Luận văn Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen

UYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Tám giống đậu xanh do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu là: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Đặc điểm của các giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu STT Tên giống Nguồn gốc Màu sắc hạt Hình dạng hạt Khả năng chịu hạn 1 VN93 - 1 Giống lai trong nước (Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo) Xanh - không bóng Tròn Khá 2 VN99- 3 Giống lai khác loài trong nước (Viện Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo -VN93-1 x Vigna mungo) Xanh nâu – không bóng Tròn Trung bình 3 VC1973A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 4 ĐX06 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – không bóng Tròn Trung bình 5 VC3902A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 6 VC6148 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 7 VC 6372 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình 8 VC 2768A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 2.1.2. Hoá chất và thiết bị - Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông dụng khác. - Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH … 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau: Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Tạo đa chồi từ mắt lá mầm Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro HẠT ĐẬU XANH Tạo mô sẹo Xử lý thổi khô Tái sinh cây Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.2.1. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro * Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh Khử trùng hạt Mẫu vật ở ngoài môi trường nuôi cấy có thể có nấm mốc và vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ. - Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất. - Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm dung dịch Javen lắc đều trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với nồng độ cồn 60%,70%,80%, 90%, nồng độ javen 50%,60%,70%. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ. Tạo mô sẹo Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức: t cp N N Ci  (%) Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Tái sinh cây Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển. Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức: sv r c N N R  (%) Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%) Nr là tổng số mô tái sinh cây Nsv là tổng số mô nuôi cấy Kéo dài chồi đậu xanh Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần. Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn. Tạo cây hoàn chỉnh Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo 2.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức: f df L W WW W   (%) Trong đó: WL: độ mất nước (%) Wf: khối lượng mô tươi (mg) Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg) 2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7). + Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức: t sv v N N S  (%) Trong đó:Sv:tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv:số mô sống sót Nt:tổng số mô xử lý + Tỷ lệ tái sinh cây: sv r c N N R  (%) Trong đó: Rc:khả năng tái sinh cây (%) Nr:số mô tái sinh cây Nsv: số mô sống sót Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 25 0 C  10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6. 2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên. Các bước ra cây được tiến hành như sau: - Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch. - Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm. - Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc. - Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60% trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần. Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm. Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số chồi / mảnh cấy. Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,7. Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l. Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp ra cây ở mục 2.2.2) 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu ( x ), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 trung bình mẫu ( x S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO 3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao. 3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo 3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%) Công thức Nồng độ 2.4D (mg/l) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00 10 12 94,04 92,05 84,10 84,10 92,15 84,10 90,15 85,10 11 13 82,03 80,80 79,50 79,50 82,50 79,30 83,50 83,50 Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống trên đều giảm. Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l 2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình dạng nhẵn. Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh Công thức Nồng độ 2,4D mg/l VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 2 4 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 3 5 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 4 6 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 5 7 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 6 8 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 7 9 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 8 10 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 9 11 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 10 12 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 11 13 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms) (1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2) Công thức 2.4-D (mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25 2,650,50 2,580,15 2,600,50 2 4 2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10 2,70 0,15 2,750,10 2,60 0,15 3 5 2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25 2,78 0,25 2,700,25 2,80 0,35 4 6 3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15 3,05 0,45 3,150,40 3,10 0,52 5 7 3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35 3,38 0,25 3,480,15 3,27 0,25 6 8 3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40  0,15 3,45 0,35 3,550,25 3,44 0,32 7 9 3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55  0,42 3,50 0,20 3,600,20 3,52 0,21 8 10 3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75  0,15 3,650,45 3,650,45 3,75 0,35 9 11 2,900,20 3,100,25 3,00 0,35 3,850,35 2,75  0,25 2,6 0,25 2,850,50 2,95  0,25 10 12 2,700,15 2,800,50 2,65 0,42 3,3  0,20 2,78  0,27 2,58 0,26 2,750,20 2,75  0,26 11 13 2,300,20 2,450,20 2,43 0,25 2,500,27 2,33  0,10 2,50 0,30 2,600,18 2,50 0,25 Bảng 3.3 cho thấy, sau 10 ngày nuôi cấy ở môi trường có nồng độ 3mg/l - 10 mg/l 2,4D mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06 có kích thước khối mô tăng dần và đạt kích thước lớn nhất ở môi trường có nồng độ 11mg/l 2,4D. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l kích thước mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, kích thước mô sẹo giảm mạnh (2,5 đvms). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A, các phôi nuôi cấy trong môi trường bổ sung từ 3 mg/l – 9 mg/l kích thước khối mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất kích thước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 lớn nhất khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Ở môi trường có nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l và kích thước mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống đó bắt đầu giảm dần. Như vậy môi trường bổ sung nồng độ 2,4D 11mg/l thích hợp nhất với giống đậu xanh ĐX06 và nồng độ 2,4D cao hơn 10 mg/l đối với 7 giống đậu xanh còn lại, vì ở nồng độ đó tỷ lệ tạo mô sẹo, hình dạng cũng như kích thước mô sẹo là tốt nhất. Nồng độ 2,4D cao hơn tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước khối mô đều giảm. Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các mô sẹo này đều vàng và nhanh bị chết. Hiện tượng này cũng thường xuyên gặp khi nuôi cấy mô thực vật, có thể do khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao, thì sự phân chia tế bào xảy ra nhanh, sự định hướng cho sự biệt hoá cơ quan khó khăn nên các mô sẹo tạo ra dễ bị biến dạng. Hơn nữa khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao đặc biệt ở các loại mô sẹo hoặc chồi được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường luôn duy trì các chất kích thích, các mẫu nuôi cấy này luôn tích tụ hàm lượng hoocmon ngoại sinh cao, dẫn đến các tế bào và mô dễ bị độc và nhanh chết. Còn nếu sử dụng nồng độ 2,4D thấp quá trình tạo mô sẹo và phát triển của mô sẹo rất chậm. Mai trường và cs (2001) chỉ sử dụng BAP với nồng độ 4mg/l sau 1 tuần bắt đầu thấy sự hình thành các đám mô sẹo [16]. Kaviraj và cs (2006) tái sinh cây đậu xanh hoàn chỉnh từ mô sẹo đã sử dụng 2,4D trong giai đoạn tạo mô sẹo với nồng độ 9mg/l – 15mg/l và kết quả thu được với môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D tạo 100% mô sẹo [34]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nhận được của nhóm Kaviraj và cs (2006). Như vậy môi trường bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo phôi của giống đậu xanh ĐX06 và môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khă năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 giống còn lại, vì ở môi trường này tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước mô đều cao nhất. Hình 3.1. Hình ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D A:Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 10mg/l của giống đậu xanh VN93-1 B: Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 11mg/l của giống đậu xanh ĐX06 3.1.2.2. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh BAP (6 - Benzyl amino purine) là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. BAP là chất có hiệu quả và sử dụng rộng rãi cho cảm ứng chồi trong cây họ đậu bao gồm cả đậu xanh (Gulati, Jaiwal, 1994) [20]. Mô sẹo thu được của các giống đậu xanh được chia thành những khối mô nhỏ có kích thước khoảng 3x3 mm, cấy lên môi trường MS cơ bản có chứa BAP với nồng độ khác nhau (2mg/l; 3mg/l; 4mg/l). Mỗi công thức được tiến hành trên 30 mô sẹo, lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi khả năng tái sinh cây của mô sẹo sau 10 và 15 ngày cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh được thể hiện ở bảng 3.4. A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh (%) Công thức Nồng độ BAP (mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Sau 10 ngày 1 2 60,2 2,5 61,03,5 66,0 2,5 63 4,0 60,01,5 63,0 5,0 65,0 1,5 60,0 4,1 2 3 98,6 1,2 88,02,1 77,3 1,1 87,0 2,4 77,52,5 75,8 1,5 82,7 2,5 86,8 2,5 3 4 63,31,5 64,02,0 62,0 3,5 63,0 1,5 61,5 1,5 60,5 4,5 61,5 4,0 63,1 2,5 Sau 15 ngày 1 2 65,2 1,5 66,03,0 67 2,1 63,53,5 62,0 1,0 66,0 1,0 67 1,8 66,0 3,8 2 3 99,0 1,0 90,01,9 78,0 1,2 88,0 1,8 78,5 1,5 77,0 1,5 84,7 2,5 87,0 2,5 3 4 65,52,5 66,02,8 63,0 2,5 64,0 1,5 65,0 1,5 63,0 2,5 63,5 3,0 64,1 1,5 Bảng 3.4 cho thấy, dưới ảnh hưởng của BAP thì tỉ lệ tái sinh cây của cả 8 giống đậu xanh khá cao sau 10 ngày, trong đó tỉ lệ tái sinh cây thấp nhất trên môi trường có nồng độ BAP 2 mg/l (60% - 66%) và cao nhất khi nồng độ BAP là 3 mg/l (77,3% - 98,6%). Bổ sung nồng độ BAP cao hơn (4mg/l) không làm tăng tỷ lệ tái sinh ở cây đậu xanh mà còn giảm tỷ lệ tái sinh (60,5% - 64,0%). Sau 15 ngày tỉ lệ tái sinh cây tăng lên không đáng kể. Các giống đậu xanh khác nhau tỷ lệ tái sinh cũng khác nhau. Tỷ lệ tái sinh cao nhất là giống VN93-1 (98,6% sau 10 ngày, 100% sau 15 ngày), giống VC6148 tỷ lệ tái sinh thấp nhất (75,8% sau 10 ngày, 77% sau 15 ngày). Sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 khác nhau này cho thấy cùng điều kiện môi trường nuôi cấy các giống khác nhau (kiểu di truyền khác nhau) khả năng tái sinh cũng khác nhau. Khả năng tái sinh và số chồi/mô sẹo được dùng để đánh giá ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh của các giống đậu xanh nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm tạo chồi được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số chồi / một mô sẹo VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 2 1,230,31 1,660,63 1,660,32 1,66  0,63 1,660,63 1,66 0,32 1,66 0,32 1,660,63 2 3 2,330,39 2,560,39 2,700,27 2,660,329 2,660,63 2,75 0,25 2,55 0,25 2.700,32 3 4 1,670,29 2,200,35 2,660,32 2,400,32 2,350,15 2,66 0,44 2,50 0,14 2,430,20 Sau 10 ngày tái sinh, số chồi/mô cao nhất đạt 2,75 chồi trên môi trường có bổ sung 3mg/l BAP. Môi trường bổ sung nồng độ BAP 2mg/l và 4 mg/l đều cho tỷ lệ tạo chồi thấp hơn. Kết quả cho thấy trong thí nghiệm của chúng tôi tỷ lệ tái sinh và số lượng chồi nhiều hơn so với báo cáo của Mai Trường và cs (2001) [15]. Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cho rằng nồng độ BAP 3mg/l là tốt nhất cho sự tái sinh của 8 giống đậu xanh nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung3mg/l BAP 3.1.2.3. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh GA3 (axit Gibberelic) là chất kích thích thuộc nhóm Gibberelin, nó tác động làm cho tế bào dãn ra và phân chia, làm tăng chiều cao của cây. Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 với nồng độ : 0,5mg/l; 1mg/l;1,5mg/l; 2mg/l. Kết quả cho thấy, sau 10 ngày cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 với nồng độ khác nhau đều làm cho chồi của đậu xanh dài ra. Nhưng trong 3 công thức nồng độ trên thì công thức môi trường bổ sung GA3 với nồng độ 1,5mg/l làm cho chồi đậu xanh được kéo dài và mập nhất, còn nồng độ GA3 0,5 mg/l và 1mg/l thì chồi kéo dài chậm hơn. Nồng độ GA3 2mg/l chồi kéo dài nhanh nhất nhưng cây yếu và sau một thời gian thì bị héo ngọn. Hiện nay chưa thấy nghiên cứu nào nói về môi trường kéo dài chồi ở đậu xanh có sử dụng GA3, do vậy, từ kết quả thu được ở trên chúng tôi cho rằng nồng độ GA3 1,5 mg/l là tốt nhất cho kéo dài chồi ở đậu xanh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Hình 3.3. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 3.1.2.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh α - NAA là chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, có tác dụng mạnh đến quá trình hình thành và phát triển rễ thực vật. Để tạo rễ cây tái sinh chuẩn bị cho khâu tiếp theo là đưa ra ngoài đồng ruộng, chúng tôi đã nghiên cứu môi trường ra rễ cây đậu xanh nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung α-NAA với các nồng độ khác nhau. Theo dõi khả năng tạo rễ của các cây tái sinh sau 3 tuần và 5 tuần cấy chuyển, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.6. Bảng 3.6 cho thấy, bổ sung α-NAA với các nồng độ từ 0,2 mg/l đến 0,4 mg/l đều giúp cho các chồi tạo rễ với tỉ lệ cao. Song nồng độ α-NAA cao thì tỉ lệ tạo rễ và chiều dài rễ phát triển càng kém đi. Môi trường có nồng độ α - NAA là 0,3 mg/l là môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ của đậu xanh, ở môi trường này tỉ lệ tạo ra rễ cao nhất (đạt 100%) và chiều dài rễ là cao nhất. Từ kết quả thu được cho thấy ngoài việc sử dụng BAP để tạo rễ ở đậu xanh (Mai Trường và cs, 2001) [16] và sử dụng IAA kết hợp với α-NAA (Ignacimuthu và cs,1999) [31], chúng tôi chỉ sử dụng α-NAA bổ sung vào môi trường khả năng tạo rễ với tỷ lệ cũng cao (100%). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh từ mô sẹo phôi đậu xanh (tỷ lệ ra rễ của đậu xanh = số chồi ra rễ/ tổng sô chồi cấy chuyển (%)) Công thức Nồng độ α-NAA VN 93-1 VC 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC2768A Sau 3 tuần 1 0,2 75,674,5 71,03,0 68,74,3 68,74,3 60,54,5 63,04,0 66,53,5 65,0 2,5 2 0,3 98,61,4 97,0 1,1 97,0 1,4 97,0 1,4 97,52,5 97,51,5 94,72,5 96,8 2,0 3 0,4 72,3 2,7 64,0 4,0 64,0 2,5 64,0 2,5 61,01,5 60,52,5 61,54,5 63,1 5,0 Sau 5 tuần 1 0,2 85,5 1,5 76,03,0 68,74,3 73,53,5 68,01,0 69,01,0 70,01,5 76,0 3,8 2 0,3 99,0 1,0 98,0 1,9 97,0 1,4 98,0 1,8 98,51,5 98,01,5 94,72,5 97,0 2,5 3 0,4 65,5  2,5 66,0 2,0 64,0 2,5 64,0 1,5 65,01,5 63,02,5 63,53,0 64,5 1,5 Hình 3.4. Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 3.1.3. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh cấy cây đậu xanh từ mô sẹo (1) Môi trường thích hợp nhất cho tạo mô sẹo của phôi đậu xanh là môi trường có bổ sung 10 mg/l 2,4D đối với các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A. Còn giống đậu xanh ĐX06 thích hợp với môi trường có nồng độlà 11mg/l 2,4D. (2) Các mô sẹo có nguồn gốc từ phôi đậu xanh đều có khả năng tái sinh cây cao, khả năng sinh trưởng của chồi mạnh. Tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình và kích thước chồi cao nhất trên môi trường có bổ sung BAP với nồng độ 3mg/l. (3) Môi trường thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh là môi trường có bổ sung 0,3 mg/l α -NAA, tại môi trường này tỷ lệ tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ là cao nhất. 3.2. ĐỘ MẤT NƢỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƢỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI CÁC GIỐNG ĐẬU XANH 3.2.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo phôi đậu xanh dƣới tác động của thổi khô Để chọn ra các dòng tế bào có khả năng chịu mất nước, một số tác giả đã tiến hành cho các tế bào mô sẹo bị mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng của bàn cấy. Đối với mô sẹo đậu xanh, trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục, lượng nước trong mô giảm dần tới mức không có thể bay hơi được nữa. Kết quả xác định khả năng chịu mất nước của mô sẹo dưới tác động của thổi khô đối với các giống VN93-1; VN99-1; VC1973A; ĐX06; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9,11 giờ liên tục được thể hiện ở bảng 9 và hình 3.6. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Bảng 3.7.Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi sử lý bằng thổi khô (% khối lượng tươi) Thời gian thổi khô (giờ) VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3 48,84 50,00 70,60 62,15 50,28 64,18 60,22 57,29 5 65,22 65,86 79,05 73,92 69,86 73,92 72,28 69,26 7 85,75 82,38 81,44 82,53 85,38 82,53 76,29 84,26 9 87,79 89,67 83,19 85,99 86,67 85,99 81,68 85,65 11 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 0 3 5 7 9 11 Thêi gian thæi kh« (giê) Tû lÖ m Êt n• íc (% ) 0 2 40 6 80 100 120 VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A DX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Hình.3.5. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô Độ mất nước của mô tăng theo thời gian thổi khô ở tất cả các giống. Sau 3 giờ đến 5 giờ thổi khô, mức độ mất nước giống VC1973A là cao nhất (70,60 - 79,05% khối lượng tươi), sau đó là giống VC6148 (64,18 -73,92 % khối lượng tươi, giống VN93- 1 có mức độ mất nước thấp nhất (48,84% - 65,22% khối lượng tươi). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Ở các ngưỡng thổi khô 7 giờ, 9 giờ, 11 giờ, độ mất nước của mô giảm dần. Nhìn chung, tốc độ mất nước giữa các giống không có sự sai khác đáng kể. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của các tác giả khi chọn dòng tế bào chịu thổi khô ở lúa, ở lạc [14], [7]. 3.2.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô Tỉ lệ sống sót của mô sẹo phôi đậu xanh được đánh giá sau khi nuôi phục hồi 1 tuần. Quan sát khả năng phục hồi mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lí bằng thổi khô được cấy lên môi trường tái sinh chúng tôi thấy, sau 2-3 ngày những mô sẹo sống sót đã hút nước và sinh trưởng bình thường. Tỉ lệ sống sót của mô sẹo tỉ lệ nghịch với thời gian xử lí (bảng 3.8 và hình 3.7). Bảng 3.8. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi phục hồi Thời gian thổi khô (giờ) Tỷ lệ sống sót của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 0 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 3 100,00 96,29 85,00 95,00 96,00 92,00 92,40 95,38 5 100,00 88,00 75.00 91,00 92,00 68,00 85,83 90,20 7 96,43 80,00 42,86 64,38 65,38 44,82 76,43 72,18 9 88,00 44,00 23,80 50,00 51,00 34,61 66,35 55,78 11 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 00,00 Sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ thổi khô, tỉ lệ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót của giống VN93- 1 là lớn nhất và cuối cùng là giống VC1973A có tỉ lệ mô sẹo sống sót thấp nhất, sau 9 giờ thổi khô chỉ còn 23,80 %. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Như vậy cùng một mức độ mất nước như nhau nhưng khả năng chịu đựng của mô sẹo có sự khác nhau rõ rệt giữa các giống nghiên cứu. 0 3 5 7 9 11 Thêi gian thæi kh« (giê) Tû lÖ sè ng sã t ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Hình 3.6. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi trên môi trường tái sinh * Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh cây của 8 giống đậu xanh nghiên cứu sau 3 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.8. Kết quả ở bảng 3.9 và hình 3.8 cho thấy, tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu đều có khả năng tái sinh sau 3 tuần nuôi cấy. Ở ngưỡng xử lí bằng thổi khô 3 giờ, tất cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tái sinh cao và thời gian xử lí càng cao thì tỉ lệ tái sinh càng giảm. Giống có tỷ lệ tái sinh cao nhất là giống VN93 -1, giống VC1973A có tỷ lệ tái sinh thấp nhất ở các ngưỡng thời gian xử lý, sau 9 giờ xử lí thổi khô tỉ lệ tái sinh chỉ còn 10,5%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Bảng 3.9. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Thời gian thổi khô (giờ) Tỷ lệ tái sinh của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi thổi khô (%) VN 93- 1 VN 99-3 VC1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 0 98,6 90,0 78,3 88,0 78,5 77,8 84,7 87,8 3 96,4 88,1 85,5 87,8 89,8 95,0 85,6 89,5 5 87,2 84,7 66,9 84,4 82,0 83,0 67,7 70,6 7 80,6 79,6 50,1 79,0 74,7 76,0 52,2 50,7 9 20,0 15,7 10,5 17,3 20,2 16,3 10,7 12,8 0 3 5 7 9 V N 9 3- 1 V C 19 73 A V C 39 02 A V C 63 720 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thêi gian thæi kh« (giê) Tû lÖ t¸i sinh %) VN 93- 1 VN 99-3 VC 1973A DX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A Hình 3.7. Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Như vậy kết quả cho thấy, hầu hết mô sẹo phôi đậu xanh của các giống qua xử lý mất nước 3h khi sống sót thường có khả năng tái sinh cây cao hơn so với đối chứng không bị xử lý (0h). Điều này có thể do xử lí mất nước, khi đặt lên môi trường tái sinh, các tế bào hút nước mạnh hơn, nên sức sống, sức sinh trưởng và khả năng tái sinh cao hơn. Theo Lê Trần Bình và cs (1995), nguyên nhân là do quá trình xử lý đã giết chết những tế bào mẫn cảm, chọn ra những tế bào có sức sống và khả năng tái sinh cao. Hiện tượng này cũng được phát hiện khi xử lý mất nước ở một số đối tượng cây khác như ở thuốc lá và mảnh lá cây Craterosticgma plantagineum, lạc [9], [7]. Kết quả các thí nghiệm đã thu được 289 dòng mô chịu mất nước của 8 giống đậuxanh và 715 dòng cây xanh. Hình 3.8. Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý thổi khô 3.2.3. Nhận xét về khả năng chịu mất nƣớc bằng xử lý thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu (1) Cả 8 giống đậu xanh nghiên cứu đều có khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo và có biểu hiện khác nhau giữa các giống. (2) Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 (3) Kết quả thu được 289 dòng mô chịu mất nước và 715 dòng cây xanh của 8 giống đậu xanh nghiên cứu. Đây là nguồn vật liệu phong phú cho chọn dòng chịu hạn ở cây đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước. 3.3. KẾT QUẢ TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MẮT LÁ MẦM 3.3.1. Môi trƣờng nảy mầm của hạt Hạt đậu xanh của 8 giống được khử trùng (điều kiện khử trùng giống như phần khử trùng hạt của mục 2.2.1) cấy trên môi trường nảy mầm, ở giai đoạn này hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong hạt nên môi trường chưa cần cung cấp chất kích thích sinh trưởng. Ở cả 8 giống đậu xanh, sau một ngày nuôi cấy hạt bắt đầu nứt vỏ, 3 ngày hạt nảy mầm hoàn chỉnh. Hình 3.9. Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), Hạt đậu xanh được tách ra để tạo đa chồi (C, D) 3.3.2. Môi trƣờng tạo đa chồi Môi trường tạo đa chồi ở đa số các loài thực vật cần sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng như IAA, BAP, IBA,…Trong quá trình thí nghiệm A B C D Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 chúng tôi đã sử dụng BAP để tạo đa chồi ở đậu xanh. Việc sử dụng nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng thích hợp có ý nghĩa quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của cây, đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào. Sau 3 ngày, khi hạt nảy mầm dùng dao mổ tách hạt thành hai mảnh, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm, cấy các mảnh đó trong môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau (1,5mg/l; 2mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5mg/l). Mỗi bình cấy 10 – 15 mảnh lá mầm. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 lá mầm, lặp lại 3 lần. Khả năng tạo chồi và số chồi / mảnh lá mầm được dùng để đánh giá khả năng thích ứng của giống và ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy in vitro, kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.10. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh Công thức Nồng độ BAP Số chồi / một lá mầm VN 93-1 VN99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 1,5 1,33 0,329 1,660,639 1,660,329 1,660,639 1,660,639 1,660,329 1,660,329 1,66 0639 2 2 1,660,639 2,330,329 2,000,577 2,330,329 1,660,329 2,330,086 2,000,57 2,300,639 3 2,5 1,670,329 2,300,375 2,660,329 2,430,352 2,350,144 2,660,144 2,500,144 2,330,202 4 3 2,330,329 2,660,329 3,000,577 2,660,329 2,660,639 3,350,259 3,150,329 3,000,577 5 3,5 1,330,329 1,670,329 1,330,329 1,570,190 1,660,329 2,330,329 1,480,069 1,330,369 Từ bảng 3.10 cho thấy sự khác biệt số lượng chồi từ mắt lá mầm môi trường tạo đa chồi bổ sung BAP với nồng độ 3 mg/l cho số chồi đạt tối đa trên một lá mầm dao động từ 2,33  0,329 đến 3,35  0,259 gặp ở tất cả 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 giống đậu xanh: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Số lượng chồi không chỉ phụ thuộc vào nồng độ BAP mà trong quá trình làm thí nghiệm mà chúng tôi còn thấy rằng, nếu gây tổn thương đúng vị trí, không quá sâu hay quá nông sẽ tạo được số chồi nhiều nhất. Cũng sử dụng lá mầm để tái sinh và môi trường tái sinh có bổ sung BAP nhưng nhóm nghiên cứu của Mai Trường và cs chỉ thu được số chồi tối đa là 3 chồi/lá mầm. Như vậy có thể kết luận rằng gây tổn thương mắt lá mầm đúng vị trí và môi trường tạo đa chồi bổ sung 3mg/l BAP tạo được số chồi / lá mầm là cao nhất. Hình 3.10. Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm 3.3.3. Môi trƣờng kéo dài chồi Sau khoảng 10 ngày khi chồi được hình thành, tách riêng từng chồi và cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung 1,5 mg/l GA3 và các chất dinh dưỡng khác nhau để cho chồi phát triển thuận lợi. Sau 10 ngày cấy trên môi trường kéo dài chồi, chồi đậu xanh đạt kích thước 4 - 5 cm được chuyển sang môi trường ra rễ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.11. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 3.3.4. Môi trƣờng ra rễ Hệ rễ được hình thành khi chuyển các chồi sang môi trường ra rễ có bổ sung 0,3mg/l α – NAA, khoảng 30 ngày, khi cây hoàn chỉnh với bộ rễ phát triển tốt đạt chiều cao 7 – 8 cm, cây được chuyển ra ngoài nuôi cấy trong các khay. Hình 3.12. Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA 3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc Khi cây con trong ống nghiệm có kích thước 5 - 7 cm với hệ rễ phát triển được đưa ra ngoài nuôi cấy trong khay (điều kiện nuôi cấy như phương pháp ra cây mục 2.2.1). Sau khoảng 30 ngày cây đậu xanh ra hoa và kết quả. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Hình 3.13. Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong khay (A), Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu ra hoa kết quả (B, C, D) 3.3.6. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh từ mắt lá mầm (1). Môi trường bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí trí tạo được số lượng chồi / lá mầm là cao nhất. (2) Môi trường bổ sung 1,5 mg/l GA3 sau 10 ngày nuôi cấy chồi tạo được chồi đạt kích thước cấy chuyển ra rễ tốt nhất. (3) Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, cây tái sinh đều có khả năng ra hoa kết quả khi trồng trong điều kiện trồng và chăm sóc trong khay. A B C D Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Thăm dò môi trường nuôi cấy mô sẹo đậu xanh cho thấy: môi trường có bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo giống đậu xanh ĐX06. Môi trường có bổ sung 10mg/l 2,4D thích hợp cho tạo mô sẹo 7 giống còn lại. Nồng độ 3mg/l BAP cho tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình, kích thước trung bình chồi là cao nhất và môi trường có bổ sung 0,3mg/l α-NAA là thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh. 1.3. Đánh giá khả năng chịu mất nước của các giống đậu xanh ở mức độ mô sẹo trên cơ sở xác định độ mất nước, khả năng chịu mất nước, khả năng sống sót và khả năng tái sinh cây đã cho thấy cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng chịu mất nước ở mức độ mô sẹo. Đã chọn được 289 dòng mô chịu mất nước và 715 dòng cây xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước. 1.3. Thăm dò môi trường tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầmcho thấy, môi trường có bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí sẽ tạo được số chồi/ lá mầm cao. Môi trường có bổ sung 1,5 mg/l GA3 là môi trường tốt nhất để kéo dài chồi; môi trường bổ sung 0,3 mg/l α – NAA là môi trường thích hợp cho tạo rễ chồi đậu xanh. 1.4. Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi từ mắt lá mầm và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, có khả năng ra hoa kết quả khi trồng ra chậu. 2. Đề nghị 2.1. Tiếp tục sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc chọn dòng chịu hạn từ các giống đậu xanh nghiên cứu trên. 2.2. Cần có những nghiên cứu chuyển gen thích hợp để cải tiến các giống đậu xanh có chất lượng cao và khảnăng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường tốt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyễn Thị Luyện, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Lò Mai Thu, Chu Hoàng Mậu (2009), Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 54(6): 123-128. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội (188 trang). 2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội. 3. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí sinh học, 17(1), tr. 19 – 55. 4. Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo quản, nhân giống và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomoea batatas L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 5. Nguyễn Hữu Hồ và Nguyễn Văn Uyển (2005), Nghiên cứu hai kiểu tái sinh in vitro cây khoai lang Inpomoea Batatas, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống ; NXB khoa học và kỹ thuật, 1242 – 1245. 6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 52(4): 82-88. 7. Ngô Thị Liêm (2006),Nghiên cứu sự đa dạng di truyền và khả năng chịu hạn của một số giống lạc (Arachis hypogaea L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. 8. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh. NXB Nông nghiệp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 9. Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl và chịu mất nước ở thuốc lá (Nicotiana tabacum L.), luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, 107 trang. 10. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến đột biến thích hợp cho vùng núi đông bắc Việt Nam. Luận án tiến sĩ Sinh học. Viên Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 11. Nguyễn Thị Phương Nam và cộng sự (2007), “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây ngô và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo protein giàu sắt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Khoa học và kỹ thuật, 887 -89. 12. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 13. Nguyễn Thị Thanh và Võ Phan MiSa (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng chuyển gen ở hồ tiêu; Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, NXB Khoa học và kỹ thuật, 820 – 824. 14. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. 15. Phan Hữu Tôn (2004), Giáo trình Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 16. Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Uyển (2001), “Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp nuôi cấy in vitro”. Tạp chí sinh học, 23: 33-35. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 17. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ng nghiệp trên máy vi tính, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Tài liệu tiếng anh 18. Abdul B., Frinch R. P., Cocking E. C. (1999), Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)”, Plant cell Rep, 10, pp. 200 – 203 19. Adkins S. M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R.,Godwin I. D. (1995), “Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters”, Aust J Bot, 4, pp. 201 – 209. 20. Amutha S., Muruganantham M., and Ganapathi A. (2006), “Thidiazuron- induced high-frequency axillary and adventitious shoot regeneration in Vigna radiata (L.) Wilczek”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 42:26–30. 21. Bajai S., Rajam H. (1996), “Spermidine for effcient regeneration”, Rice Bio Quar, 26, pp. 6. 22.Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”, Aust J Bot, 44, pp. 91 – 105. 23. Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1997), “ Somaclonal variation and improvement of chilling tolerance in rice: Chance in chilling – induce chlorophyll fluorescence”, Crop Sci, 37, pp. 1727 – 1735. 24. Biwas G. C., Zapata F. J.(1993), “High – frequence plant regeneratin from protoplast of indica rice (Oryza sativa L.) using mantose”, J plant Physiol, 141, pp. 475. 25. Chandler S. F.,Vasil I. K.(1984), “Selection and characteerrizationlof Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 NaCl tolerance cell from embryogenesis cultures of Pennisetum purpureum Schum”, Plant Sci Lett, 37, pp. 157- 164. 26. Collin H. A., Dix P.J. (1990), “Culture systems and selection procedure. In: Plant cell line selection. VCH Verlagsgesellschaft”. 27. Dix P.J (1986), Plant cell culture technology, Yeoman M.M. (eds), Oxford, Blackwel Scientific Publication, pp. 143 – 201. 28. Dix P.J.(1990), Plant cell line selection (Procedures and Applications), VCH Verlagsgllchaft MBH 29. Gulati A. and Jaiwal P.K. (1993). “In vitro selection of salt-resistant Vigna radiata (L.) Wilczek plants by adventitious shoot formation from cultured cotyledon explants”. J. Plant Physiol. 142: 99–10. 30. Gulati A, Jaiwal PK (1994), “Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”. Plant Cell Rep 13:523–527. 31. Ignacimuthu S. & Franklin G. (1999), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L. Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 55: 75–78. 32. Jayanti Sen & Spra Guha Mukherjee (1998), “In vitro intoduction of multiple shoots and plant regeneration in Vigna, In vitro Cell.Dev. Biol. plant, 34: 276 – 280. 33. K. Ramakrishnan · R. Gnanam · P. Sivakumar A. Manickam, “In vitro somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”, Plant Cell Rep (2005) 24: 449–461. 34. Kaviraj C.P., G. Kiran, R.B. Venugopan, P.B.Kavi Kishor, Srinath Rao (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyredorary Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 explants of green gram (Vigna radiata (L.) Wilczek)- A recalcitrant grain legume”. In vitro Cell.Der. Biol. plant. 42: 134 – 138. 35. Mundy J., Chua N. H. (1988), Abcisis and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp. 2279 – 2286. 36.Muruganantham M., Amutha S.,Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A. (2007), “Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent”. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43:550–557. 37. Norbor M. W. (1990), Environmental stress resistance. In: Plant Cell Line Selection, Weihein, New York, Basel, Cambridge, VCH, pp. 167 – 186. 38. Prem R. anand, Ganapathi A., Ramesh V. Anbazhagan, Gengadesan G., and Selvaraj N (2001), “High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in cell suspension cultures of cowpea, vigna unguiculata (L.) walp”. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant, 36:475-480. 39. Poddar K., Vishnoi R. K., Kothari S. L. (1998), “Plant regeneration from embryogenesis callus”, Rice Bio quar, 35, pp. 9. 40. Raghava. R. N. V., Nabors M. V., (1985), “Plant negeneration from tissue cultures of Pokali rice is promoted by optizing callus to medium volume ratio and by a medium conditioning factor produced by embryogeneic callus”, Cell Tiss Org Cult, 4, pp. 241 – 248. 41. Rudrabhatla Sairam, Siva Chennareddy, Madasamy Parani, Shulu Zhang, Diaa Al-abed, Wissam Abou-Alaiw, and Stephen Goldman (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond – plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 41:411–423. 42. Renato A. Avenido & Kazumi Hattori (1999), “Differences in shoot Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 99–110. 43. Renato A Avenido, Jo Motoda and Kazumi Hattori (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis {Piper} Verdc.) species”. Plant Growth Regulation, 35: 59–67. 44. Sita L. Mahala, T. Leela, B. Kiran Kumar, B. Naresh, Prathibha Devi (2006), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)”. Plant Biotechnology, 23: 409–411. 45. Sonia, Raman Saini, Rana P. Singh, Pawan K. Jaiwal (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris - amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.)Wilczek) using bar as selectable marker”. Plant Cell Rep 26:187–198 1.