Luận văn Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR phát hiện gen halothan trên heo

ững mục tiêu hàng đầu của bộ kit PCR halothan là phục vụ cho công tác chọn giống trong ngành chăn nuôi. Do vậy chúng ta không thể giết thú để lấy mẫu cơ trong việc phát hiện gen halothan. Từ yêu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả của bộ kit PCR halothan với DNA tách chiết từ máu và da. Việc tách chiết DNA đƣợc thực hiện với bộ kit tách chiết DNA sau 3 tháng bảo quản ở 4oC. Sử dụng bộ kit PCR halothan bảo quản 1 tuần ở 4oC để thực hiện phản ứng với 10 mẫu DNA tách chiết từ máu và 5 mẫu DNA tách chiết từ da. Kết quả này đƣợc so sánh với kết quả dùng bộ kit PCR halothan để khuếch đại DNA từ cơ. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu theo dõi là hiệu quả của phản ứng PCR. 3.4.4 Cắt enzym giới hạn 38 Hỗn hợp cắt sản phẩm PCR đối với gen halothan gồm: 10 µl sản phẩm PCR; 0,3 µl HhaI (10UI / µl); 0,2 µl BSA (10 µg / µl); 2 µl buffer C; 7,5 µl nƣớc cất hai lần vô trùng. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 3 giờ. 3.4.5 Điện di và quan sát kết quả 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5% và 2% - Cân 0,225 g agarose (đối với gel agarose 1,5%) hoặc 0,3 g agarose (đối với gel 2%) hoà tan trong 15 ml TBE 0,5 X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều. - Đun agarose trong lò vi ba ở 650 w, 2 phút (đối với multi agarose) hoặc 350 W, 4 phút (đối với midi agarose). - Để gel nguội đến khoảng 50oC; đổ vào khuôn có gắn lƣợc. - Chờ gel đông, rút lƣợc ra. Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR gen giới tính là 1,5%; nồng độ agarose dùng cho điện di gen halothan và gen thụ thể estrogen là 2%. Loại agarose dùng để điện di sản phẩm PCR của gen giới tính, gen thụ thể estrogen và gen halothan là multi agarose. Loại agarose dùng điện di sản phẩm cắt enzym giới hạn HhaI của gen halothan là midi agarose. 3.4.5.2 Điện di và đọc kết quả - Dùng 7,5 µl sản phẩm PCR trộn với 1,5 µl loading dye 6 X. - Đối với sản phẩm PCR gen halothan và gen giới tính thì điện di gel 30 phút trong TBE 0,5 X với dòng điện 100 V, 250 mA. Đối với sản phẩm enzym cắt giới hạn HhaI thì điện di gel 50 phút trong TBE 0,5 X với dòng điện 50 V, 250 mA. - Vớt gel ra khỏi buồng điện di; cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1% trong 30 phút. - Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả. 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê sinh học với trắc nghiệm chi - square hoặc trắc nghiệm F trên phần mềm Statgraphics 7.0. 39 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ TỐI ƢU HÓA QUI TRÌNH LY TRÍCH DNA 4.1.1 Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào DNA từ cơ bò đƣợc tách chiết theo qui trình I và II, kết quả đo OD đƣợc trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình tách chiết I và II Chỉ tiêu Qui trình I ( X ± SD) Qui trình II ( X ± SD) Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,86 ± 0,02 1,92 ± 0,03 P = 0,06 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,23 ± 0,03 0,18 ± 0,02 P = 0,19 Số mẫu 5 5 Biểu đồ 4.1 DNA tách chiết theo qui trình I và II Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy độ tinh sạch và hàm lƣợng của DNA thu đƣợc từ hai qui trình ly trích I và II khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05). Khác nhau giữa hai qui trình là thay đổi thời gian ở giai đoạn ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào. Đối với qui trình II, thời gian thực hiện giai đoạn này ngắn hơn nhƣng có kết hợp vortex mẫu trong quá trình ủ cho nên sự tiếp xúc giữa mẫu và dung dịch phân giải tốt hơn so với qui trình I. Chính điều này làm cho yếu tố thời gian không ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả phân giải tế bào của qui trình II. Tỷ số OD qui trình I và II khoảng 1,8 – 2. Nhƣ vậy, DNA ly trích theo qui trình I và II có độ tinh sạch đạt yêu cầu. Tuy nhiên, so với qui trình I, thời gian thực hiện 40 của qui trình II ngắn hơn nên chúng tôi quyết định giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào. 4.1.2 Giảm thời gian tủa DNA lần I DNA từ cơ bò đƣợc tách chiết theo qui trình I và III, kết quả đo OD đƣợc trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình tách chiết I và III Biểu đồ 4.2 DNA tách chiết theo qui trình I và III Theo kết quả ở bảng 4.2, độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ hai qui trình tách chiết I và III khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05). Điểm khác biệt giữa qui trình I và qui trình III là thời gian tủa DNA lần 1 trong 1 giờ thay vì 2 giờ. Độ tinh sạch DNA trong hai qui trình ly trích đều nằm trong khoảng 1,8 – 2. Từ kết quả trên chúng tôi quyết định giảm thời gian tủa DNA lần 1. 4.1.3 Không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2 DNA từ cơ bò đƣợc tách chiết theo qui trình I và IV, kết quả đo OD đƣợc trình bày ở bảng 4.3. Chỉ tiêu Qui trình I ( X ± SD) Qui trình III ( X ± SD) Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,86 ± 0,02 1,87 ± 0,03 P = 0,79 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,23 ± 0,03 0,21 ± 0,02 P = 0,54 Số mẫu 5 5 41 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và IV Biểu đồ 4.3 DNA tách chiết theo qui trình I và IV Qua kết quả ở bảng 4.3, DNA ly trích từ cơ theo hai qui trình I và IV có độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05). Tỷ số OD của DNA tách chiết từ hai qui trình khoảng 1,8 – 2. Nhƣ vậy, độ tinh sạch của DNA thu đƣợc từ hai qui trình đạt yêu cầu. Chúng tôi thực hiện qui trình IV nhƣ qui trình I nhƣng không có giai đoạn tủa DNA lần 2. Mục đích của giai đoạn này là làm tinh sạch DNA. Do đây là phƣơng pháp tách chiết DNA có sử dụng phenol, proteinase K nên rất hiệu quả trong việc loại bỏ protein trong DNA tách chiết. Vì thế, việc thực hiện giai đoạn này là không cần thiết. 4.1.4 Giảm thời gian hòa tan DNA trong TE DNA từ cơ bò đƣợc tách chiết theo qui trình I và V, kết quả đo OD đƣợc trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và V Chỉ tiêu Qui trình I ( X ± SD) Qui trình IV ( X ± SD) Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,86 ± 0,02 1,88 ± 0,04 P = 0,65 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,23 ± 0,03 0,19 ± 0,04 P = 0,42 Số mẫu 5 5 Chỉ tiêu Qui trình I ( X ± SD) Qui trình V ( X ± SD) Sai biệt thống kê 42 Biểu đồ 4.4 DNA tách chiết theo qui trình I và V Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy độ tinh sạch của DNA thu đƣợc từ hai qui trình ly trích I và V khác nhau một cách rất có ý nghĩa (p < 0,01). Hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ hai qui trình ly trích khác nhau không ý nghĩa (p > 0,05). Độ tinh sạch của DNA ly trích theo hai qui trình đều đạt yêu cầu. Hai qui trình này chỉ khác nhau về thời gian hòa tan DNA trong TE. Đối với qui trình V, thời gian thực hiện giai đoạn này là 2 giờ còn ở qui trình I giai đoạn này thực hiện qua đêm. Nhƣ vậy, quá trình tách chiết DNA theo qui trình V có tỷ số OD trung bình 1,95 sạch hơn so với DNA tách chiết theo qui trình I một cách có ý nghĩa. Ở qui trình I, giai đoạn hòa tan DNA đƣợc thực hiện qua đêm cho nên lƣợng DNA tan hoàn toàn nhƣng cũng kéo theo sự hòa tan một số tạp chất có trong cặn DNA cho nên làm giảm độ tinh sạch của DNA. Ngƣợc lại, giai đoạn hòa tan DNA ở qui trình V đƣợc thực hiện trong thời gian ngắn nên hạn chế sự hòa tan tạp chất nhƣng lại làm giảm hàm lƣợng DNA hòa tan. Do đó, hàm lƣợng DNA tách chiết theo qui trình V thấp hơn so với hàm lƣợng DNA tách chiết theo qui trình I. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa (p > 0,05). Qua kết quả thu đƣợc ở bảng 4.4, chúng tôi quyết định giảm thời gian hòa tan DNA trong TE. 4.2 KẾT QUẢ THIẾT LẬP BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA 4.2.1 So sánh hiệu quả tách chiết DNA theo qui trình của bộ kit và qui trình I Tỷ số OD 1,86 ± 0,02 1,95 ± 0,01 P = 0,006 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,23 ± 0,03 0,16 ± 0,03 P = 0,1 Số mẫu 5 5 43 DNA đƣợc tách chiết theo qui trình của bộ kit và qui trình I, kết quả đo OD đƣợc trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc theo qui trình I và bộ kit Biểu đồ 4.5 DNA tách chiết theo qui trình I và qui trình bộ kit Kết quả bảng 4.5 cho thấy độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA tách chiết theo qui trình I và qui trình của bộ kit khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05). Bộ kit tách chiết DNA từ cơ đƣợc thiết lập từ các qui trình II, III, IV, V. Các qui trình này khác nhau về độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA so với qui trình I một cách không có ý nghĩa, thậm chí độ tinh sạch cao hơn qui trình I. Cho nên khi thiết kế bộ kit tách chiết DNA từ các qui trình này đã mang lại hiệu quả tách chiết không kém với qui trình I. Chất lƣợng DNA tách chiết từ bộ kit chỉ đƣợc đánh giá bằng tỷ số OD thì chƣa đủ cơ sở để kết luận mẫu DNA đảm bảo yêu cầu cho các ứng dụng của kỹ thuật sinh học phân tử. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả phản ứng PCR với nguồn DNA tách chiết từ bộ kit. 4.2.1.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR Chỉ tiêu Qui trình I ( X ± SD) Qui trình theo bộ kit ( X ± SD) Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,86 ± 0,02 1,85 ± 0,01 P = 0,51 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,23 ± 0,03 0,21 ± 0,02 P = 0,56 Số mẫu 5 10 44 Thực hiện phản ứng PCR với primer của gen giới tính và gen thụ thể estrogen với nguồn DNA mẫu từ hai qui trình tách chiết DNA, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.6 và 4.7. Bảng 4.6 Tỷ lệ thành công khi PCR với primer của gen giới tính Qui trình tách chiết DNA Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) I 10 10 100 Bộ kit 10 10 100 Bảng 4.7 Tỷ lệ thành công khi PCR với primer của gen thụ thể estrogen Qui trình tách chiết DNA Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) I 5 5 100 Bộ kit 5 5 100 Kết quả từ bảng 4.6 và 4.7 cho thấy tỷ lệ thành công khi thực hiện phản PCR với DNA tách chiết theo qui trình I và qui trình của bộ đều cho tỷ lệ thành công 100%. Kết quả so sánh hiệu quả tách chiết DNA theo hai qui trình bằng phƣơng pháp đo OD và phƣơng pháp PCR, chúng ta khẳng định chất lƣợng DNA tách chiết theo qui trình của bộ kit đảm bảo yêu cầu cho việc thực hiện phản ứng PCR. Trong kỹ thuật PCR xác định gen giới tính, trên con đực sản phẩm PCR có band với kích thƣớc 655 bp và trong kỹ thuật PCR xác định gen thụ thể estrogen sản phẩm PCR có kích thƣớc 120 bp. Nhƣ vậy, tính nguyên vẹn của DNA tách chiết từ bộ kit có thể đáp ứng yêu cầu khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu có kích thƣớc lớn lẫn kích thƣớc nhỏ. 45 A: qui trình I; B: qui trình bộ kit; LAD: ladder Hình 4.1 Sản phẩm PCR gen giới tính từ DNA tách chiết của hai qui trình I: qui trình I; II: qui trình bộ kit Hình 4.2 Sản phẩm PCR gen thụ thể estrogen từ DNA tách chiết của hai qui trình Tiện lợi, nhanh chóng là các điểm vƣợt trội của qui trình tách chiết DNA theo bộ kit khi so sánh với qui trình I. Với bộ kit tách chiết DNA, các hóa chất đƣợc phối trộn sẵn với nồng độ hợp lý và số thao tác trong quá trình thực hiện giảm đáng kể khi so sánh với qui trình I cho nên tạo sự tiện lợi cho ngƣời sử dụng. Nếu sử dụng qui trình 46 I để tách chiết DNA, chúng ta cần 24 giờ để hoàn thành công việc, trong khi đó nếu dùng bộ kit ngƣời sử dụng chỉ mất 5 giờ là có đƣợc mẫu DNA sẵn sàng cho phản ứng PCR. Với sản phẩm Wizard Genomic DNA Purification Kit của công ty Promega, ngƣời sử dụng mất 5 – 6 giờ để hoàn thành việc tách chiết DNA từ cơ vân. Nhƣ vậy, về mặt thời gian để thực hiện công đoạn tách chiết, sản phẩm của chúng tôi không thua kém so với sản phẩm của công ty Promega. 4.2.2 Thử nghiệm tính ổn định của bộ kit ly trích DNA từ cơ vân Bảng 4.8 Kết quả đo OD của DNA tách chiết theo bộ kit ở các thời điểm bảo quản Thời gian Bảo quản Tham số Thống kê Tỷ số OD Nồng độ DNA (µg/µl) 2 tuần n 5 5 X 1,87 0,22 SD 0,03 0,03 1 tháng n 5 5 X 1,92 0,2 SD 0,03 0,02 2 tháng n 5 5 X 1,93 0,21 SD 0,03 0,02 3 tháng n 5 5 X 1,94 0,2 SD 0,03 0,01 Sai biệt thống kê P = 0,48 P = 0,83 Biểu đồ 4.6 Hiệu quả tách chiết DNA của bộ kit ở các thời điểm bảo quản 47 Từ kết quả ở bảng 4.8 chúng ta có thể kết luận độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA tách chiết từ bộ kit ở các thời điểm bảo quản khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05). Nhƣ vậy, sau 3 tháng bảo quản bộ kit tách chiết DNA vẫn cho hiệu quả tách chiết đạt yêu cầu. 4.3 KẾT QUẢ THIẾT LẬP BỘ KIT PCR PHÁT HIỆN GEN HALOTHAN 4.3.1 Kết quả khảo sát nồng độ glycerol trong Master Mix 2X Thực hiện phản ứng PCR với Master Mix 2X ở 2 nồng độ glycerol 10% và 20% sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần bảo quản. Tiến hành 5 phản ứng PCR cho mỗi thời gian bảo quản ở mỗi nồng độ, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9 Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR với Master Mix 2X Theo kết quả ở bảng 4.9, tỷ lệ thành công của phản ứng PCR với Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 10% và 20% sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần bảo quản ở 4oC đều đạt 100%. Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR chỉ có sự khác biệt sau 4 tuần bảo quản Master Mix 2X ở các nồng độ glycerol. Do đó, chúng tôi dùng trắc nghiện chi – square để so sánh giữa hai phƣơng pháp: Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 10% sau 4 tuần bảo quản (phƣơng pháp A) và Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 20% sau 4 tuần bảo quản (phƣơng pháp B). Kết quả trình bày ở bảng 4.10. Bảng 4.10 Tỷ lệ thành công của phản ứng PCR ở hai phƣơng pháp Phƣơng pháp Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) A 5 1 20% B 5 5 100% Sai biệt thống kê P < 0,01 Nồng độ glycerol Thời gian bảo quản 10% 20% 1 tuần 100% 100% 2 tuần 100% 100% 3 tuần 100% 100% 4 tuần 20% 100% 48 Kết quả ở bảng 4.10 cho thấy sử dụng Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 20% sau 4 tuần bảo quản ở 4oC cho hiệu quả phản ứng PCR cao hơn rõ rệt so với Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 10% bảo quản cùng điều kiện (100% so với 20%). Nhƣ vậy, yếu tố nồng độ glycerol gây ra sự khác biệt về tỷ lệ thành công phản ứng PCR giữa hai phƣơng pháp A và B. Ở tuần thứ 3, với nồng độ glycerol 10% trong Master Mix 2X tuy cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR là 100% nhƣng band điện di sản phẩm PCR trên gel mờ hơn so với band điện di của phản ứng PCR với nồng độ 20 % trong Master Mix 2X. Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể là do sự giảm hoạt tính của Taq trong Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 10%. Trong các buffer trữ Taq của đa số các công ty sinh học hiện nay đều chứa 50% glycerol (v/v). Theo Gerard và Henegariu (1997), glycerol ở nồng độ cao có khả năng giúp ổn định Taq. Do đó, kết quả thu đƣợc ở trên là phù hợp với những dẫn liệu đã đề cập. Với nồng độ glycerol 20% trong Master Mix 2X chúng ta có thể bảo quản sau 4 tuần ở 4oC mà vẫn cho hiệu quả phản ứng PCR tối ƣu. Một vấn đề cần đặt ra là chúng ta có thể tăng thêm nồng độ glycerol để tăng thời gian bảo quản. Theo Henegariu (1997), nồng độ glycerol thêm vào mỗi phản ứng PCR từ 5% - 10% để tăng cƣờng hiệu quả phản ứng, nếu nồng độ glycerol cao hơn mức cho phép sẽ gây ức chế phản ứng PCR và phản ứng cắt bởi enzym giới hạn. Master Mix 2X chứa 20% glycerol thì trong hỗn hợp PCR (thể tích phản ứng 30 µl) nồng độ glycerol là 10% phù hợp với nồng độ glycerol khuyến cáo trong phản ứng PCR. Cho nên chúng tôi quyết định chọn nồng độ glycerol 20 % để pha Master Mix 2X cho bộ kit PCR halothan. 49 Hình 4.3 Sản phẩm PCR gen halothan ở hai nồng độ glycerol 4.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ bảo quản Master Mix 2X Kết quả ở mục 4.3.1 cho thấy ở điều kiện bảo quản 4oC sau 4 tuần, Master Mix 2X chứa 20% glycerol cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR là 100%, cho nên chúng tôi chỉ tiến hành thực hiện 5 phản ứng PCR với Master Mix 2X sau mỗi tuần bảo quản ở nhiệt độ bảoquản 10oC để xác định khoảng nhiệt độ tối ƣu trong việc bảo quản bộ kit, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.11. Bảng 4.11 Tỷ lệ thành công của bộ kit PCR halothan ở 10oC Thời gian bảo quản Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) 1 tuần 5 5 100 2 tuần 5 5 100 3 tuần 5 5 100 5 5 100 4 tuần 5 5 100 100 Kết quả từ bảng 4.11 cho thấy tỷ lệ thành công của phản ứng PCR với Master Mix 2X bảo quản ở 10oC qua các thời gian (1 tuần đến 4 tuần) đều cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR là 100%. Nhƣ vậy, khoảng nhiệt độ từ 4oC → 10oC là khoảng nhiệt độ có thể dùng để bảo quản bộ kit PCR halothan trong quá trình sử dụng. Theo Gerard và Henegariu (1999), glycerol có khả năng giúp bảo vệ Taq dƣới những tác động của nhiệt. Chính vì 50 vậy, kết quả thu đƣợc thí nghiệm này có thể lý giải do những tác động của glycerol trong thành phần bộ kit PCR. Theo Denhart và Doratswamy (2002), sản phẩm PCR Master Mix của công ty Promega có thể bảo quản ở khoảng nhiệt độ 2oC – 8oC. Qua kết quả khảo sát bảo quản 2X PCR Master Mix ở 4oC → 10oC không có khác biệt lớn khi so sánh với điều kiện bảo quản của công ty Promega. Với nhiệt độ bảo quản 4oC – 10oC, 2X PCR Master Mix có thể dễ vận chuyển đi xa, tránh rã đông sản phẩm và tạo thuận lợi trong việc bảo quản sản phẩm ở những nơi có cơ sở vật chất thiếu thốn. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ có tính thƣơng mại. Ngƣời sử dụng có thể dùng bộ kit PCR halothan sau khi đã bảo quản 1 tháng ở 4oC → 10oC để thực hiện phản ứng. Cũng theo Denhart và Doratswamy (2002), sản phẩm PCR Master Mix của công ty Promega có thể bảo quản ở khoảng nhiệt độ 2oC – 8oC trong thời gian 3 tháng. Xét về thời gian bảo quản, sản phẩm của chúng tôi thấp hơn so với sản phẩm của công ty Promega. Đây là hạn chế của đề tài do không có đủ thời gian để khảo sát các thời gian bảo quản lâu hơn. Tuy nhiên, bộ kit PCR của chúng tôi chỉ dùng cho 10 phản ứng PCR cho nên thời gian bảo quản 1 tháng là có thể chấp nhận đƣợc. Hình 4.4 Sản phẩm PCR gen halothan ở hai nhiệt độ bảo quản 4.3.3 Kết quả khảo sát độ nhạy của bộ kit PCR halothan Sử dụng bộ kit PCR halothan sau 2 tuần để thực hiện phản ứng PCR với DNA tách chiết từ cơ ở các nồng độ khác nhau đã cho kết quả ở bảng 4.12. 51 Bảng 4.12 Kết quả PCR ở các nồng độ DNA mẫu Kết quả bảng 4.12 cho thấy hiệu quả bộ kit PCR halothan ở các nồng độ DNA mẫu khác nhau, tỷ lệ thành công của phản ứng PCR vẫn đạt 100%. Tuy nhiên, độ sáng band điện di trên gel khác nhau ở các nồng độ. Độ sáng của band tỷ lệ thuận với nồng độ DNA mẫu. Hình 4.5 Sản phẩm PCR gen halothan ở các nồng độ DNA mẫu Bộ kit PCR halothan vẫn cho kết quả khuếch đại với nồng độ DNA mẫu 1 ng. Nhƣ vậy bộ kit PCR halothan có thể dùng để xác định gen halothan ở các mẫu có lƣợng DNA thấp nhƣ DNA tách chiết từ mô máu, lông,… Nồng độ DNA Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) 50 ng 5 5 100 20 ng 5 5 100 10 ng 5 5 100 1ng 1 ng 5 5 100 52 4.3.4 Hiệu quả của bộ kit PCR halothan với DNA tách chiết từ máu và da Thực hiện phản ứng PCR trên 10 mẫu DNA chiết tách từ máu và 5 mẫu DNA tách chiết từ da, kết quả tỷ lệ thành công của phản ứng PCR là 100% trên mẫu máu và da. Hình 4.6 Sản phẩm PCR gen halothan từ mẫu máu 53 Hình 4.7 Sản phẩm PCR gen halothan từ mẫu da Nhƣ vậy, bộ kit tách chiết DNA sau 3 tháng bảo quản ở 4oC vẫn đảm bảo hiệu quả tách chiết DNA đạt yêu cầu cho phản ứng PCR. Với bộ kit tách chiết DNA, ngƣời sử dụng có thể dùng để tách chiết DNA từ mô cơ, mô máu và da. Kết quả trên cho thấy bộ kit PCR halothan có thể dùng để khuếch đại DNA tách chiết từ mô cơ, máu và da. Bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan đã đáp ứng đƣợc tiêu chí nhanh, tiện lợi, hiệu quả trong việc phát hiện gen halothan trên heo. Tuy nhiên, do nhu cầu đa dạng trong thực tiễn ngành chăn nuôi, đôi khi phải phát hiện gen halothan từ mẫu lông thú. Do vậy, bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan cần đƣợc nghiên cứu thêm để đáp ứng yêu cầu này. Hình 4.8 Sản phẩm cắt enzym giới hạn HhaI của gen halothan 54 4.3.5 Hiệu quả kinh tế của bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan Bảng 4.13 Chi phí hóa chất sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR Bộ kit Hóa chất Lƣợng dùng Thành tiền (VNĐ) Tách chiết DNA Tris-HCl 0,36 g 640,8 EDTA 0,002 g 3,5 Na2EDTA 0,08 g 240 NaCl 0,007 g 3,98 SDS 0,06 g 67,2 Sodium acetate 0,646 g 350 Ethanol 100 % 105 ml 64.000 Phenol 12,5 ml 16.250 Chloroform 12 ml 1200 Isoamyl alcohol 0,5 ml 72,5 Proteinase K 6,2 mg 148.800 Tổng chi phí 231.743 PCR halothan Taq ABgene 10 UI 96.000 dNTP (25mM) 2,4 µl 4.800 Primer ngƣợc (15 pmol/ µl) 10 µl 900 Primer xuôi (15 pmol/ µl) 10 µl 900 DTT (25mM) 6 µl 580 Tween 20 0,6 µl 370 Glycerol 30 µl 450 DNA chuẩn 1 mẫu 4.600 55 Theo bảng 4.13, chi phí để sản xuất bộ kit tách chiết DNA cho 100 mẫu là 231.743 VNĐ và chi phí để sản xuất bộ kit PCR halothan cho 10 phản ứng là 108.600 VNĐ. Nếu tính hao hụt hóa chất trong sản xuất là 10%, chi phí để sản xuất bộ kit tách chiết DNA cho 100 mẫu là 260.000 VNĐ và chi phí để sản xuất bộ kit PCR halothan cho 10 phản ứng là 120.000 VNĐ. Sản phẩm Wizard Genomic DNA Purification Kit sử dụng cho 100 lần tách chiết của công ty Promega có giá bán trên thị trƣờng là 124 USD (khoảng 1.981.000 VNĐ). Nhƣ vậy khi so sánh với chi phí sản xuất bộ kit tách chiết DNA, sản phẩm của công ty Promega có giá đắt hơn gấp hơn 7 lần trong khi sản phẩm Wizard Genomic DNA Purification Kit không có cung cấp proteinase K. Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam chƣa có bộ kit PCR halothan, các bộ kit PCR để phát hiện virus gây bệnh trên tôm của phòng sinh học phân tử - Viện Công Nghệ Sinh Học có giá bán 2.500.000 VNĐ / bộ cho 100 phản ứng. Nhƣ vậy, với chi phí sản xuất bộ kit PCR halothan, sản phẩm tạo ra hoàn toàn có thể cạnh tranh trên thị trƣờng. Tổng chi phí 108.600 56 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Thiết lập đƣợc bộ kit tách chiết DNA cho 100 mẫu và bộ kit PCR halothan cho 10 phản ứng, đáp ứng tiêu chí: nhanh, tiện lợi, hiệu quả. 2) Bộ kit tách chiết DNA có thể dùng để tách chiết DNA từ mô cơ, máu, da. Bộ kit tách chiết DNA có thể bảo quản ở 4oC trong 3 tháng. 3) Master Mix 2X chứa glycerol nồng độ 20% cho tỷ lệ PCR thành công cao hơn Master Mix 2X chứa glycerol 10% sau 1 tháng bảo quản ở 4oC. 4) Khoảng nhiệt độ 4oC → 10oC có thể dùng để bảo quản Master Mix 2X trong 1 tháng. 5) Bộ kit PCR halothan có thể phát hiện gen halothan với nồng độ DNA mẫu tối thiểu 1ng. 6) Bộ kit PCR halothan có thể sử dụng hiệu quả với DNA tách chiết từ mô cơ, mô máu và da. 5.2 ĐỀ NGHỊ 1) Khảo sát hiệu quả của bộ kit PCR halothan với DNA tách chiết từ lông. 2) Theo dõi tính ổn định của bộ kit PCR halothan sau 2 tháng, 3 tháng bảo quản. 3) Khảo sát nồng độ glycerol lớn hơn 20% trong Master Mix 2X để xác định nồng độ glycerol mang lại hiệu quả tốt nhất cho bộ kit PCR halothan. 4) Ứng dụng bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan vào thực tế sản xuất. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. 2. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothan, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ Sở Di Truyền Phân Tử Và Kỹ Thuật Gen. NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội. Tr. 121-125 và tr. 137-140. 4. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật Multiplex PCR trên ba giống bò. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công ngệ sinh học, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.  Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 5. Alves A. C. B., Hossepian de Lima M. F. V., Teixera M. C., Moreira- Filho A. C., 2003. Use of primers derived from a new sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus and Bos indicus embryos. Theriogenology 59: 1415-1419. 6. Barton-Gade P. A., Chrystall B. B., Kirton A. H., Longdill G. R., Cross H. R., and Jenspersen M., 1988. Slaughter procedures for pigs, sheep, cattle and poultry. In World animal science (Cross H. R. and Overby A. J.). Elsevier science publishers, pp 33-36. 7. Chambers P. G., and Grandin T., 2001. Guidelines for human handling, transport and slaughter of livestock. Ho Chi Minh city, Viet Nam, July 2006. 58 8. Denhart M., and Doraiswamy V., 2001. Advantages of PCR Master Mix. Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2006. 9. Du W., 2004. Porcine Stress Syndrome gene and pork production. Ho Chi Minh city, Viet Nam, May 2006. 10. Ellis M., and Bertol T. M., 2001. Halothane genotype and pork quality. Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2006. 11. Franco M. M., Conatser A. L., Carneiro A. L., Rodrigues M. C., 1998. Relationship between the Porcine Stress Syndrome gene and pork quality. Ho Chi Minh city, Viet Nam, May 2006. 12. Fujii J., Otsu K., Zorzato F., Deleon S., Khanna V. K., Weiler J. E. and MacLennan D.H., 1991. Identification of a mutation in the porcine ryanodine receptor associated malignant hyperthermia. Science, 253: 448-451. 13. Gerard D. R, and Henegariu L. M., 1997. Adjuvants in PCR reactions. Biotechniques 23: 504-511. 14. Houde A., Pommier S. A. and Roy R., 1993. Detection of the ryanodine receptor mutation associated with malignant hyperthermia. Science 253: 448- 452. 15. Hughes I. P., Moran C., and Nicholas F. W., 1992. PCR genotype of the ryanodine receptor gene for a putative causal mutation for malignant hyperthermia in Autralian pis. J. Anim. Breed. Genet. 109: 465-476. 16. Lundstrom K., Essen-Gustavson B., Rundgren M., Edfors-Lilja I., and Malmfors G., 1989. Effect of halothane genotype on muscle metabolism at slaughter and its relationships with meat quality: A within – litter comparison. Meat Science, 0309 - 1740: 251-261. 17. Pfeiffer H., Lengerken G. V., Schwalbe M., Horn P. and Kovac G., 1986. Relationships between the stress susceptibility and the fertility of pig. 37 th Animal meeting of the European associated for animal prodution, Budapest, Hungary. 18. Rundgren M., Lundstrom K., and Edfors-Lilja I., 1990. A within – litter comparison of the three halothane genotype. 2. Performance, carcass quality, 59 organ development and long – term effects of transportation and amperozide. Liverstock Production Science 26: 231-243. 19. Schneider A., Schworer D. and Blum J., 1980. Effects of halothane genotype on production and reproduction traits in Swiss Landrace. Anim. Prod., Munich, Germany. 20. Short T. H., Rothschild M. F., Southwood O. I., McLaren D. G., de Vries A., van der Steen H., Eckardt G. R., Tuggle C. K., Helm J., Vaske D.A., Mileham A. J., and Plastow G. S., 1997. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines. J. Anim. Sci. 75:3188-3142. 21. Simpson S. P., and Webb A. J., 1989. Growth and carcass performance or British Landrace pigs heterozygous at the halothane locus.p. 503 – p. 509. 22. Weaver K. P., Wilfinger M. C., and Loffert A. J., 1997. DNA extraction and purification. Ho Chi Minh city, Viet Nam, May 2006. 23. Willeke H., Amler K., and Fisher K., 1984. The influence of the halothane genotype of the sow on her litter size. Zuechtungskunde 56:20-25. 60 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 1  CHỈ TIÊU TỶ SỐ OD One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn1.OD Level codes: tn1.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0106602 1 .0106602 4.737 .0612 Within groups .0180027 8 .0022503 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0286629 9 Table of means for tn1.OD by tn1.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 .0150994 .0212148 1.8244376 1.8936424 2 5 1.9243400 .0259258 .0212148 1.8897376 1.9589424 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 1.8916900 .0150011 .0150011 1.8672224 1.9161576 Multiple range analysis for tn1.OD by tn1.nt --------------------------------------------------------------------------- 61 Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 X 2 5 1.9243400 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.06530 0.06920  CHỈ TIÊU HÀM LƢỢNG DNA One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn12.nongdoDNA Level codes: tn12.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0072900 1 .0072900 2.089 .1864 Within groups .0279200 8 .0034900 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0352100 9 Table of means for tn12.nongdoDNA by tn12.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 .2340000 .0326497 .0264197 .1909082 .2770918 2 5 .1800000 .0181659 .0264197 .1369082 .2230918 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 .2070000 .0186815 .0186815 .1765295 .2374705 Multiple range analysis for tn12.nongdoDNA by tn12.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 2 5 .1800000 X 62 1 5 .2340000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.05400 0.08618 --------------------------------------------------------------------------- KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 2  CHỈ TIÊU TỶ SỐ OD One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn21.OD Level codes: tn21.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0002611 1 .0002611 .075 .7934 Within groups .0277058 8 .0034632 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0279670 9 Table of means for tn21.OD by tn21.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 .0150994 .0263182 1.8161138 1.9019662 2 5 1.8692600 .0340191 .0263182 1.8263338 1.9121862 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 1.8641500 .0186098 .0186098 1.8337966 1.8945034 Multiple range analysis for tn21.OD by tn21.nt 63 --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 X 2 5 1.8692600 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.01022 0.08585 ---------------------------------------------------------------------------  CHỈ TIÊU HÀM LƢỢNG DNA One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn22.nongdoDNA Level codes: tn22.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0016900 1 .0016900 .415 .5443 Within groups .0326000 8 .0040750 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0342900 9 Table of means for tn22.nongdoDNA by tn22.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 .2340000 .0326497 .0285482 .1874365 .2805635 2 5 .2080000 .0237487 .0285482 .1614365 .2545635 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 .2210000 .0201866 .0201866 .1880746 .2539254 Multiple range analysis for tn22.nongdoDNA by tn22.nt --------------------------------------------------------------------------- 64 Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 2 5 .2080000 X 1 5 .2340000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.02600 0.09313 --------------------------------------------------------------------------- KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 3  CHỈ TIÊU TỶ SỐ OD One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn31.OD Level codes: tn31.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0011903 1 .0011903 .232 .6480 Within groups .0410589 8 .0051324 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0422491 9 Table of means for tn31.OD by tn31.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 .0150994 .0320386 1.8067835 1.9112965 2 5 1.8808600 .0427195 .0320386 1.8286035 1.9331165 65 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 1.8699500 .0226547 .0226547 1.8329991 1.9069009 Multiple range analysis for tn31.OD by tn31.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 X 2 5 1.8808600 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.02182 0.10451 --------------------------------------------------------------------------  CHỈ TIÊU HÀM LƢỢNG DNA One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn32.nongdoDNA Level codes: tn32.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0044100 1 .0044100 .754 .4195 Within groups .0468000 8 .0058500 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0512100 9 Table of means for tn32.nongdoDNA by tn32.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 .2340000 .0326497 .0342053 .1782096 .2897904 2 5 .1920000 .0356931 .0342053 .1362096 .2477904 --------------------------------------------------------------------------- 66 Total 10 .2130000 .0241868 .0241868 .1735502 .2524498 Multiple range analysis for tn32.nongdoDNA by tn32.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 2 5 .1920000 X 1 5 .2340000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.04200 0.11158 --------------------------------------------------------------------------- KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 4  CHỈ TIÊU TỶ SỐ OD One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn41.OD Level codes: tn41.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0210497 1 .0210497 29.533 .0006 Within groups .0057020 8 .0007127 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0267517 9 Table of means for tn41.OD by tn41.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 67 --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 .0150994 .0119394 1.8395662 1.8785138 2 5 1.9508000 .0075570 .0119394 1.9313262 1.9702738 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 1.9049200 .0084424 .0084424 1.8911500 1.9186900 Multiple range analysis for tn41.OD by tn41.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 X 2 5 1.9508000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.09176 0.03895 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  CHỈ TIÊU HÀM LƢỢNG DNA One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn42.nongdoDNA Level codes: tn42.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0136900 1 .0136900 2.935 .1251 Within groups .0373200 8 .0046650 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0510100 9 Table of means for tn42.nongdoDNA by tn42.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 .2340000 .0326497 .0305450 .1841796 .2838204 68 2 5 .1600000 .0282843 .0305450 .1101796 .2098204 --------------------------------------------------------------------------- Total 10 .1970000 .0215986 .0215986 .1617716 .2322284 Multiple range analysis for tn42.nongdoDNA by tn42.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 2 5 .1600000 X 1 5 .2340000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.07400 0.09964 --------------------------------------------------------------------------- KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 5  CHỈ TIÊU TỶ SỐ OD One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn51.OD Level codes: tn51.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0005027 1 .0005027 .486 .5054 Within groups .0134546 13 .0010350 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0139573 14 69 Table of means for tn51.OD by tn51.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8590400 .0150994 .0143873 1.8370562 1.8810238 2 10 1.8467600 .0099414 .0101733 1.8312151 1.8623049 --------------------------------------------------------------------------- Total 15 1.8508533 .0083065 .0083065 1.8381610 1.8635457 Multiple range analysis for tn51.OD by tn51.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 2 10 1.8467600 X 1 5 1.8590400 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.01228 0.03808 ---------------------------------------------------------------------------  CHỈ TIÊU HÀM LƢỢNG DNA One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn52.nongdoDNA Level codes: tn52.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0017633 1 .0017633 .376 .5569 Within groups .0610100 13 .0046931 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0627733 14 Table of means for tn52.nongdoDNA by tn52.nt --------------------------------------------------------------------------- 70 Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 .2340000 .0326497 .0306368 .1871869 .2808131 2 10 .2110000 .0210000 .0216635 .1778981 .2441019 --------------------------------------------------------------------------- Total 15 .2186667 .0176882 .0176882 .1916391 .2456942 Multiple range analysis for tn52.nongdoDNA by tn52.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 2 10 .2110000 X 1 5 .2340000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.02300 0.08108 --------------------------------------------------------------------------- KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 6  CHỈ TIÊU TỶ SỐ OD One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn61.od Level codes: tn61.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0114458 3 .0038153 .870 .4770 71 Within groups .0701639 16 .0043852 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0816097 19 Table of means for tn61.od by tn61.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8736200 .0312292 .0296150 1.8292161 1.9180239 2 5 1.9209400 .0271251 .0296150 1.8765361 1.9653439 3 5 1.9257400 .0309095 .0296150 1.8813361 1.9701439 4 5 1.9357400 .0290132 .0296150 1.8913361 1.9801439 --------------------------------------------------------------------------- Total 20 1.9140100 .0148075 .0148075 1.8918080 1.9362120 Multiple range analysis for tn61.od by tn61.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.8736200 X 2 5 1.9209400 X 3 5 1.9257400 X 4 5 1.9357400 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.04732 0.08881 1 - 3 -0.05212 0.08881 1 - 4 -0.06212 0.08881 2 - 3 -0.00480 0.08881 2 - 4 -0.01480 0.08881 3 - 4 -0.01000 0.08881 ---------------------------------------------------------------------------  CHỈ TIÊU HÀM LƢỢNG DNA One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: tn62.nongdoDNA Level codes: tn62.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig.level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .0017800 3 .0005933 .296 .8280 Within groups .0321200 16 .0020075 --------------------------------------------------------------------------- 72 Total (corrected) .0339000 19 Table of means for tn62.nongdoDNA by tn62.nt --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 5 .2200000 .0282843 .0200375 .1899564 .2500436 2 5 .1980000 .0198494 .0200375 .1679564 .2280436 3 5 .2060000 .0163095 .0200375 .1759564 .2360436 4 5 .1960000 .0120830 .0200375 .1659564 .2260436 --------------------------------------------------------------------------- Total 20 .2050000 .0100187 .0100187 .1899782 .2200218 Multiple range analysis for tn62.nongdoDNA by tn62.nt --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 4 5 .1960000 X 2 5 .1980000 X 3 5 .2060000 X 1 5 .2200000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.02200 0.06009 1 - 3 0.01400 0.06009 1 - 4 0.02400 0.06009 2 - 3 -0.00800 0.06009 2 - 4 0.00200 0.06009 3 - 4 0.01000 0.06009 --------------------------------------------------------------------------- KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA THÍ NGHIỆM 7 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) --------------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance --------------------------------------------------------------------------- 6.66667 1 9.82327E-3 3.75000 1 0.0528075 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent --------------------------------------------------------------------------- Lambda 0.77778 0.75000 0.80000 Uncertainty Coeff. 0.61898 0.62824 0.60999 Somer's D -0.81633 -0.80000 -0.83333 73 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 2) --------------------------------------------------------------------------- Statistic Value Significance --------------------------------------------------------------------------- Contingency Coeff. 0.63246 Cramer's V 0.81650 Conditional Gamma -1.00000 Kendall's Tau B -0.81650 Kendall's Tau C -0.80000 Fisher's Exact Test 0.02381 (one-tail) 0.04762 (two-tail)