Luận văn Sử dụng enzyme bromelain - Khóm để ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase trong nước ép trái bưởi

c yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain. Từ đó tìm ra những điều kiện tốt nhất mà bromelain có thể ức chế được hoạt động của enzyme pectinmetylesterase một cách hiệu quả nhất. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bưởi 2.1.1 Nguồn gốc Theo nhiều tài liệu, bưởi có nguồn gốc từ Đông Nam Á, quần đảo Mã Lai , sau này lan dần sang Châu Á và đến Châu Úc. Bưởi được xem như là giống cây quan trọng ở Đông Nam Á. Cây cao từ 5-15m, thường có gai lớn (nhất là trồng hột), nhánh non có lông tơ, bưởi chịu được cả nhiệt độ cao và cả nhiệt độ thấp, giống này có khả năng phát triển ở những vùng đất thấp hay khô hạn. Ở Việt Nam, bưởi được trồng nhiều ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long với nhiều giống với các tên gọi khác nhau. Bưởi da xanh được trồng nhiều ở tỉnh Bến Tre. Giống ưởi này được biết đến trong vài năm gần đây nhờ phẩm chất thơm ngon, trái hình cầu, nặng khoảng 1,1 kg, có màu từ hồng đến đỏ không đều, bó khá chặt, nước quả khá ngọt (Brix=9,5-12%), tỷ lệ thịt quả trên 55%, có vị thơm và rất ngon. Giống như cam, quýt, bưởi được sử dụng rộng rãi vì có chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể nhất là vitamin C. Vị chua nhẹ và hơi đắng của bưởi giúp dễ tiêu hóa và tuần hoàn máu. Trái bưởi được chế biến thành nhiều loại sản phẩm: nước giải khát, xyrô, mứt, rượu… 2.1.2 Thành phần Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của bưởi trong 100 g phần ăn được Nước (g) 91.38 P (mg/100g) 9 Tro (g) 0,29 Fe (mg/100g) 0,12 Protein (g) 0,55 Mg (mg/100g) 8 Carbonhydrate (g) 7.68 K (mg/100g) 129 Chất xơ (g) 0,7 B2(mg/100g) 0,02 Năng lượng (kj) 126 P.P (mg/100g) 0,1 Ca (mg/100g) 11 C (mg/100g) 38.1 (6) Bảng 2: Hàm lượng khoáng chất của bưởi so với một số trái cây khác (ppm) Trái cây Canxi Phospho Magie Kali Bưởi 170 160 100 2000 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 Táo 100 130 100 1500 Chuối 100 300 300 4000 Sơ ri 200 300 150 2500 Chanh 80 100 70 1400 Cam 350 300 130 1400 Khóm 110 100 150 2500 (5 ) Bảng 3: Hàm lượng vitamin của bưởi so với một số trái cây khác (ppm) Trái cây Vitamin A Vitamin B1 Vitamin B2 Vitamin C Bưởi 2 0,5 0,2 400 Táo 0,5 0,3 0,2 100 Chuối 2 0,5 0,6 100 Sơ ri 2 0,4 0,7 2000 Chanh 2 0,4 0,2 500 Cam 1 0,9 0,4 500 Khóm 0,3 0,8 0,4 200 (5 ) 2.1.3 Dược tính của bưởi Nước khoáng trong bưởi chứa hàm lượng vitamin C cao Vitamin C có khả năng phòng chống ung thư Vitamin C có khả năng phòng chống các bệnh tim mạch (4). Nước bưởi giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường Theo y học hiện đại, nước bưởi có chứa thành phần tựa như insulin, giúp hạ đường huyết, có tác dụng hỗ trợ đối với bệnh nhân tiểu đường, cao huyết áp (7). Ăn bưởi đều đặn sẽ giúp giảm cân và phòng chống thư Một hoặc hai quả bưởi mỗi ngày, cùng với một khẩu phần ăn khoa học, có thể giúp bạn giảm cân. Nó cũng giúp làm giảm nguy cơ ung thư ở những người hút thuốc nhờ tác dụng khống chế hoạt động của chất sinh ung thư trong khói thuốc (8). Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 PME 2H2O Ăn bưởi làm giảm cholesterol Trong bưởi có pectin, chất sợi hòa tan có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu, giảm chất béo thâm nhập vào cơ thể. Theo nghiên cứu trên những người có lượng cholesterol trong máu cao, việc ăn thường xuyên 15 g pectin trong bưởi trong thời gian 4 tháng giúp giảm cholesterol trung bình 8%, trong một vài trường hợp cá biệt giảm đến 20% (9). Giảm tai biến tim mạch Hesperidin và naringin là hai chất flavonoid có trong bưởi giúp bảo vệ tính đàn hồi của mạch máu, ngừa xơ cứng động mạch, gián tiếp chống cao huyết áp và tai biến mạch máu não. Acid galacturonique trong bưởi tác động đặc biệt lên cholesterol xấu, một trong những yếu tố tạo nên mảng xơ vữa thành mạch làm giảm độ đàn hồi của động mạch. Chính tác động này có tác dụng săn đuổi và loại bỏ sự tích tụ cholesterol, đồng thời làm sạch các mạch máu (9). 2.1.4 Enzyme pectinmetylesterase Pectinmetylesterase (PME) còn có tên là Pectinesterase hay pectin-pectinhydrolase (EC 3.1.1.11), là enzyme xúc tác thủy phân của các nhóm methyl ester của các gốc galacturonase nằm kề đơn vị không bị ester hóa. Tức là phân cắt các nhóm methoxyl (- COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do. Hình 1: Cơ chế phân cắt của pectinmethylesterase Cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan: các gốc bị acetyl hóa, các nhóm ester bị chuyển đổi thành amid hay bị khử đến rượu bậc một hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh sẽ ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase (PME). Polygalacturonic acid cũng là chất ức chế cạnh tranh của PME (3). Tốc độ để ester hóa trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch. Đối với pectinmetylesterase có nguồn gốc từ thực vật tấn công hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 Bảng 4: Thành phần pectin trong một số loại trái cây Trái cây Pectin (% w/w) Loại pectinase pH Táo 0,7-0,8 PE-PG 3,5 Chuối 0,5-0,6 PE-PG - Sơ ri 0,2-0,3 PE 3 Bưởi 1,3-1,6 PE 3,2 Cam 0,6-0,9 PE 2,2 (5 ) Cà chua chứa ít nhất 2 loại PME: PME1 và PME2. PME1 giảm vào giai đoạn chín nhưng PME2 tích lũy dần cho đến khi trái có màu đặc trưng của trái chín. PME có khối lượng 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở nồng độ 0,005M và 0,05M theo thứ tự. Pectinesterase (PE) của đậu nành là protein có khối lượng 33kD, hoạt động ở pH tối ưu gần bằng 8. Chuối có hai loại pectinesterase (PE). Cả hai cùng có khối lượng phân tử là 30kD, nhưng điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3; pH tối thích là 7,5. Hoạt độ của hai enzyme này tăng khi thêm vào dung dịch NaCl 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose, và galactose. PE trong quả cam (cũng như các quả họ citrus khác) có hai loại: PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,5 và ≥11, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 = 7,6, còn PE2 = 8,0 (3). Sự có mặt của PE trong trái cây họ citrus là nguyên nhân gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công nghệ thực phẩm, tức là sự mất đi của các vết vẩn đục trong dịch ép. Nếu PE không bị ức chế trực tiếp sau khi chiết tách dịch quả bằng cách bất hoạt bởi nhiệt hay lạnh đông, các phân tử pectin sẽ bị đề ester hóa và sẽ bị đông tụ bởi sự có mặt của ion Ca2+ trong dịch ép. Để ngăn chặn điều này, nước ép phải được tách phần cặn và phần trong. Nếu nước ép quá đặc, gel pectate hình thành và do đó nước ép sẽ không được hoàn nguyên trở lại. Những vấn đề này làm giảm chất lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng. Các chất tạo hương của nước ép trái cây họ citrus cực kỳ mẫn cảm với nhiệt. Các phương pháp sản xuất trái cây đông lạnh được thực hiện. Polyphenol có thể ức chế được hoạt động của PE nhưng lại gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan (vị và tính đồng nhất của sản phẩm. PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối, nhưng nếu thêm pectic acid vào lại làm cho nước ép bị phân lớp. Việc thêm các exo-enzyme : PG (polygalactorunase) làm phân hủy pectin có mức ester hóa thấp hình thành trước khi đông tụ với Ca2+ xảy ra, hay PL ( pectin liase) phân Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 hủy pectin trong nước ép trái cây đến sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn, là các hợp chất không mẫn cảm với Ca2+, dù là đề ester hóa nhưng thực chất cũng đã thực hiện chức năng ức chế hoạt động của enzyme PE. Vấn đề đặt ra là nước ép được cho bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hóa quá trình xử lý nhiệt và khôi phục hương vị cho sản phẩm, kết hợp với điều kiện bảo quản đông lạnh và vận chuyển nhanh nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bị bất hoạt do tác động của nhiệt độ.Tuy nhiên, đối với các nước đang phát triển, vân đang tồn tại vấn đề này trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus có hoạt lực PE cao (3). 2.2 Khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase Để ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase bằng các phương pháp nói trên là điều khó thực hiện với điều kiện ở nước ta. PME có bản chất là một protein nên nó dễ bị biến tính bởi nhiệt độ cao và cũng bị enzyme protease cắt đứt liên kết peptide. Việc sử dụng nhiệt độ cao để ức chế hoạt động của enzyme này thường được áp dụng ở các nước đang phát triển. Còn việc sử dụng enzyme protease được xem như là một phát hiện mới dựa trên việc protease sẽ cắt đứt mạch pepetide của PME, cũng đồng nghĩa với việc sẽ ức chế được hoạt động của enzyme PME Sử dụng enzyme protease Sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác: Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa. Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein. Cơ chế thủy phân như sau: Endopeptidase HO H HO H NH2-CH-CO-NHCH….NHCHCO-NHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOH R1 R2 R3 R4 R5 R6 Aminopeptidase HO H Carboxy peptidase Exopeptidase (3) Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 Thường protease trong cơ thể tồn tại dạng không hoạt động (zymogen) và có thể chuyển thành dạng hoạt động do chính enzyme protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó.Khi đó sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho các hoạt động khác, enzyme chuyển sang trạng thái họat động. Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein mà người ta chia protease ra làm 2 nhóm: Endopeptidase phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành các polypeptide mạch ngắn, peptone… Exopeptidase (polypeptidase) phân cắt liên kết peptide ở 2 đầu mạch Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease mà người ta chia nhóm: Protease acid: hoạt động ở pH acid Protease kiềm: hoạt động ở vùng pH kiềm Protease trung tính hoạt động ở vùng pH trung tính. Có nhiều loại enzyme protease có thể ức chế hoạt động của PE. Nhưng do đặc thù của sản phẩm nước bưởi là pH thấp, không chịu được nhiệt độ cao, cũng như vấn đề về nguồn ezyme và các vấn đề về kinh tế, kỹ thuật khác nên nghiên cứu này quyết định sử dụng enzyme bromelain để tiến hành thí nghiệm. 2.3 Giới thiệu enzyme bromelain 2.3.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu Khóm là một loại nông sản vô cùng quan trọng, chỉ đứng thứ hai - sau chuối và đóng góp hơn 20% tổng sản lượng trái cây ở các nước nhiệt đới. Các nhà khoa học cho rằng nguồn gốc ban đầu của khóm là ở lưu vực sông Amazon với Brazil và Paraguay là hai nước thuần hoá được giống khóm đầu tiên. Khóm được sản xuất một cách rộng rãi trên toàn thế giới vào những năm 1500 khi nó bắt đầu du nhập sang châu Âu và các nước nhiệt đới. Ban đầu, khóm được người dân vùng Caribbe gọi là Anana có nghĩa là “trái cây ngon tuyệt” (“excellent fruit”). Tên gọi “khóm” (“pineapple”) bắt nguồn từ châu Âu vì người ta nghĩ rằng nó giống như trái thông (“pinecone”) với phần thịt giống như một quả táo (apple). Ngày nay, Thái Lan, Philippine, Brazil và Trung Quốc là những nước sản xuất khóm hàng đầu trên toàn thế giới. Bên cạnh đó, các nước khác như Ấn Độ, Nigieria, Kenya, Indonesia, Mexico và Costa Rica cũng đóng góp trên 50% tổng sản lượng khóm trên toàn thế giới (10). Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha. Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ. Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12. Ở miền Nam, dứa có thể ra hoa quanh năm, song thường tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10. Từ khi ra hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng (10). Quả dứa được coi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, loại quả “vua”, rất được ưa chuộng ở các nước phương Tây. Quả dứa có mùi thơm mạnh, chứa nhiều đường, lượng calo khá cao, giàu chất khoáng, nhất là Kali, có đủ các loại vitamin cần thiết như A, B1, B2, PP, C đặc biệt trong cây và quả dứa có chất Bromelin là một loại men thủy phân protein (giống như chất Papain ở đủ đủ), có thể chữa được các bệnh rối loạn tiêu hóa, ức chế phù nề và tụ huyết, làm vết thương mau thành sẹo. Trong công nghiệp, chất Bromelin dùng làm mềm thịt để chế biến thực phẩm, nước chấm (10). 2.3.2 Enzyme bromelain Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ học Bromeliaceae, đặc biệt là cây dứa (thân và trái). Bromelain được trích ly từ khóm lần đầu tiên vào năm 1891 và được giới thiệu như một sản phẩm thương mại vào năm 1957. Hoạt tính của bromelain được phát hiện ở trong thân và quả cây khóm, nhưng trong thân khóm chứa nhiều bromelain hơn quả khóm Bromelain là một loại enzyme thuộc nhóm protease, nó dễ dàng thủy phân hầu hết các loại protin như casein, gelatin, đậu nành, cá…để tạo thành các peptide, poly peptide và các acid amin. Bromelain không giống như các các loại enzyme khác, nó hoạt động rất rộng cả trong môi trường acid lẫn kiềm. Bromelain vẫn có hoạt tính cả trong môi trường cơ thể sinh vật (2). Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Enzyme bromelain có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da ( 3) Trong công nghiệp, phần thân nguyên liệu được dùng làm nguyên liệu chính để sản xuất enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau mùa thu hoạch trái. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33) Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2. Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân tại vị trí bất kỳ trên mạch polypeptide. Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như broimelain thân. Nhưng bromelain quả hoạt động thủy phân tốt trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg- NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân (11). Mã số enzyme Bromelain thân: E.C.3.4.22.32 (12). Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain Tên khoa học và y học: sulfuhydryl proteolytic enzyme, cytein protase Tên thương mại: Bromanase (Kramer – Novis), bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp). Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine. i. Cấu tạo hóa học Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain thân có khoảng 321-144 acid amin, còn bromelain quả có khoảng 283-161 acid amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở đầu carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alnine. Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH (sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp amino trong phân tử bromelain như sau: Ser-Val-Lys-Asn=Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-AlaCys-Tryp (3) ii. Hoạt tính của bromelain Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amylase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp. -Gly-Cys-Lys- Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10 Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị BTU, (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU (đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)… Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCUs hoặc GMU. 1 GMU tương đương với 1,5 MCU (8). iii. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain Giống như các cấu trúc sinh học khác, hoạt tính enzyme của bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác: Nhân tố môi trường: nhiệt độ, pH, ion kim loại…; Nhân tố bên trong: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme…; Các yếu tố pH, nhiệt độ cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa… Bromelain là một enzyme có nguồn gốc từ thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý được quan tâm nhiều nhất bởi các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng đến nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (3). Nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11 hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme… Các nghiên cứu cho thấy: Bromelain hoạt động ở nhiệt độ từ 40-600C ( tối thích 50-600C) và bị ức chế ở nhệt độ trên 65oC (17). Bromelain tinh khiết rất nhạy cảm với nhiệt độ Ở 50C, pH 4-10, bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24 giờ Ở 550C, pH 6,1 bromelain bị bất hoạt 50% hoạt tính trong vòng 29 phút. Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính (3). Theo cuộc nghiên cứu của Bollag và Edelstein vào năm 1991 thì Bromelain có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 45-700C. Hình 2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của bromelain (1) Ảnh hưởng của nhân tố pH pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà còn tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự hiện diện của chất hoạt hóa. Khoảng pH mà bromelain có hoạt tính lớn nhất từ 4-8. Tuy nhiên, pH từ 4.5-5.5 thì khả năng thủy phân của bromelain là mạnh nhất (17). H o ạt tín h củ a en zy m e (U /m l) Nhiệt độ (0C) Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12 Theo cuộc nghiên cứu của Bollag và Edelstein vào năm 1991 thì Bromelain có thể hoạt động ở pH từ 4-9. Hình 3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của Bromelain ( 1) Nồng độ enzyme Khi cơ chất đầy đủ thì vận tốc của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. [ ]EkV ×= Trong đó: v: vận tốc của phản ứng k: hằng số vận tốc [ ]E : nồng độ enzyme Nồng độ của enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất càng bị biến đổi bấy nhiêu, nhưng nếu nồng độ enzyme quá lớn thì vận tốc phản ứng sẽ chậm lại. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Năm 1993 Mischealis và Menten đã giải thích tính chất động học của enzyme và lập phương trình biểu diễn liên quan giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất. Enzyme đã tham gia quá trình xúc tác tạo phức hợp enzyme - cơ chất (E). Trường hợp đơn giản nhất phản ứng chỉ có một cơ chất (S) thì enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất thành một sản phẩm (P) phản ứng xảy ra như sau: H o ạt tín h củ a en zy m e (U /m l) Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13 E: enzyme S: cơ chất P: sản phẩm K1: hằng số tốc độ phản ứng tạo ES K2: hằng số tốc độ phân ly ES và cơ chất ban đầu K3: hằng số tốc độ phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P [ ] [ ]SK SV v m + × = max Trong đó: V: vận tốc phản ứng Km: hằng số Michaelis-Menten Vmax: vận tốc phản ứng cực đại [ ]S : nồng độ cơ chất V là hàm số của [ ]S , đồ thị có dạng nhánh hyperbol vuông góc: Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng Km: là hằng số Mischealis-M.Menten đặc trưng cho mỗi enzyme, –Km đặc trưng cho ái lực của enzyme và cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc phản ứng càng lớn. Qua đồ thị chung của đường biểu Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14 diễn cho thấy khi tăng nồng nộ cơ chất đến một giá trị nào đó, vận tốc phản ứng đạt một giá trị cực đại Vmax, sau đó vận tốc sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng nồng độ cơ chất. Ảnh hưởng bởi chất ức chế: Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Muối và thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối. Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelain do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzyme. Trong đó: E: enzyme I:chất kìm hãm K1, K2: hệ số vận tốc của phản ứng thuận nghịch Ảnh hưởng bởi chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme, chất hoạt hóa có bản chất giống nhau có thể là: Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydro Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme kết quả là bỏ một vài đoạn peptide, phá vỡ thế bị bao vây của một số nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme trở nên hoạt động. Các chất có tác dụng phục hồi nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme. Trung tâm hoạt động của bromelain có chứa nhóm –SH sẽ chuyển thành –S-S làm enzyme mất khả năg hoạt động. Nếu thêm vào môi trường chất hoạt hóa có tính khử như cystein, glutation, nhóm –SH sẽ được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở lại. Các ion kim loại, hoặc các kim loại cũng có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất . Tuy nhiên, khi sử dụng hóa chất này phải tùy từng loại mà sử dụng nồng độ khác nhau vì các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15 iv. Sơ lược các nghiên cứu về enzyme bromelain Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi thành phần hóa học của enzyme bromelain thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2- hydroxy-5-5- nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp chất trên, enzyme bromelin bị biến đổi mạnh về mặt cấu trúc, thành phần các acid amin trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định (13). Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại protease từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến đổi của enzyme này sẽ sinh ra chuổi acid amin cuối cùng là Ala-Val-Pra-Gln-Ser-Ile-Asp=Trp-Arg-Asp-Tyr-Gly-Ala Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt gì so với bromelain thân, tuy nhiên về cấu tạo FA2 có ít hơn tổng lượng lysine và alanine so với glycine như với bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein (14). Waliszewski và Coro (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme bromelain quả dạng thô trên cơ chất protein khác nhau. Nghiên cứu đã thực hiện ở dịch quả dứa ở 4 mức độ chín khác nhau trên 5 loại cơ chất gồm azocasein, azoalbumine, hemoglobin, natricasenate và casein. Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp quang phổ. Nghiên cứu đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ tối thích đối với hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả trên từng loại cơ chất (15). Bên cạnh, Andrew et al. (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất tổng hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành. Một phần kết quả cho thấy trong thân dứa có tối thiểu 4 loại cysteine proteinase này là thể hiện mạnh nhất. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Công nghệ sau thu hoạch, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2 Nguyên liệu Bưởi da xanh mua ở huyện Châu Thành, Tiền Giang Nước 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm NaOH 0.01N Pectin táo (poly-D-galacturonic acid methylester) 3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Máy xay nguyên liệu Máy đo pH Đồng hồ thời gian Bếp điện Nhiệt kế Dụng cụ gọt vỏ Micropipet Ống nghiệm Ống đong Máy chuẩn độ acid bazơ 785 DMP Titrio Metrohm, Thụy Sỉ Cốc thủy tinh Vải lọc Bình định mức Một số dụng cụ khác. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung nghiên cứu Sử dụng enzyme bromelain thô được trích ly bởi Viện Công nghệ sinh học Trường Đại Học Cần Thơ nghiên cứu khả năng ức chế lên hoạt động của enzyme pectinmetylesterase. 3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu Hình 5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu nước bưởi 3.2.3 Bố trí thí nghiệm i. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase của enzyme bromelain khóm Mục đích Xác định pH, nhiệt độ tối ưu để ức chế hoạt động PME của enzyme bromelain Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố Nhân tố A: Nhiệt độ môi trường A1: 35oC A2: 40oC A3: 45oC A4: 50oC Dịch quả Lọc Tách bao, hạt Ép Vỏ, cùi Phân loại Bóc vỏ, tách múi Nguyên liệu Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18 A5: 55oC A6: 60oC Nhân tố B: pH môi trường B1: pH 4,6 B2: pH 5,2 B3: pH 5,8 B4: pH 6,4 Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 3 lần Tổng số mẫu thí nghiệm: 6x 4x 3 (lần lặp lại) = 72 mẫu Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: Mô tả tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị enzyme: enzyme bromelain được pha thành dung dịch ở nồng độ 0,004g/ml trong nước cất Chuẩn bị mẫu: 15 ml nước bưởi được cho vào trong ống nghiệm. Sau đó, ống nghiệm được cho vào trong waterbath đến khi nào nhiệt độ nước bưởi đạt nhiệt độ yêu cầu thì cho enzyme bromelain khóm với tỷ lệ 0,004g enzyme bromelain/100ml nước bưởi Sau khoảng thời gian 10 phút, mẫu được đo 1 lần để xác định hoạt tính của enzyme pectinmetylesterase A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1 A5B1 B2 A1B2 A2B2 A3B2 A4B2 A5B2 A6B2 B3 A1B3 A2B3 A3B3 A4B3 A5B3 A6B3 B4 A1B4 A2B4 A3B4 A4B4 A5B4 A6B4 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19 Kết quả thí nghiệm Hoạt tính của enzyme pectinmetylesterase còn lại trong nước bưởi ở các điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau. Kết quả được phân tích thống kê theo phần mềm STATGRAPHICS 4.0 ii Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase Mục đích Xác định tỷ lệ enzyme bromelain và thời gian thủy phân thích hợp để ức chế hoạt động của pectinmetylesterase Bố trí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố Nhân tố C: nồng độ enzyme bromelain khóm C1: 0 % C2: 0,002 % C3: 0,004 % C3: 0,006 % C4: 0,008 % Nhân tố D: Thời gian thủy phân D1: 0 phút D2: 5 phút D3: 10 phút D4: 15 phút D5: 20 phút Ứng với mỗi nghiệm thức ta lặp lại 3 lần Tổng số mẫu thí nghiệm: 5 x 5 x 3 = 75 mẫu Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20 Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: D1 D2 D3 D4 D5 C1 C1D1 C1D2 C1D3 C2D4 C1D5 C2 C2D1 C2D2 C2D3 C2D4 C2D5 C3 C3D1 C3D2 C3D3 C3D4 C3D5 C4 C4D1 C4D2 C4D3 C4D4 C4D5 C5 C5D1 C5D2 C5D3 C4D4 C5D5 Mô tả tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị enzyme: enzyme bromelain được pha thành dung dịch ở các nồng độ 0,002g/ml; 0,004g/ml; 0,006g/ml; 0,008g/ml trong nước cất Chuẩn bị mẫu: 15 ml nước bưởi trong điều kiện pH được xác định thí nghiệm 1 được cho vào trong ống nghiệm. Sau đó, ống nghiệm được cho vào trong waterbath đến khi nào nhiệt độ nước bưởi đạt nhiệt độ yêu cầu (kết quả từ thí nghiệm 1) thì cho enzyme bromelain khóm với các tỷ lệ 0; 0,002; 0,004; 0,006; 0,008g enzyme bromelain/100ml nước bưởi. Sau các khoảng thời gian 0, 5, 10, 15, 20 phút, mẫu được đo 1 lần để xác định hoạt tính còn lại của enzyme pectinmetylesterase. Kết quả thí nghiệm Hoạt tính của enzyme pectinmetylesterase còn lại trong nước bưởi ở các tỷ lệ enzyme bromelain khác nhau, trong các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả được phân tích thống kê theo phần mềm STATGRAPHICS 4.0 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và pH đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase (PME) của enzyme bromelain khóm Hình 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase (PME) của enzyme bromelain khóm Nhiệt độ là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain và pectinmetylesterase. Từ đồ thị hình 6 nhận thấy rằng, ở nhiệt độ từ 35-450C, hoạt tính còn lại của enzyme pectinmetylesterase rất nhiều, đặc biệt ở nhiệt độ 450C là 0,066 đơn vị/ml.Tuy nhiên, từ nhiệt độ 45-550C thì hoạt tính của PME bắt đầu giảm dần, ở 550C hoạt tính còn lại của PME là 0,0332 đơn vị/ml. Nhưng khi nhiệt độ môi trường tăng lên là 600C thì hoạt tính còn lại của PME lại bắt đầu tăng lên. Theo nghiên cứu của Bollag DM và Edelstein SJ vào năm 1991 thì Bromelain có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 45-700C do đó ở nhiệt độ thấp, khả năng thủy phân của bromelain kém. Hơn thế nữa, trong dịch nước bưởi chứa một hàm lượng lớn ion kim loại Ca2+và Mg 2+ (5). Hai ion kim loại này là yếu tố làm gia tăng hoạt tính của PME. Hình 7: Ảnh hưởng của pH đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase (PME) của enzyme bromelain khóm 0.0448b 0.0552bc 0.0660c 0.0401ab 0.0332a 0.0407ab 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 35 40 45 50 55 60 Nhiệt độ (oC) H o ạ t t ín h PM E cò n lạ i (đ ơ n v ị/m l) 0 0.02357a 0.0263a 0.0177a 0.1192b 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 4.6 5.2 5.8 6.4 pH H o ạ t t ín h cò n lạ i c ủ a PM E (đ ơ n v ị/m l) Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22 Với mỗi nguyên liệu protein (ốc bươu vàng, casein, protein thực vật…)khác nhau sẽ có một giá trị pH thích hợp cho phản ứng thủy phân của enzyme bromelain. Nhìn vào đồ thị hình 7 thấy rằng, ở pH từ 4,6-5,8 hoạt tính của PME còn rất thấp từ 0,0177- 0,0263 đơn vị/ml. Tuy nhiên, khi pH môi trường là 6,4 thì hoạt tính còn lại của PME rất cao 0,1162đơn vị/ml. Điều này có thể giải thích, do enzyme bromelain thể hiện hoạt tính mạnh nhất trong vùng pH từ 4,5-5,8 (17). Hình 8: Ảnh hưởng nhiệt độ và pH đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase (PME) của enzyme bromelain khóm Từ đồ thị hình 8 nhận thấy rằng có mối liên hệ giữa nhiệt độ và pH, hai yếu tố này tác động lên đồng thời hoạt tính của enzyme bromelain và PME. Ở pH 4,6-5,8 và nhiệt độ 35-600C hoạt tính còn lại của PME thấp. Tuy nhiên, với pH 6,4 hoạt tính còn lại của PME là rất cao. 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase (PME) Hình 9: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme bromelain khóm đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase 0.1124b 0.0617a 0.0630a 0.0434a 0.0377a 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0 0.002 0.004 0.006 0.008 Tỷ lệ enzyme Bromelain (%) H o ạ t t ín h cò n lạ i c ủ a PM E (Đ ơ n v ị/m l) Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 23 Từ đồ thị hình 11 cho thấy, nếu không bổ sung lượng enzyme bromelain vào nước bưởi thì hoạt tính còn lại của PME là rất cao 0,1124 đơn vị/ml. Khi tăng nồng độ enzyme lên 0,002% thì hoạt tính còn lại của PME thấp nhưng khi tăng tiếp tục ở mức 0,004-0,008% so với cơ chất thì hoạt tính còn lại của PME vẫn không giảm đáng kể, không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Theo Nguyễn Đức Lượng, 2004 thì khi tăng nồng độ enzyme lên phản ứng thủy phân sẽ diễn ra mạnh mẽ, nhưng nếu tăngnồng độ enzyme lên quá nhiều thì vận tốc phản ứng sẽ chậm lại. Hình 10: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase Thời gian thủy phân cũng là một trong những yếu tố quan trọng đánh giá khả năng thủy phân, và xác định hiệu suất thủy phân. Quá trình thủy phân phụ thuộc vào nhiều yếu tố cơ chất, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt môi trường…Việc xác định thời gian thủy phân là rất cần thiết, nếu như trong quá trình thủy phân ta không xác định chính xác quá trình thủy phân có kết thúc hay chưa mà ngưng sớm quá trình thủy phân, trong khi đó enzyme vẫn xúc tác thủy phân PME thì hoạt tính còn lại của PME sẽ cao. Từ đồ thị hình 12 nhận thấy quá trình thủy phân tăng dần theo thời gian nghĩa là hoạt tính còn lại của PME giảm dần. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với Nguyễn Đức Lượng, 2004. Hình 11. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase 0.2105c 0.0627b 0.0414b 0.0031a 0.0005a 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0 5 10 15 20 Thời gian (phút) H o ạ t t ín h cò n lạ i c ủ a PM E (Đ ơ n v ị/m l) Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 24 Từ đồ thị hình 11 nhận thấy rằng mẫu không sử dụng enzyme bromelain và thời gian thủy phân là 0 phút thì hoạt tính còn lại của PME rất cao.Tuy nhiên nếu bổ sung enzyme bromelain để tiến hành thủy phân PME thì hoạt tính còn lại của PME rất thấp kể từ 5 phút đầu tiên. Từ thí nghiệm này có thể kết luận rằng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính còn lại của PME. Nồng độ enzyme bromelain càng cao và thời gian thủy phân càng dài thì hoạt tính còn lại của PME rất thấp. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết quả nghiên cứu trên nhận thấy: - Thí nghiệm 1 cho thấy có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ của môi trường xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme bromelain khóm. Enzyme bromelain khóm thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở pH là 4,6-5,8 và nhiệt độ 50-55-600C. Tuy nhiên, mẫu có nhiệt độ là 500C và pH 4,6 là thích hợp nhất để tiến hành thí nghiệm 2. - Thời gian tác động mạnh đến khả năng ức chế hoạt tính của PME. Sau khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính còn lại của PME nhận thấy khoảng thời gian 15-20 phút là khoảng thời gian thích hợp để enzyme bromelain thủy phân enzyme PME. Nồng độ enzyme bromelain khóm thì không ảnh hưởng lớn đến hoạt tính còn lại của PME. Từ kết quả thí nghiệm 2 cho thấy ở nồng độ enzyme bromelain khóm từ 0,002-0,006%, thời gian thủy phân từ 15 phút và nồng độ enzyme bromelain khóm 0,008%, thời gian thủy phân 10 phút là điều kiện thích hợp nhất để hoạt tính còn lại của PME là thấp nhất. Theo kết quả và thảo luận mẫu được chọn ở thí nghiệm hai là mẫu nồng độ enzyme bromelain khóm 0,008%, thời gian thủy phân 10 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính còn lại của PME thấp nhất ở điều kiện: pH 4,6-5,8 và nhiệt độ từ 50-600C Tỷ lệ enzyme bromelain khóm 0,002-0,006%, thời gian thủy phân 15-20 phút và 0,008% enzyme bromelain khóm, thời gian thủy phân 10-20 phút 5.2 Đề nghị - Đưa ra một quy trình sản xuất nước ép trái bưởi hoàn chỉnh - Khảo sát khả năng ức chế hoạt động của enzyme bromelain khóm lên hoạt tính còn lại của PME một số loại rau và quả khác. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bollag DM và Edelstein SJ, 1991. Protein methods. Willey-LISS, inc. New York. 2. Monograph. Bromelain. Altern Med Rev. 1998. 3. Nguyễn Đức Lượng, (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Trung Thuần và Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa dinh dưỡng, Nhà xuất bản Phụ Nữ. 5. Vicken, J.P., Beldman, G. and Voragen, A. (1994). The effect of xylogucans on the degradation of cell wall embedded cellulose by the combined action of cell cellobiohydrolase and endoglucanases from Trichoderma viride. Plant Physiol. 6. 7. 8. 9. %C3%ADch+c%E1%BB%A7a+b%C6%B0%E1%BB%9Fi:&hl=vi&ct=clnk&cd=4&gl=vn 10. 11. 12. cd=2&gl=vn 13. - enzymes.php4?ecno=3.4.22.33 14. http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids=956152&dopt=Abstract 15. 16. 17. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv PHỤ LỤC 1 Phương pháp phân tích Xác định hoạt tính còn lại của pectinmetylestersae Hoạt tính còn lại của enzyme pectinmetylesterase bằng phương pháp chuẩn độ (12). Nguyên tắc Hoạt tính PME được xác định dựa vào quá trình giải phóng nhóm -OCH3 của phân tử pectin tạo ra acid polygalacturonic và methanol. Lượng acid sinh ra được đo bằng phương pháp chuẩn độ acid-base. Từ đó, ta xác định được hoạt tính của PME tham gia quá trình phân cắt mạch pectin. Tiến hành và ghi nhận kết quả Lấy 30 ml dung dịch pectin được pha sẵn cho vào cốc phản ứng; khởi động thiết bị chuẩn độ tự động (máy chuẩn độ acid-bazơ 785 DMP Titrio Metrohm, Thụy Sỉ). Hoạt tính của enzyme PME được máy xác định thông qua việc ghi liên tục thể tích NaOH 0,01N chuẩn dùng để trung hòa lượng carboxyl được giải phóng trong dung dịch, trong khoảng thời gian 10 phút ở nhiệt độ phản ứng là 22,5oC. Chuẩn bị dung dịch pectin chuẩn (3,5 g pectin táo/lít và 6.85 g NaCl/lít dung dịch sau khi pha) Tiến hành pha + Cân 3,5 g pectin táo và 6,85 g NaCl + 6,85 g NaCl được cho vào bình cùng với 800 ml nước cất đun trên bếp điện đến khi nào dung dịch muối và nước sôi 1000C. Sau đó, dung dịch muối được khuấy trên máy khuấy từ cùng với lượng pectin táo cho vào. Sau khoảng thời gian 1 phút, dung dịch được đem đi làm nguội và nước được pha thêm vào cho đến khi thể tích dung dịch pectin chuẩn là 1 lít. Hoạt tính còn lại của PME được tính theo công thức Hoạt tính còn lại của PME (đơn vị/ml)= t1: là thời gian mà tại thời điểm đó pH của dung dịch pectin chuẩn và mẫu nước bưởi sau khi tiến hành thí nghiệm có giá trị là 7 (s) v1: là thể tích NaOH 0,01N mà tại đó pH của dung dịch pectin chuẩn và mẫu nước bưởi sau khi tiến hành thí nghiệm có giá trị là 7 (ml) t2: là thời gian kết thúc quá trình chuẩn độ (s) ( )       v ttvvslope 60*:,: 2121 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v v2: là thể tích NaOH 0,01N đọc được khi kết thúc quá trình chuẩn độ (ml) v: là thể tích nước bưởi sau khi tiến hành thí nghiệm được cho vào dung dịch pectin chuẩn để tiến hành đo hoạt tính còn lại của PME (ml) 60: hoạt tính của PME được tính trong thời gian 1 phút Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi 2 Kết quả thống kê 2.1 Phân tích ANOVA cho ảnh hưởng nhiệt độ và pH đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase của enzyme bromelain khóm Analysis of Variance for hoat tinh pme con lai – Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A: nhiet do 0.00850625 5 0.00170125 3.17 0.0129 B: pH 0.126812 3 0.0422707 78.72 0.0000 RESIDUAL 0.0338274 63 0.000536942 TOTAL (CORRECTED) 0.169146 71 Mutiple Range Tests for hoat tinh pme con lai by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups 5.8 18 0.0177111 X 4.6 18 0.0235667 X 5.2 18 0.02625 X 6.4 18 0.119167 X *denotes a statistically significant difference Mutiple Range Tests for hoat tinh pme con lai by nhiet do Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups 55 12 0.0332 X 50 12 0.0401 XX 60 12 0.0407 XX 35 12 0.0448 X 40 12 0.055175 XX 45 12 0.0659917 X *denotes a statistically significant difference Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii Analysis of Variance for Hoat tinh con lai PME - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:nhiet do 0.00850625 5 0.00170125 5.15 0.0007 B:pH 0.126812 3 0.0422707 127.86 0.0000 INTERACTIONS AB 0.0179585 15 0.00119723 3.62 0.0003 RESIDUAL 0.0158689 48 0.000330602 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 0.169146 71 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Hoat tinh con lai PME by Nd-pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NdpH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1B3 3 0.0 X A5B2 3 0.0 X A4B1 3 0.0071 X A5B1 3 0.0107333 XX A4B3 3 0.0123 XX A1B1 3 0.016 XXX A2B3 3 0.0184667 XXX A2B1 3 0.0197333 XXX A6B3 3 0.0198667 XXX A2B2 3 0.0246667 XXX A6B2 3 0.0254 XXX A5B3 3 0.0274 XXX A1B2 3 0.0274333 XXX A3B3 3 0.0282333 XXX A4B2 3 0.0398667 XX A3B2 3 0.0401333 XX A3B1 3 0.0436667 XX A6B1 3 0.0441667 XX A6B4 3 0.0735 XX A5B4 3 0.0946667 X A4B4 3 0.101133 X A1B4 3 0.135933 X A3B4 3 0.151933 X A2B4 3 0.157833 X 2.2 Phân tích ANOVA cho ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase Analysis of Variance for hoat tinh pme con lai – Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A: nong do enzyme 0.0519412 4 0.0129853 5.95 0.0004 B: thoi gian 0.445745 4 0.111436 51.09 0.0000 RESIDUAL 0.143969 66 0.00218135 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng viii TOTAL (CORRECTED) 0.641656 74 Mutiple Range Tests for hoat tinh pme con lai by nong do enzyme Method: 95.0 percent LSD Nong do enzyme Count LS Mean Homogeneous Groups 0.008 15 0.0376671 X 0.006 15 0.0434074 X 0.002 15 0.0616709 X 0.004 15 0.0630066 X 0 15 0.112369 X *denotes a statistically significant difference Mutiple Range Tests for hoat tinh pme con lai by thoi gian Method: 95.0 percent LSD Toi gian Count LS Mean Homogeneous Groups 20 15 0.000454967 X 15 15 0.00308113 X 10 15 0.0413705 X 5 15 0.0627416 X 0 15 0.210473 X *denotes a statistically significant difference Analysis of Variance for HOAT TINH PME CON LAI - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:NONGDO 0.0519412 4 0.0129853 14.57 0.0000 B:THOIGIAN 0.445745 4 0.111436 125.06 0.0000 INTERACTIONS AB 0.0994165 16 0.00621353 6.97 0.0000 RESIDUAL 0.0445529 50 0.000891058 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 0.641656 74 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ix Multiple Range Tests for HOAT TINH PME CON LAI by ND-TG -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NDTG Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C5D4 3 0.0 X C4D4 3 0.0 X C4D5 3 0.0 X C5D5 3 0.0 X C3D5 3 0.0 X C5D3 3 0.0 X C2D5 3 0.0 X C3D4 3 0.0 X C2D4 3 0.0 X C1D5 3 0.00227483 X C4D3 3 0.0035499 X C5D2 3 0.0107217 X C1D4 3 0.0154057 X C3D3 3 0.0155077 X C4D2 3 0.0158547 X C3D2 3 0.025252 X C2D2 3 0.044386 X C2D3 3 0.0471063 X C1D3 3 0.140689 X C5D1 3 0.177614 XX C1D1 3 0.185982 XX C4D1 3 0.197633 X C2D1 3 0.216862 X C1D2 3 0.217494 X C3D1 3 0.274273 X -------------------------------------------------------------------------------- Chương trình SAS cho đồ thị 3D và contour xác định ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase của enzyme bromelain khóm data scatter; input pH tem Act; cards; 4.6 35 0.0160 5.2 35 0.0274 5.8 35 0.0000 6.4 35 0.1359 4.6 40 0.0197 5.2 40 0.0247 5.8 40 0.0185 6.4 40 0.1578 4.6 45 0.0437 5.2 45 0.0402 5.8 45 0.0282 6.4 45 0.1519 4.6 50 0.0071 5.2 50 0.0399 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng x 5.8 50 0.0123 6.4 50 0.1011 4.6 55 0.0107 5.2 55 0.0000 5.8 55 0.0274 6.4 55 0.0947 4.6 60 0.0442 5.2 60 0.0254 5.8 60 0.0199 6.4 60 0.0735 ; proc print data=scatter; run; goptions reset=all hpos=0 vpos=0 hsize=9 cm vsize=9 cm colors=(black black green black) cback=white ftext=simulate htext= 0.35 cm; title1 h=0.4cm 'Anh huong cua pH & nhiet do'; proc g3d data=scatter; scatter Tem*pH=Act/ grid rotate=150 tilt=80 shape='prism' size=1.2 yticknum=6 xticknum=4 zticknum=5 zmin=0 zmax=0.2; run; Chương trình SAS cho đồ thị 3D và contour xác định ảnh hưởng của nồng độ và thời gian đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase của enzyme bromelain khóm data scatter; input C t Act; cards; 0 0 0.1860 0 5 0.2175 0 10 0.1407 0 15 0.0154 0 20 0.0023 0.002 0 0.2169 0.002 5 0.0444 0.002 10 0.0471 0.002 15 0.0000 0.002 20 0.0000 0.004 0 0.2743 0.004 5 0.0253 0.004 10 0.0155 0.004 15 0.0000 0.004 20 0.0000 0.006 0 0.1976 0.006 5 0.0159 0.006 10 0.0035 0.006 15 0.0000 0.006 20 0.0000 0.008 0 0.1776 0.008 5 0.0107 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xi 0.008 10 0.0000 0.008 15 0.0000 0.008 20 0.0000 ; proc print data=scatter; run; goptions reset=all hpos=0 vpos=0 hsize=9 cm vsize=9 cm colors=(black black green black) cback=white ftext=simulate htext= 0.35 cm; title1 h=0.4cm 'Anh huong cua nong so & thoi gian'; proc g3d data=scatter; scatter t*C=Act/grid rotate=240 tilt=80 shape='prism' size=1.2 yticknum=6 xticknum=3 zticknum=4 zmin=0 zmax=0.3; run;