Luận văn Quy trình tinh sạch và bước đầu xác định một số tính chất của chế phẩm thu nhận được từ canh trường nuôi cấy Aspergillus awamori theo phương pháp bề sâu

, Soriano (2005) vaø Hayashi (1997) cuøng caùc coäng söï ñaõ xaùc ñònh ñöôïc khoái löôïng phaân töû cuûa PMGL naèm trong khoaûng 30-40 kDa, duy chæ coù tröôøng hôïp PMGL töø Aureobasidium pullulans vaø Pichia pinus coù khoái löôïng phaân töû raát cao (xaáp xæ 90 kDa). [40, 92] Thoâng thöôøng, pH cho PMGL hoaït ñoäng toái öu naèm trong vuøng acid ñeán trung tính (töø 4 ñeán 7) (Soriano vaø coäng söï, 2005; Silva vaø coäng söï, 2005). Ñieåm ñaúng ñieän cuûa haàu heát PMGL xaáp xæ 3.5 vaø giaù trò Km trong khoaûng töø 0.1 ñeán 5.0 mg/mL tuøy theo loaïi cô chaát söû duïng (Sakiyama vaø coäng söï 2001; Moharib vaø coäng söï, 2000). [40, 64, 82, 87] 2- Pectate lyase (pectate transeliminase hay polygalacturonate lyase) Pectate lyase hay polygalacturonate lyase (PGL) xuùc taùc cho phaûn öùng phaân giaûi maïch polygalaturonate theo cô cheá trans-elimination. Cô chaát thích hôïp cho enzyme taùc duïng laø acid pectic hay muoái pectate vaø caùc pectin coù möùc ñoä methoxyl hoùa thaáp. Trong töï nhieân, coù 2 loaïi PGL ñöôïc tìm thaáy ôû daïng endo vaø exo. Trong ñoù, daïng endo-PGL phong phuù vaø phoå bieán hôn so vôùi daïng exo-PGL. [45, 101] PGL ñöôïc toång hôïp töø nhieàu loaøi vi sinh vaät chuû yeáu laø vi khuaån vaø moät soá naám sôïi gaây beänh cho caây. Thöôøng gaëp nhaát laø Colletotrichum lindemuthionum, Bacteroides thetaiotaomicron, Erwinia carotovora, Amucala sp., Pseudomonas syringae pv. Glycinea, Colletotrichum magna, E. chrysanthemi, Bacillus sp., Bacillus sp. DT-7, C. gloeosporioides. [44] PGL thuoäc loaïi enzyme löôõng caáu töû vaø noù ñoøi hoûi phaûi coù ion calcium laøm thaønh phaàn coäng toá (cofactor) (Margo P. vaø coäng söï, 1994). Khoái löôïng phaân töû cuûa caùc enzyme naøy thöôøng naèm trong khoaûng 30-50 kDa (McCarthy vaø coäng söï, 1985; Truong vaø coäng söï, 2001). Giaù trò pH toái thích vaø nhieät ñoä toái thích ñeå enzyme naøy hoaït ñoäng töông öùng laø 8.0-10.0 vaø 30-40oC. Moät soá loaøi vi sinh vaät chòu nhieät coù theå toång hôïp neân PGL coù nhieät ñoä toái thích cao (töø 50 ñeán 75oC). [33, 34, 44, 58] Ngoaøi ra, trong soá caùc enzyme lyase, coøn coù moät loaïi enzyme khaùc coù teân laø oligogalacturonate lyase (EC 4.2.2.6). Enzyme naøy coù taùc duïng laøm beõ gaõy maïch cuûa caùc oligogalacturonate baõo hoøa vaø khoâng baõo hoøa theo cô cheá trans-elimination töø vò trí ñaàu khoâng khöû. Keát quaû laø laøm giaûi phoùng ra caùc monomer chöùa noái ñoâi ra khoûi cô chaát. Oligogalacturonate lyase ñöôïc sinh toång hôïp chuû yeáu töø Erwinia vaø Pseudomonas sp., vaø coù pH toái öu laø 7.0. [44] Baûng 2.5 Tính chaát cuûa moät vaøi lyase [44] Chuù thích: PGL: polygalacturonate lyase, PMGL: polymethyl galacturonate lyase Moät soá enzyme khaùc lieân quan ñeán quaù trình phaân giaûI pectin Ngoaøi caùc enzyme vöøa keå treân, trong thöïc teá, ngöôøi ta coøn tìm thaáy moät soá enzyme khaùc cuõng lieân quan ñeán quaù trình phaân giaûi caùc hôïp chaát pectic nhöng söï xuaát hieän cuûa chuùng ít phoå bieán. Caùc enzyme naøy chuû yeáu taùc duïng leân phaàn vuøng coù caáu truùc phaân nhaùnh (hairy structure) hay vuøng môû roäng cuûa phaân töû pectin. [99] Caùc enzyme naøy bao goàm rhamnogalaturonan acetylesterase, rhamnogalacturonan galacturonohydrolase, rhamnogalacturonan rhamnohydrolase, rhamnogalacturonan lyase, endogalactanase, feruloyl esterase, a-L-arabinofuranosidase vaø endoarabanase. [99, 101] THU NHAÄN PECTINASE TÖØ VI SINH VAÄT Hieän nay, vieäc thu nhaän cheá phaåm pectinase ñöôïc thöïc hieän chuû yeáu töø vi sinh vaät. Trong soá caùc enzyme thuoäc heä thoáng pectinase, polygalacturonase laø enzyme ñöôïc quan taâm nhieàu nhaát vaø coù phaïm vi öùng duïng roäng lôùn khoâng nhöõng trong coâng nghieäp thöïc phaåm maø coøn trong lónh vöïc coâng ngheä sinh hoïc. Choïn gioáng vi sinh vaät Nhö ñaõ giôùi thieäu ôû phaàn 1.2.3.1, polygalacturonase coù theå ñöôïc toång hôïp töø nhieàu nguoàn khaùc nhau bao goàm caû vi khuaån, naám men vaø naám sôïi. Tuy nhieân, haàu heát caùc cheá phaåm enzyme thöông maïi hieän nay ñeàu ñöôïc saûn xuaát töø naám sôïi, ñaëc bieät laø gioáng Aspergillus. Caùc cheá phaåm pectinase ñöôïc saûn xuaát töø caùc loaøi khaùc nhau thì coù nhöõng tính chaát khaùc nhau (de Vries vaø coäng söï, 2001). [24, 99] Vieäc löïa choïn nguoàn naám sôïi sinh toång hôïp polygalacturonase coøn phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá khaùc nhau nhö toác ñoä sinh tröôûng, hieäu suaát sinh toång hôïp enzyme, phöông phaùp nuoâi caáy (canh tröôøng beà maët hay beà saâu), thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy (cô baûn, phoå bieán vaø kinh teá), ñieàu kieän nuoâi caáy (lieân quan ñeán pH vaø ñoä beàn nhieät cuûa enzyme), ñaëc ñieåm veà genotype cuûa chuûng söû duïng (chuûng daïi, chuûng thuaàn, chuûng ñoät bieán, chuûng taùi toå hôïp di truyeàn). [67, 99] Moâi tröôøng nuoâi caáy thu nhaän enzyme pectinase 1- Nguoàn Carbon Pectinase thuoäc loaïi enzyme caûm öùng. Ñieàu naøy coù nghóa laø pectinase chæ coù theå ñöôïc sinh toång hôïp bôûi vi sinh vaät khi coù maët cuûa chaát caûm öùng, trong tröôøng hôïp naøy chính laø pectin, trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Vì theá, khi thieát laäp moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå thu nhaän pectinase thì cô chaát pectin laø thaønh phaàn baét buoäc phaûi boå sung vaøo. [8, 10, 52] Ngöôøi ta coù theå boå sung nguoàn chaát caûm öùng laø pectin vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy döôùi 2 daïng: [28; 99] Boå sung cheá phaåm pectin ñaõ ñöôïc tinh saïch. Boå sung pectin töø caùc nguyeân lieäu giaøu pectin nhö: taùo, caø roát, baõ mía, baõ cuû caûi ñöôøng, voû cuûa moät soá loaïi quaû citrus, … Thôøi gian (giôø) Thôøi gian (giôø) Hình 2.4 Saûn xuaát pectinase töø A. niger trong canh tröôøng nuoâi caáy beà saâu vôùi cô chaát pectin vaø caùc nguoàn carbon khaùc: (l), pectin; (¡), pectin+glucose; (n), pectin+acid galacturonic; (o), pectin+sucrose. A, Endo-polygalaturonase; B, Exo-polygalaturonase. [91] Nhö ñaõ bieát, pectinase laø moät heä thoáng goàm nhieàu loaïi enzyme khaùc nhau taùc duïng leân cô chaát laø pectin. Vì vaäy, thaønh phaàn caáu taïo cuûa pectin seõ aûnh höôûng ñeán vieäc taïo thaønh caùc loaïi enzyme vôùi haøm löôïng khaùc nhau. Moät ví duï ñieån hình laø polymethylgalacturonase vaø pectin esterase chæ coù theå ñöôïc toång hôïp vôùi hoaït tính cao khi trong moâi tröôøng coù chöùa pectin coù möùc ñoä methoxyl hoùa cao. Ngöôïc laïi, khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng chöùa pectin coù möùc ñoä methoxyl hoùa thaáp thì laïi kích thích cho söï sinh toång hôïp polygalacturonase vaø pectate lyase. [32] Ngoaøi pectin ra, trong moät soá tröôøng hôïp, ngöôøi ta cuõng coù theå keát hôïp boå sung moät soá thaønh phaàn cô chaát khaùc ñoùng vai troø laø nguoàn chaát dinh döôõng cho teá baøo sinh tröôûng vaø taêng sinh khoái. Caùc chaát naøy coù theå laø caùc loaïi mono-, di- hoaëc trisaccharide nhö glucose, saccharose,... Tuy nhieân, vieäc boå sung caùc thaønh phaàn naøy caàn phaûi ñöôïc tieán haønh khaûo saùt tröôùc vì söï coù maët cuûa chaát naøy coù theå daãn ñeán hieän töôïng öùc cheá söï sinh toång hôïp enzyme ngay caû khi coù maët cuûa chaát caûm öùng. Hình 2.4 bieåu dieãn aûnh höôûng vieäc löïa choïn nguoàn carbon khaùc nhau ñeán hoaït tính polygalacturonase thu ñöôïc töø A. niger trong canh tröôøng beà saâu. Qua ñoù cho thaáy, hoaït tính endo-PG vaø exo-PG ñaït ñöôïc cao nhaát khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng chæ chöùa pectin laøm cô chaát caûm öùng. Trong haàu heát caùc tröôøng hôïp coù boå sung caùc loaïi monosaccharide hoaëc disaccharide vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy ñeàu coù taùc duïng laøm chaäm hoaëc kìm haõm söï sinh toång hôïp enzyme polygalacturonase. [32, 51, 91] Toùm laïi, vieäc löïa choïn nguoàn carbon thích hôïp ñeå nuoâi caáy coøn tuøy thuoäc vaøo loaïi enzyme caàn thu nhaän (endo- hoaëc exo- pectinase) vaø phaûi ñöôïc tieán haønh khaûo saùt baèng thöïc nghieäm. 2- Nguoàn nitô [4, 6, 28, 51, 87] Nguoàn nitô cuõng ñoùng vai troø quan troïng trong thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy naám sôïi. Caùc nguoàn nitô khaùc nhau seõ aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme do vi sinh vaät sinh toång hôïp. Coù theå söû duïng nguoàn nitô ôû 2 daïng: Nguoàn nitô höõu cô: nöôùc chieát ngoâ, boät ñaäu naønh, boät mì, dòch thuûy phaân casein, peptone, cao thòt, cao naám men, …. Nguoàn nitô voâ cô: muoái ammonium hoaëc muoái nitrat nhö: (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, NaNO3 ... Baûng 2.6 AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô leân hoaït tính endo-PGase ôû Asp. awamori [6] Nguoàn nitô Hoaït tính endo-PGase (U/ml) Cao thòt 1,133 Chaát chieát naám men 1,077 Soy protein 0,870 (NH4)2SO4 0,805 NH4Cl 0,727 NH4NO3 0,873 (NH4)2HPO4 0,765 NaNO3 0,895 Söï toång hôïp pectinase töø naám sôïi coøn phuï thuoäc vaøo haøm löôïng caùc hôïp chaát coù chöùa nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Do ñoù, ta caàn phaûi xaùc ñònh nguoàn nitô vaø haøm löôïng söû duïng baèng phöông phaùp thöïc nghieäm. Baûng 2.6 cho thaáy aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung caùc nguoàn nitô khaùc nhau leân hoaït tính cheá phaåm endo-polygalacturonase (endo-PG) thu ñöôïc töø A. awamori trong canh tröôøng nuoâi caáy beà saâu. Döïa vaøo ñoù, ta coù theå thaáy raèng hoaït tính endo-PG thaáp nhaát khi nuoâi caáy A. awamori trong moâi tröôøng söû duïng NH4Cl (0,727 U/mL) hoaëc (NH4)2HPO4 (0,765 U/mL). Trong caùc nguoàn nitô höõu cô thì cao thòt cho hoaït tính endo-polygalacturonase cao nhaát (1,133 U/mL). Trong caùc nguoàn nitô voâ cô thì NH4NO3 vaø NaNO3 cho hoaït tính endo-polygalacturonase cao nhaát (0,873 U/ml vaø 0,895 U/ml). Nhö vaäy, tuøy theo loaøi vi sinh vaät söû duïng maø ta ñieàu chænh tæ leä thích hôïp giöõa haøm löôïng carbon vaø nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy. [6] 3- Caùc nguyeân toá khaùc Theo Tewari vaø coäng söï (2005), thaønh phaàn khoaùng söû duïng (0.05-3.0 mM) trong nuoâi caáy sinh toång hôïp pectinase theo phöông phaùp beà saâu bao goàm: CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, CuCl2.H2O, CoCl2.2H2O, MnSO4.4H2O, H3BO3, ZnCl2, Fe (III) citrate, Na2MoO4.2H2O, FeSO4, KCl vaø NaCl. [97] Thu nhaän pectinase treân moâi tröôøng nuoâi caáy beà saâu Trong phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu (Submerged fermentation), ngöôøi ta cho vi sinh vaät phaùt trieån trong moâi tröôøng loûng. Gioáng vaø moâi tröôøng dinh döôõng ñöôïc ñöa vaøo moät laàn ñeå tieán haønh quaù trình nuoâi caáy. Quaù trình sinh toång hôïp pectinase trong canh tröôøng beà saâu dieãn ra trong khoaûng thôøi gian 24 – 120 giôø tuøy vaøo gioáng vi sinh vaät söû duïng. Sau ñoù, caû canh tröôøng nuoâi caáy ñöôïc thaùo ra khoûi thieát bò ñeå thöïc hieän tieáp quaù trình taùch vaø tinh saïch. [4, 6, 8, 10, 67] Caùc vi sinh vaät bao goàm caû naám men, naám sôïi, vi khuaån ñeàu thích hôïp vôùi phöông phaùp naøy. Hieän nay, trong lónh vöïc thu nhaän pectinase, ngöôøi ta thöôøng söû duïng nhoùm vi sinh vaät hieáu khí. Ñeå cung caáp ñuû oxy cho vi sinh vaät phaùt trieån, quaù trình suïc khí laø raát caàn thieát. Beân caïnh ñoù, ngöôøi ta coøn söû duïng caùnh khuaáy (quy moâ coâng nghieäp) hoaëc laéc ñaûo (quy moâ phoøng thí nghieäm) ñeå cung caáp oxy cho vi sinh vaät vaø giuùp caùc thaønh phaàn trong moâi tröôøng trôû neân ñoàng ñeàu hôn. [3, 7, 8, 10] Baûng 2.7 toùm taét moät soá keát quaû nghieân cöùu trong lónh vöïc thu nhaän polygalacturonase vi sinh vaät baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu. [28] Hieän nay, trong coâng nghieäp saûn xuaát enzyme noùi chung, haàu heát caùc nhaø saûn xuaát ñeàu söû duïng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu vì phöông phaùp naøy coù nhöõng öu ñieåm sau: [8, 10, 13, 77] Tieát kieäm nhaân coâng vaø dieän tích nhaø xöôûng; Khaû naêng cô giôùi hoùa cô giôùi hoùa, töï ñoäng hoùa quaù trình nuoâi caáy thöïc hieän deã daøng hôn do canh tröôøng nuoâi caáy ñoàng nhaát maø nhôø ñoù coù theå chuû ñoäng ñieàu chænh caùc thoâng soá nhö noàng ñoä, nhieät ñoä, pH, löôïng O2; Vaán ñeà ñieàu khieån quaù trình sinh toång hôïp enzyme cuõng thuaän lôïi hôn; Löôïng cô chaát soùt thaáp, nhôø ñoù, tieát kieäm chi phí saûn xuaát; Ít sinh ra caùc enzym taïp, töø ñoù, giaûm chi phí quaù trình tinh saïch; Chi phí cho quaù trình ñieàu nhieät, cung caáp oxy thaáp hôn; Khoâng caàn thieát phaûi qua giai ñoaïn trích ly trong quaù trình tinh saïch enzym do ñoù coù theå ruùt ngaén quy trình saûn xuaát. Baûng 2.7 Thu nhaän polygalacturonase baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu [28] (*) Ñôn vò quoác teá tính baèng löôïng enzyme caàn ñeå giaûi phoùng 1 mmol acid galacturonic trong 1 phuùt. (**) Ñôn vò hoaït tính ñöôïc hieäu chænh töø 140U/5g caùm mì veà ñôn vò quoác teá U/mL. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình nuoâi caáy thu nhaän pectinase töø naám sôïi trong canh tröôøng nuoâi caáy beà saâu 1- Tyû leä gioáng caáy Theo quy luaät, tyû leä gioáng caáy aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh tröôûng vaø löôïng sinh khoái trong canh tröôøng töø ñoù aûnh höôûng ñeán naêng suaát vaø hieäu suaát sinh toång hôïp caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát. [30] Löôïng gioáng cao: toác ñoä sinh tröôûng cao, tieâu hao cô chaát cho sinh tröôûng taêng, thôøi gian nuoâi caáy ngaén, chi phí cao cho quaù trình nhaân gioáng. Löôïng gioáng thaáp: toác ñoä sinh tröôûng chaäm, thôøi gian nuoâi caáy keùo daøi. Khi khaûo saùt haøm löôïng gioáng caáy ban ñaàu leân hoaït tính endo-PGase toång hôïp töø Asp. awamori, Phaïm Thaønh Leã vaø coäng söï (2007) ñaõ tìm ra tyû leä thích hôïp ñoái vôùi quaù trình sinh toång hôïp enzyme naøy laø khoaûng 34 mg chaát khoâ baøo töû cho 1 lít canh tröôøng nuoâi. Khi ñoù, hoaït tính endo-PGase thu ñöôïc laø cöïc ñaïi (0.903 U/mL) sau 30 giôø nuoâi caáy. Keát quaû nghieân cöùu ñöôïc trình baøy trong baûng 2.8: [6] Baûng 2.8 So saùnh aûnh höôûng löôïng gioáng caáy ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase töø Asp. awamori vôùi nhöõng tyû leä gioáng caáy khaùc nhau Löôïng gioáng caáy (mg chaát khoâ baøo töû/lít moâi tröôøng) 17 34 68 136 272 Hoaït tính endo-PG cao nhaát (U/mL) 0,885 0,903 0,828 0,722 0,678 Thôøi ñieåm thu nhaän (giôø) 36 30 30 28 26 2- Ñieàu kieän nuoâi caáy i) AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu Keát quaû nghieân cöùu tröôùc ñaây cuûa Phaïm Thaønh Leã vaø coäng söï (2007), veà aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu ñeán hoaït tính endo-polygalaturonase thu ñöôïc töø canh tröôøng naám sôïi Asp. awamori ñöôïc trình baøy trong baûng 2.9. [6] Baûng 2.9 AÛnh höôûng pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase pH ban ñaàu 3,5 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Hoaït tính endo-PG cao nhaát (U/mL) 0,323 0.903 1.039 0.94 0,868 0.842 Thôøi ñieåm thu nhaän (giôø) 30 30 30 32 34 36 Soá lieäu trong baûng 2.9 cho thaáy, pH ban ñaàu thích hôïp cho Asp. awamori sinh toång hôïp hoaït tính endo-PGase dao ñoäng quanh giaù trò pH = 5.0, khi ñoù hoaït tính endo-PG ñaït cao nhaát laø 1.039 U/mL sau 30 giôø nuoâi caáy. ii) AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhieät ñoä nuoâi caáy phaûi ñöôïc kieåm soaùt chaët cheõ vaø ñieàu chænh ñeán nhieät ñoä toái thích cho naám sôïi phaùt trieån. Nhieät ñoä quaù cao hay quaù thaáp ñeàu aûnh höôûng quaù trình sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp enzyme trong teá baøo. Maëc khaùc, nhieät ñoä coøn aûnh höôûng ñeán ñoä hoaø tan cuûa oxy trong canh. Nhieät ñoä caøng thaáp thì ñoä hoaø tan cuûa oxy caøng cao. Nhöng neáu nhieät ñoä quaù thaáp (döôøi 25oC) seõ laøm chaäm quaù trình sinh tröôûng cuûa naám sôïi, töø ñoù, keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy. [6] Baûng 2.10 AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase [6] Nhieät ñoä nuoâi caáy, oC 27 30 33 36 39 Hoaït tính endo-PG cao nhaát (U/mL) 0,996 1,191 1,195 1,269 1,107 Thôøi ñieåm thu nhaän (giôø) 34 30 28 22 20 Soá lieäu trong baûng 2.10 cho thaáy, nhieät ñoä moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp nhaát ôû 36oC, khi ñoù hoaït tính endo-polygalacturonase ñaït cao nhaát laø 1,269 U/mL sau 22 giôø nuoâi caáy. iii) AÛnh höôûng cuûa suïc khí vaø khuaáy troän Theo Friedrich J. vaø coäng söï (1989), söï taêng cöôøng cheá ñoä suïc khí vaø khuaáy troän trong quaù trình nuoâi caáy coù khaû naêng laøm taêng hieäu suaát thu nhaän pectinase maø khoâng aûnh höôûng ñeán hình thaùi cuûa sôïi naám. Keát quaû nghieân cöùu nuoâi caáy naám sôïi Aspergillus niger A138 trong bình nuoâi caáy dung tích 10L cho thaáy, neáu taïi thôøi ñieåm toác ñoä sinh tröôûng ñaït cöïc ñaïi, toác ñoä suïc khí taêng leân töø 0.5vvm ñeán 1.2vvm vaø toác ñoä khuaáy taêng töø 300rpm ñeán 500rpm thì hoaït tính pectinase thu ñöôïc taêng leân 2 laàn so vôùi tröôøng hôïp giöõ nguyeân cheá ñoä cuõ. [31] ÖÙNG DUÏNG CUÛA PECTINASE TRONG COÂNG NGHIEÄP Pectinase ñöôïc xem laø moät trong nhöõng cheá phaåm enzyme quan troïng trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø thöôøng ñöôïc söû duïng trong caùc lónh vöïc nhö saûn xuaát röôïu vang vaø nöôùc traùi caây leân men coù ñoä coàn thaáp, saûn xuaát nöôùc rau quaû khoâng coàn, saûn xuaát caùc saûn phaåm töø quaû: möùt nhöø, möùt ñoâng, saûn xuaát caø pheâ, ca cao... ÖÙng duïng trong coâng ngheä saûn xuaát nöôùc quaû Trong coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc quaû, ngöôøi ta thöôøng taïo ra 2 daïng saûn phaåm laø nöôùc quaû trong vaø nöôùc quaû ñuïc. Phöông phaùp taïo nöôùc quaû trong thöôøng duøng ñeå saûn xuaát nöôùc eùp taùo, leâ, nho, daâu,…. Phöông phaùp taïo nöôùc quaû ñuïc ñöôïc duøng ñeå saûn xuaát nöôùc eùp caùc loaïi citrus (cam, chanh, böôûi,… ), xoaøi, mô, oåi, ñu ñuû, thôm, chuoái,… Muïc ñích söû duïng pectinase laø: 1- Naâng cao hieäu suaát thu hoài chaát chieát cho quaù trình eùp vaø thu nhaän dòch quaû Trích ly hoaëc eùp rau quaû ñeå thu hoài chaát chieát laø moät trong nhöõng coâng ñoaïn quan troïng caû veà maët kyõ thuaät laãn kinh teá trong coâng ngheä cheá bieán rau quaû. Hieäu suaát thu hoài chaát chieát phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö: ñoä thaåm thaáu cuûa teá baøo moâ quaû, caáu taïo teá baøo, moâ thöïc vaät vaø tính chaát cô lyù cuûa nguyeân lieäu, ñoä nhôùt cuûa dòch baøo, ñoä chaéc cuûa thòt quaû, thaønh phaàn, haøm löôïng vaø söï phaân boá cuûa pectin trong rau quaû, möùc ñoä nghieàn nguyeân lieäu… Thoâng thöôøng, hieäu suaát thu hoài chaát chieát töø rau quaû chæ ñaït döôùi 70%, nhöng neáu ta boå sung cheá phaåm enzyme pectinase trong quaù trình xöû lyù thì seõ laøm taêng hieäu suaát thu hoài chaát chieát leân theâm 15-25%. [2, 15, 17, 24, 90] 2- Laøm trong vaø caûi thieän ñoä nhôùt cho caùc saûn phaåm thöùc uoáng töø rau quaû Söï coù maët cuûa pectin trong dòch rau quaû thu ñöôïc seõ taïo ñoä nhôùt cho saûn phaåm vaø laøm keùo daøi thôøi gian loïc. Hôn nöõa, pectin trong dung dòch ôû daïng keo neân deã gaây ñuïc saûn phaåm trong quaù trình baûo quaûn. Ñoái vôùi nöôùc quaû trong, ta caàn phaûi coù bieän phaùp xöû lyù, phaù huûy heä thoáng keo do pectin gaây neân trong dòch rau quaû. Enzyme pectinase seõ xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân pectin laøm giaûm kích thöôùc vaø troïng löôïng phaân töû. Khi ñoù ñoä trong cuûa dòch rau quaû seõ taêng leân. [17, 65, 99, 101] 3- Laøm taêng haøm löôïng chaát khoâ hoøa tan cuûa dòch eùp Ñoàng thôøi vôùi taùc duïng laøm trong, söï thuûy phaân pectin do enzyme pectinase seõ taïo thaønh caùc acid polygalacturonic maïch ngaén hay caùc monogalacturonic, digalacturonic... Nhöõng saûn phaåm naøy khoâng coù khaû naêng keo hoùa, do ñoù laøm taêng haøm löôïng chaát chieát hoaø tan töø nguyeân lieäu vaøo dòch quaû, giaûm ñoä nhôùt vaø taêng ñoä beàn hoùa lyù cuûa saûn phaåm nöôùc quaû. Ngoaøi ra, khi söû duïng cheá phaåm pactinase, khaû naêng trích ly caùc hôïp chaát hoaø tan, maøu, muøi, cuõng nhö caùc vitamine cuõng taêng leân do söï phaù vôõ caáu truùc teá baøo thòt quaû cuõng nhö voû quaû. [99, 101] ÖÙng duïng trong coâng ngheä saûn xuaát röôïu vang ÖÙng duïng cuûa pectinase trong saûn xuaát röôïu vang cuõng vôùi nhöõng muïc ñích töông töï nhö trong saûn xuaát nöôùc quaû trong. Ngoaøi ta, ngöôøi ta coøn thaáy raèng, neáu boå sung pectinase vaøo hoãn hôïp dòch quaû (ñaõ qua xöû lyù nhieät) tröôùc khi leân men coù theå laøm taêng ñoä maøu vaø caûi thieän ñoä beàn hoùa lyù cho röôïu vang thaønh phaåm so vôùi khi khoâng xöû lyù baèng pectinase (theo Revilla I. vaø coäng söï, 2003). [74] ÖÙng duïng trong coâng ngheä saûn xuaát möùt quaû Trong saûn xuaát caùc saûn phaåm töø quaû (möùt nhuyeãn, möùt ñoâng… ) pectinase cuõng coù vai troø quan troïng. Nhôø pectinase maø coù theå thu ñöôïc dòch quaû coù noàng ñoä chaát khoâ cao hôn. Chaúng haïn nhö trong saûn xuaát möùt taùo, dòch taùo ñaõ qua xöû lyù baèng pectinase coù theå coâ ñaëc leân ñeán haøm löôïng chaát khoâ ñaït 72o Brix. Trong khi ñoù, neáu khoâng taùch caùc pectin thì saûn phaåm deã bò keo tuï vaø khoâng theå coâ ñaëc ñeán noàng ñoä cao ñöôïc. [2] ÖÙng duïng trong quaù trình khai thaùc daàu thöïc vaät Ngöôøi ta söû duïng caùc enzyme phaân huûy vaùch teá baøo thöïc vaät, trong ñoù coù heä enzyme pectinase ñeå hoã trôï quaù trình eùp daàu töø haït caây caûi daàu, phoâi döøa, haït hoa höôùng döông, haït coï, quaû oâliu. Caùc enzym naøy coù taùc duïng laøm “hoùa loûng” caùc thaønh phaàn caáu truùc vaùch teá baøo cuûa caây coù chöùa daàu. Chuùng ñöôïc boå sung vaøo trong quaù trình nghieàn nguyeân lieäu coù daàu. Do ñoù, daàu ñöôïc phoùng thích ra deã daøng trong quaù trình tieáp theo. Vieäc xöû lyù enzyme laøm taêng saûn löôïng daàu. Söï taêng saûn löôïng naøy phuï thuoäc vaøo pH, nhieät ñoä vaø lieàu löôïng cuûa enzym ñöôïc söû duïng. [15, 45, 99] ÖÙng duïng trong quaù trình leân men cheø, caø pheâ Thaønh phaàn chuû yeáu trong lôùp voû nhaøy cuûa haït caø pheâ laø pectin. Vì theá, trong quaù trình leân men caø pheâ, ngöôøi ta duøng enzyme pectinase ñeå phaân giaûi pectin, loaïi lôùp voû nhaøy khoûi haït caø pheâ. Cheá phaåm pectinase thöông maïi ñöôïc hoøa tan vaø phun vaøo khoái haït vôùi haøm löôïng 2-10g/taán ôû 15-20oC. Khi ñöôïc xöû lyù vôùi enzym pectinase, quaù trình leân men haït caø pheâ dieãn ra nhanh hôn vaø thôøi gian ñöôïc ruùt ngaén töø 40 – 80 giôø xuoáng coøn khoaûng 20 giôø. Tuy nhieân, do vieäc xöû lyù caø pheâ vôùi cheá phaåm enzym pectinase thöông maïi ôû quy moâ lôùn coù giaù thaønh cao neân trong thöïc teá saûn xuaát, ngöôøi ta thöôøng taùi söû duïng lôùp voû nhaøy cuûa caø pheâ thaûi ra ñeå nuoâi caáy vi khuaån sinh enzym pectinase. Canh tröôøng sau leân men ñöôïc xöû lyù sô boä vaø sau ñoù phun vaøo haït. [24, 45 ] Trong saûn xuaát cheø ñen, neáu laù cheø ñöôïc xöû lyù baèng pectinase thì thôøi gian leân men seõ ñöôïc ruùt ngaén do pectin trong laù cheø bò phaân giaûi seõ giuùp cho quaù trình trích ly caùc polyphenol ra khoûi teá baøo deã daøng hôn. Ngoaøi ra, neáu pectin bò phaân giaûi cuõng giuùp laøm giaûm khaû naêng taïo boït ñoái vôùi caùc saûn phaåm traø hoøa tan. [45] ÖÙng duïng laøm meàm moâ thöïc vaät vaø coâ laäp protoplast (teá baøo traàn) Trong quaù trình lai taïo gioáng ôû thöïc vaät, ngöôøi ta khoâng theå chuyeån caùc toå hôïp gene mong muoán vaøo teá baøo baèng phöông phaùp thao taùc gene thoâng thöôøng. Ngaøy nay, ngöôøi ta söû duïng phöông phaùp dung hôïp caùc protoplast ñöôïc coâ laäp töø teá baøo sinh döôõng ôû thöïc vaät baäc cao trong ñieàu kieän nuoâi caáy invitro vaø phaùt trieån noù thaønh gioáng lai. Ñaây thöïc söï laø moät coâng cuï höõu hieäu ñeå laøm taêng söï ña daïng veà ñaëc tính di truyeàn ôû thöïc vaät baèng nhöõng toå hôïp gene khoâng coù trong töï nhieân (Gleba, 1978). Ñeå thöïc hieän ñieàu naøy, ñaàu tieân, ngöôøi ta laøm meàm moâ thöïc vaät baèng caùch xöû lyù vôùi enzyme pectinase, sau ñoù tieáp tuïc xöû lyù vôùi enzym cellulase ñeå chuyeån moâ naøy thaønh protoplast. Noàng ñoä caùc enzym laø: pectinase 0,5% vaø cellulose 0,5%, chænh pH 5,6 baèng HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983). [45] CAÙC KYÕ THUAÄT TINH SAÏCH CHEÁ PHAÅM ENZYME Coù raát nhieàu kyõ thuaät vaø phöông phaùp tinh saïch khaùc nhau ñeå tinh saïch enzyme. Caùc kyõ thuaät naøy ñöôïc aùp duïng chuû yeáu döïa vaøo tính chaát cuûa phaân töû protein nhö kích thöôùc, khoái löôïng phaân töû, khaû naêng tích ñieän, ... Moãi kyõ thuaät tinh saïch ñeàu coù öu vaø nhöôïc ñieåm rieâng trong vieäc chieát taùch caùc loaïi protein-enzyme khaùc nhau. Trong khuoân khoå cuûa luaän vaên naøy, chuùng toâi xin giôùi thieäu moät soá kyõ thuaät cô baûn vaø thöôøng ñöôïc aùp duïng trong tinh saïch pectinase. Kyõ thuaät siEÂu loïc Nguyeân taéc Kyõ thuaät sieâu loïc (Ultrafiltration) laø quaù trình phaân rieâng choïn loïc caùc hôïp chaát baèng maøng loïc coù kích thöôùc sieâu nhoû vôùi aùp suaát laøm vieäc vaøo khoaûng 0,5 – 5bar. Ñöôøng kính mao quaûn trung bình töø 2 ñeán 50 nm. [73, 83] Vaät lieäu loïc Trong phöông phaùp naøy, vaät ngaên ñeå phaân rieâng caùc caáu töû laø membrane. AÙp löïc laø ñoäng löïc duy nhaát cuûa quaù trình. Membrane coù theå ñöôïc saûn xuaát töø nhieàu loaïi vaät lieäu khaùc nhau nhö: cellulose acetate, polyamide, polysulfone hay ceramic. ÖÙng duïng trong nghieân cöùu tinh saïch pectinase Trong lónh vöïc tinh saïch enzyme noùi chung, ñaëc bieät laø pectinase, quaù trình sieâu loïc thöôøng ñöôïc aùp duïng trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quy trình tinh saïch. Muïc ñích cuûa quaù trình laø taùch nöôùc vaø caùc taïp chaát coù phaân töû löôïng nhoû trong canh tröôøng loûng nhö caùc ion kim loaïi, ñöôøng soùt, acid amin, peptide… (doøng permeate). Trong haàu heát caùc tröôøng hôïp, enzyme tinh saïch phaûi ñöôïc giöõ laïi treân beà maët vaät lieäu loïc (doøng retentate). Vì theá, vaät lieäu loïc caàn phaûi coù kích thöôùc mao quaûn nhoû hôn kích thöôùc enzyme. Phaàn lôùn caùc enzyme polygalacturonase coù khoái löôïng phaân töû trong khoaûng 30-80kDa (Jayani R. S. vaø coäng söï, 2005). Vì vaäy, ñeå tinh saïch canh tröôøng nuoâi caáy thu nhaän loaïi enzyme naøy thì caàn vaät lieäu coù kích thöôùc nhoû hôn 30kDa. Kích thöôùc naøy khoâng taùch ñöôïc caùc protein taïp (coù khoái löôïng phaân töû lôùn hôn 30kD) bò laãn trong canh tröôøng. [44] Keát quaû nghieân cöùu cuûa Manachini P.L. vaø coäng söï (1987) khi tinh saïch endo-PGase baèng kyõ thuaät sieâu loïc söû duïng sôïi Diaflo (kích thöôùc 10kDa) töø canh tröôøng nuoâi caáy naám sôïi Rhizopus Stolonifer cho thaáy, ñoä tinh saïch cuûa cheá phaåm sau tinh saïch taêng leân 2,1 laàn vôùi hieäu suaát thu hoài laø 89%. Moät nghieân cöùu khaùc cuûa Gainvors A. vaø coäng söï (2000) coù theå naâng cao ñoä tinh saïch pectinase leân ñeán 10,4 laàn vôùi hieäu suaát thu hoài khoaûng 83% baèng kyõ thuaät sieâu loïc vôùi kích thöôùc loã 30kDa. Tuy nhieân, trong moät soá tröôøng hôïp, vieäc aùp duïng kyõ thuaät sieâu loïc khoâng ñaït hieäu quaû cao do löïa choïn kích thöôùc loã maøng khoâng thích hôïp (Dinu D. vaø coäng söï, 2007). [26, 34, 56] KYÕ THUAÄT TINH SAÏCH DÖÏA TREÂN SÖÏ KHAÙC BIEÄT VEÀ ÑOÄ HOAØ TAN Keát tuûa baèng caùch thay ñoåi löïc ion Nguyeân taéc Enzyme hoøa tan trong dung dòch döïa vaøo söï caân baèng giöõa löïc tónh ñieän vaø töông taùc kî nöôùc. Söï keát tuûa enzyme xaûy ra khi ta theâm muoái trung tính vaøo dung dòch vôùi noàng ñoä thích hôïp. Khi ñoù, enzyme keát tuûa thuaän nghòch vaø coù theå thu laïi dung dòch enzyme baèng caùch taùch (ly taâm) vaø hoøa tan laïi keát tuûa. Ngoaøi ra, trong moät soá tröôøng hôïp, khi boå sung muoái coøn coù taùc duïng laøm beàn enzyme, choáng laïi söï bieán tính vaø phaân huûy hoaëc nhieãm vi sinh vaät. [83, 75] Taùc nhaân keát tuûa Ñeå keát tuûa enzyme coù theå söû duïng nhieàu loaïi muoái khaùc nhau. Trong thöïc teá, ammonium sulfate ñöôïc duøng phoå bieán nhaát vì muoái naøy coù ñoä hoøa tan cao trong nöôùc, ñaït ñöôïc löïc ion cao vaø giaù thaønh reû. Tyû troïng cuûa dung dòch baõo hoaøø khoaûng 1.235 g/mL, thuaän lôïi cho quaù trình ly taâm ñeå taùch keát tuûa. [83] Caùc yeáu toá aûnh höôûng Noàng ñoä muoái: ôû noàng ñoä thaáp, söï coù maët cuûa muoái laøm beàn nhoùm mang ñieän trong phaân töû enzyme vaø laøm taêng tính tan cuûa enzyme. Khi noàng ñoä muoái taêng thì ñoä tan cuûa protein cuõng taêng. Neáu tieáp tuïc taêng noàng ñoä muoái thì ñoä tan cuûa enzyme seõ giaûm vaø enzyme baét ñaàu keát tuûa vì khi theâm muoái vaøo dung dòch, moät soá phaân töû nöôùc seõ solvat phaân töû muoái. [75, 83] Tính chaát ion: söï aûnh höôûng cuûa muoái ñeán quaù trình keát tuûa ñöôïc xaùc ñònh qua tính chaát cuûa caùc ion, trong ñoù ñieän tích ion laø yeáu toá aûnh höôûng nhieàu nhaát. Hieäu quaû aûnh höôûng cuûa caùc ion aâm giaûm daàn theo traät töï sau: phosphate, sulphate, acetate, chloride… Nhöõng ion döông hoùa trò moät coù aûnh höôûng maïnh hôn ion döông hoùa trò hai. Hieäu quaû aûnh höôûng xeáp theo thöù töï giaûm daàn cuûa caùc ion döông nhö sau: NH4+ , K+ , Na+. [75] Thaønh phaàn, noàng ñoä dòch protein, nhieät ñoä quaù trình cuõng coù aûnh höôûng ñeán söï keát tuûa protein. Nhieät ñoä caøng cao thì tính tan cuûa protein caøng giaûm. Phöông phaùp tieán haønh Noàng ñoä muoái toái öu caàn söû duïng thay ñoåi tuøy theo töøng tröôøng hôïp vaø ñöôïc xaùc ñònh baèng thöïc nghieäm. Khi thöïc hieän thí nghieäm, caàn tieán haønh boå sung ammonium sulphate chaäm vaø khuaáy ñeàu. Keát tuûa coù theå taùch ra baèng ly taâm hay loïc. Phöông phaùp loïc chæ ñöôïc aùp duïng khi tyû troïng cuûa protein keát tuûa gaàn baèng vôùi tyû troïng trong dung dòch. [75, 76] Trong moät soá tröôøng hôïp, coù theå söû duïng phöông phaùp keát tuûa phaân ñoaïn ñeå tinh saïch protein. Ngöôøi ta boå sung ammonium sulfate vaøo dòch trích ñeán noàng ñoä maø protein mong muoán khoâng tuûa, caùc keát tuûa xuaát hieän seõ ñöôïc taùch boû. Sau ñoù boå sung muoái vaøo dòch ñeå ñaït ñeán noàng ñoä maø protein mong muoán keát tuûa. Cuoái cuøng, taùch vaø thu nhaän keát tuûa. [73, 75] ÖÙng duïng trong nghieân cöùu tinh saïch pectinase Ammonium sulphate laø taùc nhaân thöôøng gaëp nhaát trong nghieân cöùu tinh saïch enzyme noùi chung vaø ñaëc bieät trong tinh saïch enzyme pectinase (Afifi A.F. vaø coäng söï, 1988; Miyazaki Y., 1990; Jaffar M. B. vaø coäng söï, 1993, Guo Chung-Teng vaø coäng söï, 2001). Ammonium sulphate coù öu ñieåm noåi baät laø nguyeân lieäu reû tieàn, phoå bieán vaø ít coù khaû naêng gaây bieán tích baát thuaän nghòch enzyme. Vì theá, ñaây thöôøng laø taùc nhaân keát tuûa ñöôïc nhaø saûn xuaát öu tieân löïa choïn. Noàng ñoä ammonium sulphate toái öu cho tinh saïch enzyme thöôøng naèm trong khoaûng töø 60-80% tuyø vaøo töøng loaïi enzyme cuï theå. [14, 35, 42, 62] Keát tuûa enzyme baèng dung moâi höõu cô Nguyeân taéc Quaù trình keát tuûa enzyme döïa treân söï thay ñoåi haèng soá ñieän moâi cuûa moâi tröôøng. Löïc ñaåy vaø löïc huùt tæ leä nghòch vôùi haèng soá ñieän moâi cuûa moâi tröôøng. Vì vaäy, khi boå sung caùc dung moâi coù haèng soá ñieän moâi nhoû (ethanol, acetone...), chuùng seõ laøm giaûm haèng soá ñieän moâi cuûa moâi tröôøng, töø ñoù laøm giaûm khaû naêng solvat hoùa cuûa caùc phaân töû nöôùc ñoái vôùi phaân töû enzyme trong dung dòch. Do vaäy, tính tan cuûa enzyme giaûm vaø enzyme bò keát tuûa. Hieän töôïng keát tuûa xaûy ra toát hôn vaø caàn ít dung moâi hôn khi pH dung dòch gaàn vôùi pI cuûa enzyme. [8, 10, 11, 83] Dung moâi Protein coù theå keát tuûa baèng dung moâi höõu cô tan trong nöôùc, nhö ethanol, acetone, methanol, isopropanol. Trong ñoù, acetone vaø ethanol laø hai dung moâi phoå bieán nhaát trong vieäc keát tuûa protein. Dung moâi söû duïng phaûi an toaøn, khoâng ñoäc vaø coù nhieät ñoä boác chaùy lôùn hôn 20oC. [8, 10, 83] Caùc yeáu toá aûnh höôûng Kích thöôùc cuûa protein cuõng aûnh höôûng ñeán söï keát tuûa. Nhöõng protein coù kích thöôùc lôùn seõ tuûa ôû noàng ñoä dung moâi thaáp hôn so vôùi protein coù kích thöôùc nhoû. [83] Söï toûa nhieät cuûa dung moâi: khi boå sung dung moâi vaøo dung dòch enzyme, nhieät ñoä cuûa hoãn hôïp taêng vì ñaây laø moät quaù trình toûa nhieät. Khi nhieät ñoä taêng cao, caáu hình khoâng gian cuûa enzyme bò thay ñoåi vaø enzyme coù theå bò keát tuûa baát thuaän nghòch. [73] Tyû troïng cuûa dung moâi caøng nhoû thì ñoä nhôùt caøng thaáp, keát tuûa caøng deã taùch. Ñoä daøi maïch carbon cuûa dung moâi caøng daøi thì khaû naêng gaây bieán tính baát thuaän nghòch caøng taêng. [83] Phöông phaùp thöïc hieän Thoâng thöôøng, ngöôøi ta boå sung dung moâi vaøo dung dòch enzyme vôùi moät tæ leä theå tích nhaát ñònh. Sau ñoù, dung dòch enzyme caàn ñöôïc khuaáy ñeàu vaø ñeå yeân trong moät thôøi gian nhaèm taïo ñieàu kieän keát tuûa thuaän lôïi. Khi caùc enzyme ñaõ keát tuûa heát thì caàn phaûi taùch ra ngay baèng quaù trình ly taâm laïnh. Trong keát tuûa vaãn coøn moät phaàn dung moâi. Löôïng dung moâi naøy coù theå taùch ra baèng phöông phaùp boác hôi ôû aùp suaát chaân khoâng. Keát tuûa enzyme söû duïng polyethylen glycol (PEG) Nguyeân taéc Cô cheá keát tuûa enzyme bôûi PEG gioáng vôùi cô cheá keát tuûa bôûi dung moâi höõu cô. Trong dung dòch coù PEG, enzyme seõ bò taùch ra töø nhöõng vuøng coù PEG, noàng ñoä taêng daàn leân vaø keát tuûa. Töông taùc giöõa PEG vaø protein khoâng phaûi laø töông taùc hoùa hoïc. PEG ñöôïc taùch ra khoûi keát tuûa baèng phöông phaùp sieâu loïc. Vieäc söû duïng PEG ñeå tinh saïch protein khoâng laøm aûnh höôûng ñeán nhöõng böôùc tinh saïch sau ñoù. [8, 10, 83] Taùc nhaân keát tuûa Polyethylene glycol (PEG) laø moät polymer öa nöôùc khoâng ñieän li, trô veà maët hoùa hoïc. PEG coù khoái löôïng phaân töû nhoû hôn 50.000. PEG tan trong nöôùc, methanol, benzen, khoâng tan trong diethyl ether, hexane. PEG laø moät taùc nhaân keát tuûa protein khaù phoå bieán, vì: Nhieät ñoä thöïc hieän quaù trình: 4 – 30oC; Löôïng PEG caàn cho quaù trình keát tuûa ít: 5 – 30 %; Ít gaây bieán tính baát thuaän nghòch protein; Khoâng aên moøn thieát bò; Khoâng ñoäc haïi ; Khoâng gaây chaùy noå; Hieäu quaû tinh saïch cao; Tuy nhieân, PEG cuõng coù moät vaøi nhöôïc ñieåm nhö khaû naêng taïo ra ñoä nhôùt cao cho dung dòch khi ôû noàng ñoä ñuû lôùn (> 20%) gaây khoù khaên cho quaù trình laéng vaø taùch tuûa. Ngoaøi PEG, ngöôøi ta coøn duøng caùc hôïp chaát khaùc ñeå keát tuûa protein nhö dextran, polyethyleneimine… Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán tính tan cuûa enzyme trong dung dòch khi coù PEG: Khoái löôïng phaân töû PEG söû duïng: khoái löôïng phaân töû caøng taêng thì tính tan enzyme caøng giaûm. [83] Noàng ñoä PEG trong dung dòch: noàng ñoä PEG caøng taêng thì tính tan cuûa enzyme caøng giaûm. Tuy nhieân, noàng ñoä taêng seõ laøm taêng ñoä nhôùt cuûa dung dòch. Khi ñoä nhôùt dung dòch caøng taêng thì keát tuûa caøng khoù taùch ra khoûi dung dòch. [83] Baûn chaát hoùa hoïc phaân töû enzyme, pH, nhieät ñoä: cuõng aûnh höôûng ñeán ñoä tan cuûa enzyme trong dung dòch coù PEG. Tính tan cuûa enzyme caøng thaáp khi pH cuûa dung dòch gaàn pI cuûa enzyme. [83] KYÕ THUAÄT TINH SAÏCH ENZYME BAÈNG SAÉC KYÙ Saéc kyù loïc gel Nguyeân taéc Phöông phaùp saéc kyù loïc gel (gel filtration) ñöôïc öùng duïng ñeå taùch hoãn hôïp caùc chaát döïa vaøo söï khaùc nhau veà kích thöôùc, hình daïng, caáu truùc khoâng gian, phaân töû löôïng (Xem hình 2.5 B). [83, 88] Baûn chaát quaù trình loïc gel Quaù trình trieån khai saéc kyù ñöôïc thöïc hieän thoâng qua söï töông taùc cuûa 2 pha: Pha tónh laø caùc haït gel coù caáu truùc môû, chöùa lieân keát ngang taïo thaønh maïng löôùi khoâng gian ba chieàu ñöôïc nhoài coá ñònh trong coät. Beân trong vaø beân ngoaøi haït gel coù caùc mao quaûn kích thöôùc nhoû. Caû coät gel ñöôïc giöõ caân baèng caùch röûa qua dung dòch ñeäm. Pha ñoäng laø hoãn hôïp goàm dòch enzyme vaø caùc taïp chaát hoøa tan khaùc coù kích thöôùc phaân töû khaùc nhau ñöôïc pha trong dung dòch ñeäm. Dung dòch maãu chöùa enzyme vaø caùc caáu töû hoøa tan (pha ñoäng) coù kích thöôùc khaùc nhau ñöôïc chaïy qua coät. Nhöõng phaân töû coù kích thöôùc lôùn hôn kích thöôùc loã mao quaûn cuûa gel thì khoâng theå ñi vaøo beân trong haït gel, vì theá chuùng di chuyeån trong khoaûng khoâng gian giöõa caùc haït. Nhöõng phaân töû coù kích thöôùc nhoû hôn thì coù khaû naêng khueách taùn vaøo beân trong caùc haït gel. (A) (B) (C) Hình 2.5 Söï phaân taùch caùc phaân töû protein-enzyme baèng kyõ thuaät saéc kyù. (A) Saéc kyù trao ñoåi ion; (B) Saéc kyù loïc gel; (C) Saéc kyù aùi löïc. [68] Trong quaù trình trieån khai saéc kyù, tính chaát ñaëc tröng cuûa caùc phaân töû coù theå ñöôïc moâ taû thoâng qua heä soá phaân taùch Kav = (Ve – Vo)/(Vt – Vo) (fraction coefficient). Trong ñoù, Vt chính laø theå tích toaøn boä coät gel, Vo laø theå tích roãng (theå tích doøng chaïy beân ngoaøi haït) vaø Ve laø theå tích röûa giaûi cuûa caáu töû caàn phaân taùch. Kva ñöôïc ñònh nghóa laø tæ leä cuûa caùc mao quaûn bò phuû ñaày bôûi caùc caáu töû phaân taùch so vôùi toång soá mao quaûn treân haït gel. Kav khoâng phuï thuoäc vaøo kích thöôùc coät maø chæ phuï thuoäc vaøo tính chaát cuûa protein vaø baûn chaát cuûa gel. [83] Hình 2.6 Söï di chuyeån cuûa caùc phaân töû beân trong vaø beân ngoaøi haït gel [83] Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa moät soá loaïi gel trong saéc kyù loïc gel Caùc loaïi gel cô baûn ñöôïc söû duïng laø dextran, agarose, polyacrylamide vaø hoãn hôïp dextran-polyacrylamide (xem baûng 2.11). Baûng 2.11 Moät soá loaïi gel duøng trong saéc kyù loïc gel [8] Teân thöông maïi Loaïi gel Khoaûng phaân ñoaïn, Da Biogel Polyacrylamide (P-type) Agarose (A-type) 100 1.000 – – 400.000 150.000.000 Uetrogele (IBF, Serva) Agarose/polyacrylamide Agarose 60.000 25.000 – – 1.300.000 20.000.000 Fractogel (Merk) Vinyl polymer 100 – 5.000.000 Sephadex (Pharmacia) Dextran 50 – 600.000 Sephacryl (Pharmacia) Sephacryl/bisacrylamide 5.000 – 1.000.000 Sepharose (Pharmacia) Agarose Agarose lieân keát cheùo 10.000 10.000 – – 40.000.000 1.000.000 Glycophase (Piere) 1,2-dihydroxylpropyl-substituted 1.000 – 350.000 Hieän nay, ngöôøi ta thöôøng söû duïng gel sephadex laøm vaät lieäu nhoài coät. Sephadex laø teân thöông maïi cuûa moät loaïi polysaccharide coù nguoàn goác töø vi sinh vaät – dextran. Trong ñoù, caùc phaân töû ñöôïc lieân keát vôùi nhau thoâng qua caùc lieân keát ngang nhôø taùc duïng cuûa epichlorohydrin taïo thaønh caùc “raây phaân töû”. Soá lieân keát ngang caøng nhieàu thì kích thöôùc loã raây seõ caøng nhoû. [8, 10] Sephadex khi ngaâm trong nöôùc seõ hình thaønh neân maïng löôùi gel ba chieàu. Caùc loaïi sephadex hieän nay chæ tröông nôû trong nöôùc vaø moät vaøi dung moâi phaân cöïc nhöng khoâng tröông trong methanol, ethanol, acid acetic. Sephadex khoâng töông taùc vôùi caùc ion do noù trung hoøa veà ñieän. Neáu bò oxy hoùa maïnh trong caùc dung dòch thì caáu truùc gel seõ bò phaù vôõ, coøn trong trong dung dòch acid maïnh thì caùc glucoside trong gel seõ bò thuûy phaân. [8, 83] Moät soá hieän töôïng chuù yù khi tieán haønh loïc gel [83] Hieän töôïng haáp phuï (Adsorption effect) laø hieän töôïng coù theå gaëp trong quaù trình loïc gel. Söï haáp phuï moät phaàn coù theå gaây ra söï treã (delay) trong quaù trình phaân taùch moät phaân töû protein naøo ñoù. Söï haáp phuï coù theå xem gaàn gioáng nhö tính chaát trao ñoåi ion (ion exchange character) maø khi ñoù coù theå traùnh baèng caùch söû duïng dung dòch ñeäm coù löïc ion lôùn. Hieän töôïng chaûy roái (Turbulent flow) laø hieän töôïng xaûy ra khi doøng dung dòch ñeäm-maãu di chuyeån töø moät vuøng khoâng gian heïp giöõa caùc haït gel ñeán vuøng khoâng gian lôùn hôn. Hieän töôïng naøy luoân xaûy ra trong quaù trình saéc kyù. Chæ coù theå giaûm bôùt hieän töôïng chaûy roái baèng caùch giaûm toác ñoä chaûy cuûa dung dòch röûa giaûi hoaëc söû duïng haït gel coù kích thöôùc nhoû hôn. Hieän töôïng khoâng oån ñònh do troïng löïc (gravitational instability). Hieän töôïng naøy xuaát hieän khi maãu ñöôïc ñöa vaøo ôû vò trí phía treân coät. Heä quaû cuûa noù laøm giaûm khaû naêng khueách taùn cuûa protein vaøo haït gel, töø ñoù, khaû naêng phaân taùch protein trong hoãn hôïp cuõng bò giaûm. Coù theå khaéc phuïc hieän töôïng naøy baèng caùch tieáp maãu töø döôùi leân vaø giaûm kích thöôùc haït gel. Moät soá ñieàu kieän khi tieán haønh loïc gel [8, 75, 76, 83] Ñeå tinh saïch protein baèng phöông phaùp saéc kyù loïc gel, ta caàn phaûi loaïi ñöôïc caùc protein taïp ra khoûi hoãn hôïp. Löïa choïn kích thöôùc coät gel. Tuøy vaøo muïc ñích thí nghieäm maø löïa choïn coät gel coù ñoä daøi vaø ñöôøng kính khaùc nhau. Ñeå tinh saïch enzyme, ngöôøi ta söû duïng nhöõng loaïi coät daøi hôn 100 cm, tyû leä chieàu daøi vaø ñöôøng kính coät vaøo khoaûng 25100. Löïa choïn loaïi gel. Sephadex ñöôïc söû duïng phoå bieán nhaát ñoái vôùi quaù trình chieát taùch maø ôû ñoù toác ñoä chaûy khoâng phaûi laø yeáu toá quan troïng. Biogels (haït polyacrylamide lieân keát ngang) ñöôïc söû duïng roäng raõi trong lónh vöïc xaùc ñònh phaân töû löôïng cuûa protein. Ñoái vôùi caùc phaân töû coù kích thöôùc raát lôùn (töø kích thöôùc protein cho ñeán caùc kích thöôùc côõ virus) thì gel agarose ñöôïc xem laø thích hôïp hôn caû. Tuy nhieân, nhöôïc ñieåm chính cuûa caùc loaïi gel naøy thöôøng do chuùng raát meàm, deã bò taùc ñoäng bôûi aùp suaát (bao goàm caû aùp suaát thaåm thaáu) trong quaù trình saéc kyù, töø ñoù, deã gaây ra hieän töôïng boùp meùo (distortion), ñeø neùn cuïc boä, vaø giaûm toác ñoä chaûy. Löïa choïn kích thöôùc haït gel: kích thöôùc haït gel aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng phaân taùch protein-enzyme. Thoâng thöôøng, trong saéc kyù loïc gel duøng ñeå tinh saïch protein-enzyme, ngöôøi ta thöôøng choïn haït gel coù kích thöôùc nhoû. Kích thöôùc nhoû coù theå khaéc phuïc hieän töôïng chaûy traøn do troïng löïc, chaûy roái vaø taêng beà maët tieáp xuùc giöõa pha ñoäng vaø pha tónh. Tuy nhieân, neáu gel coù kích thöôùc quaù nhoû, ñaëc bieät laø caùc gel coù caáu truùc meàm thì xuaát hieän söï taêng aùp suaát trong quaù trình saéc kyù vaø deã xaûy ra hieän töôïng ñeø neùn cuïc boä. Löïa choïn dung dòch ñeäm chieát xuaát. Tuøy theo ñoä oån ñònh cuûa gel vaø caùc caáu töû caàn chieát taùch maø löïa choïn dung dòch ñeäm coù pH thích hôïp. Thoâng thöôøng, ñoái vôùi gel dextran vaø polyacrylamide, pH oån ñònh trong khoaûng 110. Gel agarose oån ñònh trong giôùi haïn pH 410. Hình 2.7 Quaù trình tinh saïch enzyme baèng saéc kyù loïc gel söû duïng haït coù kích thöôùc loã mao quaûn khaùc nhau. (a) Kích thöôùc loã lôùn: enzyme C ñöôïc röûa giaûi chaäm vaø taùch toát ra khoûi protein A vaø B nhöng khoâng taùch toát ra khoûi D; (b) Kích thöôùc loã nhoû: enzyme C röûa giaûi nhanh hôn, taùch roõ khoûi theå tích ñaàu A vaø protein D. [83] Theå tích maãu: theå tích maãu laø yeáu toá quyeát ñònh trong thí nghieäm veà saéc kyù loïc gel. Theå tích maãu quaù lôùn hay quaù nhoû ñeàu aûnh höôûng khoâng toát ñeán quaù trình phaân taùch. Khi tinh saïch enzyme, theå tích maãu chieám khoaûng 1-5% theå tích coät. Hình 2.8 AÛnh höôûng cuûa theå tích maãu ñeán hieäu quaû phaân taùch caùc caáu töû trong saéc kyù loïc gel. (i) Theå tích ñaàu (Vo); (ii) 2% theå tích maãu – söï phaân taùn maãu toát (lyù töôûng); (iii) 4% theå tích maãu – theå tích maãu lôùn hôn theå tích lyù töôûng laøm cho theå tích röûa giaûi lôùn hôn; (iv) Theå tích maãu quaù lôùn daãn ñeán maãu bò phaân taùn nhieàu hôn. [83] Toác ñoä doøng chaûy qua gel phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá bao goàm chieàu daøi coät, kieåu vaø kích thöôùc haït gel. Ñeå ñaûm baûo an toaøn chung cho söï röûa giaûi cuûa coät gel thì toác ñoä doøng chaûy phaûi thaáp hôn nhieàu so vôùi doøng chaûy töï do. Toác ñoä doøng chaûy cao seõ laøm giaûm ñoä khueách taùn cuûa maãu hoaëc laøm roäng mieàn khueách taùn nhöng chuû yeáu laø laøm maát caân baèng noäi taïi giöõa caùc caáu töû caàn chieát taùch vaø beà maët mao quaûn gel. Tuy nhieân, neáu toác ñoä röûa giaûi quaù thaáp thì khoâng nhöõng laøm chaäm quaù trình phaân tích maø coøn coù theå laøm taêng söï phaân taùn cuûa maãu. Do ñoù, moãi loaïi gel ñoøi hoûi phaïm vi giôùi haïn toác ñoä chaûy khaùc nhau tuøy theo kích thöôùc gel. Thoâng thöôøng, ñoái vôùi gel kích thöôùc nhoû, coù theå ñieàu chænh toác ñoä chaûy leân ñeán 15-25 mL/giôø maø khoâng gaây ra söï maát caân baèng noäi taïi vaø söï phaân taùn maãu. Ngöôïc laïi, ñoái vôùi gel kích thöôùc lôùn thì toác ñoä chaûy thöôøng choïn laø 5-10 mL/giôø. Saéc kyù trao ñoåi ion (Ion-exchanged chromatography) 1- Nguyeân lyù cuûa phöông phaùp: Phöông phaùp saéc kyù trao ñoåi ion coù theå ñöôïc coi laø moät daïng ñaëc bieät cuûa saéc kyù haáp phuï maø trong ñoù caùc caáu töû mang ñieän trong maãu coù khaû naêng töông taùc tónh ñieän moät caùch thuaän nghòch vôùi pha tónh laø caùc haït nhöïa mang ñieän traùi daáu, coøn pha ñoäng laø dung dòch ñieän ly. Löïc lieân keát phuï thuoäc vaøo baùn kính ion vaø maät ñoä ion cuûa pha tónh (soá ñieän tích treân moät ñôn vò theå tích phaân töû). [83] Hình 2.9 Moâ phoûng söï trao ñoåi ion dieãn ra trong quaù trình saéc kyù. Phaân töû protein tích ñieän aâm töông taùc tónh ñieän vôùi caùc ion döông trong dung dòch röûa giaûi (HTris+). Khi qua beà maët chaát mang (haït anionite), protein coù löïc tónh ñieän maïnh hôn seõ töông taùc vôùi haït chaát mang, coøn caùc ion döông töông taùc vôùi caùc ion aâm (Cl-) trong moâi tröôøng. 2- Nhöïa trao ñoåi ion [10, 75] Nhöïa ñöôïc caáu taïo bôûi caùc hôïp chaát cao phaân töû bao goàm khung carbon coù mang nhoùm chöùc hoaït ñoäng noái vôùi caùc ion di ñoäng baèng löïc tónh ñieän. Ion di ñoäng tham gia caân baèng trao ñoåi ion. Coù hai loaïi nhöïa chính: Cationit: ÖÙng vôùi söï trao ñoåi ion döông, haït nhöïa chöùa nhoùm hoaït ñoäng laø anion vaø coù tính acid. Ví duï, -SO3-, -PO42-, -COO-. Anionit: ÖÙùng vôùi söï trao ñoåi ion aâm, haït nhöïa chöùa nhoùm hoaït ñoäng mang ñieän laø cation vaø coù tính base. Ví duï, -N+(CH3)3, -CH2N+R3. 3- Quy trình thöïc hieän: goàm 5 böôùc [10] Böôùc 1: Nhoài haït nhöïa trao ñoåi ion vaø coät Böôùc 2: Ñöa maãu phaân tích vaøo coät Böôùc 3: Caùc thaønh phaàn trong maãu (goàm caùc caáu töû tích ñieän aâm, döông hoaëc trung hoøa veà ñieän) khi ñi qua coät thì chæ coù caùc phaàn töû mang ñieän traùi daáu môùi keát hôïp ñöôïc vôùi caùc haït nhöïa, caùc thaønh phaàn khaùc khoâng bò giöõ laïi bôûi pha tónh seõ nhanh choùng chaïy ra khoûi coät. Böôùc 4: Duøng pha ñoäng coù löïc ion lôùn hôn ñaåy ion maãu ra khoûi haït nhöïa. Böôùc 5: Taùi sinh coät. Saéc kyù aùi löïc (Affined chromatography) 1- Nguyeân taéc Phöông phaùp naøy döïa treân khaû naêng giöõ enzyme baèng nhöõng chaát neàn khoâng hoøa tan. Söï phaân taùch naøy ñöôïc thöïc hieän nhôø vaøo ñaëc tính sinh hoïc cuûa caáu töû. 2- Ligand vaø chaát mang Ligand ñöôïc söû duïng trong saéc kyù aùi löïc laø nhöõng hôïp chaát coù khaû naêng töông taùc ñaëc hieäu vôùi caùc hôïp chaát caàn phaân taùch. Ligand ñöôïc coá ñònh treân phaân töû chaát mang nhôø lieân keát coäng hoaù trò. Ñoái vôùi chaát caàn phaân taùch laø enzyme, ligand coù theå laø coenzyme, cofactor hoaëc caùc chaát coù caáu taïo töông ñoàng vôùi cô chaát. Chaát mang laø caùc polymer trô veà maët hoùa hoïc, ít bò bieán ñoåi nhö agarose, polyacrylamide, sepharose. 3- Quy trình thöïc hieän Cho hoãn hôïp maãu ñi qua coät. Trong coät chöùa chaát mang coù gaén caùc hôïp chaát ligand coù khaû naêng töông taùc ñaëc hieäu vôùi enzyme. Nhö vaäy, caùc enzyme töông taùc vôùi ligand seõ ñöôïc giöõ laïi, coøn caùc protein khaùc seõ thoaùt ra khoûi coät. Sau ñoù enzyme seõ ñöôïc ñaåy ra ngoaøi baèng nhöõng dung dòch coù pH thay ñoåi hay coù löïc ion taêng. Hình 2.10 Moâ phoûng nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa saéc kyù aùi löïc. Ligand (L) ñöôïc gaén leân phaân töû chaát mang nhôø lieân keát coäng hoaù trò. Chæ coù nhöõng enzyme (E) naøo coù khaû naêng töông taùc vôùi caùc caáu töû Ligand thì seõ ñöôïc giöõ laïi laâu hôn treân chaát mang. Caùc protein (P) khoâng coù khaû naêng töông taùc vôùi ligand seõ laàn löôït chaïy qua coät. [83] MOÄT SOÁ KEÁT QUAÛ TRONG LÓNH VÖÏC TINH SAÏCH PECTINASE Caùc nghieân cöùu trong lónh vöïc tinh saïch pectinase ñaõ ñöôïc tieán haønh töø nhöõng naêm 1960, nhöng cho ñeán nay, vaãn chöa coù moät phöông phaùp naøo ñöôïc xem laø thaät söï coù hieäu quaû trong lónh vöïc tinh saïch pectinase. Do ñoù, vaán ñeà quan troïng caàn ñaët ra laø phaûi bieát löïa choïn caùc phöông phaùp vaø keát hôïp chuùng vôùi nhau ñeå taïo neân moät quy trình tinh saïch thaät söï haøi hoaø vaø ñaït hieäu quaû cao. [10, 34] Baûng 2.12 trình baøy toùm taét moät soá keát quaû trong nghieân cöùu tinh saïch enzyme pectinase töø vi sinh vaät. [14, 21, 22, 26, 35, 42, 47, 57, 61, 62, 66, 96] Baûng 2.12 Toång hôïp moät soá nghieân cöùu tinh saïch enzyme pectinase töø vi sinh vaät [34] Vi sinh vaät Loaïi enzyme Phöông phaùp tinh saïch Hieäu suaát thu hoài, % Ñoä tinh saïch Taùc giaû Asp. niger Exo-PG I PG II DEAE-cellulose 8.6 1.0 209.0 205.0 Mill P.J., 1966. Erwinia carotava Endo-pectate lyase I Endo-pectate lyase II Endo-pectate lyase III Endo-pectate lyase IV Keát tuûa ñaúng ñieän (2 laàn) 60.2 61.1 60.4 59.5 54.2 53.8 55.2 56.8 Tanabe H. vaø coäng söï, 1984. Rhizopus stolonifer Endo-Polygalaturonase Sieâu loïc Keát tuûa vôùi ethanol 1:2 CM-sepharose 6B Sephadex G-100 89.0 77.0 62.0 55.0 2.1 9.2 77.0 82.0 Manachini P.L. vaø coäng söï, 1987. Curvularia inaequalis Pectin lyase Keát tuûa baèng (NH4)2SO4 Sephadex G-100 DEAE-cellulose 86.8 70.1 46.1 3.9 16.44 50.9 Afifi A.F. vaø coäng söï, 1988. Bacillus macerans Endo-Pectate lyase (NH4)SO4 80% DEAE-sephadex A-50 CM-cellulofine (1) CM-cellulofine (2) 64.0 55.0 47.0 28.0 8.3 19.0 34.4 37.0 Miyazaki Y., 1990. Arthrobotrys oligospora Pectinmethylesterase Keát tuûa (NH4)2SO4 Hydroxyapatide Sephadex G-100 62.5 52.5 46.3 10.0 14.3 26.4 Jaffar M.B. vaø coäng söï, 1993. Amycolata sp. Pectate lyase DEAE-sepharose Mono S Phenyl-Superose 89.7 69.8 36.6 1.3 2.8 3.6 Bru¨hlmann vaø coäng söï, 1995 Asp. awamori IFO 4043 Endo-PGase X2 DEAE-Toyopearl CM-Toyopeal (1) CM-Toyopeal (2) Superdex 75 30.1 22.3 5.3 3.0 1.63 236.0 272.0 349.0 Nagai M. vaø coäng söï, 2000. Bacillus sp. Exo-PG CM-Toyopearl SuperQ-Toyopearl DEAE-Bio-Gel A (pH 9) DEAE-Bio-Gel A (pH 6) Bio-gel A-0.5m 52.0 44.0 25.0 11.0 8.4 1.3 11.0 22.0 137.0 284.0 Kobayashi T. vaø coäng söï, 2001. Acrophialophora nainiana Pectinase ngoaïi baøo Sepharyl S-100 DEAE-Sepharose Sephadex G-50 4.8 9.2 9.4 122.0 81.0 66.6 Celestino vaø coäng söï, 2006 Asp. niger Endo-PGase Keát tuûa (NH4)2SO4 - Phaân ñoaïn 60% - Phaân ñoaïn 60-100% CM-Sephadex C-50 - CMC-I - CMC-II 70.0 46.0 7.0 22.0 - 1.4 - 66.3 Guo C.-T. vaø coäng söï, 2001