - 236. 18. Fegan, 1999. Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain reaction-based assay. Phytopathology, p 33 - 36. 19. John R. Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34. 20. Gillaspie Jr., A.G. Davis, M.J. (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane. In Plant disease of International Importance. Disease of sugar, Forestand Plantation Crops, vol4 (A.N. Mukhopadhyay,J. Kamar, H.S. Chaube, U.S.Singh, eds). EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61. 21. G.P. Rao, A. Salem Saumtally, Phillippe Rott. (2004). Sugarcane pathology. Volume III: Bacteria and nematode diseases, p 1 – 225. 22. Hoy J. W; Grisham M. P. and Damann K.E, 1999. Spread and increase of ratoon stunting disease and comparison of disease detection methods. In Plant disease. 23. Koike H, and Gillaspie A.G, 1989. Mosaic. In: Diseases of Sugarcane: Major diseases, (Edited by C. Recaud, B. T. Egan, A.G. Gillaspie, C. G. Hughes). International Society of Sugarcane Technologist, p 301-322. 24. P. Taylor and Stevens Brumbley, 2003. Development of PCR –based markers for detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane plants. CSIRO publishing. 25. Y Pan, 1998. A polymerase chain reaction protocol for detection of Clavibacter xyli subsp xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting. Phytopathology: p 1 – 8. 26. Biowave vol.6 No.23 2004, tomato spotted wilt virus. 27. G.A. Dafalla, Plant Pathology Centre, Faculty of Agricultural Sciences,University of Gezira, Wad Medani, Sudan. 28. Introduction to Microbiology: Virus Genomes, 2005. xii PHỤ LỤC Phụ lục 1: Qui trình thu dịch chiết nƣớc mía. (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) 1. Cắt hết lá của thân bị nhiễm bệnh. - Phụ thuộc vào chiều dài của mắt mía mà cắt đoạn thân ra có chứa 3 - 4 mắt mía - Vì nồng độ vi khuẩn cao nhất ở dƣới thân cho nên lấy phần thân ở sát gốc mía. 2. Rửa thân bằng bàn chải và lau cho khô bằng giấy lau. 3. Rửa sạch bằng nƣớc. 4. Ngâm thân mía vào trong dung dịch thuốc tẩy 10 % trong 10 phút. 5. Rửa sach dƣới vòi nƣớc máy. 6. Khử trùng thân mía bằng cồn 70 % và đốt để cho hết cồn còn dƣ. 7. Cắt một đoạn thân mía ra và khử trùng đoạn thân này. 8. Dùng bơm đẩy khí từ một đầu và thu dịch chiết ở đầu kia bằng eppendorf vô trùng. 9. Đổ dịch chiết trên vào môi trƣờng nuôi cấy MSC. Kiểm tra môi trƣờng nuôi cấy hàng ngày. xiii Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) MÔI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MÔI TRƢỜNG)  Thành phần hấp vô trùng: Corn meal agar = 17 g Bacto-agar = 4 g Bacto-peptone = 8 g MgSO47H2O = 0.2 g K2HPO4 (0.1 M ) = 13 ml KH2PO4 (0.1 M ) = 87 ml H2O = 800 ml  Thành phần lọc Glucose = 2 g Cysteine = 0.5 g Bovine serum albumin = 2 g H2O = 100 ml Bovine hemin chloride = 30 ml Hòa tan các thành phần hấp trong nƣớc và chỉnh về pH = 7,5 với 5 N NaOH. Hấp vô trùng. Hòa tan các thành phần lọc vào trong nƣớc và thêm vào môi trƣờng đƣợc hấp khi chúng ở 55OC bằng một màng lọc vô trùng 0.22 m. MÔI TRƢỜNG LỎNG S8  Thành phần hấp vô trùng Bacto - Soytone = 8 g Hemin chloride = 15 ml MgSO4 .7H2O = 0.2 g K2HPO4 = 0.35 g KH2PO4 = 1.1 g H2O = 885 ml  Thành phần lọc: Glucose = 2 g Cysteine = 0.5 g Bovine serum albumin = 2 g H2O = 100 ml 1) Hòa tan tất cả các thành phần trong nƣớc và chỉnh về pH 6,6 bằng NaOH 5N. 2) Hấp vô trùng và trữ ở nhiệt độ phòng đến khi thêm các thành phần lọc vô trùng vào. xiv Phụ lục 3: Quy trình li trích DNA vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006) Quy trình gồm 14 bƣớc nhƣ sau: 1) Nuôi Lxx trong 50 ml môi trƣờng lỏng S8. 2) Thu tế bào (ly tâm 6000 vòng trong 10 phút). 3) Huyền phù tế bào trong 2 ml lysis buffer (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA). 4) Ủ ở 37OC trong 30 phút. 5) Thêm 1/10 thể tích SDS vào để đạt nồng độ 1% SDS. 6) Thêm proteinase K đến nồng độ cuối cùng là 50 μg/ml. 7) Ủ ở 50 - 55OC trong 4 giờ. 8) Ly trích với phenol trung tính: chloroform : isoamyl alcohol cho đến khi bề mặt đƣợc rửa sạch. 9) Thêm ethanol lạnh vào với thể tích tăng 2 lần nhằm làm kết tủa acid nucleic. 10) Thu DNA bằng pipet, rửa cẩn thận bằng cồn 70%. 11) Xử lí bằng Rnase. 12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol. 13) Thu DNA bằng pipet và rửa bằng cồn 70%. 14) Huyền phù DNA trong TE. xv Phụ lục 4: Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến. Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại I Bệnh do nấm 1 Bệnh sọc nâu Brown stripe Cohliobalus stenospilus (Drechs) 2 Bênh mốc sƣơng Downy mildew Peronosclerospora sacchri (T. Miyake) 3 Bệnh đốm mắt én Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker 4 Bênh đốm trắng White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo 5 Bệnh cháy lá Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling 6 Bệnh dứa Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau 7 Bệnh xoắn cổ lá Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon 8 Bệnh thối đỏ Red rod Colectotrichum falcatum Went 9 Bệnh rỉ sắt đỏ Rust Puccinia melanopcephala H. &P. Syd 10 Bệnh rỉ sắt vàng Rust orange P. kuehnii Butl 11 Bệnh than Smut Ustilago senaminea Syd 12 Bệnh đốm vàng Yellow spot Mycovellosiella koepket 13 Bệnh đốm vòng Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan Bệnh do vi khuẩn 14 Bệnh gôm Gumming diease Xanthomonas camestris pv. Vasculorum 15 Bệnh thân ngọn đâm chồi Leaf scald Xanthomonas alibilineans (Ashby 1929) 16 Bệnh cằn mía gốc Ratoon stunting disease Leifsonia xyli subsp xyli (Davis et al, 1980) 17 Sọc đỏ Red stripe Pseudomonas rubrilineans (Lee et al) II Bệnh do Phytoplasma 18 Bênh chồi cỏ Grassy shoot 19 Bệnh trắng lá White leaf III Bệnh do virus 20 Bênh sọc vàng Chlorotich streak Chƣa rõ 21 Bệnh Fiji Fiji disease Fiji disease virus 22 Bệnh khảm Mosaic Sugarcane mosaic virus 23 Bệnh đốm sọc Streak Sugarcane streak virus 24 Vàng gân lá Sugarcane yellow leaf virus xvi Phụ lục 4: Một số hình ảnh về quá trình nghiên cứu bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc. Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. Hình PL6. Gốc mía bị cằn xvii Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân. Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng.