Luận văn Polyphenol và hoạt độ ức chế serine-Proteinase từ thân, hạt cây gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác

®Ó ph©n tÝch. §Ó ph¸t hiÖn c¸c vÕt dÞch chuyÓn cã thÓ soi d­íi ¸nh s¸ng tö ngo¹i, hiÖn mµu b»ng c¸c thuèc thö thÝch hîp. Cã thÓ c¹o c¸c vÕt, röa gi¶i, tinh chÕ ®Ó tiÕp tôc nghiªn cøu. Trong c«ng tr×nh nµy, chóng t«i sö dông b¶n máng Silicagel 25 DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 cña Merck ®Ó ph©n chia, x¸c ®Þnh c¸c thµnh phÇn polyphenol trong c¸c c©y mÉu nghiªn cøu. C¸c hÖ dung m«i triÓn khai s¾c ký ®· dïng: TEAF (Toluene: Ethyl acetate: Acetone : acid Formic): (5:2:2:1) TEAF: (5:3:1:1) Chloroform:methanol: (9:1) Chloroform:ethyacetate: acid formic: (5:3:0,4) HiÖn mµu: H2SO4 10%, 800C H¬i Amoniac b·o hßa 2.3.5 X¸c ho¹t ®é øc chÕ proteinase: dÞch chiÕt mÉu ®­îc pha lo·ng nhiÒu lÇn ®Ó ®¹t nång ®é ethanol khi tiÕp xóc víi enzyme nhá h¬n 5% (v/v) lµ nång ®é kh«ng ¶nh h­ëng tíi ho¹t tÝnh enzyme. Ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n trªn ®Üa th¹ch (®iÒu tra s¬ bé PIA) víi c¬ chÊt casein 0,1% gi÷ ë 37oC trong 4 giê nhuém b»ng Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, ho¹t ®é enzyme tû lÖ thuËn víi ®­êng kÝnh vµ ®é s¸ng cña vßng ph©n gi¶i trªn ®Üa th¹ch [70]. Ph­¬ng ph¸p Anson c¶i tiÕn [69] Nguyªn t¾c dùa vµo sù thñy ph©n c¬ chÊt protein (casein) bëi enzyme. Sau ®ã diÖt enzyme vµ kÕt tña protein ch­a bÞ thñy ph©n b»ng acid tricloroaxetic (TCA). §Þnh l­îng s¶n phÈm t¹o thµnh sau ph¶n øng víi thuèc thö Folin-Ciocalteau, kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase cña mÉu nghiªn cøu tØ lÖ víi hiÖu sè gi÷a s¶n phÈm t¹o thµnh cña èng thÝ nghiÖm kh«ng cã mÉu nghiªn cøu vµ èng nghiÖm cã chÊt nghiªn cøu. Mét ®¬n vÞ øc chÕ (IU) lµ l­îng chÊt øc chÕ lµm gi¶m 50% ho¹t ®é cña 2 mg enzyme. Hãa chÊt thÝ nghiÖm Thuèc thö Folin-Ciocalteau §Öm Sorensen pH 7,6 nång ®é 1/15M C¬ chÊt casein 1% trong ®Öm Sorensen pH 7,6 nång ®é 1/15M Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa t¸ch tõ Pseudomonas aeruginosa TCA 5% Na2CO3 6% TiÕn hµnh thÝ nghiÖm èng thÝ nghiÖm: lÊy hai èng nghiÖm, mét èng cho vµo 400 ml ®Öm, èng cßn l¹i cho vµo 300 ml ®Öm cïng víi 100 ml mÉu nghiªn cøu cã ®é pha lo·ng thÝch hîp. Sau ®ã cho vµo mçi èng 100 ml enzyme, trén ®Òu, ®Ó ë 35,50C trong 10 phót, thªm 1 ml casein 1% vµ gi÷ ë 35,50C trong 20 phót. TiÕp theo cho vµo mçi èng 2,5 ml TCA 5%, l¾c ®Òu, läc lÊy dÞch trong lµm ph¶n øng mµu víi thuèc thö Folin-Ciocalteau. èng kiÓm tra: lµm t­¬ng tù víi èng thÝ nghiÖm, nh­ng sau khi ñ 10 phót ë 35,50C cho ngay TCA tr­íc råi ®Ó 20 phót, sau ®ã míi cho c¬ chÊt casein. Ph¶n øng mµu: cho 250 ml dÞch läc vµo 1ml Na2CO3 6%, trén ®Òu råi cho tiÕp vµo 250 ml thuèc thö Folin ®· pha lo·ng 5 lÇn. Sau 30 phót so mµu ë b­íc sãng 750 nm. Ho¹t ®é øc chÕ ®­îc tÝnh nh­ sau: DEI = E - EI E = Etn - Ekt EI = EItn - EIkt I (mIU/ml) = DEI/E.n.x Etn : §é hÊp thô èng thÝ nghiÖm kh«ng cã chÊt øc chÕ. Ekt : §é hÊp thô èng kiÓm tra kh«ng cã chÊt øc chÕ. EItn: §é hÊp thô èng thÝ nghiÖm cã chÊt øc chÕ. EIkt: §é hÊp thô èng kiÓm tra cã chÊt øc chÕ. n: ®é pha lo·ng mÉu nghiªn cøu x: hµm l­îng enzyme (mg/ml) t­¬ng øng víi ho¹t ®é E I : ho¹t ®é øc chÕ ThÝ nghiÖm x¸c ®Þnh PIA ®­îc tiÕn hµnh víi nhiÒu ®é pha lo·ng mÉu nghiªn cøu kh¸c nhau ®Õn khi t×m ®­îc ®é pha lo·ng thÝch hîp. §é pha lo·ng thÝch hîp lµ ®é pha lo·ng mÉu nghiªn cøu mµ ë ®ã ho¹t ®é enzyme khi cã chÊt k×m h·m (dung dÞch mÉu nghiªn cøu) b»ng kho¶ng mét nöa so víi ho¹t ®é enzyme khi cã ®èi chøng lµ n­íc. X¸c ®Þnh ho¹t ®é ph©n gi¶i protein theo ph­¬ng ph¸p Anson c¶i tiÕn §¬n vÞ ho¹t ®é ph©n gi¶i protein lµ l­îng enzyme mµ trong 1 phót ë 35,5 0C cã kh¶ n¨ng ph©n gi¶i protein t¹o thµnh c¸c s¶n phÈm hßa tan trong TCA cho ph¶n øng mµu víi thuèc thö Folin-Ciocalteau t­¬ng ®­¬ng víi ph¶n øng mµu cña 1 mmol tyrosine víi thuèc thö Folin-Ciocalteau. OD750 μmol/ml H×nh 2.3 §­êng chuÈn tyrosine Ho¹t ®é ph©n gi¶i protein (HP/ml) cña 1 ml dung dÞch enzyme ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: HP/ml = (mmol tyrosine x a x b)/t a: Toµn bé thÓ tÝch hçn hîp sau ph¶n øng (4 ml) b: TÝnh trªn 1 ml enzyme x¸c ®Þnh (nh©n víi 10 nÕu l­îng enzyme x¸c ®Þnh lµ 100 ml) t: Thêi gian ñ enzyme víi c¬ chÊt (20 phót) 2.3.6 §iÖn di PA trªn gel polyacryamide theo ph­¬ng ph¸p cña Heussen vµ Dowdle [26] C¸c b­íc thùc hiÖn kü thuËt ®iÖn di ph¸t hiÖn proteinase trªn gel polyacrylamide cã SDS nh­ sau: * ChuÈn bÞ dung dÞch a. Dung dÞch acryamide 30%: C©n 29,2 g acrylamide, 0,8 g bisacrylamide hßa tan thµnh 100 ml b»ng n­íc cÊt 2 lÇn. Dung dÞch ®Öm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 C©n 18,15g Tris, pha trong 50 ml n­íc cÊt, ®iÒu chØnh b»ng HCl 2N ®Õn pH 8,8 sau ®ã thªm n­íc cÊt ®Õn 100 ml. Dung dÞch ®Öm Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 C©n 3 g Tris, pha trong 40 ml n­íc cÊt, ®iÒu chØnh b»ng HCl 2N ®Õn pH 6,8 sau ®ã thªm n­íc cÊt ®Õn 50ml §Öm mÉu Gåm 2,5ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml glycerol, 2 mg bromophenol xanh vµ 1,5 ml n­íc cÊt. * §æ gel a. Gel t¸ch 12,5 % 2,31 ml acrylamide 30% 0,55 ml casein 1% 0,85 ML ®Öm Tris-HCl pH 8,8 55 mL SDS 10% 1,76 ml H20 27,5 ml pesunphate amon 2,5 ml TEMED Gel c« 5% 0,3 ml acryamide 30% 0,5 ml Tris-HCl pH 6,8 1,2 ml H2O 10 ml SDS 10% 10 ml Amonium persulfate 4 ml TEMED * TiÕn hµnh ®iÖn di L­îng mÉu ®¹t ~40 mg protein trªn mçi giÕng. §iÖn di theo chiÒu tõ ©m sang d­¬ng víi dßng ®iÖn 8mA/1 giÕng Sau khi ®iÖn di, lo¹i bá SDS b»ng Triton X-100 2,5% ®Ó. Röa s¹ch b»ng n­íc cÊt. Sau ®ã ñ trong ®Öm Sorensen pH 7,6 cã hoÆc kh«ng cã chÊt øc chÕ trong 4 giê ë 37oC. Nhuém gel b»ng dung dÞch Amido Black 10B hoÆc Coomassie Brilliant Blue. C¸c b¨ng proteinase lµ c¸c b¨ng tr¾ng kh«ng b¾t mµu thuèc nhuém. 2.3.7 S¾c ký cét silicagel S¾c ký cét ®­îc sö dông ®Ó t¸ch c¸c hîp chÊt h÷u c¬ dùa trªn nguyªn t¾c t­¬ng tù nh­ s¾c ký líp máng, chÊt hÊp phô th­êng ®­îc sö dông lµ silicagel hoÆc alumina. Dung dÞch c¸c chÊt h÷u c¬ ®­îc ®­a lªn cét vµ röa chiÕt (eluent) b»ng mét dung m«i h÷u hoÆc hÖ dung m«i thÝch hîp. C¸c ph©n tö cã tÝnh ph©n cùc kh¸c nhau sÏ di chuyÓn víi tèc ®é kh¸c nhau qua cét. C¸c ph©n ®o¹n khi ®ã ®­îc thu l¹i vµ kiÓm tra kh¶ n¨ng ph©n t¸ch trªn b¶n máng. Chóng t«i sö dông silicagel pha th­êng cã kÝch th­íc h¹t lµ 0,040-0,063 mm lµm chÊt hÊp phô vµ röa chiÕt b»ng hÖ dung m«i chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4) vµ chloroform : ethylacetate (5:3). C¸c ph©n ®o¹n ®­îc kiÓm tra trªn b¶n máng víi hÖ dung m«i chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4). 2.3.8 Quang phæ hÊp thô tö ngo¹i [8, trÝch theo tµi liÖu 10] C¸c ph©n ®o¹n s¾c ký ®­îc hoµ tan trong cån tuyÖt ®èi vµ x¸c ®Þnh phæ tö ngo¹i trªn m¸y quang phæ HeλIOS α Spectronic Unicam. C¸c nhãm flavonoid kh¸c nhau sÏ cã phæ hÊp thô tö ngo¹i ®Æc tr­ng kh¸c nhau trong hai d¶i hÊp thô cña c¸c hîp chÊt flavonoid. Ch­¬ng 3 KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn 3.1 Hµm l­îng polyphenol tæng sè vµ ho¹t tÝnh øc chÕ proteinase ë mét sè c©y thuèc 3.1.1 §iÒu tra s¬ bé PIA c¸c mÉu nghiªn cøu §Ó th¨m dß s¬ bé kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase (PIA) cña c¸c mÉu nghiªn cøu chóng t«i sö dông ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n lµ ph­¬ng ph¸p t­¬ng ®èi nhanh vµ nh¹y. KÕt qu¶ ®iÒu tra kh¶ n¨ng øc chÕ 3 lo¹i proteinase serine lµ trypsin, chymotrypsin vµ proteinase t¸ch tõ vi khuÈn P. aeruginosa (PsA) ®­îc chØ ra ë h×nh 3.1 vµ b¶ng 3.1. C¸c mÉu cã PIA cao sÏ ®­îc sö dông cho c¸c nghiªn cøu tiÕp theo. 12 4 3 18 11 (b) (a) 1 7 8 16 15 (c) H×nh 3.1a. Kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase cña mét sè mÉu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E (Enzyme)+H2O; 4-6: E+c©y Muèi; 7-9: E+S¾n thuyÒn; 10-12: E+Tr©m bÇu; 13-15: E+Vá th©n T« méc; 16-18: E+Gç T« méc 4 3 12 6 7 10 9 1 (b) (a) H×nh 3.1b. Kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase cña mét sè mÉu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E +H2O; 4-6: E+Vá h¹t T« méc chÝn; 7-9: E+§¬n t­íng qu©n; 10-12: E+§¹i hoµng (c) B¶ng 3.1. §iÒu tra s¬ bé PIA (b»ng ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n) STT Mẫu Bộ phận sö dông TIA KIA PsIA 1 Muçng truæng Zanthoxylum avicennae (Lamk.) Hä Cam (Rutaceae) Rễ +++ +++ ++ 2 DÇu giun Chenopodium ambrosioides L. Hä Rau muèi (Chenopodiaceae) L¸ - - - 3 TÕ t©n Asarum sieboldii Miq. Hä Méc th«ng (Aristolochiaceae) L¸ - - - 4 Tr©m bầu Combretum quadrangulare Kurz. Hä Tr©m bÇu (Combretaceae) L¸ +++++ +++++ +++++ 5 Khoai n­a Amorphophallus rivieri Dur. Hä R¸y (Araceae) L¸ - - - 6 C©y hoa phÊn Mirabilis jalapa L. Hä Hoa giÊy (Nyctaginaceae) L¸ - - - 7 Xoan Melia azedarach Hä Xoan (Meliaceae) Vỏ th©n ++ +++ ++ 8 Sử qu©n tử Quisqualis indica L.Hä Bµng (Combretaceae) Vỏ th©n +++ ++ + 9 C©y muối Bischofia Javanica) Hä ThÇu dÇu (Euphorbiaceae) Vỏ th©n ++ ++ - 10 Lộc mại Mercuriadis indica Lour. Hä ThÇu dÇu (Euphorbiaceae) L¸ + + + 11 Sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep. Hä Sim (Myrtaceae) L¸ +++++ +++++ +++++ Cành +++ +++ +++ 12 Đơn tướng qu©n Syzygium formosum var. Hä Sim (Myrtaceae) L¸ ++++ +++ ++++ 13 Đại hoàng (sapa) Rheum sp. Họ Rau r¨m (Polygonaceae) Củ ++++ ++++ ++++ 14 Đậu cọc rào Cajanus indicus Spreng. Hä §Ëu (Fabaceae) Vá qu¶ - - - L¸ +++ +++ ++ 15 Xoài Mangifera indica L. Hä §µo lén hét (Anacadiaceae) Vỏ th©n +++ +++ ++ 16 C©y gỗ Vang (T« méc) Caesalpinia sappan L. Hä Vang (Caesalpiniaceae) Gỗ ++++ +++++ +++ Vá th©n ++++ +++++ +++++ Vá h¹t xanh +++ +++ ++ Vá h¹t chÝn +++++ +++++ +++++ 17 C©y me Tamarindus indica L. Hä Vang (Caesalpiniaceae) Vá th©n + + - 18 §¹i Plumeria rubra Hä Tróc ®µo (Apocynaceae) L¸ +++ - - 19 H¹ kh« th¶o Brunella vulgaris L. Hä B¹c hµ (Lamiaceae) L¸ ++ +++ ++ Hoa ++ +++ +++ 20 Ng­u bµng Artium lappa L. Hä Cóc (Asteraceae) RÔ + ++ + Ghi chó: + : øc chÕ < 25% ; + + : øc chÕ tõ 25% ®Õn 50%; + + + : øc chÕ tõ 50% ®Õn 75% ; + + + + : øc chÕ >75%; + + + + + : øc chÕ 100% KÕt qu¶ ®iÒu tra 26 mÉu cña 20 c©y thuèc th­êng ®­îc sö dông ch÷a c¸c bÖnh viªm nhiÔm, môn nhät, mÈn ngøa thuéc 17 hä thùc vËt kh¸c nhau cho thÊy cã 21 mÉu cña 16 c©y cã ho¹t tÝnh øc chÕ proteinase, chiÕm 80% nh÷ng c©y ®iÒu tra. TØ lÖ trªn cho thÊy cã thÓ cã mèi quan hÖ gi÷a kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase cña dÞch chiÕt c¸c c©y thuèc víi kh¶ n¨ng ch÷a bÖnh cña chóng. C¸c mÉu cã PIA cao tiÕp tôc ®­îc x¸c ®Þnh PIA theo ph­¬ng ph¸p Anson c¶i tiÕn, kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.2. B¶ng 3.2. Ho¹t ®é øc chÕ proteinase cña dÞch chiÕt n­íc (x¸c ®Þnh theo ph­¬ng ph¸p Anson c¶i tiÕn) STT MÉu % chÊt kh« TIA ChIA PsIA mIU/g t­¬i mIU/g kh« mIU/g t­¬i mIU/g kh« mIU/g t­¬i mIU/g kh« 1 Tr©m bÇu 44,6 7.651 17.155 11.960 26.816 1.789 4.011 2 C©y xoan 43,1 1.375 3.190 2.763 6.411 260 603 3 Sö qu©n tö 42,5 263 619 1.154 2.715 184 433 4 Léc m¹i 20,5 222 1.083 171 834 179 873 5 S¾n thuyÒn 31,7 11.631 36.691 33.332 105.148 8.195 25.852 6 §¬n t­íng qu©n 33,3 2.465 7.402 3.694 11.093 1.518 4.559 7 §¹i hoµng 29,7 759 2.556 2.021 6.805 274 923 8 §Ëu cäc rµo 27,6 632 2.290 805 2.917 372 1.348 9 C©y xoµi 34,7 287 827 1.033 2.977 63 182 10 Th©n gç t« méc 57,2 14 24 29 51 22 38 11 Vá th©n t« méc 47,8 7 15 19 40 13 27 12 Vá h¹t t« méc chÝn 79,1 2.861 3.617 11.454 14.480 5.183 6.552 13 Vá h¹t t« méc xanh 33,6 255 759 3.463 10.307 1.271 3783 Tõ b¶ng 3.2 cã thÓ thÊy c¸c dÞch chiÕt ®Òu cã kh¶ n¨ng øc chÕ chymotrypsin (ChIA) tèt h¬n kh¶ n¨ng øc chÕ trypsin (TIA), kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase t¸ch tõ P. aeruginosa (PsIA) lµ kÐm nhÊt. Kh¶ n¨ng øc chÕ PsA kÐm cã thÓ do proteinase t¸ch tõ dÞch nu«i cÊy P. aeruginosa cßn cã mét sè lo¹i proteinase kh¸c, c¸c dÞch chiÕt nghiªn cøu chØ cã thÓ øc chÕ mét lo¹i proteinase nµo ®ã (cã thÓ lµ c¸c proteinase serine) hoÆc còng cã thÓ do trong dÞch nu«i cÊy cßn cã c¸c chÊt kh¸c ¶nh h­ëng tíi ho¹t tÝnh cña c¸c chÊt øc chÕ. B¶ng 3.2 còng cho thÊy cã sù kh¸c nhau rÊt lín vÒ ho¹t ®é øc chÕ proteinase cña c¸c mÉu. Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hµm l­îng polyphenol cña 13 mÉu nµy vµ nhËn thÊy c¸c mÉu cã hµm l­îng polyphenol cao th­êng cã PIA cao nh­: c¸c mÉu Tr©m bÇu, S¾n thuyÒn, tuy nhiªn còng cã mÉu cã hµm l­îng polyphenol thÊp nh­ng còng cã PIA cao nh­ vá h¹t T« méc chÝn (b¶ng 3.3). B¶ng 3.3. Hµm l­îng polyphenol dÞch chiÕt n­íc vµ ho¹t ®é riªng (mIU/mg polyphenol) STT MÉu Hµm l­îng polyphenol (mg/g t­¬i) TIA (mIU/mg polyphenol) ChIA (mIU/mg polyphenol) PsIA (mIU/mg polyphenol) 1 Tr©m bÇu 20,1 380,6 5950.0 89,0 2 C©y Xoan 3,3 416,7 837,3 78,8 3 Sö qu©n tö 5,5 47,8 209,8 33,5 4 Léc m¹i 5,7 38,9 30,0 31,4 5 S¾n thuyÒn 12,3 945,6 2709,9 666,3 6 §¬n t­íng qu©n 8,2 300,6 450,5 185,1 7 §¹i hoµng 8,7 87,2 23,2 11,8 8 §Ëu cäc rµo 3,9 162,0 206,4 95,4 9 C©y Xoµi 1,9 151,1 543,7 33,2 10 Gç T« méc 5,5 2,6 5,3 4,0 11 Vá th©n T« méc 7,5 0,9 2,5 1,7 12 Vá h¹t T« méc chÝn 2,1 1362,4 5454,3 2468,1 13 Vá h¹t T« méc xanh 1,4 182,1 2473,6 907,9 B¶ng 3.3 còng cho thÊy sù kh¸c biÖt rÊt lín gi÷a c¸c mÉu T« méc, c¸c mÉu gç vµ vá th©n cã hµm l­îng polyphenol cao h¬n c¸c mÉu vá h¹t kho¶ng 2 ®Õn 5 lÇn nh­ng ho¹t ®é riªng (mIU/mg polyphenol) l¹i thÊp h¬n rÊt nhiÒu. Do ®ã cã thÓ thÊy cã sù kh¸c nhau vÒ thµnh phÇn polyphenol cña c¸c mÉu T« méc. 3.1.2 Hµm l­îng polyphenol tæng sè vµ flavonoid trong dÞch chiÕt ethanol Ethanol ®­îc sö dông ®Ó chiÕt rót polyphenol tæng sè v× lµ mét dung m«i ph©n cùc tèt, cã kh¶ n¨ng chiÕt rót tèt c¸c hîp chÊt tù nhiªn, h¬n n÷a, ë nång ®é cao cã thÓ lo¹i bá mét sè t¹p chÊt vµ c¸c chÊt øc chÕ cã b¶n chÊt lµ protein (cã thÓ cã). Qu¸ tr×nh chiÕt rót ®­îc thùc hiÖn theo quy tr×nh ®· m« t¶ trong ch­¬ng 2, dÞch chiÕt nµy ®­îc gäi lµ dÞch chiÕt polyphenol tæng sè. Tõ c¸c dÞch chiÕt polyphenol tæng sè, flavonoid toµn phÇn ®­îc t¸ch ra theo s¬ ®å h×nh 2.1, c¸c dÞch chiÕt sau ®ã ®­îc ®Þnh l­îng polyphenol vµ x¸c ®Þnh PIA. B¶ng 3.4. Hµm l­îng polyphenol tæng sè vµ flavonoid toµn phÇn STT MÉu Hµm l­îng (mg/g bét kh«) Hµm l­îng (mg/g t­¬i) Polyphenol Flavonoid Polyphenol Flavonoid 1 S¾n thuyÒn 46,13 6,52 15,91 2,25 2 §¬n t­íng qu©n 62,41 16,11 21,51 5,55 3 §¹i hoµng 53,57 20,21 5,58 5,58 4 §Ëu cäc rµo 13,43 1,78 3,71 0,49 5 C©y Xoµi 14,35 5,18 4,98 1,8 6 Gç T« méc 59,00 44,49 33,75 25,45 7 Vá th©n T« méc 96,84 25,27 46,25 12,07 8 Vá h¹t T« méc chÝn 51,93 1,55 41,08 1,23 9 Vá h¹t T« méc xanh 21,39 1,99 7,19 0,67 B¶ng 3.4 cho thÊy khi chiÕt b»ng ethanol 96%, l­îng polyphenol tæng sè thu ®­îc cao h¬n khi chiÕt b»ng n­íc, mÉu vá th©n T« méc cã hµm l­îng polyphenol tæng sè cao nhÊt (96,84 mg/g bét kh«). Flavonoid Polyphenol tæng sè mg/g bét kh« H×nh 3.2. Hµm l­îng polyphenol cña dÞch chiÕt n­íc vµ dÞch chiÕt EtOH cña c¸c mÉu Tõ h×nh 3.2 cã thÓ thÊy kh¶ n¨ng chiÕt rót cña ethanol tèt h¬n n­íc nhiÒu lÇn, ®Æc biÖt lµ c¸c mÉu t« méc, kh¶ n¨ng chiÕt rót t¨ng lªn tõ 5 ®Õn 20 lÇn. Hµm l­îng flavonoid toµn phÇn trong c¸c mÉu chiÕm tØ lÖ t­¬ng ®èi thÊp tõ kho¶ng 3% (vá h¹t T« méc chÝn) tíi gÇn 40% (§¹i hoµng). Riªng mÉu th©n gç T« méc tØ lÖ nµy vµo kho¶ng 75%, cao nhÊt trong c¸c mÉu ®iÒu tra. 3.1.3 Ho¹t ®é øc chÕ proteinase cña dÞch chiÕt polyphenol tæng sè vµ flavonoid B¶ng 3.5. Ho¹t ®é øc chÕ proteinase dÞch chiÕt polyphenol tæng sè STT MÉu TIA (mIU/g bét kh«) ChIA (mIU/g bét kh«) PsIA (mIU/g bét kh«) 1 S¾n thuyÒn 25.553 73.544 28.923 2 §¬n t­íng qu©n 12.528 37.707 10.053 3 §¹i hoµng 416 1.388 454 4 §Ëu cäc rµo 4.056 11.957 4.615 5 C©y xoµi 3.763 11.549 2.099 6 Gç T« méc 1.976 16.729 4.925 7 Vá th©n T« méc 13.264 44.311 17.320 8 Vá h¹t T« méc chÝn 74.016 530.681 99.025 9 Vá h¹t T« méc xanh 18.733 126.556 25.416 Còng gièng nh­ dÞch chiÕt n­íc, kh¶ n¨ng øc chÕ c¸c proteinase cña polyphenol tæng sè gi¶m dÇn theo thø tù chymotrypsin, trypsin, PsA, trong ®ã dÞch chiÕt polyphenol tæng sè mÉu vá h¹t T« méc chÝn øc chÕ m¹nh nhÊt c¶ ba lo¹i enzyme, còng lµ mÉu cã hµm l­îng polyphenol thuéc nhãm cao trong c¸c mÉu nghiªn cøu. PIA tÝnh trªn 1 gam bét mÉu kh« cña dÞch chiÕt polyphenol tæng sè c¸c mÉu còng cao h¬n nhiÒu so víi dÞch chiÕt n­íc ®Æc biÖt lµ c¸c mÉu T« méc. Tuy nhiªn c¸c mÉu S¾n thuyÒn vµ §¹i hoµng l¹i cã PIA thÊp h¬n, ph¶i ch¨ng polyphenol hai mÉu nµy kh«ng ph¶i lµ thµnh phÇn ®ãng gãp chÝnh vµo ho¹t ®é øc chÕ proteinase. Nghiªn cøu ë ViÖt Nam ®· tinh s¹ch ®­îc acid asiatic tõ c©y S¾n thuyÒn vµ cho thÊy acid asiatic cã thÓ øc chÕ nhiÒu enzyme kh¸c nhau cña vi khuÈn Steptococcus mutans [7]. Acid asiatic lµ mét triterpene ®· ®­îc sö dông trong nhiÒu lo¹i thuèc ®iÒu trÞ c¸c bÖnh da vµ ®­îc cho lµ cã vai trß trong viÖc h×nh thµnh collagen, mét sè dÉn xuÊt triterpene còng ®­îc cho lµ cã kh¶ n¨ng øc chÕ proteinse serine (trypsin, chymotrypsin), proteinase kim lo¹i (collagenase) [28]. Do vËy acid asiatic cã thÓ gi÷ vai trß nµo ®ã ®èi víi ho¹t ®é øc chÕ proteinase cña dÞch chiÕt S¾n thuyÒn. Flavonoid toµn phÇn c¸c mÉu ®Òu cã PIA nh­ng yÕu h¬n dÞch chiÕt polyphenol tæng sè nhiÒu lÇn (trõ mÉu §¹i hoµng, ph©n ®o¹n flavonoid cã kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase tèt h¬n dÞch chiÕt tæng sè cña mÉu nµy). B¶ng 3.3 cho thÊy trong 4 mÉu cña c©y T« méc, mÉu vá th©n cã hµm l­îng polyphenol tæng sè trong dÞch chiÕt ethanol cao nhÊt sau ®ã ®Õn gç, vá h¹t giµ cuèi cïng lµ vá h¹t xanh. Tuy vËy, b¶ng 3.5 l¹i cho thÊy mÉu vá h¹t giµ l¹i cã kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase cao nhÊt råi ®Õn h¹t non, vá th©n, gç. Do ®ã cã thÓ thÊy PIA c¸c mÉu nµy phô thuéc vµo thµnh phÇn c¸c polyphenol h¬n lµ hµm l­îng polyphenol tæng sè. H×nh 3.3 còng cho thÊy sù kh¸c biÖt rÊt râ vÒ ho¹t ®é riªng tÝnh trªn mg polyphenol. H×nh 3.3 cho thÊy sù kh¸c nhau rÊt lín vÒ ho¹t ®é riªng (mIU/mg polyphenol) cña c¸c mÉu T« méc, ho¹t ®é riªng mÉu vá h¹t chÝn rÊt cao trong khi ho¹t ®é riªng mÉu gç l¹i thÊp nhÊt trong c¸c mÉu. Cã thÓ ®©y lµ mét c¬ chÕ chèng l¹i c¸c yÕu tè g©y h¹i nh­ s©u bä, ®éng vËt ¨n h¹t. Nghiªn cøu míi ®©y ®· ph¸t hiÖn ra trong nh©n h¹t T« méc chÝn cã Ýt nhÊt 7 b¨ng protein cã kh¶ n¨ng øc chÕ trypsin, chymotrypsin vµ proteinase cña P. aeruginosa b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel polyacrylamide, tuy nhiªn kh«ng ph¸p hiÖn ra b¨ng protein cã PIA nµo ë dÞch chiÕt vá h¹t trong khi PIA vá h¹t cao h¬n PIA nh©n h¹t. Do ®ã c¸c t¸c gi¶ cho r»ng PIA vá h¹t chñ yÕu lµ do c¸c chÊt ph©n tö thÊp, kh«ng ph¶i protein [6]. Khi so s¸nh ho¹t ®é riªng tÝnh theo polyphenol tæng sè (mIU/mg polyphenol) vµ ®é riªng tÝnh theo protein (mIU/ mg protein) theo c«ng tr×nh nghiªn cøu trªn cña c¸c mÉu nµy chóng t«i nhËn thÊy ho¹t ®é riªng tÝnh theo polyphenol tæng sè lín h¬n nhiÒu, cã thÓ thÊy kÕt qu¶ nµy ®· chøng minh cho nhËn ®Þnh trªn. mIU/mg polyphenol TIA mIU/mg polyphenol ChIA mIU/mg polyphenol PsIA H×nh 3.3. BiÓu ®å so s¸nh ho¹t ®é riªng PIA (mIU/mg polyphenol) cña dÞch chiÕt polyphenol tæng sè (ts) vµ flavonoid c¸c mÉu nghiªn cøu 3.2 §Þnh tÝnh c¸c thµnh phÇn polyphenol vµ flavonoid trong mét sè c©y thuèc trªn b¶n máng Sau khi x¸c ®Þnh hµm l­îng polyphenol tæng sè vµ flavonoid toµn phÇn, chóng t«i tiÕn hµnh s¾c ký ®Þnh tÝnh c¸c thµnh phÇn nµy trªn b¶n máng silicagel mét sè c©y thuèc cã PIA cao víi c¸c hÖ dung m«i kh¸c nhau nh­: Chloroform:Methanol (9:1); TEAF (5:2:1:1); TEAF (5:2:2:1). KÕt qu¶ cho thÊy hÖ dung m«i TEAF (5:2:2:1) cã kh¶ n¨ng ph©n t¸ch râ nhÊt. Sau ®ã b¶n máng ®­îc sÊy kh« vµ nhuém mµu b»ng H2SO4 10% vµ sÊy ë 1100C trong 10 phót hoÆc h¬i NH3 b·o hßa. 3.2.1 S¾c ký dÞch chiÕt flavonoid c¸c mÉu nghiªn cøu KÕt qu¶ cho thÊy thµnh phÇn flavonoid trong c¸c c©y thuèc rÊt ®a d¹ng, kh¸c nhau ë tõng lo¹i c©y thuèc còng nh­ c¸c bé phËn cña mét c©y. H×nh 3.4. S¾c ký ®å dÞch chiÕt flavonoid toµn phÇn mét sè mÉu (hÖ dung m«i TEAF (5:2:2:1), nhuém H2SO4 10%) Gç Vang 6. §¬n t­íng qu©n Vá th©n gç Vang 7. §¹i hoµng Vá h¹t Vang giµ 8. §Ëu cäc rµo Vá h¹t Vang non 9. Xoµi S¾n thuyÒn 3.2.2 S¾c ký c¸c thµnh phÇn polyphenol mÉu T« méc trªn b¶n máng Tõ c¸c thÝ nghiÖm trªn, chóng t«i nhËn thÊy c¸c bé phËn mÉu T« méc cã sù kh¸c nhau rÊt lín vÒ PIA, hµm l­îng polyphenol tæng sè vµ flavonoid, h×nh 3.4 còng cho thÊy c¸c thµnh phÇn polyphenol rÊt kh¸c nhau, v× vËy ®· tËp trung nghiªn cøu c¸c mÉu nµy. C¸c dÞch chiÕt qua c¸c giai ®o¹n t¸ch chiÕt cña c¸c mÉu T« méc tiÕp tôc ®­îc s¾c ký trªn b¶n máng vµ ®­îc nhuém b»ng h¬n amoniac b·o hßa, kÕt qu¶ chØ ra ë h×nh 3.5. H×nh 3.5. S¾c ký ®å c¸c thµnh phÇn polyphenol trong c©y t« méc víi hÖ dung m«i TEAF (5:2:2:1) (nhuém h¬i Amoniac b·o hoµ) 1. Acid gallic 2. DC EtOH gç Vang 3. Flavonoid gç Vang 4. CÆn kh«ng tan gç Vang 5. DC EtOH vá th©n 6. Flavonoid vá th©n 7. CÆn kh«ng tan vá th©n 8. DC EtOH vá h¹t chÝn 9. Flavonoid vá h¹t chÝn 10. CÆn kh«ng tan vá h¹t chÝn 11. DC EtOH vá h¹t xanh 12. Flavonoid vá h¹t xanh 13. CÆn kh«ng tan vá h¹t xanh §Ó so s¸nh thµnh phÇn polyphenol cña c¸c mÉu nghiªn cøu, ®· tiÕn hµnh s¾c ký dÞch chiÕt c¸c mÉu trªn b¶n máng silicagel (l­îng polyphenol chÊm trªn b¶ng s¾c ký gièng nhau). H×nh 3.5 cho thÊy s¾c ký ®å polyphenol tæng sè vµ flavonoid cña gç T« méc t­¬ng tù nhau vµ cã nhiÒu b¨ng nhÊt (vÞ trÝ thø 2 vµ 3 trªn s¾c ký ®å), kho¶ng 11 b¨ng; polyphenol hay flavonoid vá th©n cã Ýt nhÊt lµ 7 b¨ng, c¸c b¨ng chÝnh t­¬ng øng víi c¸c b¨ng di ®éng chËm cña mÉu gç. S¾c ký ®å flavonoid cña vá h¹t chÝn vµ vá h¹t xanh kh¸ gièng nhau, ®Òu cã 4 b¨ng chÝnh, b¨ng ®Ëm nhÊt cã mµu s¾c vµ ®é di ®éng t­¬ng øng víi acid gallic chuÈn (b¨ng nµy kh«ng râ l¾m ë mÉu gç). KÕt qu¶ trªn chøng tá polyphenol còng nh­ flavonoid trong phÇn gç T« méc lµ ®a d¹ng nhÊt, vµ cã thµnh phÇn flavonoid kh¸c nhiÒu so víi vá h¹t. PhÇn gç c©y T« méc ®· ®­îc sö dông lµm d­îc liÖu ë ViÖt Nam vµ nhiÒu n­íc kh¸c, cã thÓ sù phong phó vÒ thµnh phÇn flavonoid gãp phÇn chÝnh t¹o nªn t¸c dông d­îc lÝ cña c©y T« méc. Khi x¸c ®Þnh PIA c¸c dÞch chiÕt polyphenol tæng sè vµ flavonoid, chóng t«i nhËn thÊy PIA cña flavonoid c¸c mÉu ®Òu thÊp h¬n dÞch chiÕt polyphenol tæng sè nhiÒu lÇn nªn c¸c chÊt cã thÓ PIA n»m l¹i ë phÇn kh«ng tan cña dÞch chiÕt polyphenol tæng sè nªn ®· tiÕn hµnh hßa tan phÇn cÆn nµy trong ethanol, s¾c ký b¶n máng vµ nhËn thÊy phÇn lín c¸c chÊt nµy kh«ng di chuyÓn trªn b¶n s¾c ký. Ph¶i ch¨ng ®©y lµ c¸c chÊt polymer ho¸ cña c¸c hîp chÊt phenolic vµ cã khèi l­îng ph©n tö lín nh­ c¸c hîp chÊt tannin. 3.3 Th¨m dß PIA cña c¸c b¨ng polyphenol sau khi s¾c ký b¶n máng C¸c mÉu §¹i hoµng, gç T« méc, vá th©n T« méc, vá h¹t T« méc xanh, vá h¹t T« méc chÝn ®­îc sö dông trong thÝ nghiÖm nµy. Sau khi s¾c ký, c¾t mét d¶i b¶n máng, nhuém ®Ó x¸c ®Þnh vÞ trÝ c¸c b¨ng, tõ c¸c b¨ng nµy dãng hµng ®Ó c¾t riªng c¸c b¨ng/vïng b¨ng, t¸ch röa polyphenol tõ mçi b¨ng b»ng dung dÞch ethanol, ly t©m lo¹i bá silicagel, thu dÞch trong, cho bay h¬i dung m«i, hoµ tan cÆn trong dung dÞch ®Öm, x¸c ®Þnh PIA. KÕt qu¶ cho thÊy, trong c¸c mÉu nghiªn cøu, PIA tËp trung ë c¸c b¨ng cã ®é di ®éng thÊp, ®Æc biÖt lµ vïng kh«ng di ®éng trªn b¶n máng. 3.3.1 PIA c¸c b¨ng flavonoid mÉu §¹i hoµng ChIA PPsIA TIA 4 1 3 7 11 8 15 12 16 1 2 4 5 6 3 §C H×nh 3.6. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid khi s¾c ký trªn b¶n máng silicagel cña mÉu §¹i hoµng C¸c b¨ng ®­îc ®¸nh sè theo thø tù tõ vÕt chÊm mÉu 1 , 2, 3... §C: ®èi chøng 1,2: E+n­íc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16 E+6 MÉu ®¹i hoµng cã hai b¨ng øc chÕ chÝnh lµ b¨ng 1 vµ 4, trong ®ã b¨ng 1 øc chÕ tèt h¬n. C¸c tµi liÖu cho thÊy trong §¹i hoµng cã chrysophanol, emodin lµ c¸c H×nh 3.7a. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid khi s¾c ký trªn b¶n máng silicagel cña gç C¸c b¨ng ®­îc ®¸nh sè theo thø tù tõ vÕt chÊm mÉu (1) , 2, 3 …DC: ®èi chøng 1,2: E+n­íc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5 dÉn xuÊt cña, ®· cã nh÷ng nghiªn cøu cho thÊy c¸c dÉn H×nh 3.7a. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid khi s¾c ký trªn b¶n máng silicagel cña gç, vá th©n. C¸c b¨ng ®­îc ®¸nh sè theo thø tù tõ vÕt chÊm mÉu (1) , 2, 3 …DC: ®èi chøng 1,2: E+n­íc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5, ë vá th©n cã thªm b¨ng 6, giÕng 15, 16: E +6 xuÊt anthroquinone cã kh¶ n¨ng øc chÕ nhiÒu lo¹i protease [35, 56]. V× vËy chóng t«i kh«ng ®i s©u nghiªn cøu vµo §¹i hoµng. 3.3.2 PIA c¸c b¨ng flavonoid mÉu T« méc TIA 4 1 3 7 11 8 15 12 16 1 2 3 4 5 §C STT Băng/ vùng băng mg polyphenol 1,68 2,99 3,55 0,49 0,73 ChIA PPsIA Gỗ TIA 1 2 3 5 6 §C 4 8,07 1,65 2,04 0,05 0,03 0,06 STT Băng/ vùng băng mg polyphenol ChIA PPsIA Vỏ thân H×nh 3.7a. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid khi s¾c ký trªn b¶n máng silicagel mÉu gç T« méc, vá th©n T« méc C¸c b¨ng ®­îc ®¸nh sè theo thø tù tõ vÕt chÊm mÉu: 1 , 2, 3... §C: ®èi chøng 1,2: E+n­íc; 3,4: E+§C; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; MÉu vá th©n cã thªm b¨ng 6: 15,16: E+6 H×nh 3.7b. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid khi s¾c ký trªn b¶n máng silicagel vá h¹t chÝn C¸c b¨ng ®­îc ®¸nh sè theo thø tù tõ vÕt chÊm mÉu: 1 , 2, 3... DC: ®èi chøng 1,2: E+n­íc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16: E+6 15, 16: E +6 4 1 3 7 11 8 15 12 16 TIA ChIA PPsIA H×nh 3.7b. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid khi s¾c ký trªn b¶n máng silicagel vá h¹t chÝn C¸c b¨ng ®­îc ®¸nh sè theo thø tù tõ vÕt chÊm mÉu: 1 , 2, 3... DC: ®èi chøng 1,2: E+n­íc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16: E+6 15, 16: E +6 STT Băng/ vùng băng 1 2 3 4 5 6 mg polyphenol DC 0,09 0,13 0,03 0,31 0,51 2,84 Vỏ hạt chín KÕt qu¶ cho thÊy c¶ 4 b¨ng/vïng b¨ng cña mÉu gç (1, 2, 3, 4) Ýt nhiÒu ®Òu cã TIA, ChIA, PsIA, trong ®ã vïng b¨ng 2 cã ho¹t ®é m¹nh nhÊt. MÉu vá th©n: chØ cã b¨ng/vïng b¨ng 1 vµ vïng b¨ng (2+3) t­¬ng øng víi vïng b¨ng 2 cña gç cã TIA, ChIA, PsIA; ®èi víi vá h¹t chØ cã vïng b¨ng 1 cã c¸c ho¹t tÝnh trªn. Sù sai kh¸c nµy còng cã thÓ do sai kh¸c vÒ l­îng polyphenol trong mçi b¨ng nh­ng còng cã thÓ do sai kh¸c vÒ thµnh phÇn cã PIA cña mçi mÉu. Qua c¸c thÝ nhiÖm víi c¸c mÉu c©y gç Vang, PIA cña c¸c mÉu nghiªn cøu tËp trung chñ yÕu ë vÞ trÝ kh«ng di ®éng trªn b¶n s¾c ký, do vËy cã thÓ cã kh¶ n¨ng vïng nµy lµ c¸c hîp chÊt tannin. 3.4 Hµm l­îng tannin cña c¸c mÉu T« méc Tannin cã thÓ kÕt tña kh«ng ®Æc hiÖu víi protein, lµm bÊt ho¹t nhiÒu enzyme. V× vËy ®· tiÕn hµnh ®Þnh l­îng tannin trong c¸c bé phËn cña c©y T« méc b»ng ph­¬ng ph¸p kÕt tña tannin cïng víi gelatin theo ph­¬ng ph¸p c¶i tiÕn míi ®­îc c«ng bè n¨m 2009 [59]. Hµm l­îng tannin ®­îc tÝnh b»ng hiÖu sè hµm l­îng polyphenol tr­íc vµ sau khi kÕt tña víi gelatin. B¶ng 3.6. Hµm l­îng tannin c¸c bé phËn c©y gç Vang MÉu Tannin (mg/g chÊt kh«) % tannin so víi polyphenol tæng sè Gç 9,0 15,5 Vá th©n 19,3 19,9 Vá h¹t chÝn 13,8 26,6 Vá h¹t xanh 2,5 11,8 MÉu vá th©n cã hµm l­îng tannin cao nhÊt: 19,3 mg/g chÊt kh«, kho¶ng 19,9 % l­îng polyphenol tæng sè cã trong vá th©n. Tannin cã trong vá h¹t giµ lµ 13,8 mg/g chÊt kh«, 26,6% l­îng polyphenol tæng sè, cao nhÊt trong c¸c mÉu. MÉu vá h¹t T« méc chÝn cã tØ lÖ tannin cao nhÊt, hµm l­îng flavonoid thÊp nhÊt, l¹i lµ cã PIA cao nhÊt, ph¶i ch¨ng tannin cã vai trß quan träng ®Õn ho¹t tÝnh øc chÕ proteinase vá h¹t chÝn. 3.5 Th¨m dß ho¹t ®é øc chÕ proteinase b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di Proteinase trªn gel polyacryamide Kh¶ n¨ng øc chÕ PsA kh«ng cao b»ng kh¶ n¨ng øc chÕ trypsin vµ chymotrypsin tinh s¹ch, do ®ã chóng t«i sö dông ph­¬ng ph¸p ®iÖn di PA trªn gel cã c¬ chÊt casein 1% ®Ó nghiªn cøu s©u h¬n c¸c proteinase vµ PIA. 3.5.1 Ho¹t ®é ph©n gi¶i proteinase cña P. aeruginosa vµ S. aureus Vi khuÈn P. aeruginosa vµ S. aureus lµ hai lo¹i vi khuÈn sinh proteinase ngo¹i bµo ®iÓn h×nh. Proteinase cña chóng rÊt ®a d¹ng vµ tham gia vµo nhiÒu qu¸ tr×nh bÖnh häc. V× vËy, ®· tiÕn hµnh ®iÖn di c¸c PA dÞch nu«i cÊy hai loµi trªn vµ nghiªn cøu kh¶ n¨ng øc chÕ cña dÞch chiÕt polyphenol tæng sè cña c¸c mÉu vá h¹t giµ vµ gç T« méc ®èi víi proteinase cña mçi loµi. Tr­íc khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm nµy, chóng t«i thu nhËn chÕ phÈm protease tõ dÞch m«i tr­êng nu«i cÊy b»ng c¸ch kÕt tña víi acetone ë nhiÖt ®é thÊp vµ x¸c ®Þnh ho¹t ®é ph©n gi¶i protein (PA) cña dÞch nu«i cÊy hai loµi vi khuÈn nµy. KÕt qu¶ cho thÊy ho¹t ®é proteinase cña P. aeruginosa lµ 1,27 HP/ml vµ cña S. aureus lµ 0,06 HP/ml; ho¹t ®é thñy ph©n cña S. aureus yÕu h¬n P. aeruginosa rÊt nhiÒu do ®ã ®· kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc kh¶ n¨ng øc chÕ ë c¸c thÝ nghiÖm trªn. V× vËy ®· nghiªn cøu t¸c dông øc chÕ proteinase cña S. aureus b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di. B­íc ®Çu t×m hiÓu c¸c lo¹i proteinase trong dÞch nu«i cÊy P. aeruginosa vµ S. aureus ®· tiÕn hµnh ñ b¶n gel ë c¸c pH kh¸c nhau: 4,5; 6,5 vµ 8, ®é s¸ng c¸c b¨ng PA kh«ng thay ®æi nhiÒu nh­ng cã xu h­íng s¸ng râ h¬n ë pH kiÒm. KÕt qu¶ nµy phï hîp víi ®Æc tÝnh sinh proteinase kiÒm cña hai loµi vi khuÈn nµy [52, 54]. (1) (2) H×nh 3.8. §iÖn di ®å PsA (1), StA (2) KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy proteinase cña hai loµi rÊt kh¸c nhau, PsA cã Ýt nhÊt 3 b¨ng vµ cã ®é di ®éng t­¬ng ®èi chËm (P1, P2, P3). StA còng cã ba b¨ng nh­ cã ®é di ®éng cao h¬n nhiÒu (P4, P5, P6). 3.5.2 Nghiªn cøu PIA b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di §Ó t×m hiÓu kh¶ n¨ng øc chÕ protease, chóng t«i tiÕn hµnh theo c¸c c¸ch kh¸c nhau: ñ enzyme víi dÞch nghiªn cøu 20 phót tr­íc khi ®iÖn di. Trén dÞch nghiªn cøu vµo b¶n gel cïng víi c¬ chÊt. Sau khi ®iÖn di PA, ñ b¶n gel trong ®Öm Sorrensen pH 7,6 cïng víi dÞch nghiªn cøu. KÕt hîp c¶ 3 c¸ch trªn. B¶n ®iÖn di sau ®ã ®­îc nhuém b»ng 2 thuèc nhuém lµ Amido Black 10B vµ Coomassie Brilliant Blue R250. (1) ( 2) H×nh 3.9. §iÖn di ®å PsA (1), StA (2) (trªn gel cã dÞch chiÕt vá h¹t T« méc chÝn víi nång ®é polyphenol lµ 0,4 mg/ml) B¶n gel kh«ng chøa mÉu nghiªn cøu B¶n gel cã chøa mÉu nghiªn cøu Nghiªn cøu cho thÊy khi nhuém b¶n gel víi Amido Black 10B cho kÕt qu¶ tèt h¬n, do ®ã c¸c b¨ng PA s¸ng râ, Ýt bÞ ¶nh h­ëng bëi mµu cña dÞch nghiªn cøu. Trong c¸c c¸ch trªn, khi trén dÞch nghiªn cøu trong b¶n gel cïng víi c¬ chÊt th× kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase râ rµng nhÊt. Khi kÕt hîp c¶ 3 c¸ch, b¶n gel b¾t mµu víi thuèc nhuém kh¸ ®Ëm, v× vËy c¸ch thø 2 lµ c¸ch tèt nhÊt cho thÝ nghiÖm nµy. C¸c mÉu nghiªn cøu ®Òu lµm gi¶m ho¹t ®é cña c¸c b¨ng PA, thËm chÝ cßn cã thÓ øc chÕ hoµn toµn c¸c b¨ng yÕu. 3.6 Ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn c¸c mÉu T« méc Th¨m dß kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn cña mÉu gç lªn hai loµi vi khuÈn S. aureus vµ P. aeruginosa, kÕt qu¶ cho thÊy dÞch chiÕt mÉu vá h¹t chÝn cã kh¶ n¨ng kh¸nh m¹nh hai loµi nµy. C¸c dÞch chiÕt mÉu gç ë nång ®é cao còng kh¸ng c¶ hai loµi. H×nh 3.10. Ho¹t tÝnh kh¸ng khuÈn DC polyphenol tæng sè gç T« méc t¸c dông lªn S. aureus DC flavonoid gç T« méc t¸c dông lªn S. aureus DC polyphenol tæng sè gç T« méc t¸c dông lªn P. aeruginosa DC polyphenol tæng sè vá h¹t chÝn t¸c dông lªn S. aureus DC flavonoid vá h¹t chÝn t¸c dông lªn S. aureus DC polyphenol tæng sè vá h¹t chÝn t¸c dông lªn P. aeruginosa 3.7 Ph©n chia c¸c thµnh phÇn flavonoid trªn cét silicagel §Ó t×m hiÓu s©u h¬n flavonoid toµn phÇn cña dÞch chiÕt gç T« méc, chóng t«i tiÕn hµnh s¾c ký líp máng ®ång thêi víi mét sè chÊt chuÈn flavonoid hay gÆp nh­ catechin, rutin, quercetin vµ nhËn thÊy cã mét b¨ng s¾c ký cã ®é di ®éng t­¬ng ®­¬ng víi chÊt chuÈn quercetin, do ®ã ®· tiÕn hµnh ph©n chia trªn cét silicagel pha th­êng ®Ó t×m hiÓu râ h¬n c¸c thµnh phÇn cã ho¹t tÝnh PIA cña dÞch chiÕt gç Vang. Qua th¨m dß trªn b¶n s¾c ký, ®· chän ®­îc hÖ dung m«i chloroform : ethylacetate : acid formic (5:3:0,4) lµ hÖ dung m«i ®¬n gi¶n vµ cã kh¶ n¨ng ph©n t¸ch tèt. C¸c ph©n ®o¹n thu ®­îc sau khi s¾c ký ®­îc kiÓm tra sù ph©n chia trªn b¶n máng còng nh­ ho¹t tÝnh PIA b»ng ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n. H×nh 3.11. S¾c ký b¶n máng c¸c thµnh phÇn polyphenol sau khi qua cét silicagel (dung m«i s¾c ký b¶n máng lµ hÖ dung m«i ch¹y cét) I, II, III, IV, V: c¸c ph©n ®o¹n 7: quercetin 12: flavonoid toµn phÇn (dÞch lªn cét) Dùa vµo s¾c ký ®å, ®· thu riªng c¸c ph©n ®o¹n cã phæ s¾c ký t­¬ng ®­¬ng ®­îc 5 phÇn chÝn (I, II, III, IV, V) ®Ó kiÓm tra ho¹t tÝnh øc chÕ proteinase b»ng ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n, kÕt qu¶ thÓ hiÖn ë h×nh 3.12. H×nh 3.12 cho thÊy c¸c phÇn I, III, IV, V thu ®­îc khi s¾c ký cét ®Òu cã PIA trong ®ã phÇn I vµ III cã kh¶ n¨ng øc chÕ râ rµng h¬n c¶. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn cho thÊy cã nhiÒu thµnh phÇn flavonoid cña c©y gç Vang tham gia vµo kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase. 1 4 3 12 11 7 8 (a) (b) (c) H×nh 3.12. PIA c¸c ph©n ®o¹n s¾c ký (a) trypsin (b) chymotrypsin (c) PsA 1-2: E + H2O ; 3-4: E + I 5-6: E + II ; 7-8: E + III 9-10: E + IV ; 11-12: E + V §Ó t×m hiÓu s¬ bé b¶n chÊt cña c¸c b¨ng nµy, phÇn I cã mét b¨ng di ®éng trïng víi quercetin lµ mét flavonoid ®­îc cho lµ cã kh¶ n¨ng t­¬ng t¸c vµ øc chÕ trypsin [11], do vËy ®· tiÕp tôc t¸i s¾c ký trªn cét silicagel víi hÖ dung m«i chloroform : ethylacetate (5:3), kÕt qu¶ chóng t«i ®· t¸ch riªng ®­îc b¨ng nµy víi ®é tinh s¹ch kh¸ cao kÝ hiÖu lµ GV1 vµ GV2. GV1 cã ®é di ®éng t­¬ng ®­¬ng víi quercetin. H×nh 3.13. S¾c ký ®å c¸c ph©n ®o¹n thu ®­îc sau khi t¸i s¾c ký ph©n ®o¹n I ChÊt chuÈn quecertin GV1 GV2 GV1 vµ GV2 sau ®ã ®­îc thö PIA, kÕt qu¶ lµ GV1 cã ho¹t ®é øc chÕ proteinase râ rÖt. 16 1 7 8 15 18 12 3 H×nh 3.14 PIA cña c¸c ph©n ®o¹n GV1 vµ GV2 1-2: T(trypsin) + H2O, 3-4: T+ GV2 5-6: T+GV1; 7-8 C(chymotrypsin) + H2O; 9-10: C+GV2; 11-12: C+GV1; 13-14: PsA+H2O; 15-16: PsA+GV2; 17+18: PsA+GV1 11 4 Quecertin GV1 GV2 H×nh 3.15 Phæ hÊp thô UV-Vis cña GV1 vµ GV2 H×nh 3.13 cho thÊy mÆc dï GV1 cã ®é di ®éng t­¬ng tù víi quercetin nh­ng phæ UV-Vis h×nh 3.15) l¹i cho thÊy GV1 chØ cã hai ®Ønh hÊp thô ë vïng tö ngo¹i 290nm gièng nh­ quercetin (®¨c tr­ng cña nhãm flavonol) [8], v× vËy cÇn cã nh÷ng nghiªn cøu s©u h¬n vÒ hai ph©n ®o¹n nµy. NhiÒu tµi liÖu cho thÊy trong gç T« méc cã chøa nhiÒu dÉn xuÊt homoisoflavonoid [42,43], homoisoflavonoid còng cã kh¶ n¨ng øc chÕ protease [57], ph¶i ch¨ng GV1 lµ mét homoisoflavonoid. Chóng t«i ®· göi mÉu GV1 ®i ph©n tÝch ®Ó x¸c ®Þnh cÊu tróc cña chÊt cã mÆt trong ph©n ®o¹n nµy. KÕt luËn 1. §· th¨m dß ®­îc 26 mÉu cña 20 c©y thuèc thuéc 17 hä kh¸c nhau trong ®ã cã 21 mÉu cña 16 c©y (80% c¸c c©y nghiªn cøu) cã kh¶ n¨ng øc chÕ mét sè proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase t¸ch tõ P. aeruginosa), kh¶ n¨ng øc chÕ chymotrypsin lµ cao nhÊt. C¸c mÉu cã PIA cao lµ vá h¹t T« méc chÝn, §¹i hoµng, §¬n t­íng qu©n, Tr©m bÇu, S¾n thuyÒn, trong ®ã TIA, PsIA, ChIA theo thø tù ®Òu cao h¬n 3.500, 4.000 10.000 (mIU/g bét kh«). MÉu S¾n thuyÒn cã PIA cao nhÊt, TIA, PsIA, ChIA, lÇn l­ît vµo kho¶ng: 36.691, 25.852, 105.148 mIU/g bét kh«. 2. DÞch chiÕt ethanol cña c¸c mÉu cã PIA cao còng cã hµm l­îng polyphenol cao: tõ 46 ®Õn 62 mg/g bét kh«. PIA cña dÞch chiÕt ethanol cao h¬n nhiÒu lÇn dÞch chiÕt n­íc, ®Æc biÖt dÞch chiÕt polyphenol tæng sè vá h¹t T« méc chÝn lµ mÉu cã PIA cao nhÊt trong c¸c mÉu nghiªn cøu, TIA, PsIA, ChIA lÇn l­ît lµ 74.016, 99.025, 530.681 mIU/g bét kh«. Ho¹t ®é riªng (mIU/g polyphenol) cña c¸c mÉu rÊt kh¸c nhau. DÞch chiÕt flavonoid cña c¸c mÉu còng øc chÕ c¸c proteinase nh­ng t­¬ng ®èi thÊp. 3. Víi c¸c mÉu T« méc, polyphenol cña gç, vá th©n, vá h¹t chÝn vµ vá h¹t xanh lÇn l­ît lµ: 59, 96,84, 51,93 vµ 21,39 mg/g kh«. Hµm l­îng tannin h¹t T« méc chÝn cao nhÊt trong 4 mÉu, ®¹t 26,6% polyphenol tæng sè. Hµm l­îng flavonoid cña c¸c mÉu nµy chiÕm tØ lÖ t­¬ng ®èi thÊp tõ 3% - 9% polyphenol tæng sè. Riªng mÉu gç T« méc tØ lÖ flavonoid/polyphenol tæng sè lµ 75,4%, cao nhÊt trong c¸c mÉu ®iÒu tra. 4. PIA cña c¸c b¨ng flavonoid t¸ch ®­îc sau khi s¾c ký trªn b¶n máng c¸c mÉu T« méc cho thÊy: hÇu hÕt c¸c b¨ng/vïng b¨ng cña mÉu gç ®Òu øc chÕ c¸c proteinase nghiªn cøu ë møc ®é kh¸c nhau; mÉu vá th©n: chØ cã vïng b¨ng di ®éng chËm nhÊt vµ b¨ng kh«ng di ®éng cã ho¹t ®é øc chÕ; mÉu vá h¹t: PIA chØ ®­îc ph¸t hiÖn ë vïng polyphenol kh«ng di chuyÓn trªn b¶n s¾c ký. 5. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña c¸c dÞch chiÕt polyphenol tæng sè cña mÉu vá h¹t T« méc chÝn vµ gç T« méc lªn PA cña P. aeruginosa vµ S. aureus b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di cho thÊy chóng øc chÕ c¶ 3 b¨ng PA cña hai loµi vi khuÈn nµy. 6. DÞch chiÕt c¸c mÉu T« méc ®Òu cã kh¶ n¨ng øc chÕ sù ph¸t triÓn cña hai loµi P. aeruginosa vµ S. aureus. 7. §· tiÕn hµnh s¾c ký cét silicagel flavonoid mÉu gç T« méc vµ thu ®­îc 5 ph©n ®o¹n cã PIA. Ph©n ®o¹n I ®­îc tiÕp tôc ®­îc t¸i s¾c ký thu ®­îc 2 ph©n ®o¹n kÝ hiÖu lµ GV1 vµ GV2 cã phæ hÊp thô UV-Vis ®Æc tr­ng cho nhãm chÊt flavonoid, trong ®ã GV1 cã PIA râ rµng h¬n c¶. KiÕn nghÞ 1. TiÕp tôc ®iÒu tra nghiªn cøu c¸c c©y thuèc ch÷a môn nhät, mÈn ngøa ®Ó lµm râ h¬n mèi liªn hÖ gi÷a kh¶ n¨ng øc chÕ proteinase vµ t¸c dông d­îc lý còng nh­ mèi liªn hÖ víi hµm l­îng vµ thµnh phÇn polyphenol cña c¸c c©y. Nghiªn cøu s©u h¬n c¸c mÉu cã PIA vµ polyphenol cao. 2. T×m hiÓu thªm ho¹t tÝnh øc chÕ cña c¸c mÉu lªn c¸c proteinase kh¸c, ®Æc biÖt lµ c¸c proteinase ngo¹i bµo cña c¸c vi khuÈn kh¸c cã vai trß h×nh thµnh c¸c bÖnh viªm nhiÔm, môn nhät, mÈn ngøa. X¸c ®Þnh ¶nh h­ëng cña c¸c mÉu tíi tõng lo¹i proteinase cña hai loµi vi khuÈn ®· kh¶o s¸t. 3. TiÕp tôc tinh s¹ch vµ x¸c ®Þnh c¸c flavonoid trong gç T« méc cã vai trß øc chÕ proteinase. X¸c ®Þnh c«ng thøc cÊu t¹o GV1, GV2 vµ nghiªn cøu ho¹t ®é øc chÕ c¸c proteinase kh¸c. Danh môc c¸c c«ng tr×nh khoa häc ®· c«ng bè liªn quan ®Õn luËn v¨n NguyÔn Minh Th¾ng, Ph¹m ThÞ Tr©n Ch©u (2008), “Ho¹t tÝnh øc chÕ proteinaza cña dÞch chiÕt polyphenol trong c©y gç Vang (T« méc) Caesalpinia sappan L.” T¹p ChÝ Sinh häc, TËp 30, Sè 3: 114-120. (cã ®¨ng tãm t¾t b¸o c¸o ë Héi nghÞ khoa häc toµn quèc lÇn thø IV, Ho¸ sinh vµ sinh häc ph©n tö phôc vô n«ng, sinh, y häc vµ c«ng nghiÖp thùc phÈm, Hµ néi 15-17/10/2008, trang 648) Pham Thi Tran Chau, Nguyen Minh Thang, Hoang Thu Ha (2008), "Proteinase inhibitory activity in an aqueous extracts and polyphenol fractions of Caesalpinia sappan wood and seed" , 20th FAOBMB Conference "Frontier in Life Sciences" October 23-25th, 2008, Taipei, Taiwan, Abtracts Book p.158. Tµi LiÖu Tham Kh¶o TiÕng ViÖt Ph¹m ThÞ Tr©n Ch©u (1992), “§¹i c­¬ng vÒ c¸c PPI”, T¹p chÝ Di truyÒn vµ øng dông, 1, tr. 22-24. Ph¹m ThÞ Tr©n Ch©u, Phan TuÊn NghÜa (2005), C«ng nghÖ sinh häc, tËp 3: Enzyme vµ øng dông, NXB Gi¸o Dôc, pp. 81-86. Vâ V¨n Chi (1997), Tõ ®iÓn c©y thuèc ViÖt Nam, Nxb Y Häc. §µo Hïng C­êng, Giang Kim Liªn (2008), “Nghiªn cøu x¸c ®Þnh thµnh phÇn hãa häc cña dÞch chiÕt tõ gç Vang ë Qu¶ng Nam”, T¹p chÝ khoa häc §¹i häc §µ N½ng, 24, tr. 63-68. Phan ThÞ Hµ (2000), Nghiªn cøu proteinase cña Pseudomonas N01 ph©n lËp tõ mñ báng, t¸c dông cña Momoseratin ®Õn proteinase cña chóng, LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc, m· sè 1.05.12, Tr­êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §¹i häc quèc gia Hµ Néi. Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châu (2008), “Nghiên cứu điều tra các chất ức chế proteinaza của thân và hạt Caesapinia sappan L.” Tạp chí Khoa học ĐHQG Hà nội, KH TN &CN, 24(4), tr. 261 -270. NguyÔn Quang Huy (2008), Nghiªn cøu t¸c dông cña mét sè chÊt thø cÊp tõ thùc vËt lªn vi khuÈn s©u r¨ng Streptococcus mutans, LuËn ¸n TiÕn sÜ sinh häc, m· sè 62. 42. 30. 15, Tr­êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §¹i häc quèc gia Hµ Néi. Ph¹m Thanh Kú, NguyÔn ThÞ T©m, TrÇn V¨n Thanh (2004), Bµi gi¶ng d­îc liÖu, TËp 1, §¹i häc D­îc Hµ Néi, Bé m«n D­îc liÖu, tr. 259-290. §ç TÊt Lîi (2005), Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam, Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc kÜ thuËt. §µo ThÞ Kim Nhung (1996), Mét sè ®Æc tÝnh hãa häc vµ t¸c dông sinh häc cña flavonoid trong c©y thuèc thanh nhiÖt Smilax glabra Roxb, Lactuca indica Linn, Lonicera japonica Thunb, LuËn ¸n phã tiÕn sÜ khoa häc, m· sè 01.05.10., Tr­êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §¹i häc quèc gia Hµ Néi. TiÕng Anh Andersen O. M., Markham K. R. (2006), Flavonoids: Chemistry, biochemistry and Applications, Taylor & Francis Group, pp. 433-471. Andrejko M., Cytryńka M., Jakubowicz T., 2005, “Apolipophorin III is a substrate for protease IV from Pseudomonas aeruginosa”, FEMS Microbiology Letters, 243, pp. 331-337. Camp B. J., Zant W. C. (1957), “Proteolytic enzyme from Pseudomonase putrefaciens”, Food Research, 22, pp. 158. Chang T.L. (2009), “Inhibitory effect of flavonoids on 26s proteasome activity”, Journal of Agricuture and Food Chemistry., 57 (20), pp. 9706-9715. Chen D., Landis-Piwowar KR., Chen MS., Dou QP. 2007), “Inhibition of proteasome activity by the dietary flavonoid apigenin is associated with growth inhibition in cultured breast cancer cells and xenografts”, Breast Cancer Research, 9(6), pp. 80. Fang B, Song Y, Ma J, Zhao RC. (2007), “Severe epidermal necrolysis after bortezomib treatment for multiple myeloma”, Acta Haematologica, 118, pp. 65-67. Fuke C., Yamahara J., Shimokawa T., Kinjo J., Tomimatsu T., Nohara T. (1985), “Two aromatic compounds related to brazilin from Caesalpinia sappan”, Phytochemistry, 24(10), pp. 2403-2405. Dewich P. M. (2002), Medicinal natural products, John Wiley & Son, pp. 8-9. Domash V. I. , Sharpio T. P. , Zabreiko S. A.  and Sosnovskaya T. F. (2008), “Proteolytic enzymes and trypsin inhibitors of higher plants under stress conditions”, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 34(3), pp. 318-322. Engel L. S., Hill J. M., Caballero A. R., Green L. C. and O’Callaghan R. J., (1998), “Protease IV, a unique extracellular protease and virulence factor from Pseudomonas aeruginosa”, The Journal of Biological Chemistry, 273(27), pp. 16792-16797. Hagerman E. A. (2002), Tannin chemistry, Department of Chemistry and Biochemistry, Miami University, Oxford, USA. Hahn-Deinstrop E. (2007), Applied Thin-Layer Chromatography, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Harborne, J.B. (1980), “Plant Phenolics. In: Secondary Plant Products” (eds E.A. Bell & B.W.Charlwood), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, 8, pp. 329-402. Harborne J.B. (1994), The flavonoids advances in research since 1986, Chapman & Hall Ltd, London. Hättenschwiler, S. & Vitousek, P.M. (2000), “The role of polyphenols in terrestrial ecosystem nutrient cycling”, Tree, 15, pp. 238–243. Heussen C., Dowdle E. B. (1980), “Electrophoretic analysis of plasminogen ativators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and co-polymerized substrate”, Analytical Biochemistry., 102, pp. 196-202. Hobden J. A. (2002), “Pseudomonas aeruginosa proteases and corneal virulence”, DNA and Cell Biology, 21(5-6) pp. 391-396. Hodges L. D., George Kweifio-Okai and Macrides T. A., (2003), “Antiprotease effect of anti-inflammatory lupeol esters”, Molecular and Cellular Biochemistry, 252(1-2), pp. 97-101. Hu J., Yan X., Wang W., Wu H., Hua L., Du L., (2008), “Antioxidant Activity In Vitro of three Constituents from Caesalpinia sappan L”, Tsinghua Science & Technology, 13(4), pp. 474-479. Iwashina T. (2000), “The structure and distribution of the flavonoids in plants”, Journal of Plant Research, 113, pp. 287-299. John Smith H. and Simons C. (2009) Design of Caspase Inhibitors as Potential Clinical Agents, CRC Press, Taylor & Francis Group, LLC. Kim J.H., Kim H.A, Baek S.H., Kho Y.H., Kim M.R., Lee C.H., (2003), “A caspase inducing inhibitor isolate from Caesalpinia sappan”, Korean medical database, 35(4) pp. 680-683. Kim K.J., Yu H.H., Jeong S.I., Cha J.D., Kim S.M., You Y.O. (2004), “Inhibitory effects of Caesalpinia sappan on growth and invasion of methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, Journal of Ethnopharmacology, 91, pp. 81-87. Lim M.Y., Jeon J.H., Jeong E.Y., Lee C.H., Lee H.S. (2007), “Antimicrobial activity of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone isolated from Caesalpinia sappan toward intestinal bacteria”, Food chemistry, 100(3), pp. 1254-1258. Lin CW., Tsai FJ., Tsai CH., Lai CC., Wan L., Ho TY., Hsieh CC, Chao PD., (2005), “Anti-SARS coronavirus 3C-like protease effects of Isatis indigotica root and plant-derived phenolic compounds”, Antiviral Research, 68(1), pp. 36-42. Mar W., Lee H.T., Je K.H., Choi H.Y., Seo E.K. (2003), “A DNA strand-nicking principle of a higher plant, Caesalpinia sappan”, Arch Pharm Res, 26(2), pp. 147-150. Mathee K., Narasimhan G., Valdes C.,Qiu X., Matewish J. M., Koehrsen M., Rokas A., Yandava C., N. Engels R., Zeng E., Olavarietta R., Doud M.,Smith R., S. Montgomery P., White J., R. Godfrey P., A. Kodira C., Birren B., Galagan J. E., Lory, (2008), “Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution”, PNAS, 105(8), pp. 3100-3105. Matsumoto K., Shams NB., Hanninen LA,. Kenyon KR., (1992), “Proteolytic activation of corneal matrix metalloproteinase by Pseudomonas aeruginosa elastase”, Curr Eye Res,11(11) pp.1105-1109. Min, B. R., Pinchak, W. E., Merkel, R., Walker, S., Tomita, G. Anderson, R. C. (2008), “Comparative antimicrobial activity of tannin extracts from perennial plants on mastitis pathogens”, Scientific Research and Essay, 3(2), pp. 66-73. Min B. R., Hart S. P., (2003), “Tannins for suppression of internal parasites”, Journal of Animal Science, 81(2) pp. E102-E109. Nagai M., Nagumo S., Lee S.M., Eguchi I., Kawai Ken-ichi, (1986), “Protosappanin A, a novel biphenyl compound from Sappan Ligum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 34 (1) pp. 1-6. Namikoshi M., Nakata H., Saitoh T., (1987), “Homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan”, Phytochemistry, 26(6), pp. 1831-1833. Namikoshi M., Saitoh T. (1987), “Homoisoflavonoid and related compounds, IV. Absolute configuration of homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan L.”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 35(9) pp. 3597-3602. Nguyen T. M., Dinh V. B. , Ærskove. R. (2005), “Effect of foliages containing condensed tannins and on gastrointestinal parasites”, Animal feed science and technology, 121(1-2), pp. 77-87. Nguyen T. M. T., Awale S., Tezuka Y., Tran Q. L., Kadota S., (2004), “Neosappanone A, a xanthine oxidase (XO) inhibitory dimeric methanodibenzoxocinone with a new carbon skeleton from Caesalpinia sappan”, Tetrahedron Letters, 45(46), pp. 8519-8522. Page M. J. and Di Cera E., (2008), “Serine peptidases: Classification, structure and function”, Cellular and Molecular of Life Sciences, (65), pp. 1220-1236. Pengelly A. (2004), The constituents of medicinal plants, Sunflower Herbals, 2nd Edition, 109 p. Ravaglia S, Corso A, Piccolo G, Lozza A, Alfonsi E, Mangiacavalli S, Varettoni M, Zappasodi P, Moglia A, Lazzarino M, Costa A. (2008), “Immune-mediated neuropathies in myeloma patients treated with bortezomib”, Cinical Neurophysiology, 119(11), pp. 2507-2512. Rawlings N. D., Tolle D. P., Barrett A. J., (2004), “Evolutionary families of peptidase inhibitors”, Biochemical Journal, 378, pp. 705-716. Rawlings, N.D., Morton, F.R., Kok, C.Y., Kong, J. & Barrett, A.J. (2008) “MEROPS: the peptidase database”. Nucleic Acids Ressearch, 36, pp. D320-D325. Sabeh F., Ryoko Shimizu-Hirota, and Weiss S. J., (2009), “Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited”, The Journal of Cell Biology, 185(1), pp.11-19. Shaw L., Golonka, E. Potempa J., Foster S. J. (2004), “The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus”, Microbiology, 150, pp. 217-228. Smagur J., Guzik K., Bzowska M., Kuzak M., Zarebski M., Kantyka T., Walski M., Gajkowska B,  Potempa J., (2009), “Staphylococcal cysteine protease staphopain B (SspB) induces rapid engulfment of human neutrophils and monocytes by macrophages”, Biological Chemistry, 390(4), pp. 361-371. Smith L., Rose B., Tingpej P., Zhu H., Conibear T., Manos J., Bye P., Elkins M., Willcox M., Bell S., Wainwrigh C., and Harbour C., (2006), “Protease IV production in Pseudomonas aeruginosa from the lungs of adults with cystic fibrosis”, Journal of Medical Microbiology, 55, pp. 1641-1644. Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S., and Rattanasuwan, P., (2003), “HIV-1 protease inhibitory effects of some selected plants in Caesalpiniaceae and Papilionaceae families”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 2003, 25(4), pp. 509-514 Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S., Rattanasuwan, P and Puripattanavong, J, 2007, “HIV-1 protease inhibitory substances from Cassia garrettiana”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 29(1), pp. 145-149. Tsukamoto S., Wakana T., Koimaru K., Yoshida T., Sato M. and Ohta T., (2005), “7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman and Broussonin B: neurotrophic compounds, isolated from Anemarrhena asphodeloides BUNGE, function as proteasome inhibitors”, Biological and Pharmaceutical Bulletin 28(9), pp. 1798-1800. Valera A. G., Díaz-Hernández M., Hernández F., Ortega Z, Lucas J. J. (2005), “The ubiquitin-proteasome system in Huntington's disease”, Neuroscientist, 11, pp. 583-594. Vu N. K. P., Phan V. H. N., Vo T. B. H. (2008), “Determination of tannin contents in plants by improved Folin-Ciocalteu method”, Conference proceeding Analytica Vietnam 2009, pp. 175-180. Waterman W. P., (1992), Secondary metabolites: their function and evolution, Chapter: Roles for secondary metabolites in plants, JohnWiley & Sons, pp. 255-275. Waterhouse, A.L., 2001, “Determination of total phenolics, in current protocols in food” Analytical Chemistry, pp. I1.1.1-I1.1.8. Wink M. (2008), Evolution of Secondary Plant Metabolism. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS), JohnWiley&Sons. Ye M., Xie W.D., Lei F., Meng Z., Zhao Y., Su H. and Du L.J (2006) “Brazilein, an important immunosuppressive component from Caesalpinia sappan L.” International Immunopharmacology, 6(3), pp. 426-432. Yohei S., Tomokazu H., Masahiro N. and Seiji N., (2007), “In Vitro Study for Inhibition of NO Production about Constituents of Sappan Lignum”, Biologial and Pharmaceutical Bulletin, 30(1) pp. 193-196. Yoon J.H., Baek S.J. (2008), “Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties”, Yonsei Med, 46(5), pp. 585-596. Yuan, J., Shaham, S., Ledoux, S., Ellis, H. M. & Horvitz, H. R. (1993), “The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian Interleukin-1b-converting enzyme”, Cell, 75, pp. 641-652 Zhao H., Bai H., Wang Y., Li W., Koike K. (2008), “A new homoisoflavan from Caesalpinia sappan”, Jounal of Natural Medicines, 62, pp. 325–327. Zhao Y. N., Pan Y., Tao J. L., Xing D. M., Du L. J. (2006) “Study on cardioactive effects of brazilein”, Pharmacology, 76, pp. 76-83. TiÕng Nga Pietrova J. S., M. M. Wincjunajte (1966), “Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologichskovo proiskhozhdenia”, Priklad. Biochim. I Microbiol., 2, pp. 232. TiÕng Ba lan Leluk J., Pham T.C, Kieleczawa J. (1985), “Zastosawanie edestyny do badania aktywnosci proteinaz ich inhibitorow”, XXI meet.Pol.Biochem.Soc., Krakow, Abstract, pp.139. C¸c trang wed