Luận văn Sử dụng số hóa chất cải thiện hiệu quả ly trích DNA từ lông

và gen halothane ................................................ 9 2.7.1. Nguyên tắc xác định gen giới tính ..................................................................... 9 2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane ................................................................... 9 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 11 3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 11 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành.............................................................................. 11 3.3. Vật liệu ................................................................................................................... 11 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA ............................................................................ 11 3.3.2. Đoạn mồi ......................................................................................................... 11 3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính ........................................................ 11 vii 3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane .................................................................... 12 3.4. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................................................. 12 3.4.1. Lấy và trữ mẫu ................................................................................................. 12 3.4.2. Tách chiết DNA ............................................................................................... 12 3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ly trích ......................................... 15 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................................ 15 3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính ............................................................ 15 3.4.4.2. PCR xác định gen halothane..................................................................... 16 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả .............................................................................. 17 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose ................................................................................ 17 3.4.5.2. Kết quả điện di PCR ................................................................................. 17 3.5 Xử lý số liệu ............................................................................................................ 17 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 18 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA ............ 18 4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò ............................... 19 4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò ................................ 20 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích DNA ............................................................................................................................... 21 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin .............. 23 4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR ................................................ 23 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 25 5.1. Kết luận................................................................................................................... 25 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 25 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 26 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 28 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair ctv cộng tác viên DNA deoxyribonucleic acid NST nhiễm sắc thể OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide BSA bovine serum albumine PCR polymerase chain reaction Taq thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit UV ultra violet W wave ix DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi của gen xác định giới tính ........................................ 12 Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính ................................................. 15 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định giới tính ................................................... 16 Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane ....................................... 16 Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane .......................................... 17 Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ ...... 18 Bảng 4.2a Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò ............................ 19 Bảng 4.2b Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò ................................................................... 19 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông ................................ 21 Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT ........................ 22 Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mức CTAB ................................ 23 Bảng 4.6 Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung ............................. 24 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Chu kỳ đầu tiên trong PCR .............................................................................. 7 Hình 2.2 Chu kỳ thứ hai trong phản ứng PCR .............................................................. 8 Hình 4.1 Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ ............................................................. 19 Hình 4.2 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò ..................................................... 20 Hình 4.3 Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò ................................ 21 Hình 4.4 Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT ................................................. 22 Hình 4.6 Kết quả PCR từ mẫu sử dụng và không sử dụng BSA ................................... 24 Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ .. 18 Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò ......................... 19 Biểu đồ 4.3 Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò ................... 21 Biểu đồ 4.4 So sánh DNA ly trích bởi dung dịch đệm có DTT và không có DTT ....... 22 Biểu đồ 4.5 Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB ... 23 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học nhƣ chăn nuôi, thực vật, thực phẩm...Áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng cấp độ và hiệu quả của việc cải thiện cây trồng và chăn nuôi. Một điều kiện tiên quyết để đạt ƣu điểm của những phƣơng pháp này là khả năng tách chiết và tinh sạch DNA đạt yêu cầu số lƣợng và giữ nguyên cấu trúc. Sự phát triển của những phƣơng pháp tinh sạch DNA hiệu quả từ nhiều nguồn mẫu khác nhau là mối quan tâm đối với những phòng thí nghiệm mô hình mẫu. Công việc này đang là thử thách đối với những vật liệu chứa một hàm lƣợng lớn polysaccharide hay những chất thứ cấp nhƣ polyphenol, terpene, resin… Tách chiết DNA từ máu, thịt rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các mẫu này thƣờng đƣợc dùng cho hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, các nguồn mẫu khác nhƣ lông, da, xƣơng… cũng cần đƣợc quan tâm. Loại mẫu này thƣờng chứa lƣợng DNA ít, nhiều protein và chất hữu cơ nên việc ly trích trở nên khó khăn khi muốn tinh sạch và có đủ lƣợng DNA cho bất kỳ phân tích nào. Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng. Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc tạo sẽ giúp việc tách chiết đƣợc thực hiện nhanh, và có thể đƣợc thƣơng mại hóa vì vấn đề này vẫn còn đang bỏ ngỏ. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu Đánh giá ảnh hƣởng của một số hóa chất trong quy trình tách chiết DNA từ lông, trên cơ sở hoàn thiện quy trình ly trích và tạo bộ kit ly trích lông sau này. 2 1.2.2. Yêu cầu - Thay đổi quy trình tách chiết DNA từ lông heo, bò bằng cách bổ sung canxi, DTT, CTAB trong dung dịch đệm ly trích, và bổ sung BSA trong hỗn hợp PCR. - Kiểm tra hiệu quả quy trình tách chiết thông qua đo OD và phản ứng PCR với gen mục tiêu là giới tính (trên bò) và halothane (trên heo). 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu trúc tổng quát của lông Theo Hairhandout (2005), lông có 3 vùng hình thái học: lớp cutin, vỏ, lõi. - Lớp cutin: là 1 lớp mờ bên ngoài của thân lông chứa những vảy bao lấy thân. Có 3 cấu trúc vảy cơ bản tạo lên lớp cutin – vòng hoa, cánh hoa, mái ngói. - Lớp vỏ: là thân chính của lông chứa những tế bào thon dài và mảnh. Nó chứa cortical fusi, hạt sắc tố, và / hoặc những cấu trúc có hình dạng từ bầu dục đến hình tròn lớn gọi là thân hình trứng. - Lõi: là trung tâm của những tế bào có thể hiện diện trong lông. Thành phần cơ bản của lông là keratin (1 loại protein), melanin (1 loại sắc tố), và 1 lƣợng rất nhỏ nguyên tố kim loại. 2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo Theo Wagner và ctv (1996), lông không chỉ bao gồm thân lông chết nhìn thấy bên ngoài da mà còn bao gồm phần gốc đang phát triển trong da. Phần gốc nằm trong da đƣợc bao quanh bởi bao gốc lông, để lộ ra cấu trúc phức tạp và khác nhau. Cấu trúc này thƣờng đƣợc tìm thấy trong tất cả động vật có vú. Tại phần đế của lông có hình dạng nhƣ chuông (hành lông), bao quanh là một nhú da nhỏ, hình dạng này phụ thuộc vào lớp biểu bì hình ngói của da. Chức năng của hành lông là dinh dƣỡng cho những tế bào đang phát triển của lông. Những tế bào gần nhú lông không khác nhau và là vùng tái sinh của lông, bao gồm cả bao gốc. Phụ thuộc vào vị trí của chúng trong hành lông, những tế bào đƣợc tạo ra sau trong vùng này khác nhau về những loại tế bào mà nó sẽ tạo ra lông và mô xung quanh nó. Mô này chứa năm lớp đồng tâm khác nhau, ba lớp trong cùng hợp thành bao gốc trong cùng (inner root sheath – IRS). Tiếp xúc trực tiếp với lớp cutin của lông là cutin của IRS (IRS – cutin), tiếp theo là hai lớp, lớp Huxley và lớp Henle. Lớp kèm (companion layer – CL) là lớp tiếp theo bên trong bao gốc. Lớp này cũng đƣợc gọi là lớp trong cùng của bao gốc bên ngoài (outer root sheath – ORS) hay bao gốc giữa. Lớp ngoài cùng của bao gốc là ORS, bao quanh bởi những lớp khác nhau và lông. Lớp ORS 4 không chỉ nằm trong phần nhú da của gốc lông, mà còn trong phần thân lông, thay đổi bên trong lớp biểu bì tại điểm kết thúc của nó. Những lớp của bao gốc IRS chứa ba lớp tế bào khác nhau. Lớp trong cùng của nó là cutin (IRS – cutin), những tế bào của nó là những tế bào nhỏ nhất của lông với bề dày dƣới 1 mm. Chúng có hình dạng và cách xếp lớp giống vảy cá. Lớp cutin đƣợc theo sau bởi hai lớp tế bào đơn từ những tế bào có cấu trúc tƣơng tự: lớp Huxley bên trong và Henle bên ngoài. Những lớp này chứa những tế bào có hình dạng thon dài và hình ngọn giáo bao quanh bề mặt nhẵn của lớp cutin – IRS. Ba lớp IRS có sự keratin hóa xảy ra tại những thời điểm khác nhau. Tiến trình này chịu trách nhiệm cho cấu trúc cứng giống da của ba lớp tế bào này. Ý nghĩa sinh lý học của tiến trình này chƣa đƣợc biết. Lớp đầu tiên bị keratin hóa là lớp Henle. Lớp tiếp theo là lớp cutin – IRS. Lớp Huxley giữa hai lớp này vẫn là cấu trúc sợi nhỏ của mô ngắn, không bị keratin hóa. Lớp CL bao quanh IRS. Nó có thể đƣợc thấy trong phần chiều dài gần lớp Henle nhƣ là một lớp sáng hơn, mỏng hơn. Nó gồm một lớp những tế bào hình chữ nhật, dát mỏng. ORS là lớp ngoài cùng của gốc lông. Nó tiếp xúc trực tiếp với CL và xung quanh chứa những tế bào hình khối. 2.3. Cấu trúc của melanin Trong nghiên cứu của Rees (2003) tế bào melanin tạo những hạt melanin chứa một enzyme gọi là tyrosinase. Enzyme này chứa Cu, tổng hợp sự chuyển đổi oxy hóa của DOPA (tyrosine) thành một sắc tố gọi là melanin. Tế bào melanin có nguồn gốc từ những tế bào thần kinh di chuyển vào biểu bì trong tháng thứ 3 đầu tiên. Việc tạo melanin đi cùng với việc tạo 1 vài chất trung gian độc và xảy ra chủ yếu trong hạt giống nhƣ lysosome (hạt melanin). Hạt melanin đƣợc tiết ra trong những tế bào keratin qua cơ chế đƣợc mô tả khá ít. Cơ chế hóa học của melanin là phức tạp và chƣa đƣợc hiểu nhiều do những đặc điểm của nó là 1 phức hợp của nhiều polymer, những chất trung gian tự oxy hoá nhanh chóng và không ổn định, phƣơng pháp hòa tan melanin làm thay đổi cấu trúc cơ bản của nó. Sự tạo màu lông và màu biểu bì có cơ chế tƣơng tự nhau. Trong nang lông, sắc tố đƣợc chuyển từ tế bào melanin sang tế bào keratin kề bên; trong lông, sắc tố 5 đƣợc thêm vào trong những tế bào keratin đang phát triển mà nó sẽ tạo thành thân lông. Trong da tế bào melanin đƣợc tìm thấy trong ngăn biểu bì gần màng đế. Hạt melanin đƣợc chuyển vào tế bào keratin thƣờng tạo mũ trên nhân, bảo vệ vật liệu di truyền khỏi tia UV. Màu của lông là do tế bào melanin trong hành lông chuyển melanin vào những tế bào kerarin khi lông kéo dài ra, và sau đó hóa sừng. Melanin thƣờng đƣợc mô tả trong hai lớp chính: eumelanin màu nâu hay đen và pheomelanin (do bởi sự hợp thành của cysteine) màu vàng hay đỏ. Sự phân loại hay thể hiện tình trạng sắc tố liên quan đến hai yếu tố: số lƣợng melanin đƣợc tạo ra và số lƣợng liên quan của eumelanin hay pheomelanin. Việc thiếu 1 hay cả hai loại melanin liên quan đến tóc trắng. Eumelanin chiếm ƣu thế thì cho lông nâu hay đen và pheomelanin chiếm ƣu thế thì cho lông vàng hay đỏ. Cuối cùng, màu lông không chỉ đơn thuần là kết quả của thành phần hoá học của nhiều polymer melanin. Sự phân tán ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới màu lông. 2.4. Cấu tạo của keratin Theo Eggling (2001, 2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạng sợi. Keratin hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xƣơng sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ. Đơn vị cơ bản của lông là một sợi protein dài hình thành trong cấu trúc alpha xoắn ốc bậc hai. Ba trong số những protein xoắn alpha xoắn quanh một cái khác hình thành nên cấu trúc gọi là tiền fibrin. Trong vòng xoắn, một sợi fibrin đƣợc tạo từ bảy tiền fibrin và đƣợc sắp xếp theo một kiểu gồm chín tiền fibrin xoắn xung quanh hai tiền fibrin. Sau đó hàng trăm sợi fibrin gắn vào một loại protein dạng keo để hình thành sợi fibrin lớn. Những sợi fibrin lớn này sẽ đƣợc gắn vào trong thân của tế bào lông chết. Đƣờng kính một sợi lông điển hình có khoảng 10 tế bào lông. Những sợi protein trong lông và những keratin alpha khác liên kết chéo trong một mức độ bởi những cầu nối 2 hóa trị giữa những phần cystein để hình thành những cầu nối disulfide. Càng nhiều cầu nối disulfide giữa các sợi thì protein càng cứng. Keratin alpha có thể phân loại thành mềm hay cứng phụ thuộc vào thành phần chứa sulfur của nó (số lƣợng cystein trong sợi polypeptide). Keratin ít sulfur của da thì mềm dẻo hơn keratin nhiều sulfur của móng, sừng, vuốt. 2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông 6 Thông thƣờng những công trình nghiên cứu sử dụng mẫu lông để thao tác thƣờng liên quan đến những loài động vật quý hiếm, sắp tiệt chủng hay tìm nạn nhân trong các vụ mất tích. * Schnabel và ctv (2000) sử dụng mẫu máu và nang lông trong thí nghiệm mô tả đặc điểm, tiêu chuẩn hoá, và cung cấp tính hợp lệ cho một tập hợp microsatellite đa hình cao dùng cho việc kiểm tra nguồn gốc tổ tiên của bò bizon Bắc Mỹ và gia súc. * James và ctv (2004) đã sử dụng mẫu máu, cơ, lông trong thí nghiệm ƣớc định mức độ biến đổi di truyền và sự khác nhau về quần thể trong những quần thể bị giam cầm của loài động vật hữu nhũ lớn đang bị đe dọa, heo vòi Baird (Tapirus bairdii). * Maxime Galan và ctv thuộc Viện nghiên cứu Nông Nghiệp Pháp (2003) phân biệt những loài hƣơu bằng DNA ly trích từ lông và phƣơng pháp PCR. - Hƣơu đỏ và con hoẵng là hai trong số những động vật móng guốc ở Châu Âu. Chúng đều phân bố trên một khu vực địa lý rộng lớn. Không có kỹ thuật đáng tin cậy nào cho phép phân biệt chúng dựa vào nghiên cứu mẫu lông hay mẫu phân do chúng phân bố chồng chéo nhau. Các nhà khoa học đã giới thiệu một phƣơng pháp kiểm tra để phân biệt những mẫu lông của nai đỏ và hoẵng bằng sử dụng phƣơng pháp PCR. - Mẫu lông đƣợc lấy ở mông. Nhú lông đƣợc cắt khoảng 2 mm tính từ điểm gốc của lông. Họ sử dụng đồng thời hai tiến trình ly trích, Dneasy Tissue Kit dùng cho ly trích DNA từ móng và lông của QIAamp và phƣơng pháp dựa trên Chelex -100 của Biorad. - Trong giai đoạn kiểm tra sơ bộ, họ ly trích DNA từ những mẫu lông tƣơi từ những con vật đã biết về loài. Họ so sánh mật độ khuếch đại bằng sử dụng mẫu da và thấy rằng sản phẩm cũng tốt nhƣ đối với mẫu lông đƣợc ủ (2 – 3 năm). Mật độ của sản phẩm PCR từ mẫu lông tƣơi thì nhiều hơn so với mẫu lông đƣợc ủ. DNA cũng có chất lƣợng kém hơn vì thế mẫu không đƣợc khuếch đại. - Trong thí nghiệm thứ hai, ngƣời ta thực hiện để đánh giá độ lặp lại của việc khuếch đại DNA của một mẫu khi sử dụng mẫu lông đƣợc ủ. Họ ly trích và khuếch đại DNA 2 lần từ 15 mẫu lông của từng cá thể của những loài chƣa biết. Đọc trên gel đƣợc 5 mẫu trong 15 mẫu trong lần chạy PCR đầu tiên (33,3% thành công) và 8 trong 15 lần trong lần chạy PCR thứ 2. Bốn mẫu không ra trong lần thứ 1 đã ra trong lần thứ 2, trong khi 1 mẫu ra trong lần thứ 2 đã không ra trong lần thứ 1. Đối với 7 những mẫu đã cho kết quả trong cả 2 lần chạy, theo dõi mẫu có băng giống nhau và thấy rằng độ lặp lại đạt 100% trong việc xác định loài. - Các nhà khoa học nhận thấy tỷ lệ khuếch đại thành công khá thấp chắc chắn liên quan đến điều kiện ủ trong tube làm cho DNA thêm biến tính, cùng với số lƣợng nhỏ lông của từng cá thể có khả năng dùng làm mẫu. Ngoài ra, DNA ty thể rất dễ bị biến tính với DNAse vì kích thƣớc nhỏ của nó và nó nằm ngoài nhân. Có thể những mẫu đƣợc ủ trong những điều kiện thích hợp, cụ thể trong chai khô và không bịt kín (ví dụ đậy bằng giấy), và việc thu một số lƣợng lớn mẫu lông từ từng con có thể làm tăng tỷ lệ thành công của việc khuếch đại. Và nồng độ DNA thấp có khả năng do đã không lấy đƣợc DNA ty thể khi dùng pippet hút dung dịch trong từ tube phản ứng. 2.6. Nguyên tắc của PCR Theo Gerard Morel và ctv (1998), phƣơng pháp PCR sử dụng những trình tự DNA ngắn nhƣ đoạn mồi (oligonucleotides), một enzyme tái tạo DNA, một DNA polymerase chịu nhiệt (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990), và tri–photphat deoxyribonucleotides (dNTPs): dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Sau bƣớc tách hai mạch của trình tự đích (thông thƣờng do gia nhiệt ở 95oC trong 5 phút), đoạn mồi bắt cặp hay lai với trình tự đích trong bƣớc thứ hai. Hình 2.1: Chu kỳ đầu tiên trong PCR (Nguồn Dale và ctv, 2002) 8 Hình 2.2 Chu kỳ thứ hai trong phản ứng PCR (Nguồn Dale và ctv, 2002) Nhiệt độ bắt cặp này đƣợc xác định bởi nhiệt độ nóng chảy (Tm) và trình tự đoạn mồi sử dụng (thông thƣờng khoảng giữa 37oC và 60oC). Bƣớc này đƣợc theo sau bởi sự kéo dài của đoạn mồi theo hƣớng 5' đến 3' bằng cách thêm triphotphat deoxyribonucleotide vào nhóm 3'OH cuối của đoạn mồi bởi DNA polymerase. Mỗi base đƣợc thêm vào bổ sung với base của sợi DNA mẫu. Sự kéo dài đƣợc thực hiện trên hai sợi DNA khoảng thời gian từ 65 đến 75 giây. Sự biến tính, bắt cặp (hay lai) và kéo dài đƣợc lặp lại 20 đến 30 lần để khuếch đại đoạn DNA đích theo cấp số nhân. Trong pha lỏng của phản ứng PCR, với DNA sợi đôi, số bản copy tại điểm kết thúc của phản ứng theo lý thuyết là 2n (n, số chu kỳ), nhƣng phản ứng không bao giờ đạt tối ƣu nhất và sản phẩm thƣờng chỉ đạt khoảng 70%. * Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR (Lê thị Thu Phƣơng, 2004) - Taq polymerase xúc tác tổng hợp DNA theo chiều 5' – 3' trong suốt quá trình phản ứng dƣới sự hiện diện của Mg2+. 9 - Đoạn mồi là những đoạn oligonucleotide, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. - dNTPs làm thành nguyên liệu cho phản ứng DNA. - Dung dịch đệm: quan trọng nhất là ion Mg2+. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTPs, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch kép. Dung dịch đệm tiêu chuẩn chứa 50 mM KCl và khuếch đại tốt những đoạn DNA > 500 bp. - Mẫu DNA làm khuôn mẫu trong phản ứng. * Nguyên tắc của multiplex - Theo Sambrook và ctv (2001), multiplex PCR là một thuật ngữ đƣợc sử dụng khi có nhiều hơn một cặp đoạn mồi đƣợc dùng trong PCR. Mục đích của multiplex PCR là khuếch đại nhiều đoạn trong DNA đích cùng một lúc và do đó bảo tồn DNA mẫu, tiết kiệm thời gian, giảm phí tổn. Số lƣợng của mỗi phản ứng khuếch đại đƣợc giảm tƣơng ứng với số lƣợng của đoạn mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng. - Multiplex PCR rất khó để thiết lập. Cần phải chú ý để bảo đảm tất cả đoạn mồi trong phản ứng có nhiệt độ nóng chảy tƣơng đƣơng, để những đoạn mồi không phản ứng với nhau, những sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc gần nhau nhƣng có thể phân biệt với nhau trên gel. 2.7. Nguyên tắc xác định giới tính và gen halothane 2.7.1. Nguyên tắc xác định giới tính Theo trích dẫn từ Nguyễn Văn Út (2005), Schorder và ctv (1990) cho rằng việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt nhiễm sắc thể (NST) Y trong phản ứng PCR giúp khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt đực. Sự hiện diện hay vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính. Thông thƣờng, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, ngƣời ta nhân bản đồng thời một trình tự trên NST sinh dƣỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc một trình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vật liệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản. 2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane Gen halothane có hai alen N và n hình thành 3 kiểu gen NN, Nn và nn. Bằng việc so sánh trình tự nucleotide của gen này, MacLennan thấy rằng có sự đột biến C (cytosin) thành T (thymin) ở vị trí base 1843 của chuỗi nucleotide. Fujii và ctv (1991) 10 đã đƣa ra phƣơng pháp phát hiện gen halothane bằng kỹ thuật PCR và enzyme cắt giới hạn Hha I để phát hiện đột biến điểm trên bất kỳ loại tế bào nào có chứa DNA. Sau đó, kỹ thuật này đƣợc Hughes và ctv (1992) cải tiến. Phƣơng pháp này phân biệt dễ dàng các kiểu gen NN, Nn và nn (Nguyễn Thị Thu Phƣơng, 2004). 11 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu (1) Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA. (2) So sánh khả năng ly trích DNA từ gốc và ngọn lông bò. (3) So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò. (4) Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích DNA. (5) Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin khi ly trích DNA. (6) Sử dụng BSA ức chế melanin trong phản ứng PCR. 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành Tại Phòng Công Nghệ Sinh Học Động Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA Mẫu lông bò, lông heo đƣợc lấy từ các cơ sở giết mổ ở Bình Dƣơng. 3.3.2. Đoạn mồi 3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính Theo Alves và ctv (2003), trên cánh dài của NST Y ở bò có trình tự chuyên biệt cho giống đực dài 3213 bp. Trình tự này chứa đoạn lặp lại với sự tƣơng đồng rộng rãi giữa các giống bò. Từ trình tự lặp lại đó, thiết kế ra đoạn mồi RIV và đoạn mồi UIV nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 655 bp qua PCR. Ngoài ra, để kiểm chứng kết quả chính xác hay không, cần dựa vào trình tự chuyên biệt cho gen thụ thể androgen liên kết NST X. Từ trình tự chuyên biệt này, ngƣời ta thiết kế hai đoạn mồi BTANRP1 (BTA1) và BTANRP1 (BTA2) nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 370 bp. Đoạn DNA này phải hiện diện trên gel sau khi điện di nhƣ là sản phẩm đặc trƣng chung cho cả bò đực lẫn bò cái. Hai cặp mồi này đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technologies). 12 Bảng 3.1: Trình tự các đoạn mồi của gen xác định giới tính (Alves và ctv, 2003) Đoạn mồi Trình tự RIV UIV BTA1 BTA2 5' GTT TTA TTA TCC CAG CAA 3' 5' TAT TCC TTT GGG GAG CA 3' 5' CCA ACT TTC CCT TCT TTC CC 3' 5' ATG GCC CAA AAG AAC ATT CA 3' 3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane Trình tự mồi xuôi: 5' – CTT CCC ACC CTG GGT CTT – 3' Trình tự mồi ngƣợc: 5' – AGG CAG AGC CAT GGA GAC – 3' Phát hiện kiểu gen halothane bằng cách cắt bằng enzyme giới hạn Hha I. Với alen N, Hha I cắt thành 2 đoạn 127bp và 459 bp. Do đó với kiểu gen NN trên màn hình ta sẽ thấy băng 127 bp và 459 bp. Với alen n, Hha I không cắt. Do đó với kiểu gen nn ta chỉ thấy 1 băng 586 bp. Với gen Nn sẽ xuất hiện 3 băng: 127 bp, 459 bp, 586 bp. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Lấy và trữ mẫu Lấy 10 – 15 lông đuôi. Quấn lông trong tay để kéo ra và kéo nhẹ nhƣng đủ lực để kéo cả gốc lông. Cắt khoảng 5 cm thân lông để dùng làm mẫu thân lông. Nếu lấy mẫu gốc lông thì cắt bỏ thân lông và lấy khoảng 4 – 5 cm lông kể cả đoạn cuối của gốc lông. Trữ mẫu trong bao nylon dán kín và bảo quản ở nhiệt độ -70oC. 3.4.2. Tách chiết DNA Trƣớc khi ly trích, mẫu lông đƣợc xử lý. Cân 0,3 g lông cho vào cối sành vô trùng. Đổ N2 lỏng vào cối, dùng chày sành vô trùng nghiền lông thành dạng bột. Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml. Đặt eppendorf chứa bột lông trong N2 lỏng hoặc trữ ở tủ -70 oC ngay sau đó. DNA từ lông đƣợc ly trích theo quy trình của Sauer và ctv (2000). Mỗi eppendorf chứa bột lông đƣợc cho thêm 60 µl dung dịch đệm (50 mM Tris – HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH = 8). Thêm 3 µl proteinase K (20 mg/ml) vào hỗn hợp trên rồi ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1 giờ. 13 - Tinh sạch DNA: thêm 375 µl sodium acetate 0,2 M vào hỗn hợp trên; vortex trong 10 giây. Cho vào 200 µl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamy alcohol (25:24:1); vortex nhẹ; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC. - Thu hồi DNA: lấy phần dịch nổi và chuyển vào tube 1,5 ml khác; cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn, làm ráo. Cho vào 180 µl TE 1X, vortex; ủ ở 55oC trong 15 phút. Thêm 20 µl sodium acetate 2 M, trộn đều; tiếp tục cho vào 500 µl ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn. Rửa cặn bằng 1 ml ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 10 oC, lấy cặn. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC. Hòa tan cặn bằng 100 µl TE 1X, ủ 55 oC qua đêm; vortex cho tan cặn. Quy trình ly trích cơ bản trên đây đƣợc đặt tên là quy trình 1. Từ đó tiến hành 5 thí nghiệm (thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 5) để cải thiện chất lƣợng mẫu DNA ly trích. * Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích Theo Sambrook và ctv (2001), proteinase K hoạt động tối ƣu nhất trong dung dịch đệm có 10 mM Ca2+ và 50 mM Tris – HCl. Tác giả cho rằng EDTA có khả năng bắt giữ những ion hoá trị hai. Do đó, dung dịch đệm ly trích đƣợc sử dụng không chứa EDTA. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Khảo sát nồng độ Ca2+ ở 2 mM, 6 mM, 10 mM với mẫu là đoạn gốc lông dài khoảng 5 cm đƣợc nghiền trong N2 lỏng. Số mẫu theo dõi là 5 mẫu cho mỗi nồng độ Ca 2+ . Chỉ tiêu quan sát là tỷ số OD, nồng độ DNA và phản ứng PCR với gen giới tính trên bò và gen halothane trên heo. * Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò Trong nhiều trƣờng hợp khó lấy đƣợc phần gốc lông ở thú hung dữ hay thú bị stress. Do đó ly trích DNA từ phần ngọn lông là vấn đề thiết yếu. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu gốc lông đƣợc cắt dài khoảng 5cm tính từ phần gốc, còn mẫu ngọn đƣợc cắt dài khoảng 5cm ở phần giữa của nang lông. Các mẫu đều đƣợc nghiền trong N2 lỏng, sử dụng dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K không có EDTA và Ca2+. Nồng độ Ca2+ nào trong thí nghiệm 1 cho tỷ số OD cao nhất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 2. Số mẫu lông gốc theo dõi là 5 mẫu và lông ngọn là 6 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA và sản phẩm PCR 14 của gen xác định giới tính. * Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò Với mục đích đánh giá quy trình ly trích trên nhiều mẫu lông khác nhau chúng tôi sử dụng mẫu lông heo và lông bò. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố để so sánh chất lƣợng DNA từ 2 nguồn. Các mẫu đều đƣợc nghiền trong N2 lỏng, sử dụng dung dịch đệm ly trích không có EDTA chứa proteinase K và Ca2+. Nồng độ Ca2+ nào trong thí nghiệm 1 cho tỷ số OD cao nhất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 3. Số mẫu theo dõi là 5 mẫu cho mỗi loại. Mẫu là gốc lông đƣợc cắt dài khoảng 5 cm tính từ gốc. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi. Một số mẫu có tỷ số OD cao đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR để xác định giới tính với DNA ly trích từ lông bò và xác định gen halothane với DNA ly trích từ lông heo. * Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin Ngoài proteinase K có khả năng cắt phân tử keratin thì DTT cũng phân cắt keratin tốt. Theo Manual của Biorad (2005), DTT có khả năng cắt đứt nối S – S trong phân tử cystein của keratin. Thí nghiệm 4 đƣợc bố trí để so sánh 2 quy trình ly trích: quy trình ly trích không sử dụng DTT (quy trình 1 với proteinase K đƣợc trữ trong nƣớc) và quy trình có sử dụng DTT. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu quan sát là tỷ số OD, nồng độ DNA và sản phẩm PCR xác định gen giới tính trên lông bò và gen halothane trên lông heo. Số mẫu đƣợc theo dõi là 5 mẫu cho mỗi quy trình. Mẫu đƣợc cắt từ những gốc lông dài khoảng 5 – 7 cm tính từ phần gốc. Quy trình ly trích có sử dụng DTT đƣợc tiến hành theo Nozawa và ctv (1999) nhƣ sau: - Xử lý mẫu: những mẫu lông đƣợc bứt và rửa trong nƣớc vô trùng, sau đó rửa qua cồn tuyệt đối, không nghiền lông trong N2 lỏng. - Cho 100 µl dung dịch đệm ly trích (10 mM Tris – HCl; pH 8,0; 10 mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% SDS; 70 mM DTT và 0,4 mg/ml proteinase K) - Ủ 45oC qua đêm. DNA sau khi tách chiết đƣợc tinh sạch và thu hồi theo quy trình 1. * Thí nghiệm 5 :Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin DTT chỉ phân cắt keratin mà không ảnh hƣởng đến melanin. Giambernardi và ctv (1998) xác định rằng 2 µg melanin tổng hợp có thể ức chế PCR trong 25 µl thể tích phản ứng. CTAB có thể loại bỏ melanin ra khỏi DNA ly trích (Nozawa và ctv, 1999). 15 Do đó, thí nghiệm 5 đƣợc bố trí để so sánh lƣợng DNA đƣợc tinh sạch giữa quy trình DTT có sử dụng CTAB và quy trình DTT không sử dụng CTAB. CTAB đƣợc thêm vào quy trình sau khi đã ủ lông với dung dịch có DTT. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Thí nghiệm đƣợc chia làm 3 nghiệm thức: 0%, 0,06% và 0,2% CTAB. Số mẫu đƣợc kiểm tra là 5 cho mỗi nghiệm thức. Mẫu là những gốc lông đƣợc cắt dài khoảng 5 cm tính từ gốc. Chỉ tiêu quan sát là tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen giới tính và gen halothane. 3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ly trích Đo độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA sau khi ly trích đƣợc xác định bằng quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Độ tinh sạch của DNA đƣợc tính bằng tỷ số OD260nm/OD280nm. DNA đƣợc xem là sạch nếu tỷ số khoảng 1,8 – 2. Hàm lƣợng DNA đƣợc tính bằng công thức: DNA (ng/µl) = (62,9*OD260nm – 36*OD280nm)* độ pha loãng. Mẫu đƣợc pha loãng 10 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 90 µl H2O khi đo OD. 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính Thực hiện phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 3.2 và chu kỳ nhiệt ở Bảng 3.3. PCR xác định giới tính đƣợc dùng để khẳng định hiệu quả ly trích DNA từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 5. Bảng 3.2. Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Đệm PCR 10 X 1 X MgCl2 25 mM 1,5 mM RIV/UIV 100 µM 0,5 µM BTA1/ BTA2 100 µM 0,5 µM dNTP 10 mM 200 µM/ mỗi loại Taq polymerase 5 UI/µl 1,5 UI DNA 5 ng/µl H2O cất vừa đủ 30 µl (Nguồn: Nguyễn Văn Út, 2005) 16 Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định giới tính (Nguồn: Nguyễn Văn Út, 2005) * Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA (bovine serum albumine) ức chế melanin trong phản ứng PCR Ngoài CTAB có khả năng loại melanin khỏi dịch DNA ly trích thì BSA cũng có khả năng ức chế melanin trong phản ứng PCR. Ferri và ctv (2001) thấy rằng BSA có thể khắc phục đƣợc sự ức chế của melanin. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Sử dụng BSA ở 5 nồng độ 0 µg/µl; 0,0005 µg/µl; 0,01 µg/µl; 0,1 µg/µl và 0,5 µg/µl. DNA đƣợc ly trích bởi dung dịch đệm không EDTA nhƣng có proteinase K và Ca2+. Nồng độ Ca2+ nào trong thí nghiệm 1 cho tỷ số OD cao nhất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 6. Mỗi nồng độ BSA đƣợc thêm vào trong từng hỗn hợp PCR để có thể tích cuối cùng đạt 30 µl. Sản phẩm PCR theo dõi là gen giới tính trên lông bò và gen halothane trên lông heo. 3.4.4.2. PCR xác định gen halothane Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 10 X 1 X MgCl2 25 mM 2 mM F/ R primer 100 µM 0,5 µM dNTP 10 mM 200 µM/ mỗi loại Taq polymerase 5 UI/µl 1 UI DNA 5 ng/µl H2O cất vừa đủ 30 µl (Nguồn: Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Biến tính hoàn toàn 94 5 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 1 1 1 Kéo dài cuối cùng 72 7 Trữ 4 17 Thực hiện phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 3.4 ở trên. PCR xác định gen halothane cũng đƣợc thực hiện với DNA ở 5 thí nghiệm. Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane (Nguồn: Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định giới tính là 1,5%; 2% đối với sản phẩm PCR xác định gen halothane. Ví dụ để chuẩn bị 1,5% ta làm nhƣ sau: cân 0,225 g agarose hoà tan trong 15 ml TBE 0,5 X lắc đều. Đun agarose trong lò viba ở 650 w trong 2 phút. Để gel nguội đến khoảng 50oC, đổ vào khuôn có gắn lƣợc. Chờ gel đông và rút lƣợc ra. 3.4.5.2. Kết quả điện di PCR Dùng 7,5 µl sản phẩm PCR trộn với 1,5 µl loading dye 6 X. Điện di 30 phút trong TBE 0,5 X với dòng điện 100 V, 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1% trong 30 phút. Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả. 3.5. Xử lý số liệu Xử lý số liệu với các hàm thống kê trong Excel và phần mềm Statgraphics 7.0. Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Biến tính hoàn toàn 94 3 phút 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 45 giây 90 giây 90 giây Kéo dài cuối cùng 72 5 phút Trữ 4 18 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA DNA lông bò đƣợc ly trích từ các nồng độ Ca2+, kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày ở Bảng 4.1. Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ Chỉ tiêu Nồng độ Ca2+ P 2 mM 6 mM 10 mM Tỷ số OD ( X ± SD) 1,6 0,08 1,62 0,12 1,69 0,15 0,49 Hàm lƣợng DNA ( X ± SD) (µg/µl) 0,51 0,22 0,24 0,13 0,3 0,3 0,19 Số mẫu 5 5 5 1.6 1.62 1.69 0.51 0.24 0.3 0 0.5 1 1.5 2 2 mM 6 mM 10 mM Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) Biểu đồ 4.1: Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ Sự khác biệt về tỷ số OD và nồng độ DNA không nhiều (P > 0,05). Trong thí nghiệm của McNevin và ctv (2005), ông ta đã đề nghị một dung dịch đệm ly trích có sử dụng Proteinase K và bổ sung 40 mM Ca2+. Do đó, có thể bố trí thêm nhiều thí nghiệm ở các nồng độ Ca2+ từ 10 mM đến 40 mM để xác định nồng độ Ca2+ nào cho hiệu quả tối ƣu nhất. Trong các kết quả ly trích trên, dung dịch đệm ly trích chứa 10 mM Ca 2+ có tỷ số OD cao nhất nên lấy DNA để chạy PCR. Phản ứng PCR từ lông bò chỉ khuếch đại đƣợc 1 băng dài 370 bp nên không đạt yêu cầu. Kết quả PCR xác định gen halothane cũng âm tính trên 2 mẫu. La Ca Ca Ca Ca ĐC 655 bp 370 bp 19 Hình 4.1: Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ La: ladder, Ca: 10mM Ca 2+ , ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân 4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò DNA đƣợc ly trích từ mẫu gốc lông dài khoảng 5 cm tính từ gốc và mẫu ngọn lông dài khoảng 5 cm ở phần đuôi của thân lông. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.2a. Bảng 4.2a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò Chỉ tiêu Gốc lông Thân lông P Tỷ số OD 1,76 0,09 1,2 0,07 0,0001 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,34 0,28 0,07 0,03 0,04 Số mẫu 5 6 Biểu đồ 4.2: Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò 655 bp 370 bp 1.76 1.2 0.34 0.07 0 0.5 1 1.5 2 Gốc lông Thân lông Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 20 Bảng 4.2b. Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò Mẫu Số mẫu tiến hành Số mẫu có sản phẩm PCR Tỷ lệ mẫu có sản phẩm PCR P Gốc lông 5 5 100% 0,0414 Ngọn lông 6 0 0% Có sự khác biệt đáng kể giữa tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của mẫu gốc và thân lông bò (P < 0,05). Càng xa phần gốc thì lông càng bị keratin hoá và ít tế bào sống (Wagner và ctv, 1996). Do đó, DNA ly trích từ phần thân lông sẽ ít và lẫn tạp chất nhiều hơn so với phần gốc lông. Theo Sambrook và ctv (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem là sạch. Ở đây, mẫu ngọn lông có tỷ số OD trung bình là 1,2. Tỷ số này thấp chứng tỏ lƣợng protein trong dịch DNA còn nhiều. Điều này là rõ ràng bởi vì càng xa gốc thì lông càng bị keratin hóa mạnh. Do đó, sản phẩm PCR của mẫu ngọn lông không đƣợc tạo thành. Tuy nhiên, sản phẩm PCR chỉ có 1 băng 370 bp khi dùng DNA ly trích từ gốc lông, nhƣ thế sản phẩm PCR vẫn chƣa đạt yêu cầu. Hình 4.2: Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò N: ngọn, G: gốc, ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân 4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò Các mẫu đƣợc ly trích từ gốc lông, tỷ số OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong Bảng 4.3. N N N N G G G G G ĐC 655 bp 370 bp 21 Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông Chỉ tiêu Lông bò Lông heo P Tỷ số OD 1,82 0,08 1,69 0,11 0,07 Hàm lƣợng DNA (µg/ µl) 0,31 0,3 0,09 0,05 0,14 Số mẫu 5 5 Biểu đồ 4.3: Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò Tỷ số OD giữa DNA gốc lông của heo và bò không có sự khác biệt nhiều (P > 0,05). Sản phẩm PCR của DNA ly trích từ lông heo không cho băng nào. Có thể trong DNA ly trích từ lông heo vẫn còn tạp chất hoặc vì lý do khác, cần làm thêm vài thí nghiệm để giải thích rõ. Hình 4.3: Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò H: heo, B: bò 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích DNA H H H H H B B B B B 370 bp 1.82 1.69 0.31 0.09 0 0.5 1 1.5 2 Lông bò Lông heo Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 22 Bảng 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT Chỉ tiêu Không DTT DTT P Tỷ số OD 1,58 0,14 1,84 0,09 0,008 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,3 0,18 0,21 0,13 0,44 Số mẫu 5 5 Biểu đồ 4.4: So sánh DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT và không có DTT Có sự khác biệt về tỷ số OD giữa việc sử dụng DTT và không sử dụng DTT (P < 0,05). Tỷ số OD của dung dịch đệm ly trích theo DTT đạt khoảng tinh sạch (1,8 – 2). Gen giới tính (2 mẫu) từ lông bò và gen halothane từ lông heo có bổ sung DTT không có dấu hiệu phản ứng. Kalbe và ctv (1988) chứng tỏ rằng sự hiện diện của DTT trong dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích, và điều này có thể làm giảm việc gắn kết giữa các deoxyribose nucleotides trong DNA và làm chúng không thể đƣợc nhận biết bởi Taq polymerase (McNevin và ctv, 2005). Đó có thể là một giả định để giải thích tại sao sản phẩm PCR không đƣợc thấy. Kết quả PCR xác định gen halothane âm tính trên 1 mẫu. . Hình 4.4: Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT 370 bp 1 1 2 2 1.58 1.84 0.3 0.21 0 0.5 1 1.5 2 Không DTT DTT Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 1: DTT 2:Không DTT 23 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin Bảng 4.5. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mẫu CTAB Chỉ tiêu CTAB P 0,0% 0,06% 0,2% Tỷ số OD 1,84 0,09 1,6 0,04 1,3 0,03 0,001 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,17 0,04 0,16 0,06 0,1 0,02 0,46 Số mẫu 5 5 5 Biểu đồ 4.5: Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB Có sự sai biệt giữa tỷ số OD và hàm lƣợng DNA từ quy trình ly trích DTT không sử dụng CTAB và quy trình có CTAB. Sử dụng CTAB ở nồng độ càng cao thì độ tinh sạch của DNA càng giảm. Theo Sambrook và ctv (2001), CTAB đƣợc loại ra khỏi dung dịch kết tủa DNA bằng hỗn hợp phenol. Tuy nhiên có lẽ hỗn hợp phenol chƣa thể loại hết đƣợc CTAB ra khỏi dung dịch kết tủa DNA, do đó cần phải tìm thêm chất nào đó để có khả năng loại bỏ CTAB hiệu quả hơn. DNA từ dung dịch đệm có bổ xung CTAB 0,06% chạy PCR đối với gen giới tính và halothane đều không có dấu hiệu phản ứng. 4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR Bảng 4.6. Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung Nồng độ BSA (µg/µl) Số mẫu tiến hành Kết quả PCR * 0 4 Băng 370 bp 0,0005 1 Băng 370 bp 0,01 1 Băng 370 bp 0,1 1 Không dấu hiệu 0,5 1 Không dấu hiệu 1.84 1.6 1.3 0.17 0.16 0.1 0 0.5 1 1.5 2 CTAB 0,0% CTAB 0,06% CTAB 0,2% Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 24 * Chỉ phát hiện băng ngắn của gen giới tính, không có sản phẩm PCR của gen halothane. Sản phẩm PCR từ DNA ly trích từ lông bò chỉ cho 1 băng dài 370 bp. Số mẫu có sản phẩm PCR là các mẫu có BSA ở các nồng độ 0,0005 µg/µl; 0,01 µg/µl; còn những mẫu dùng BSA ở các nồng độ 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl không cho sản phẩm PCR. Một mẫu DNA ly trích từ lông heo có bổ sung BSA ở 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl cho sản phẩm âm tính. Nồng độ BSA càng nhỏ thì băng điện di càng sáng. Điều đó có thể cho thấy rằng lƣợng BSA thêm nhiều trong phản ứng PCR sẽ trở thành chất ức chế phản ứng. Hình 4.6: Kết quả PCR từ mẫu sử dụng BSA và không sử dụng BSA Qua 6 thí nghiệm, PCR xác định gen giới tính chỉ có 1 băng 370 bp; PCR xác định gen halothane không cho băng nào. Trong thí nghiệm về đánh giá sự ly trích từ lông rụng tự nhiên, Vigilant (1999) thấy rằng DNA ty thể có thể khuếch đại những đoạn lên tới 300 bp với tỷ lệ thành công là 80%, giảm xuống 60% đối với những đoạn 400 bp và 15% cho những đoạn 500 bp (McNevin và ctv, 2005). Cũng theo McNevin và ctv (2005), ngƣời ta nghĩ rằng DNA ty thể dễ dàng ly trích từ lông hơn vì nó hiện diện với số lƣợng lớn. Allen và ctv (1998) tìm thấy rằng sự khác nhau trong số lƣợng DNA đòi hỏi cho sự khuếch đại PCR thành công là sự phù hợp với số lƣợng copy của mỗi tế bào, DNA nhân (1 copy 1 tế bào) và DNA ty thể (103 – 104 mỗi tế bào). Do đó, chúng tôi nghĩ rằng quy trình ly trích lông chƣa đƣợc tối ƣu hoá nên không thể kéo dài băng 655 bp đối với gen giới tính và 586 bp đối với gen halothane. 1 2 3 4 ĐC ĐC 5 6 655 bp 370 bp 1,2: Không BSA 3: 0,0005 ng/µl BSA 4: 0,01 ng/µl BSA 5: 0,1 µg/µl BSA 6: 0,5 µg/µl BSA 25 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6 mM, 10 mM cho DNA với tỷ số OD khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò ly trích bởi dung dịch đệm 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp. - DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) có độ tinh sạch và hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông ( OD = 1,2). - Mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không khác nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích. - DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58). - Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA. - Sử dụng nồng độ BSA từ 0,0005 µg/µl đến 0,5 µg/µl trong phản ứng PCR vẫn không cải thiện đƣợc hiệu quả PCR khi dùng DNA từ mẫu lông. - Quy trình ly trích với dung dịch đệm chứa proteinase K và Ca2+ hiệu quả trong ly trích DNA với những đoạn khuếch đại dƣới 400 bp. Tóm lại, Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích đã cải thiện tỷ số OD nhƣng chỉ cho sản phẩm PCR ngắn (370 bp) của gen giới tính và không có sản phẩm PCR của gen halothane. 5.2. Đề nghị - Làm thêm thí nghiệm với nồng độ Ca2+ từ 10 – 40 mM để xác định nồng độ nào cho hiệu quả tối ƣu nhất. - Cần tìm chất có khả năng loại CTAB khỏi quy trình ly trích. 26 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu Tiếng Việt 1. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật Multiplex PCR trên 3 giống bò. Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. *Tài liệu Tiếng Anh 3. Biorad, 2005. 2 - D electrophoresis for proteomics: A method and product manual. 4. Dale J. W., Schantz M. V., 2002. From genes to genomes: Concepts and applications of DNA technology. From genes to genomes. Copy right John Wiley Sons, Ltd. 5. Eggling S., 2001 - 2003. Structual protein. Clackamas Community College, Hal Bender. - 08/structural proteins.htm. 6. Galan M., Baltzinger C., Hewison A. J. M., Cosson J., 2003. Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method. Trends in Ecology and Evolution. 12: 223 – 227. 7. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc Natl Acad SC! USA . 87,4971 – 4975. 8. Hair handout, 2005. CHEM 107. http:// www.fbi.gov 9. James N. J., Mary V. A., 2004. Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii). Zoo Biology. 23:521– 531. 27 10. McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005. Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair. Forensic Science International.153 : 237 – 259. 11. Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C. , Lobie P. E., 1998. In situ reverse transcription - polymerase chain reaction. Applications for light and electron microscopy. Biology of the Cell. 90: 137 - 154. 12. Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S., Ozawa T., KatsumataY., 1999. Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences. Legal Med. 1: 61 – 67. 13. Rees J. L., 2003. Genetics of hair and skin colour. Annu. Rev. Genet. 37: 67 – 90. 14. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230,1350 – 1355. 15. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay. Nucleic Acids Research. 28: 23. 16. Schnabel R. D., Ward T. J., Derr J. N., 2000. Validation of 15 microsatellites for parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle. Animal Genetics. 31: 360 – 366. 17. Vigilant L., 1999. An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs. Bio. Chem. 390 : 1329 – 1321. 18. Wagner M, Bailey D.G.,1993. Structure of bovine and hair root-A scanning electron microscope investigation. Superior systems service. 13: 61 – 78. 28 PHỤ LỤC * Hoá chất dùng trong đề tài - Hoá chất ly trích DNA KCl 500 mM NaCl 20 mM Tris HCl pH 8 50 mM, 100 mM SDS 1% + Proteinase K 0,5 mg/ml + Phenol: chloroform: isoamy alcohol 25:24:1 + TE buffer 1X Tris HCl 100 mM EDTA( pH 8) 1 mM + Ethanol 70%; 95% + Tris base (pH 8) 2 M + Sodium acetate 0,2 M; 2 M + DTT 70 mM + CTAB 0,06%, 0,2% - Hoá chất phản ứng PCR PCR buffer 1 X MgCl2 2 mM Mỗi dNTP 200 µM Mồi xuôi 0,5 µM Mồi ngƣợc 0,5 µM Taq DNA polymerase 1 UI - Hoá chất chạy điện di sản phẩm PCR + Agarose 1,5% + TBE (Tris Borate EDTA) (pH = 8,3) 1 X Tris base 89 mM Acid boric 89 mM Na2EDTA 2,5 mM 29 + Loading dye Bromophenol blue 0,3% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% + Ethidium bromide 10 mg/ml * Dụng cụ dùng trong đề tài - Pipetman loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl - Đầu tip tƣơng ứng với các loại pipet man - Eppendorf loại 0,2 ml và 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Dụng cụ kéo, kẹp, chày, cối * Thiết bị dùng trong đề tài - Máy Vortex - Máy ly tâm - Máy PCR - Bộ điện di - Máy chụp gel - Tủ ấm - Tủ trữ mẫu - Tủ trữ hoá chất - Microwave - Cân - Tủ sấy - Máy cất H2O, khử ion - Autoclave - Máy đo OD - Bình N2 lỏng