Luận văn So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng đìều khiển D-Loop của ba giống gà ri, gà mông và gà sao nuôi tại Thái Nguyên

ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 30 phút. Sốc nhiệt ở 42ºC trong 90 giây sau đó chuyển ngay vào đá và giữ trong 5 phút. Bổ sung 300 l SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC trong 1 giờ. Cấy trải các tế bào này trên môi trường LB đặc có bổ sung thêm các thành phần như sau: Amp (50 l/ml) và nuôi ở 37ºC qua đêm. *Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: - LB lỏng (môi trường Luria- Bertani): Bacto-Trypton 10g/l; cao nấm men 5g/l; NaCl 10g/l; NaOH 2mM. - LB đặc: gồm môi trường LB lỏng có bổ sung Agar - Agar 15g/l. - Môi trường SOC: Trypton 5 %; cao nấm men 0,5 %; NaCl 10mM; KCl 2,5mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; Glucose 20mM. Tách DNA plasmid Các khuẩn lạc trắng sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi lắc với tốc độ 200 v/p trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 37ºC, 15 giờ. Sau đó, lắc đều hỗn hợp nuôi cấy và đổ dịch vào trong ống eppendoft loại 1,5 ml rồi tiến hành thu plasmid theo quy trình kỹ thuật sau: Ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. Bỏ dịch, thấm khô. Bổ sung 150 l sol I, vortex cho tan tủa. Thêm 150 l sol II, đảo nhẹ, và giữ trong đá. Thêm 150 l sol III, đảo nhẹ, giữ trong đá hoặc để trong tủ lạnh 0ºC trong 5'. Ly tâm 12000 vòng, 15 phút, 4ºC. Hút dịch sang ống eppendoft mới. Thêm 1 ml cồn 100%, đảo nhẹ và để lạnh ở -20ºC trong ít nhất là 3 giờ. Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Thu cặn, rửa tủa bằng EtOH 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, 4ºC. Làm khô mẫu trong máy hút chân không. Cho 30 l RNAse 10 g/ ml, búng đều và ủ mẫu ở bể ổn nhiệt ở 37ºC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. *Thành phần của các dung dịch tách chiết plasmid: - Dung dịch I (Sol I): Glucose, Tris- HCl (1M, pH8), EDTA (0,5M, pH 8). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Dung dịch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M. Pha mới trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Dung dịch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (giữ ở tủ 4ºC). Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn Mục đích của bước này là kiểm tra xem đoạn DNA đích có được chèn vào vector hay không. Thành phần của phản ứng cắt bao gồm: Buffer Tango 1 l; enzyme XbaI 0,2 l (10u/ l); DNA plasmid 3 l; H2O 5,6 l (tổng thể tích 10 l). Hỗn hợp này sau đó đem ủ ở 37ºC trong ít nhất 3 giờ. Sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1 nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, DNA plasmid 200ng BigDye và nước với tổng thể tích 15 l. Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 như sau: 94ºC- 1 phút; (96ºC-10 giây; 50ºC- 5 giây; 60ºC- 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4ºC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ 3.1.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi Đây là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng trứng, trứng nhiều lòng đỏ được nhiều người ưa thích bởi lòng đỏ là nơi tập trung nhiều chất dinh dưỡng, nhiều loại protein, lipit, các vitamin, axit béo no và không no bổ dưỡng, dễ tiêu... Vì vậy, chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến chỉ tiêu này, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1. và hình 3.1. Bảng 3.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tươi (n=30) Trứng gà Tỷ lệ lòng đỏ (%) X X m Tỷ lệ lòng trắng (%) X X m Tỷ lệ lòng đỏ/ lòng trắng Vỏ( %) X X m Ri (Rhy) 32.7 ± 0,66 57.9± 0,81 0.56 9.4± 0,22 Mông (Mna) 34.82 ± 0,53 54.05± 0,77 0.65 11.13± 0,13 Sao (Sdt) 29.67± 0,84 54.5± 0,58 0.55 15.9± 0,26 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ lòng đỏ (%) Tỷ lệ lòng trắng (%) Vỏ (%) chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy ) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà thí nghiệm Theo kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 tỷ lệ lòng đỏ ở gà Mông cao nhất, thấp nhất ở gà Ri, tỷ lệ lòng trắng gà Ri cao nhất, tỷ lệ vỏ cao nhất ở gà Sao. Tỷ lệ này khá đồng đều ở các nhóm trứng nghiên cứu, đây đều là những giống gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 có chất lượng trứng cao được ưa chuộng trên thị trường. 3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô Tỉ lệ giữa hàm lượng nước và vật chất khô trong trứng gà là một chỉ tiêu quan trọng, rất có ý nghĩa trong việc đánh giá chất lượng của trứng gà. Sau khi tiến hành cân, sấy mẫu trứng gà ở 600C trong 3 ngày cho đến khi khối lượng không thay đổi, kết quả được trình bày trong bảng 3.2. và hình 3.2. Bảng 3.2. Hàm lượng vật chất khô trong trứng gà (n = 30) Trứng gà Lòng đỏ X X m Lòng trắng X X m Vỏ X X m Cả quả X X m Ri (Rhy) 47,28± 0,96 13,52± 0,41 9,022± 0,09 50,34± 1,1 Mông (Mna) 50,76± 1,03 14,64± 0,39 9,105± 0,11 52,15± 1,4 Sao (Sdt) 54,09± 1,17 15,98± 0,53 9,519± 0,25 55,09± 1,3 0 1 2 30 40 50 60 lòng đỏ Lòng trắng Vỏ Cả quả Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông ( Mna) Sao (Sdt) Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng vật chất khô trứng gà thí nghiệm Hàm lượng nước lòng đỏ, lòng trắng, vỏ và cả quả đều cao nhất ở trứng gà Ri (Rhy): 52,72% ; 86,48% ; 9,78; 49,66 và thấp nhất ở gà Sao (Sdt): 45,91%; 84,02%; 4,81%; 44,91%. Tỷ lệ vật chất khô ở trứng gà Sao là cao nhất và ở trứng gà Ri là thấp nhất. Tỷ lệ nước lòng đỏ và lòng trắng theo nghiên cứu của Lê Viết Ly (2001) [5] ở gà Ri là 47,32%; ± 1,137; 87,925 ± 0,109 và vật chất khô lòng đỏ là 52,616 ± 1,137 và lòng trắng là 12,075 ± 0,109. Còn gà Mông Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 ở Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41. Ở trứng gà Ác hàm lượng nước lòng đỏ là 49,3% ± 1,9; hàm lượng nước lòng trắng là 88,8% ± 0,4 [9]; Hàm lượng nước ở lòng đỏ trứng nói chung khoảng 49% , hàm lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản. Như vậy kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước, hàm lượng nước và vật chất khô là tính trạng số lượng, nó phụ thuộc vào giống, nguồn thức ăn và đặc biệt còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản trứng như phần tổng quan đã đề cập. 3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số Hàm lượng lipid tổng số cũng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng trứng. Lipid là một trong những chất dự trữ đem lại giá trị năng lượng cao rất cần thiết cho cơ thể sinh vật nói chung và gà nói riêng. Hàm lượng lipit tập trung chủ yếu ở lòng đỏ, lòng trắng hàm lượng lipit không đáng kể. Do đó hàm lượng lipit liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ lòng đỏ/lòng trắng. Kết quả đo chỉ tiêu hàm lượng lipid tổng số chiết bằng petroleum ether được trình bày ở bảng 3.3. và hình 3.3. Bảng 3.3. Hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm (n = 10) Trứng gà L.L đỏ (%) X X m L.Ltrắng (%) X X m L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) X X m Ri (Rhy) 64± 0,9 11.33± 0,3 5.65 37.67± 0,58 Mông (Mna) 63.33± 0,3 5.33± 0,8 11.88 34.33± 0,3 Sao (Sdt) 64.67± 0,8 6.67± 1.19 9.70 35.67± 0,65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 0 10 20 30 40 50 60 70 L.Lòng đỏ (%) L.Lòng trắng (%) L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm Qua bảng 3.3. và hình 3.3. ta thấy hàm lượng lipid lòng đỏ cao nhất ở gà Sao (Sdt) và thấp nhất ở gà Mông (Mna). Theo tác giả Rôse [27] thì hai phần ba lipit trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho.Vì vậy lòng đỏ trứng được nhiều người ưa chuộng, hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn. Lipit lòng trắng cao nhất ở gà Ri và thấp nhất ở gà Mông. Như vậy, ta thấy rằng hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở trứng gà Ri (37.76%) thấp nhất ở trứng gà Mông Nghệ An (34.33%). Nếu so sánh với kết quả nghiên cứu trên trứng gà công nghiệp của Rôse [27] thì hàm lượng lipit của các giống gà trên cao hơn hẳn. Tỷ lệ lipit lòng đỏ/lòng trắng cao nhất ở gà Mông, thấp nhất ở gà Ri. 3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số Hàm lượng protein là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá giá trị dinh dưỡng của trứng gà. Bằng phương pháp Lowry với máy đo quang phổ, chúng tôi đã thu được kết quả hàm lượng protein thô ở trứng gà của các giống nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. và hình 3.4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bảng 3.4. Hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm (n = 10) Trứng gà Pr-Lđỏ (%) X X m Pr-Ltrắng(%) X X m Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số %) X X m Ri (Rhy) 18.32± 0,64 12.86± 0,24 1.42 15.59± 0,42 Mông (Mna) 16.31± 0,51 12.94± 0,33 1.26 14.63± 0,39 Sao (Sdt) 20.27± 0,82 14.2± 0,49 1.43 17.24± 0,51 0 5 10 15 20 25 Pr-Lđỏ Pr-Ltrắng (%) Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm Qua bảng 3.4. và hình 3.4. ta thấy hàm lượng protein tổng số cao nhất ở trứng gà Sao (17,24%) và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt hàm lượng protein lòng đỏ rất cao 20,27%. Gà sao là giống gà đẻ trứng tập trung 6 tháng liền từ tháng 3 đến tháng 9 (âm) sau đó người ta thu hoạch thịt gà trưởng thành và nuôi lứa khác nên điều này rất có ý nghĩa kinh tế. Kết quả nghiên cứu trên có thể đưa ra một định hướng về chăn nuôi gà Sao, một giống gà rất có giá trị kinh tế, dễ nuôi. Theo kết quả nghiên cứu trên lòng đỏ của trứng gà Ác [9] có hàm lượng protein là 17,6% ± 0,5 thì hàm lượng protein lòng đỏ của trứng gà ri cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác [33]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu trên gà Mông nuôi tại Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ protein lòng đỏ là 16.66%, lòng trắng 11,01%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 3.2. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Sao chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, tách dòng nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt giữa chúng. 3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu nhận và tinh sạch một lượng axit nucleic đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo. Một trong những mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzym phân giải thoát ra môi trường khi các màng tế bào bị phá vỡ). Để đạt được hiệu suất và độ tinh sạch cao nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu, cho nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russell để tách chiết DNA [28]. Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39ºC trong 1 giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng. Sau khi rã đông, đem ly tâm dung dịch máu đã được hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu. Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Như vậy, cả SDS và EDTA đều tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. Hơn thế, pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó; đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn hợp Chloroform:Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần. Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 l CH3COONa 3M, pH5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nuleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện - 20ºC trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng EtOH 70%, làm khô và hòa tan tủa trong nước. Trong dung dịch lúc này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại RNA bằng RNAse, ủ ở 37ºC trong 2-3 giờ. Hòa tan DNA tinh sạch trong nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Kết quả được thể hiện trên hình 3.5. Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di DNA tổng số M: Marker DNA lamda; 1. DNA tổng số của gà Ri; 2. DNA tổng số của gà Mông; 3. DNA tổng số của gà Sao Kết quả điện di cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Mông, Sao đều sáng tập trung và tương đối rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạo nên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương đương với vạch 21kb của marker DNA lamda Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xương sống. Vùng này có chứa các điểm khởi đầu sao chép và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trưng tích lũy các đột biến cao gấp 5-10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA trong nhân, D-loop trở thành vùng ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Vì thế, để đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Mông, Sao, chúng tôi chọn trình tự nuleotide của vùng D-loop như một công cụ để nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 [3] để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu được. Các thông tin về cặp mồi này như sau: L16725 (Tm = 60ºC): 5‟-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3‟(19 nuleotide) H1255 (Tm = 55ºC): 5‟-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3‟(21 nuleotide) Cặp mồi H1255 - L16725 được lựa chọn bởi vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà (Galliformes) [3]. Khi sử dụng cặp mồi này, chúng tôi dự tính sẽ nhân được đoạn điều khiển có kích thước 1227 bp. PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng như thành phần và nồng độ các chất tham gia. Chu trình nhiệt của PCR Điều quan trọng nhất là sự lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của các cặp mồi được sử dụng từ 3 - 5ºC để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 30, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thường khoảng 94 - 95 oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ được hoạt tính. Thời gian biến tính tuỳ thuộc vào hàm lượng G - C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trước khi bước vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ được đặt 95oC trong 3 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến tính hoàn toàn. - Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55ºC nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52ºC. Chúng tôi đã thử chạy phản ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu trong thí nghiệm là 50ºC. - Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ tăng đến 72ºC để cho enzym Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của phản ứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 khoảng 1000 nuleotide/phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước 1227 bp nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi được lựa chọn là 1 phút 20 giây. Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72ºC trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ ở nhiệt độ 4ºC. Thành phần và nồng độ các chất tham gia Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nước. Trong đó có 3 thành phần thường thay đổi trong từng phản ứng là: mồi, MgCl2 và DNA khuôn. - Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong một môi trường đệm phù hợp với hoạt động của enzym có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau khi khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4 + của hãng Fermentas, nó phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lượng sản phẩm tốt hơn so với loại đệm không có chứa NH4 + . - Mồi: là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm thu được. Nồng độ mồi xuôi và ngược sử dụng trong thí nghiệm này là 10 pmol/ l. - MgCl2: Vai trò của ion Mg 2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với enzym, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Mg 2+ là 10mM cho kết quả PCR tốt nhất. - 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ thuộc nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4 mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 bị cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy, nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp. - Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn được tinh sạch và ít bị đứt gãy có chứa trình tự đích cần nhân lên. Thông thường, hàm lượng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10-100ng/phản ứng. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và bảo quản ở 4ºC. Hình 3.6. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR M: Marker; 1: Mẫu gà Ri; 2. Mẫu gà Mông; 3. Mẫu gà Sao Theo ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thước chuẩn (marker); kích thước phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản phẩm PCR đặc hiệu, chương trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham gia phản ứng là phù hợp. Các sản phẩm PCR được trực tiếp sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3 Tách dòng và xác định trình tự vùng D-Loop của DNA ty thể 3.2.3.1. Tách dòng vùng D-Loop Để tạo điều kiện cho việc xác định trình tự vùng D-loop, chúng tôi tiến hành tách dòng phân tử đoạn này với kích thước 1,3 kb đã nhân được bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 cặp mồi L16725- H1255. Chúng tôi đã sử dụng vector pJET1/Blunt để tách dòng vùng D-loop. Vector pJET1/Blunt có kích thước khoảng 3,1kb (3128 nucleotide), đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermentas, mới được sử dụng tại các phòng thí nghiệm. Nó có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với các gen của tế bào chủ E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào mang vector này mới có thể sống dược trong môi trường có Amp. Đồng thời, trên vector này còn có chứa gen gây chết Eco47IR, mã hóa cho enzyme nuclease phân hủy DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector được gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen Eco47IR khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa dẫn đến sự không phân hủy được DNA nhân của tế bào chủ. Nhờ có Eco47IR mà quá trình lựa chọn khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Vùng PlacUV5 điều khiển sự biểu hiện của gen Eco47IR một cách đầy đủ mà không cần đến chất cảm ứng IPTG. Thêm vào đó, vùng MCS (Muntiple Cloning Site) của vector có điểm nhận biết của nhiều enzyme cắt hạn chế như Kpn2I, XhoI, XbaI… nhằm phục vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi tách dòng. Ngoài ra, vector mang trình tự 2 mồi PJET1 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc giải trình tự gen. Như đã biết việc sử dụng Taq polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng 70% - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3‟. Mặt khác, pJET1/Blunt lại là vector tách dòng đầu bằng nên chỉ các sản phẩm PCR dầu bằng hoặc đã được bằng hóa mới thực hiện được phản ứng ghép nối với vector này. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng ghép nối,chúng tôi làm bằng hóa đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Thành phần của phản ứng làm bằng hóa đầu 3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 như sau: 5µl đệm phản ứng 2X; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã được làm bằng hóa vào 0,5µl vector pJET1 (50ng/µl) bằng 0,5µl enzyme T4 DNA ligase (5u/µl). Lấy 3µl sản phẩm ghép nối này để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli dòng DH5α. Các tế bào khả biến được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự đã mang đoạn gen đã nhân được bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra. Tách chiết plasmid Các tế bào sau khi nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. DNA tồn tại trong tế bào vi khuẩn E. coli gồm hai dạng: DNA nhiễm sắc thể có dạng mạch thẳng và DNA plasmid dạng mạch vòng. Để thu nhận và tinh sạch DNA plasmid, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào thu được sau khi nuôi cấy bằng các dung dịch I, II, III. Dung dịch I (sol I) có tác dụng rửa sạch tế bào và hòa tan tế bào. SDS trong sol II có tác dụng phá màng và cùng với EDTA trong sol I sẽ gắn chặt với Mg2+ làm ức chế hoạt động của các nuclease, nhờ đó DNA được bảo vệ. DNA nhiễm sắc thể có kích thước lớn, liên kết chặt chẽ với protein tạo ra phức hệ nucleoprotein nên cấu trúc của chúng rất cồng kềnh, ngược lại với DNA plasmid có cấu trúc gọn nhẹ. Chính vì thế, khi DNA plasmid đã được giải phóng ra môi trường thì DNA nhiễm sắc thể hầu như vẫn chưa kịp thoát ra ngoài. CH3COOK và CH3COOH trong sol III có tác dụng làm giảm pH của dung dịch về gần với điểm đẳng điện của DNA và gây biến tính protein; cùng với sự có mặt của EtOH 100% ở nhiệt độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 thấp, DNA plasmid bị kết tủa và dễ dàng được tách ra nhờ ly tâm. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.7. Hỗn hợp DNA plasmid thu được sau khi tách chiết thường tồn tại 3 dạng cấu trúc: Dạng siêu xoắn, dạng vòng mở và dạng mạch thẳng. Dạng thứ nhất có cấu trúc không gian gọn nhẹ nhất, được hình thành do liên kết hidro hoặc liên kết tĩnh điện giữa các phần của phân tử plasmid với nhau. Dạng vòng mở có một mạch đơn bị đứt gãy và dạng còn lại có cả hai mạch đều bị đứt gãy. Khi điện di, dạng nào càng có kích thước gọn nhẹ thì sự di chuyển của chúng càng nhanh, càng xa so với vị trí của giếng tra mẫu. Theo đó, dạng siêu xoắn chạy nhanh nhất, tiếp đó là dạng vòng mở và cuối cùng là dạng mạch thẳng. Hình 3.7. Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA) 1- 3: DNA plasmid mẫu Ri (Rhy) 4 - 6: DNA plasmid mẫu Mông (Mna) 7- 9: DNA plasmid mẫu Sao (Sdt) Để tiện lợi cho việc lựa chọn các dòng plasmid được chèn thêm đoạn DNA, khi tiến hành điện di kiểm tra, chúng tôi đã sử dụng một DNA plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, dựa vào độ cao thấp của các băng so với băng đối chứng mà ta có thể dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy: mẫu Rhy, mẫu Mna và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 mẫu Sdt đều có các dòng thứ 2, thứ 4, thứ 7 và thứ 9 (kí hiệu Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9) cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán các dòng này có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. Để khẳng định được các dòng đã chọn có mang đoạn DNA được nhân lên bằng PCR hay không, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế. Kiểm tra plasmid bằng việc xử lý enzyme hạn chế Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid kể trên bằng phương pháp cắt enzyme hạn chế. Vector pJET1/Blunt có chứa điểm nhận biết của enzyme XhoI ở phía bên trái và chứa điểm nhận biết của enzyme XbaI ở phía bên phải của vị trí ghép nối gen. Mặt khác, trình tự vùng D-Loop đã công bố không chứa điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậy khi phân tích vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI sẽ thu được các đoạn gen có kích thước gần đúng với kích thước của vector nguyên bản và của đoạn gen đã được ghép nối vào vector. Kết quả phân tích sản phẩm cắt enzyme trên hình 3.8 cho thấy các DNA plasmid tái tổ hợp được cắt thành 2 băng: một băng có kích thước 3,1 kb (tương ứng với kích thước của vector pJET1/Blunt); băng kia có kích thước khoảng 1,3 (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Kết quả này chứng tỏ sản phẩm PCR đã được ghép nối thành công vào vector. Những plasmid tái tổ hợp này được tinh sạch để phục vụ cho việc xác định trình tự gen. Kết quả của phản ứng cắt trên hình 3.8 cho thấy: trên 3 đường chạy (4, 5 và 6) xuất hiện hai băng: một băng có kích thước 3,1 kb (bằng kích thước của vector pJET1/Blunt), băng khác có kích thước khoảng 1,3 kb (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Đường chạy 2 chỉ có một băng có kích thước 3,1 kb. Như vậy, đã chọn được 3 dòng (1 dòng thuộc mẫu gà Ri (Rhy), 1dòng thuộc mẫu gà Mông (Mna), 1 dòng thuộc mẫu gà Sao (Sdt)) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Những plasmid mang đoạn chèn chứa vùng D-loop này được nhân với số lượng lớn và tinh sạch để phục vụ cho việc giải trình tự nuleotide. Hình 3.8. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI M: Thang DNA chuẩn (DNA λ được cắt bằng EcoRI và Hind III) 1. Plasmit không được cắt DNA 2. Sản phẩm cắt của plasmid không có đoạn chèn DNA 3. Sản phẩm PCR 4; 5; 6. Sản phẩm cắt của dòng Ri (Rhy)2; Mông (Mna) 4; Sao (Sdt) 9 3.2.3.2 Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể Sau khi DNA plasmid được tinh sạch, chúng tôi tiến hành xác định trình tự DNA trên máy đọc trình tự tự động trên cơ sở phương pháp của Sanger Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả trong mục 2.3.2.5. Xác định trình tự nucleotide từ 2 chiều của tất cả các đoạn DNA có trong các plasmid tái tổ hợp đã được tạo, sử lý bằng phần mềm ABI PRISM®3100- Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2. Với mỗi chiều đọc ở tất cả các plasmid chúng tôi thu được các đoạn dài khoảng 800 nucleotide. Vì đoạn gen cần xác định trình tự dài khoảng 1,3 kb, trong khi với điều kiện thí nghiệm tốt nhất, máy đọc chỉ xác định được tối đa khoảng 900- 1000 nucleotide. Sử dụng phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Seqscape 2.5 để kết hợp số liệu của 2 chiều đọc chúng tôi thu được trình tự hoàn chỉnh của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 vùng D-loop của 2 mẫu nghiên cứu Mna và Rhy với kích thước 1220 bp. Do điều kiện thời gian có hạn, mẫu gà Sao (Std) trình tự có nhiều C, việc đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-loop của gà Sao chưa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi chỉ công bố và so sánh kết quả hai mẫu Mna và Rhy. So sánh các trình tự Mna và Rhy với nhau và với trình tự D-loop của gà gallus gallus gốc Nhật Bản (Mã số AB268515) được công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL (EBI)/GenBank/DDBJ [37], chúng tôi thu được kết quả hình 3.9. 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 acctaactcccctactaagtgtaccccccctttcccccccagggggggtatactatgcat Mna .............................-.............................. Rhy .............................-.............................. 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 aatcgtgcatacatttatataccacatatattatggtaccggtaatatatactatatatg Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 tactaaacccattatatgtatacgggcattaatctatattccacatttctcccaatgtcc Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 attctatgcatgatccaggacacactcattcaccctccccatagacagctccaaaccact Mna .................A....T.........................T..T........ Rhy .................A....T.........................T..T........ 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 accaagtcacctaactatgaatggttacaggacataaatctcactctcatgttcttcccc Mna .T....C................................................C.... Rhy .T....C................................................C.... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 caacaagtcacctaattatgaatggttacaggacatacatttaactaccatgttctaacc Mna T..............C............................................ Rhy T..............C............................................ 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 catttggttatgctcgccgtatcagatggatttattgatcgtccacctcacgagagatca Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 gcaacccctgcttgtaatgtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacac Mna ...........C................................................ Rhy ...........C................................................ 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ccctcgccctactt-gccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgc Mna ..............-............................................. Rhy ..............-............................................. 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ataactcctgaactttctcactttt-cacgaagtcatctgtggattatcttcccctcttt Mna .........................-.................................. Rhy .........................-.................................. 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 agtccgtgatcgcggcatcttctctcttctattgctgttggttccttctctttttggggc Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ttcttcacaggttgcccttcacagtgcgggtgcggagtgctattcaagtgaagcctggac Mna ............................................................ Rhy ............................................................ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 tacacctgcgttgcgtcctatcctagtcctctcgtgtccctcgatgagacggtttgcgtg Mna ...........................................................A Rhy ............................................................ 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 tatggggaatcatcttgacactgatgcactttggatcgcatttggttatggttcttccac Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 cccccccggtaaatggtgctatttagtgaatgcttgtcggacatatttttatcaattttc Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 acttcctctattttcttcacaaaactaggaaattcaccacaattttttctttgttatttt Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ttaattttttttttattttttaaaaacattttttaaaaaactaaattacatacaaactac Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 cgcataaaatccctcaaactatacaaacgtttatcgtataatatatatacattattgttt Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 attctatcattattagagaaactccactaccaaaaccatcattaaaacaaaaatttacat Mna ............................................................ Rhy ............................................................ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 gccacttaactcccctcacaaacaatcgttatttatattgttaattagcaaacacaaaac Mna ............................................................ Rhy ..........................................--................ 1210 1220 ....|....|....|....| AB268515 ctgccttctaccactataaa Mna .CA................. Rhy .................... Hình 3.9. So sánh trình tự D-loop của hai mẫu nghiên cứu Ri (Rhy) và Mông (Mna) với trình tự tham khảo mã số AB268515 So sánh trình tự 2 mẫu Mông Nghệ An (ký hiệu Mna) và Ri Hưng Yên (Rhy) với trình tự chuẩn chúng tôi thấy có 16 điểm đa hình/đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Mna có 14 điểm (chiếm 1,15%) và mẫu gà Rhy có 13 điểm khác biệt với trình tự chuẩn (chiếm 1,1%). Trong 16 điểm khác biệt này cả mẫu gà Mna và Rhy đều mất một nucleotide C ở vị trí số 30 so với trình tự chuẩn. Cả hai dòng thuộc mẫu gà Mông nghệ An và Ri Hưng Yên đều cùng có sự khác biệt nucleotide so với trình tự chuẩn AB268515 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T (C T) ở các vị trí 203, 229, 232, 242, 301; Thay thế T bằng C (T C) ở các vị trí 246, 296, 316, 432; Thay thế G thành A (G A) ở vị trí 198. Ngoài ra giữa hai dòng thuộc mẫu gà Mông nghệ An và Ri Hưng Yên còn có sự khác biệt với nhau ở 5 điểm đa hình (chiếm 0,4%) ở các vị trí: Mẫu Mna đột biến thay G A ở vị trí 778; Mẫu Rhy đột biến mất 2 nucleotide A ở vị trí 1181, 1182; Mẫu Mna vị trí 1201 đột biến thay T C và vị trí 1202 đột biến thay G A. Các sai khác giữa các mẫu chủ yếu là đột biến kiểu đồng hoán (81,25%), được thống kê ở bảng 3.5. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Bảng 3.5. Thống kê các điểm đa hình ở 2 mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn Chúng tôi đã so sánh trình tự vùng D-loop của 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự của các chủng gà đã được công bố WhiteLergo gốc Anh lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số AB114078 [37], Lương Phượng, Ác Tiềm gốc Trung Quốc [3] để so sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng kết quả so sánh bảng 3.6. SST Mẫu Thay đổi nucleotide Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị 1 Mna, Rhy del C 30 Mất 1 nucleotide 2 Mna, Rhy G A 198 Đồng hoán 3 Mna, Rhy C T 203 Đồng hoán 4 Mna, Rhy C T 229 Đồng hoán 5 Mna, Rhy C T 232 Đồng hoán 6 Mna, Rhy C T 242 Đồng hoán 7 Mna, Rhy T C 246 Đồng hoán 8 Mna, Rhy T C 296 Đồng hoán 9 Mna, Rhy C T 301 Đồng hoán 10 Mna, Rhy T C 316 Đồng hoán 11 Mna, Rhy T C 432 Đồng hoán 12 Mna G A 778 Đồng hoán 13 Rhy del A 1181 Mất 1 nucleotide 14 Rhy del A 1182 Mất 1 nucleotide 15 Mna C T 1201 Đồng hoán 16 Mna G A 1202 Đồng hoán Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ sai khác trình tự nucleotide của một số giống gà Hệ số giống nhau AB268515 Mna Rhy Legho Ati LPh AB268515 0.0000 0.9892 0.9917 0.9892 0.9876 0.9967 Mna 0.0108 0.0000 0.9975 0.9892 0.9917 0.9892 Rhy 0.0083 0.0025 0.0000 0.9926 0.9926 0.9901 Legho 0.0108 0.0083 0.0074 0.0000 0.9934 0.9892 Ati 0.0124 0.0083 0.0074 0.0066 0.0000 0.9876 LPh 0.0033 0.0108 0.0099 0.0108 0.0124 0.0000 Hệ số khác nhau Qua bảng 3.6 và so sánh sai khác trên trình tự gen cho thấy sự sai khác trình tự nucleotide giữa gà Mông với gà Lương Phượng [3] là cao nhất 1,08% (13 điểm đa hình), gà Ri với gà Lương Phượng là 12 điểm đa hình chiếm 0,99% và sai khác về trình tự nucleotide giữa gà Mông với gà Ri là thấp nhất 0,25% (5điểm đa hình). Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà trên được thể hiện trên hình 3.10 Hình 3.10. Quan hệ di truyền của một số giống gà Kết quả thu được hình 3.10. cho thấy các giống gà trên được chia thành 2 nhánh: nhánh 1 gồm giống Lương Phượng có quan hệ gần nhất với giống gà của Nhật Bản được đăng ký với mã số AB268515, mức độ đồng nhất về thành phần nucleotide giữa chúng rất cao 99,67%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Nhánh 2 gồm 4 giống gà Mông, Ri, Ác Tiềm và White Lơrgho trong đó gà Ri và gà Mông có quan hệ di truyền gần, mức đồng nhất về thành phần nucleotide đến 99,75% . Ác Tiềm và White Lơrgho có quan hệ di truyền gần mức đồng nhất về thành phần nucleotide đến 99,34%. Nhìn chung sự sai khác thành phần nucleotide giữa các giống gà này không nhiều. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Trên cơ sở bước đầu nghiên cứu thành phần hóa sinh trứng của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao và phân tích trình tự đoạn D-Loop của 2 mẫu giống gà gốc Việt Nam gà Ri, gà Mông. Chúng tôi rút ra một số kết luận và đề nghị sau: Kết luận 1. Tỷ lệ lòng đỏ cao nhất ở trứng gà Mông 34.82 % , thấp nhất ở gà Sao 29.67%. Tỷ lệ vật chất khô: trứng gà Sao đạt cao nhất 55,09%; trứng gà Ri thấp nhất 50,34%. 2. Hàm lượng L tổng số và hàm lượng protein tổng số trứng 3 giống gà: Hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở gà Ri (37.76%); thấp nhất ở gà Mông Nghệ An (34.33%). Hàm lượng protein tổng số Cao nhất ở trứng gà Sao và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt ở lòng đỏ trứng gà Sao hàm lượng protein và hàm lượng lipit rất cao (20,27%; 64,67%) cho nên trứng gà Sao được đánh giá là có chất lượng tốt nhất trong trứng của 3 giống nghiên cứu. 3. Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số từ mẫu gà thuộc ba mẫu giống gà Ri, gà Mông và gà Sao. Nhân bản thành công vùng D-loop ty thể của ba giống gà này với kích thước khoảng 1,3 kb của 3 mẫu giống gà trên bằng kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi H1255 - L16725; tạo dòng phân tử sản phẩm PCR cả 3 mẫu . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 4. Xác định trình tự của vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của hai mẫu gà nghiên cứu và phát hiện được 16 điểm đa hình/đột biến về nucleotide giữa các đại diện của hai mẫu giống gà nghiên cứu với trình tự chuẩn. Mối quan hệ di truyền: Gà Ri và Mông có quan hệ di truyền gần; gà Lergho gốc Anh và Ác tiềm gốc Trung Quốc có quan hệ gần; gà Lương Phượng gốc Trung Quốc có quan hệ di truyền gần với giống gà gốc Nhật Bản mã số AB268515. Đề nghị Trong phạm vi nghiên cứu này, với số lượng chỉ lấy từ một cá thể thuộc mỗi giống, chúng tôi chỉ đưa ra được số liệu ban đầu về đặc điểm đa hình vùng D-loop trên ty thể của 2 giống gà Ri và Mông thuộc loài Gallus gallus domesticus. Để có thể đánh giá được toàn diện hơn về ý nghĩa của các vị trí đa hình/đột biến trên vùng D-loop hoặc đưa ra được các kết luận đầy đủ hơn về sự đa dạng DNA giữa hai chủng gà này cần phải tiến hành nghiên cứu và phân tích trên một số lượng mẫu lớn hơn. Tiếp tục nghiên cứu trình tự D-loop của gà Sao, và các giống gà nội, nhập nội để xác định sự đa dạng di truyền cũng như mối quan hệ di truyền giữa các giống gà hiện nay, nhằm cung cấp thông tin cho ngành chọn giống. CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Bùi Thị Kiều Vân, Nguyễn Trọng Lạng: Nghiên cứu tách vùng điều khiển D-loop ty thể gà Ri, gà Mông và gà Sao. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 2008 tập 2, số 46, trang 67 - 69. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Ân, Nguyễn Viết Ly, Nguyễn Văn Thiện, Nguyễn Khánh Quắc, Trần Xuân Thọ, Hoàng Gián (1974), Di truyền động vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 2. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển AND ty thể của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp ngành công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, trường ĐHKHTN. 3. Địch Thị Kim Hương (2006), Phân định một số chủng gà nhà (gallus gallus domesticus)qua AND ty thể, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐHKH tự nhiên, Hà Nội. 4. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa sinh thịt và đánh giá sự sai khác di truyền của gà Mông nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường ĐHSP Thái Nguyên, Thái Nguyên. 5. Lê Viết Ly (2001), "Gà Ri" - Chuyên khảo Bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam, tập II Phần gia cầm, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Tr 9-11 6. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội. 7. Vũ Quang Ninh (2002), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học và khả năng sản suất của giống gà xương đen Thái Hòa Trung Quốc, luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, trường ĐH Nông Nghiệp I, Hà Nội. 8. Kim Thị Phương Oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà lôi Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSPI, ĐHQG Hà Nội, Hà Nội. 9. Trần Thị Mai Phương, (2004), Nghiên cứu khả năng sinh sản, sinh trưởng và phẩm chất thịt của giống gà Ác Việt Nam, Luận án tiến sĩ chuyên ngành chăn nuôi, Viện Chăn Nuôi, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 10. Nguyễn Hoài Tao, Tạ An Bình và ctv (1985), Một số chỉ tiêu về tính năng sản xuất và chất lượng trứng- thịt gà Ri, Tuyển tập công trình nghiên cứu chăn nuôi 1969- 1984, NXB Nông nghệp Hà Nội, tr100 - 107. 11. Nguyễn Văn Thạch (1996), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, cho thịt và sinh sản của gà Ri nuôi bán thâm canh, Luận Văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Viện KHKT Nông Nghiệp Việt Nam. 12. Nguyễn Văn Trụ (2000) Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tính năng sản xuất của giống gà Mèo nuôi tại các nông hộ tỉnh Cao Bằng, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 13. Lê Đức Trình, Nguyễn Hồng Quế, Hoàng Thị Bích Ngọc (1995), Thực tập hóa sinh, NXB Yhọc. 14. Phùng Đức Tiến, Nguyễn Thị Kim Anh (2007), “Đặc điểm sinh học của gà Sao” Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp NXB Nông Nghiệp. tr 4-23 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15. Desjadins P., Morais R. (1990), ”Sequence DNA gene organisation of the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher vertebrates”, J.Mol.Biol., 212, pp. 599-635. 16. Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspects", In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/newyork,1971. 17. Hillis D. M., Moritz C., Mable B. K.,1996. Molecular Systematics. Sinauer Associates, Inc., Second edition. 18. Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P. W., Crowe T. M. (1999), and ligon J. D. A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests that these lineages are not monophyletic. Mol. Phylogenet. Evol., 11(1) tr.38-54 . 19. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2004), “The evolutionary origin of long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks disclosed by the mtDNA sequence analysis.”, Gene, 333, pp. 91 – 99. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 20. Krist L. (2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids, Oulu university, Oulu. 21. McPherson M.J., Quirke P.(1991), Taylor G.R.PCR - A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press. 22. Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X. P., Chen G., Zhang Y. P. (2002), “The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken breeds”, Biochem. Gene., 40(5), pp. 163-174. 23. Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S. (1996), “Monophyletic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls”, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93(13), pp. 6792- 6795. 24. Pereira S. L., Bakern A. J. (2004),” Low number of mitochondrial pseudogenes in the chicken (GALLUS GALLUS) nuclear genome: implications for molecular inference of population history DNA phylogenetics”, BMC Evol. Biol., 4(17). 25. Randy E., Lucchini V., Hennache A. (1997), Searching for mtDNA genetic diversity in captive Edwards’pheasant, The International Studbook For The Edwards’pheasant (Lophura edwardsi) DNA Its conservation, Paris, pp. 117-120. 26. Rayes A., Yang M. Y., Bowmaker M., Holt I.J. (2005), „Bidirectional replication initiates at sites throughout the mitochondrial genome of birds”, J. Biol. Chem., 280(5), pp. 3242 – 3250. 27. Rose, S.P (1997), Pinciples of poultry science - CaB International Wallingford Oxon OX 108 DE, U.K, pp 36 -37. 28. Sambrook J., Russell D. W, (2001), Molecular Cloning: A labroratory Manual, Cold Spring Harbor Labroatory Press, NewYork. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 29. Scott E.A. (1997), Systematic relationships of endemic Vietnamese pheasant. The International Studbook For The Edwards's pheasant (Lophura edwardsi) And Ít Conservation: 26 - 30. 30. Wang J., He X., Ruan J., Dai M., Chen J., Zhang Y., Hu C., Li S., Cong L., Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D. W., Ka G., Wong S., Yu J.,Yang H.,Wang J. (2005), “Chick VD: A sequence variation database for the chicken genome”, Nucle Acids Res., 33(5), pp. 438-441. 31. Van Tijen, W.F (1972), "The correlation between height of thick Albumen, yolk diameter, shape index and the position of the yol after storage", Brit. Poult Sci. (13), pp.1. TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC 32. Creger, C.R., (1965), "Verhältnis der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren im Hühnerei, DGW.(17),pp.231. 33. Hartfiel, W. (1968), "Einfluss der Musketägtickeit, des Alters und des ceschlechts auf die Fettsäuenusammensetzung", Archiv.f.Gelfk (32), pp45 -52. 34. Krax Herber (1974), Geflügelproduktion,Verlag Paul Parey Hamburg und Berline, pp 166 -196. 35. Pingel, H., H Jeroch (1980), Biologische Grundlagen der industriellen Geflügelproduktion, VEB. Gútav Fis cher Vẻlag Jena, pp.119 - 150. 36. Vogt, H. (1969), Merkblat Japanische Wachteln. 37. http//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 PHỤ LỤC Ảnh 1. Ri Hưng Yên (Rhy) Ảnh 2. Mông Nghệ An (Mna) Ảnh 3. Sao dòng trung (Sdt) Ảnh 4. 1. Trứng gà Ri 2. Trứng gà Mông 3. Trứng gà Sao 1 2 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58