Luận văn Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của nấm metarrhizium anisopliae và nấm beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại

nấm trong vai trò điều khiển cân bằng sinh học trong tự nhiên nói chung và trong bảo vệ thực vật nói riêng nên hiện nay nhiều nghiên cứu trên thế giới về nấm đƣợc áp dụng, một số kỹ thụât đƣợc áp dụng trong 8 nhận diện nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng Isozymes (St Legent et al ., 1992;Poprawski et al .,1998), rRNA Sequences (Rakotonirainy et al .,1991), phân tích RFLP (Kosir,Macpherson và Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al .,1997). Trong đó vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với PCR cho kết quả khả quan hơn cả . 2.3. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghịêm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong vụ. Dùng nấm B. bassiana vuille để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004). Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều (Trần Văn Mão, 2004). Nghiên cứu gần đây của Hệ Thống Nghiên Cứu Nông Nghiệp Hội Đồng Khoa Học Công nghệ Việt Nam cho kết quả nhƣ sau:nấm Beauveria bassiana ký sinh trên sâu róm hại thông có khả năng trừ sâu là đến 93.6%. Còn tác dụng khi sử dụng kết hợp hai lọai nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae trong vịêc trừ hại cho bọ dừa đạt hiệu quả từ 56%-97% (www.vnast .gov.vn/index .asp……) Ở Bolivia, các nhà nghiên cứu thuộc công ty PROBIOMA đã sản xuất thành công nhiều chế phẩm sinh học từ nhiều loài nấm thiên dịch khác, trong đó có hai loài nấm phổ biến là Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae và chế phẩm trên thị trƣờng là: ProbioBass, ProbioMet 9 iPROBIOMET CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM METARRHIZIUM ANISOPLIAE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI PROBIOBASS CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM BEAUVERIA BASSIANA VUILLE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium (Nguồn : www.probioma.org.bo) 2.4. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng - Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua lớp vỏ cơ thể. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chiti mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc côn trùng chích hút và cả những pha phát triểncủa côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh đƣợc. - Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng.Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các bào nội quan để gây bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nƣớc. Dƣới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhƣng rất ít. Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên 10 trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết - Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục. - Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấmgây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau. - Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào. 2.5. Hoạt tính sinh học - Các nấm diệt sâu cũng đƣợc chú ý nhiều nhƣ một sinh vật sản sinh các enzyme, toxin và các chất hoạt tính sinh học khác. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine(ví dụ: nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana ,nấm Muscardine xanh: Metarrhizium anosopliae )có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn enzyme, trong đó có ý nghĩa lớn nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chứa. chitinase,Proteinase,lipase và amylase. 2.6. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana vuille cũng nhƣ một số nấm ký sinh côn trùng khác trong ứng dụng để phòng trừ sâu hại 2.6.1. Nghiên cứu trong nƣớc - Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarrhizium để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarrhizium sau khi đã thử nghiệm trong phòng, trong nhà lƣới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Hiện tại ở Việt Nam đã thu thập và lƣu giữ một số chủng nấm Beauveria và Metarrhizium, 11 gồm 18 nguồn Beauveria và 10 nguồn Metarrhizium. Chúng đƣợc phân lập từ các loại côn trùng khác nhau, gồm sâu đo xanh, châu chấu hại cam, sâu khoang hại lạc, rầy nâu hại lúa, sâu đục thân ngô, sâu xanh hại bông, sâu cắn gié, bọ xít đen, bọ xít dài (Nguyễn Văn Tuất, 2000). - Theo Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho các chủng Metarrhizium anisopliae là môi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu.Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau một năm xử lý. - Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm, sản xuất và ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Ngoài ra, ở nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành. Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng - Hemiptera - Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nƣớc ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108 bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo phƣơng pháp này là 10 ngày, chế phẩm đƣợc làm khô ở nhiệt độ 45oC trong 8 giờ và có thể đƣợc bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phƣơng pháp lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trƣờng có pepton, cao nấm men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 109 bào tử/gam. Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lƣng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 108 bào tử/ml. Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm. - Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phƣơng pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn đƣợc các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao. Từ các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập đƣợc 9 chủng nấm Beauveria bassiana từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu 12 trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trƣởng thành và sâu xanh da láng nhƣng ở các mức độ khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng khoai lang ở Thủ Đức Thị Hƣơng Giang, 1997). - Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa . 2.6.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc - Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Theo Juntin L.Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawski và Ray M. Miller (1999), các nghiên cứu về nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng từ năm1995-1998, và cho biết trong 8 lòai nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết chết rầy mềm, gồm có 6 lòai thuộc Entomophthorale Pandora neoaphidis, Connidiobolus thromdoides, C.corcnatus, Entomophthora planhoniana và Neozygites fresenii) và hai lòai thuộc Hyphomycetes (Beauveria bassiana, verticillium lecanii) . Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm , 3mm, 4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì không đáng kể. Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố ở nấm Metarrhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể 13 . Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana ký sinh trên ong (nguồn: wescaco.ars.usda.gov) Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập từ New Zealand bằng hai phƣơng pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập đƣợc thành 4 nhóm có kiểu di truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhóm B. bassiana, nhóm B. brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền giữa giống B. bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii. 2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 và vùng ITS1 -5.8S – ITS2: Có nhiều phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) có những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi hỏi số lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lƣợng mẫu có thể phân tích đƣợc trong thời gian thích hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mô tả đặc điểm những giống Metarrhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký chủ. Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của những giống Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana lây nhiễm trên côn trùng. Đó là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2 đƣợc tiết ra bởi nấm Beauveria bassiana và men cắt giới hạn các sản phẩm PCR hai vùng này 14 2.8. Phản ứng PCR 2.8.1. Giới thiệu sơ lƣợc về PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, biện pháp cắt mầm bệnh trên ngƣời, vật nuôi và thực phẩm. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thƣờng là 94oC – 95oC trong vòng 30 giây – 4 phút. Bƣớc 2 (bƣớc lai, anealation): trong bƣớc này, ở nhiệt độ hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thƣớc sản phẩm khuếch đại. Bƣớc 3 (bƣớc kéo dài, elongation): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleoid lần lƣợt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mồi đƣợc nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 72oC. Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bƣớc trên sẽ đƣợc lập lại nhiều lần, làm gia tăng số lƣợng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312nm). 2.8.2. Yêu cầu cần thiết trong phản ứng PCR - DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch. - Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Tag polymerase tách chiết từ vi - khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus, có khả năng chịu nhiệt cao. - Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:Trình tự của 15 - primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngƣợc”. - “Nhiệt độ nóng chảy” (Tm) của primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc cách biệt quá xa - Các pimer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại. - Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngƣợc không quá lớn, phản ứng PCR tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1kb. 2.8.3. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng trong việc lập bản đồ gen, dòng hoá gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen, các khảo sát trong pháp y, trong điều tra hoạt tính di truyền, trong khảo cổ học thì giúp khuếch đại những đọan DNA ủa những sinh vật đã tuyệt chủng nhƣ: khủng long, voi mamut…và những hóa thạch khác.Và gần đây là đóng góp vào việc giải mã bộ gen ngƣời, đƣợc xem là thành tựu mang tính lịch sử. Do vậy, ƣu điểm của công cụ PCR là khả năng khuếch đại chính xác một trình tự DNA mong muốn với một lƣợng lớn. Hiện nay, phƣơng pháp PCR còn đƣợc sử dụng trong phát hiện các virus, vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và động vật cũng nhƣ việc kiểm nghiệm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, trong nƣớc. Ở các nƣớc phát triển, PCR đã đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ công cụ chuẩn đoán trong y học để phát hiện những bệnh di truyền, đƣợc sử dụng trong điều tra tội phạm để xác định những ngƣời bị tình nghi ở cấp độ phân tử, đƣợc sử dụng trong xác địnhquan hệ quyết thống và là một công cụ hữu hiệu trong việc giải trình tự các bộ gen ngƣời. 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR - Trừ vài trƣờng hợp rất cá biệt, phƣơng pháp PCR không hoạt động đƣợc với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dƣới 1,5 kb cho kết quả tốt. - Ỵếu tố ngoại nhiễm lớn nhất thƣờng là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trƣớc. - Các công đoạn thao tác khác nhau nhƣ thiết lặp phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải đƣợc tiến hành ở các địa điểm cách xa nhau. 16 - Micropipette không sử dụng vào các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trƣớc. - Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotid (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998)). 2.9.Kỹ thuật RFLP(Restriction Fragment length polymorphism) * Kỹ thuật RFLP(sự đa hình về chiều dài các đọan DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Đây là phƣơng pháp tạo nên các đọan cắt khác nhau trên band agarose và đƣợc ghi nhận trên gel bởi máy điện di, từng lòai có kích thƣớc riêng và đặc trƣng cho từng loài.Khi xử lý cùng một enzyme cắt cho các mẫu DNA khác nhau, những lòai khác nhau sẽ cho kích thƣớc band khác nhau trên gel tạo nên sự đa hình trong loài đó . Còn những loài khác nhau sẽ cho kích thƣớc band khác nhau. * Quy trình phƣơng pháp RFLP thông thƣờng: 1. Ly trích và tinh sạch DNA. 2. Thực hiện phản ứng cắt các mẫu DNA khác nhau trên cùng enzyme cắt. 3. Điện di và tiến hành phản ứng lai Southern blot. Trong thực tế, DNA của genome là rất lớn, nên khi cắt bởi enzyme và điện di Southern blot. Đây là môt kỹ thuật rất tốn kém và phức tạp. Do đó khi sự khác nhau trong trình tự của các loài lân cận chỉ xảy ra ở một vùng nào đó trong genome thì áp dụng kỹ thuật RFLP dựa trên PCR có thể đƣợc sử dụng phân biệt các sản phẩm PCR. Quy trình phƣơng pháp RFLP dựa trên PCR (phƣơng pháp RFLP-PCR): - Tách chiết DNA tổng số,tinh sạchDNA. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. - Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã đƣợc cắt. Ƣu điểm của phƣơng pháp RFLP-PCR so với phƣơng pháp RFLP thông thƣờng: - Đơn giản, dễ thực hiện . - Cần lƣợng nguyên liệu DNA ít. - Có thể đọc đƣợc kết quả trực tiếp bằng mắt thông qua điện di trên gel. 17 - Không cần phải sử dụng các đầu dò phức tạp và tốn kém. - Khi đọc kết quả dùng ánh sáng huỳnh quang thay cho chất phóng xạ. 2.10.Giải trình tự bằng máy đọc tự động Ở đây, chúng tôi tiến hành giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR bằng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 của công ty AB (Applied Bioscience). Máy hoạt động dựa trên nguyên tắc của Sanger nhƣng có một số cải biên. Trong kỹ thuật này ngƣời ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hoá chất – các fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrlamide, kết quả sẽ đƣợc đọc qua một hệ thống vi tính. 18 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm - Thôøi gian ñeà taøi ñöôïc tieán haønh laø töø 20/2/2006 ñeán 15/8/2006 - Ñòa ñieåm :phoøng thöïc taäp beänh caây Boä Moân Baûo Veä Thöïc Vaät, khoa Nông Hoïc vaø trung taâm Phaân Tích Thí Nghieäm Hoùa Sinh tröôøng Ñaïi Học Nông Laâm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh . 3.2. Vật liệu và hoá chất 3.2.1. Vật liệu 3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm Đối tƣợng khảo sát là gen gây độc protease (Pr1) hiện diện ở nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 hiện diện trên nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại cây trồng. Các mẫu phân lập nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc thu thập trên một số côn trùng gây hại ở một số tỉnh thành trong nƣớc. 3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự Các primer đƣợc dùng để khuếch đại gen, giải trình tự đều đƣợc thiết kế bằng phần mềm Amplify v1.4. Các primer đƣợc tổng hợp bởi công ty IDT (Mỹ) do công ty Bio-Rad cung cấp. 3.2.2. Hoá chất và môi trƣờng Các hoá chất đƣợc sử dụng trong đề tài này đƣợc sản xuất bởi Công ty Sigma, Merk, Amersham Biosence và Bio Rad. 3.2.2.1. Các hoá chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm Phenol bảo hoà trong TE pH 8,0. Chloroform. Isoamyl. Isopropanol. Ethanol 100%. Ethanol 70%. RNAse 1mg/ml. 19 Nitơ lỏng. Dung dịch chiết xuất (lyssis buffer): 50mM Tris HCl, 50mM EDTA, 3%SDS, 1% - mercaptoethanol. Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1). 3M sodium acetate (pH5,2). Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH 8,0. 3.2.2.2. Các hoá chất dùng trong điện di Gel agarose, thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1% agarose. Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện di với thành phần nhƣ sau: Tris HCl 4,48 g Na2EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml Glacial acetic acid 1,14 ml Nƣớc cất vừa đủ 1 lít Dung dịch nhuộm gel là Ethidium bromide 1%. Ladder 1.5kb, 1kb. 3.2.2.3. Hoá chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) Taq DNA polymerase nồng độ 5UI/µl. Dung dịch đệm 10X: đi kèm với Taq. dNTP 10 mM. MgCl2 50 mM. Primer 1 (METPR1). Primer 2 (METPR4). Primer 3 (METPR2). Primer 4 (METPR5). 3.2.2.4. Môi trƣờng Môi trƣờng PGA. Môi trƣờng Agar. Môi trƣờng lỏng CZA. 20 3.2.3. Các thiết bị chính Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho một phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Máy đo pH. Máy lắc. Máy ly tâm lạnh. Máy khuấy từ. Bộ điện di ngang HorizonR 558 (Life Technologies). Máy PCR (PTC – 100 Programable Thermal Controller, MJ Raearch). Máy vortex . Máy chụp hình gel Bio –Rad. Máy đọc trình tự ABI PRISM 3100. 3.3. Nội dung nghiên cứu 1. Phục hồi 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae vaø Beauveria bassiana trên một số sâu hại cây trồng. 2. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc của 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1) và Beauveria bassiana, vùng ITS1 -5.8S – ITS2 3. Xác định tính đa dạng di truyền của gen Pr1 và gen ITS1 - 5.8S - ITS2 trên nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille bằng phƣơng pháp RFLP và phƣơng pháp giải trình tự (Sequencing). 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu: 3.4.1 Phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA: Nấm đƣợc thu thập từ nhiều địa phƣơng khác nhau nhƣ : Bến tre.Tiền Giang, long An, Đồng Tháp, Quận 9, Quận 2 TP Hồ Chí Minh,…trên một số côn trùng gây hại nhƣ: Rầy Nâu, Bọ Dừa, Bọ Xích Đen,…đƣợc bảo quản trong ống nghiệm dể phục hồi sức sống cho nấm chúng tôi tiến hành cấy chuyền nấm sang môi trƣờng PGA(potato –glucose – agar). - Thành phần môi trƣờng phục hồi: (PGA)cho 1lít + Glucose: 20g. + Khoai tây: 200g. 21 + Agar: 18-20g. + Nƣớc cất1lần: 1lít. - Cách nấu: nấu khoai tây với 1lít nƣớc khỏang 1h cho mềm, vớt bỏ xác lấy nƣớc đong lại cho đủ 1lít (nếu thiếu cho thêm nƣớc cất)sau đó cho agar và glucose vào nấu cho tan, đem hấp môi trƣờng bằng Autoclay 1210C 15phút, để nguội bớt đỗ lên dĩa dã tịêt trùng (sấy ở 2000C trong 1h), khỏang 15ml để chuẩn bị cấy chuyền. - Cách cấy:dùng que cấy đã khử trùng bằng đèn cồn cấy lên 4 điểm, cấm sâu vào bề mặt thạch, sau 5-7 ngày nấm phát triển mạnh lúc này có thể sử dụng nấm để nhân sinh khối. 3.4.2 Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm Các mẫu phục hồi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng CZA (Czapek- Dox) (Tuite, 1969): - Glucose 10g. - Dịch chiết nấm men (Yeast extract) 1.5g. - KH2PO4 0.025g. - K2HPO4 0,25g. - MgSO4.7H2O 0.25g. - Một lƣợng nhỏ vài mg NACL. . - Nƣớc cất : 500ml. Tất cả cho vào cốc 500 ml nƣớc cất vô trùng và đặt vào máy khuấy từ nấu khoảng 20 phút. Sau đó đổ vào 10 bình tam giác, mỗi bình 50 ml đem hấp khử trùng 20 phút. Sợi nấm đƣợc băm nhỏ trực tiếp từ bề mặt của môi trƣờng PGA cho vào bình chứa môi trƣờng lỏng, để vào máy lắc điều chỉnh ở mức 170 vòng khoảng từ 3-5ngày, sau đó ta thu đƣợc khối sợi nấm là những hạt tròn nhỏ li ti. Lọc lấy khối sợi nấm này qua giấy lọc (đã đƣợc khử trùng) và làm khô. Đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở -80 o C. 3.4.3 Phƣơng pháp ly trích DNA Quy trình tách chiết đƣợc cải tiến theo hƣớng đơn giản nhƣng vẫn đạt đƣợc hiệu quả tốt trong sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR (Leal, 1994) nhƣ sau: - Đặt 1g sợi nấm đƣợc làm khô kiệt vào cối và nghiền nát trong dung dịch nitơ lỏng. Sau khi nghiền xong chuyển dung dịch này sang một eppendorf thể tích 1,5 ml. Lƣu ý trong công đoạn này cố gắng giữ cho bột nấm đƣợc nghiền không tan . 22 - Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ ở 65oC.ở giai đọan này để đạt hiệu quả tốt có thể ủ thời gian kéo dài hơn làm quá trình phá vỡ màng DNA tốt hơn. - Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nƣớc ấm. Thêm vào khoảng 300 l Phenol:Chloroform: Isoamyl: alcohol (25:24:1)lắc nhẹ nhiều lần, dung dịch lúc này có màu trắng đục nhƣ sữa. - Ly tâm 20 phút 13500 vòng ở nhiệt độ phòng 280C. - Thu dung dịch (phần trên ống nghiệm ) sang một ống nghiệm khác, chất kết tủa DNA bởi sự thêm vào với thể tích tƣơng ứng 0.03 mol của 3M Sodium acetate và 0.5 mol của Isopropanol (tƣơng ứng khỏang 15ml Sodium acetate : 250ml Isopropanol), trộn nhẹ nhàng nhiều lần. Lúc này DNA kết tủa thành những sợi có màu trắng đục. - Ly tâm 13500 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng 280C. - DNA kết tủa nằm dƣới đáy eppendorf, nhẹ nhàng dổ bỏ dịch nổi phía trên, dùng ethanol 70% rửa DNA khoảng 3 lần, mỗi lần khoảng 300 l. - Làm khô DNA ờ nhiệt độ phòng khỏang 2h, hoà tan DNA trong khỏang 80µl dung dịch TE 1X, đánh tan DNA và tồn trữ mẫu ở . +4 oC hoặc -20oC cho đến khi sử dụng. - Điện di kiểm tra kết quả bằng bộ điện di ngang trên gel agarose, nồng độ gel 0.8%. *LƢU Ý: cần phơi DNA khô trƣớc khi cho TE 1X vào để bảo quản mẫu, vì Ethanol dễ phá hủy DNA nếu trữ mẫu lâu 3.4.4 Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau: Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp lắc nhẹ nhàng. Ủ ở 370C khoảng 30 phút. Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ nhàng nhiều lần . Ly tâm lấy phần dịch nổi phía trên sang ống khác. 23 Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA đƣợc khuếch đại theo phƣơng pháp PCR với cặp primer có trình tự cụ thể nhƣ sau: - METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’ - METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Bảng 3.1 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Metarrhizium Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) - PCR buffer 1X 2.5µl - MgCl2 1.5mM 0.75µl - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl - METPR1 50ng 1.5µl - METPR4 50ng 1.5µl - Tag DNA polymerase 0.04UI 0.5µl - DNA khuôn 125ng 1µl - Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l 24 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt khuếch đại gen Pr1 trên nấm Metarrhizium Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian - Tách đoạn DNA 940C 5 phút - Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) - Tách đoạn DNA 940C 1 phút - Ủ bắt cặp 570C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút - Kéo dài 720C 6 phút - Ủ 40C 6 phút 3.4.5.2 Nấm Baeuveria Bassiana vuille Đọan DNA đƣợc khuếch đại có trình tự primer cụ thể nhƣ sau : Primer Trình tự (5’-3’) ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Bảng 3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Beauveria Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) - PCR buffer 1X 2.5µl - MgCl2 1.5mM 0.75µl - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl - ITS 4 50ng 1µl - ITS 5 50ng 1µl - Tag DNA polymerase 1UI 0.25µl - DNA khuôn 100ng 1µl - Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l 25 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 trên nấm Beauveria Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian - Tách đoạn DNA 940C 3 phút - Số chu kỳ lặp lại (30 chu kỳ) - Tách đoạn DNA 940C 1 phút - Ủ bắt cặp 560C 30giây - Kéo dài 720C 4 phút - Kéo dài 720C 7 phút - Ủ 40C 10 phút 3.4.6 Điện di và đọc kết quả trên gel Agarose 3.4.6.1 Điện di trên gel Agarose - Cho 0.125 gram agarose vào 12.5ml dung dịch 0.5X TAE. - Đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò viba. - Để nguội ở nhiệt độ phòng. - Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí trên gel. - Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel, cho dung dịch 0.5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel. - Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng than chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định kiểu gen, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA.. 3.4.6.2 Đọc kết quả điện di - Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. 26 - Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000). - Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel. - Xác định kết quả dự kiến: đối với cặp primer METPR1/METPR4 thì trên màn hình xuất hiện băng có kích thƣớc 1,5kb. 3.4.7 Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 trên nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8s – ITS2 trên nấm Beaveria Bassiana vuille Sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc này, từ đó so sánh với ngân hàng gen thế giới. Đầu tiên để đạt đƣợc kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao. 3.4.7.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch).Cho vào GFX 500µl capture buffer. 2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX. 3.Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần. 4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng trong 30 giây ở 40C. 5.Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đó đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc. 6.Thêm 500µl wash buffer vào cột GFX. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây ở 40C. 7.Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới. 8.Thêm 50µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX. 9.Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. 10.Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút ở 40C. Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở- 40C 27 3.4.7.2 Thành phần của phản ứng đọc trình tự Buffer đƣợc sử dụng ở nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối cùng phải đạt là 1X Bảng 3.5 Thành phần phản ứng đọc trình tự Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) - BDT mix 2,5 X 4µl - Buffer 5 X 2µl - Primer 3.2 pmol 1µl - DNA khuôn 10-40 ng 1µl - Nƣớc cho đến 10 µl * Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự * Nấm Metarrhizium anisopliae 1. Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đến thể tích chính xác. 2. Biến tính hoàn toàn: 960C trong 1 phút. 3. Lặp lại 25 chu kỳ: 960C trong 10 giây. 50 0C trong 5 giây. 60 0 C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. * Nấm Beaveria Bassiana vuille 1. Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thông số. 2. Biến tính hoàn toàn: 950C trong 5 phút. 3 .lặp lại 25 chu kỳ: 950C trong 30 giây. 50 0C trong 10 giây. 60 0C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. 3.4.8 Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự Sản phẩm đọc trình tự đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp EDTA . - Cho 5µl EDTA vào mỗi eppendorf. - Thêm vào 60µl ethanol 100% mỗi eppendorf. 28 - Trộn đều lên xuống hỗn hợp vài lần. - Đem ủ mẩu ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12000 vòng trong 30 phút. - Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70%. - Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C. - Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khô ở nhiệt độ phòng. - Làm tan DNA bằng cách cho vào 2µl hidiformamide, biến tính 950C trong 3 phút. 3.4.9 chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100 sản phẩm sau tinh sạch, tiến hành điện di và đọc kết quả trên máy Sequencer. 3.4.10 Phân tích RFLP *Quy trình chung phản ứng cắt - Ủ khoảng 1 g DNA đã đƣợc khuếch đại với 1U enzyme cắt dƣới những điều kiện nhà sản xuất (Roche) hƣớng dẫn. Thành phần của phản ứng xem bảng 3.6. - Những đoạn DNA đã cắt đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đó gel đƣợc nhuộm ethidium brommide. Đọc kết quả và chụp hình dƣới tia UV. Bảng 3.6 Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích SuRE/cut Buffer DNA Restriction enzyme Nƣớc cất vô trùng 10X 100 – 150 ng 10 UI 2,5 l 6 – 10 l 0,1 l Vừa đủ thể tích 25 l 29 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.kết quả phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm đã thu thập đƣợc từ các tỉnh thành trong nƣớc *Kết quả phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA chúng tôi đã phục hồi đƣợc một số dòng nấm dùng trong thí nghiệm sau thời gian khỏang 7-10 ngày nuôi cấy, nấm phát triển tốt, quan sát bào tử nấm trên kính hiển vi, xác định chính xác đây là hai nguồn nấm thu thập ban đầu Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana , không bị tạp nhiễm vi khuẩn hay các lọai nấm khác. Bao gồm các dòng sau: BDQ96, BDTN4, SCLLLA1, RNBT1.7, BXĐTG6, DÒNG3-1, RMTĐ3, BHBD6, NNPT7, SR, BRVT6, PULQ2 . * Kết quả nhân sinh khối sợi nấm trên môi trƣờng CZA. Thu đƣợc sinh khối của 12 dòng nấm gồm: 6 dòng nấm Metarrhizium anisopliae và 6 dòng nấm Beauveria bassiana. Hình 4.1 Nấm Metarrhizium anisopliae(A) Nấm Beauveria bassiana (B) A B B A 30 4.2 Kết quả ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana Sau thu sinh khối chúng tôi tiến hành ly trích các dòng nấm, đây là một quá trình đơn giản nhƣng có ý nghĩa quyết định đến chất lƣợng sản phẩm DNA thu đƣợc trong những bƣớc tiếp theo, phải thao tác nhẹ nhàng và chính xác theo qui trình chung nhằm tránh sự đứt gãy DNA, nhiễm tạp….Qua điện di cho thấy mẫu ly trích có lƣợng DNA thu đƣợc chƣa nhiều, còn lẫn tạp và gãy DNA do quá trình thao tác chƣa tốt . Sản phẩm DNA ly trích đƣợc điện di trên gel thƣờng có nồng độ gel1 %, hiệu điện thế 50 v, 250 mA, trong khỏang thời gian 50 phút Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số của nấm Metarrhizium và Beauveria Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 5.PULQ2 11.BXĐTG6 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Qua hình 4.6 ta thấy rằng: lƣợng DNA thu đƣợc trong quá trình ly trích chƣa đồng đều, ở các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 3.NNPT7, 4.SR, 5.PULQ2, 6.BRVT67.SCLLLA1, 8.DONG 3-1, 9.BDQ96 thu đƣợc lƣợng DNA nhiều , thể hiện qua ảnh kích thƣớt band đậm và rõ so với 3 mẫu còn lại là 10.BDTN4,11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7. Phần cuối giếng còn nhiều tạp nên phát sáng nhiều, điều đó gây khó khăn nhiều cho quá trình tinh sạch ở bƣớc tiếp theo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA tổng số Tạp nhiễm 31 4.3. Kết quả tinh sạch DNA tổng số của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana. Tiến hành tinh sạch sản phẩm DNA vừa ly trích bằng RNAse, nhằm lọai bỏ tạp nhiễm và giúp sản phẩm sau khuếch đại đƣợc tốt hơn. Quan sát hình 4.3 ta thấy sau khi tinh sạch tuy lƣợng DNA có giảm so với lúc chƣa tinh sạch nhƣng nhìn chung các mẫu tƣơng đối sạch, ít tạp và hầu nhƣ không còn sản phẩm đứt gãy. Điều này giúp cho quá trình khuếch đại sản phẩm DNA bằng kỹ thuật PCR diễn ra thuận lợi hơn Kiểm tra sản phẩm tinh sạch thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1 %, hiệu địên thế ở 50 v, 250 mA, thời gian điện di 50 phút . Hình 4.3 Hình ảnh DNA tổng số của nấm Beauveria và Metarrhizium sau khi xử lý RNAse Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 5.PULQ2 11.BXĐTG6 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Sau tinh sạch ta thấy rằng các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 4.SR, 5.PULQ2, 9.BDQ9 lƣợng DNA còn nhiều, khi tiến hành phản ứng PCR với những mẫu này cần phải pha lõang nồng độ DNA trong nƣớc cất 2 lần khỏang từ 7-10 lần. Riêng những mẫu còn lại gồm 3.NNPT7, 6.BRVT6, 7.SCLLLA1, 8.DONG3-1, 10.BDTN4 11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7 do nồng độ DNA trong mẫu còn ít hơn nên có thể pha lõang từ 1-3 lần hoặc không pha lõang. Vd:đối với mẫu 6.BRVT6. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA toång soá Tạp nhiễm 32 4.4. Kết quả phản ứng PCR Thực hiện PCR trên 12 dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana, tuy nhiên kết quả khuếch đại sản phẩm DNA chỉ thu đƣợc 6 dòng nấm Beauveria bassiana khi sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5. qua hình 4.4 chúng tôi đã khuếch đại đƣợc vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 gây độc cao, mặc dù đƣợc phân lập từ nhiều ký chủ và địa phƣơng khác nhau nhƣng vẫn cho kích thƣớt các band trên gel nhƣ nhau. Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng PCR. Phản ứng PCR xảy ra tốt trong điều kiện DNA ly trích phải đúng, phải đảm bảo DNA có nồng độ và độ tinh sạch nhất định. Đối với nấm Beauveria bassiana nồng độ DNA phù hợp là 100ng Nồng độ DNA cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha loãng DNA trong dung dịch đệm (TE 1X) hay nƣớc vô trùng Riêng 6 dòng nấm Metarrhizium anisopliae khi sử dụng cặp mồi METPR1 và METPR4 không thực hiện đƣợc phản ứng PCR do một số yếu tố chủ quan nhƣ đã nêu trên. PCR là một phản ứng có độ nhạy cao, nếu quá trình thao tác không đảm bảo điệu kiện vô trùng tƣơng đối thì khó tránh tạp nhiễm dẫn đến kết quả sai lệch hoặc có khi không thu đƣợc kết quả mong muốn. Ngoài ra còn có thể do quy trình chƣa phù hợp, nhiệt độ bắt cặp chƣa tƣơng thích, có sự sai khác đáng kể vùng liên kết trên gen, dẫn đến primer không bắt cặp, nên không khuếch đại đƣợc. Một khả năng nữa không thể thiếu là chính những dòng nấm Metarrhizium đó có độc tính yếu hoặc không có sự hiện diện của gen Pr1 do bị mất đi một đoạn chromosome (Wang C., Skrobek A. and Butt T.M., 2003)…Vì thế phản ứng khuếch đại DNA trên các dòng nấm Metarrhizium anisopliae vẫn chƣa có thể thực hiện đƣợc. Ở hình 4.4 ta thấy rằng, 2 mẫu đầu gồm: 1.RMTĐ3 và 2.BHBD6 tạo band phát sáng đậm là do nồng độ DNA có trong 2 mẫu trên cao hơn so với 4 mẫu còn lại, nên khi khuếch đại sẽ tạo sản phẩm có kích thƣớc band dày. Sản phẩm khuếch đại đƣợc điện di trong 60 phút , 250 mA, 50 V, nồng độ gel là 1 %. 33 Hình 4.4 sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0.5 pmol/µl Ghi chú :1. RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5.PULQ2 6.NNPT7 7.LADDER 4.5. Kết quả phân tích RFLP trên các dòng nấm Beauveria bassiana vuille Khi thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn cho 6 dòng nấm Beauveria Bassiana. kết quả cho thấy chƣa thấy rõ sự đa dạng về di truyền giữa các dòng nấm, nguyên nhân là do không có khả năng khảo sát trên nhiều enzyme cắt khác nhau, mà chỉ thực hiện đƣợc phản ứng cắt trên 2 enzyme đặc trƣng Hae III và Alu I. Vì thế nên chƣa thấy rõ đƣợc sự đa hình trên các band địên di, chỉ cho 2 band có kích thƣớc nhƣ nhau trên cả 6 dòng phân tích. Tuy nhiên tổng kích thƣớc band trên mỗi mẫu đều tƣơng đƣơng với kích thƣớc của ladder 580 bp Với enzyme HaeIII khi cắt trên 6 dòng nấm Beauveria bassiana gồm 1.RMTĐ3, 2.SR, 3.BHBD6, 4.BRVT6, 5.PULQ2, 6.NNPT7, qua hình 4.5 cho thấy enzyme cắt đƣợc hết sản phẩm PCR trên cả 6 mẫu nấm, tạo thành 2 band có kích thƣớc tƣơng đƣơng trên ladder 1.5 kb là 200 bp và 380 bp. Nồng độ DNA là 100ng (sử dụng 6µl). 1 2 3 4 5 6 7 1 kb 580 bp 34 với enzyme Alu I cũng thực hiện phản ứng cắt trên 6 dòng Beauveria bassiana nhƣ với enzyme Hae III. Qua hình 4.9 cho thấy enzyme Alu I cũngcắt đƣợc hết lƣợng sản phẩm PCR của các mẫu nấm ban đầu, và tạo thành 2 band có kích thƣớc tƣơng ứng trên ladder là 250 bp và 330 bp. Do quá trình bơm mẫu vào giếng và giai đọan trộn mẫu thao tác chuẩn nên kích thƣớc các band chƣa đề. Tuy nhiên với kích thƣớc band tạo ra tƣơng ứng 580 bp trên mỗi enzyme cho thấy mẫu cắt chính là nấm Beauveria bassiana, và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 Chính là vùng mà enzyme Hae III và Alu I đã cắt đƣợc. Hình 4.5 Sản phẩm cắt trên 2 enzyme Hae III và Alu I Ghi chú: 1.RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5. PULQ2 6. NNPT7 7. LADDER 8. RMTĐ3 9. SR 10. BHBD6 11. BRVT6 12. PULQ2 13. NNPT7 Mẫu enzyme cắt đƣợc điện di ở 50 V, 250 mA, trong thời gian 60 phút. ladder 1.5 kb Alu I Hae III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 35 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Đã phục hồi đƣợc 12 nguồn nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana trên các côn trùng khác nhau: bọ xít đen, bọ dừa, sâu cuốn lá lúa, rầy nâu ở các tỉnh Tiền Giang, Tây Ninh, Long An, Bến Tre, Quận 9 – Thành phố Hồ Chí Minh, Quận 2 – thành phố Hồ Chí Minh. - Sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phát hiện vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ở nấm Beauveria với cặp mồi ITS4 và ITS5, các thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt cụ thể đã đƣợc hoàn thiện. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục thu thập, phục hồi và phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae với số lƣợng mẫu lớn hơn từ nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc nhằm làm phong phú thêm bộ giống các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ tự nhiên ở Việt Nam. Tạo điều kiện phục vụ dắc lực cho Nông nghiệp nói chung và công tác bảo vệ thực vật nói riêng . - Trong phân tích RFLP, sản phẩm cắt chƣa cho thấy rõ sự đa hình giữa các dòng nấm với nhau. Nếu có điều kiện cần tiếp tục hoàn thiện và đọc trình tự trên nhiều đối tƣợng khác nhau , từ đó so sánh với ngân hàng gen trên thế giới để biết sự khác biệt và có hƣớng nghiên cứu phù hợp . 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231. 2. Tạ Kim Chỉnh, 1996. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt côn gây hại ở Việt Nam và khả năng ứng dụng. Luận án PTS. Viện Công Nghệ Sinh Học – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng, 1981. Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206. 5. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 140 – 145. 6. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 150 – 155. 7. Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarrhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Trang 7 –30. 8. Võ Thị Thƣơng Lan. Sinh học phân tử. Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Trang 159 – 161. 9. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 10. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích tập II. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trang 49 – 90. 11. Tống Kim Thuần, 2001. Vi sinh vật diệt sâu hại đậu tương và triển vọng sử dụng chúng ở Đồng Bằng Sông Hồng. Tạp chí sinh học 9/2001, 23(3): 22 – 28. 12. Phạm Thị Thùy, Ngƣyễn Văn Thiêm, Võ Hiền, 2000. Kết quả khảo nghiệm chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae để phòng trừ bọ hại dừa. 37 13. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Trang 19 – 44. 14. Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết, 2000. Sản suất chế biến và sử thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học. Viện Bảo Vệ Thực Vật. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 15. Nguyễn Ngọc Tú-Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TP.Hồ Chí Minh. 158 trang. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 16. Bidochka M.J., McDonald M.A., St Leger R.J., and Roberts D.W., 1994. Differentiation of species and strain of entomopathogenic fungi by Random Amplifiction of Polymorphic DNA (RAPD). Current Genetics 25: 107 – 113. 17. Charnley A.K., Xia Y., Gao M., and Clarkson J.M.,2002. Molecular cloning, characterisation, and expression of a neutral trehalase frpm the insect pathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Journal of invertebrate pathology 80: 127 –137. 18. Charnley A.K., and El – Sayed, 1989. A technique for accelerating and synchronising germination of conidia of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Archives of Microbiology 142: 204 – 206. 19. Destéfano R.H.R., Destéfano S.A.L., and Messias C.L., 2004. Detection of Metarrhizium anisopliae var anisopliae within infected sugarcane borer Diatraea saccharalis (Lepidoptera, Pyralidae) using specific primers. Genetics and Molecular Biology, 27, 2: 245 – 252. 20. Fegan M., Manners J.M., Maclean D.J., Irwin J.A., Samuels K.D., and Holdom D.P., 1993. Random amplified polymorphic DNA markers reveal a high degree of genetic diversity in the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisoliae var anisopliae. Gene Microbiol 139 (Pt9): 2075 – 2081. 21. Hegedus D.D., and Khachatourians G.G., 1993. Construction of cloned DNA probes for the specific detection of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in grasshoppers. Journal of Invertebrate Pathology 62: 233 –240. 22. Joshi L., Leger R.J.St., and Roberts D.W., 1997. Isolation of a cDNA encoding a novel subtilisin – like protease (Pr1B) from the 38 enthomopathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae using differential display RT-PCR. Gene 197: 1 – 8. 23. Leal S.C.M., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1994. Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae by RAPD – PCR. Mycological Research 98: 1077 – 1081. 24. Leger R.S.T., Roberts D.W., and Staples R.C., 1999. Molecular cloning of a comlimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi. Boyce Thompson Institute for Plant Research, Inc, Ithaca, NY. 25. Maria C.V., and Peberdy J.F., 1997. Location of chitinolytic enzymes in protoplasts and whole cells of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Mycological Research 101 (11): 1393 – 1396. 26. Nam Jin – Sik, Lee D.H., Lee K.H., Park H.M., and Bae K.S., 1998. Cloning and phylogenetic analysis of chitin synthase genes from the insect pathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae var anisopliae. FEMS Microbiology letters 159: 77 – 84. 27. Raymond J., St Leger R.J., Lokesh Joshi, Michael J., and Bidochka, 1995. Protein synthesis in Metarrhizium anisopliae growing on host cuticle. Mycological Research 99: 1034 – 1040. 28. Soraya C.M.L., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1997. Amplification and restriction endonuclease digestion of the Pr1 gene for the detection and characterization of Metarrhizium strains. Mycological research 101 (3): 257 – 265. 29. St Leger R.J., May B., Allee L.L., Frank D.C., Staples R.C., and Roberts D.W., 1992. Genetic differences in allozymes and information of infection structures among isolates of the entomopathogenic fugus Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertabrate Pathology 60: 98 – 101. 30. Wang C., Skoroberk A., and Butt T.M., 2003. Concurrence of losing a chromosome and the ability to produce destruxin in a mutant of Metarrhizium anisopliae. FEMS Microbiology lettres 226: 373 – 378. 31. Bidochka, M .J.&Khachatorians, G. G (1993). Regulation of extracellular N-acetyl-D-glucosidase production in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana vuille . Canadian Journal of Microbiology 39,6-12 32. Riba, G, Bouvier-Fuorcade, I.,and caudal, A. (1986) Isoenzyme polymorphisms in Metarrhizium anisopliae (Deute-romycotina, Hyphomycetes) entomogenous fungi . Mycopa-thologia 96,161-169 39 33. File://D:\Beauveria- thang7\Selection%20of%20Beauveria%20bassiana%20and%20Metarh... 8/17/2004 34. Kosir, J . M., MacPherson, J.M. &Khachatuorians, G. G.(1991). Genomic analysis of c Virulent and a less virulent strain of the enthomopathogenic fungus Beauveria bassiana , using restriction fragment length polymorphism . Canadian Journal of Microbiology 37,534-541 35. Mugnai, L,. Bridge . P.D & Evans, H.C. (1989). A chemotaxonomic evaluation of genus Beauveria . Mycological Research 92,199-209 36. poprawski, T. J., Riba, G., Jones, W. A. & Aioun , A. (1988) . Variation in isoesterase profiles of geographic population of Beauveria bassiana (Dueteromycotina: Hypomycetes ) isolates from Sitona weevils (Coleoptera:curculiondae). Environmental Entomology 17 , 275-279