Luận văn Tái sinh phôi soma cây mít (Artocarpus heterophyllus Lam)

g đối dài và nó chịu tác động của nhiều nhân tố như: mẫu cấy, các thành phần trong môi trường nuôi cấy, thao tác, kỹ thuật trên mẫu cấy, thời gian xử lý mẫu, cường độ ánh sáng… 2.2.5.1. Mẫu cấy Mỗi loại mẫu cấy có khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Thường những tế bào còn non có khả năng tạo phôi vô tính nhanh và tốt hơn. Tùy mục đích nuôi cấy mà chọn lựa các bộ phận, các giai đoạn phát triển của cây trồng cho phù hợp. Đối với việc nuôi cấy tạo phôi Asparagus officinalis,lilium thì chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân mầm, phôi chưa trưởng thành là thích hợp nhất, còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake 1998) hay loài một lá mầm đòi hỏi 23 mẫu cấy phải ở một giai đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô tính . 2.2.5.2. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường thích hợp nhất cho việc nuôi cấy là MS. Vì môi trường này có chứa hàm lượng nitrate và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối nitrat và ammonia trong môi trường rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi (Niedz,1993-1994). Khi môi trường dinh dưỡng không thích hợp, phôi non có thể ngừng sinh trưởng và có thể chết hay tạo mô sẹo không biệt hóa hay nẩy mầm khi chưa chính thuần thục. Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha và minocha, 1995). Ngoài ra hàm lượng các hợp chất hữu cơ khác như : nước dừa, đường, glutamine, casein, tinh chất mạch nha, photphat, amino acid…có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành phôi. 2.2.5.3. Nguồn cacbohydrate Được cung cấp chủ yếu từ Sucrose ngoài ra còn từ: galactose, lactose, maltose, glucose và fructose. Đây là nguồn cung cấp năng lượng chính cho việc nuôi cấy tế bào trong điều kiện vô trùng. Sự kết hợp những chất trên với Sucrose đã đẩy mạnh sự cảm ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi . 2.2.5.4. Chất điều hòa tăng trƣởng Chia làm 5 nhóm: auxin, cytokinin, acid dapscisic, gibberellin, ethylen. Nó có vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy một đối tượng nào đó. Đối với quá trình tạo phôi vô tính, nó giữ một vị trí rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trưởng thì lại có những tác dụng lên việc tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau, và ở những nồng độ khác nhau, điều đó cho thấy có 3 kiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng đối với phôi: ► Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng là cần thiết trong tất cả các giai đoạn phát triển của phôi. ► Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cần phải được loại bỏ. 24 ► Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa tăng trưởng, nhưng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự có mặt của các chất điều hòa không còn tác dụng nữa . Chất điều hòa tăng trưởng là auxin thường là 2,4-D và NAA được sử dụng hơn 50% và 25% trường hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự ,1983; Litz và Gray,1992). Tế bào phát sinh phôi có thể hình thành từ tế bào bình thường được nuôi cấy trên môi trường có auxin và có thể không có cytokinin. Trong trường hợp, lượng cytokinin có sẵn trong tế bào cao thường đi đôi với sự phát sinh phôi thấp như ở cây pennisetum purpureum, dactylis glomerata…(Rajasekaran etal 1987 : Wenck etal, 1988) auxin thường thúc đẩy nhanh sự phân chia tế bào và thường tạo tế bào xốp (Evans etal, 1981). Khi một tế bào hay một cụm tế bào được tách riêng biệt, sự có mặt của auxin giúp cho sự hình thành các tế bào có tính chất phân cực, sự phân cực này đi đôi với sự phân hóa tế bào (Brawley etal,1984; Nomura và Komamine, 1986; Gorst etal, 1987; Rathore, 1988; Timmers, 1989). Khi một tế bào phôi được thu nhận, sự có mặt của auxin sẽ gây tổn hại đến sự phát triển bình thường của tế bào phôi soma (Halperin và Wetherell, 1964). Cytokinin cũng có những tác dụng tương đối lên sự hình thành phôi, nhưng nó không có những tác dụng đáng kể. Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin cho thấy nhiều thuận lợi để đạt được hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài (Cruz và cộng sự, 1990; Nishi, 1997). Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ, chất điều hòa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự ,1998). Vì vậy trong những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến. Môi trường không có hormone thường được sử dụng cho ự phát triển của phôi vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ thấp của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc cho môi trường cần cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích thích sự phát triển bình thường của phôi. Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một loại hormone. Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có 2 tín hiệu hormone 25 khác nhau :Đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau. Để những tế bào phôi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một môi trường khác, có hoặc không có hormone 2.2.5.5. Sự tƣơng quan giữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose Độ tuổi hay giai đoạn của mẫu cấy là một yếu tố rất quan trọng trong sự hình thành phôi. Tùy thuộc vào loại mẫu cấy cũng như giai đoạn phát triển mà sử dụng loại môi trường nuôi cấy cho phù hợp. Năm 1987 Thompson và Thorpe đã xác định ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào nồng độ sucrose có trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ sucrose cao (4-6%) được bổ sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phôi thì rất có lợi cho việc tạo phôi ở một số loài thực vật. 2.2.5.6. Nồng độ của môi trƣờng Hầu hết các nghiên cứu tạo phôi trên môi trường MS đều cho hiệu quả tạo phôi cao. Nồng độ môi trường càng loãng thì khả năng tạo phôi càng kém. 2.2.5.7. Trạng thái vật lý của môi trƣờng Sự tạo thành phôi vô tính thường được cảm ứng trên môi trường bán rắn. Tuy nhiên, trạng thái của môi trường (bán rắn hay lỏng) thì rất quan trọng trong việc duy trì và làm tăng cường sự phát triển của phôi vô tính. Sự cảm ứng tạo phôi vô tính của Gossypium klotzschiapum trên môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B, có chứa các chất điều hòa tăng trưởng cho thấy đạt hiệu quả cao (Yuqiang Sun và cộng sự , 2003) ở Lilium longiflorum, kết quả tương tự cũng được phát hiện. (Tripulato và cộng sự, 1997; Dương Tấn Nhựt và cộng sự,2002) 2.2.5.8. Kiểu gene Một vấn đề thường gặp trong cảm ứng tạo phôi nữa là sự phụ thuộc rất lớn vào loại cây trồng và kiểu gene. Kiểu gene có một ảnh hưởng to lớn trong việc cảm ứng tạo phôi của hầu hết các loài thực vật. Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm ứng tạo phôi. Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng phát sinh phôi vô tính cũng có thể khác nhau. Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các loài có kiểu gene khác nhau để khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính. Chẳng hạn như ở cây Asparagus, người ta đã quan sát 26 khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có kiểu gene khác nhau (Hisato và Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát được từ tần suất tạo phôi từ chồi đỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gene khác nhau. Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở các loài đa bội (lưỡng bội ,tứ bội) cũng đã được phát hiện (Kunitake và cộng sự, 1992). Haensch và cộng sự (1996) đã quan sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gene khác nhau. 2.2.5.9. Cƣờng độ chiếu sáng Các nhân tố khác trong môi trường nuôi cấy như là cường độ ánh sáng cũng có ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo thành phôi vô tính. Các nghiên cứu cũng đã báo cáo về những ảnh hưởng khác nhau của chế độ sáng và tối. Nhìn chung, chế độ tối đã cho thấy có những ảnh hưởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng.Ở một số loài thực vật sự cảm ứng cần có những điều kiện ủ trong tối. Những điều kiện trong tối có thể được tạo bằng cách bao môi trường nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong hộp carton. 2.2.6. Những vấn đề thƣờng gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính Sự xuất hiện những phôi dị thường . Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh chồi có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể thiếu những trường hợp này cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thường và sự phát triển của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường. Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng. Một điều đáng chú ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan thì không loại trừ. Ví dụ, cỏ 3 lá có thể được phát sinh từ phôi vô tính (Phillips và Collins, 1984). Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự phát triển chồi thì cũng tạo ra phôi vô tính. Sau đó, nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự nhân lên của chồi thì đã tạo ra nhiều cây tái sinh hơn so với khi nuôi cấy bình thường. 27 Vì vậy, những phương pháp cho phát sinh phôi làm tái sinh cơ quan được kết hợp để làm tối ưu hóa khả năng tái sinh cây. Thật thú vị khi trên cùng môi trường thuận lợi cho sự phát triển sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi trường thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài. Từ đó cho thấy đã có một vài đặc điểm tương tự giữa phôi hợp tử và phôi vô tính . 2.3. Nuôi cấy mô cây mít Rao et al., (1981) là người đầu tiên nuôi cấy chồi đỉnh cây mít từ cây mít đã trưởng thành. Nuôi cấy trên môi trường bán rắn MS (1962) có bổ sung IAA, NAA, và 2iP, tác giả thu được nhiều chồi khi nuôi cấy đốt thân và chồi ngọn non của cây từ hạt. Amin (1987) nuôi cấy chồi ngọn non của cây mít trưởng thành (30 tuổi) và thu được nhiều chồi phát sinh. Cụm chồi thường tạo mô sẹo ở ngay vết cắt khi môi trường nuôi cấy giàu cytokinin (Rao et al., 1981; Amin, 1987). Amin (1987) qua thực nghiệm cho thấy rằng, có 2 loại mô sẹo hình thành khi nuôi cấy chồi non của cây trưởng thành trên môi trường MS (1962). Tế bào mô sẹo xốp có cơ cấu tổ chức không nhất định và có đời sống ngắn. Tế bào mô sẹo cứng hình thành ngay vết cắt và có thể cấy truyền, khối mô sẹo này có thể tái sinh khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và NAA. Cây mít in vitro tạo bộ rễ hoàn chỉnh khi nuôi cấy trên môi trường MS (1962) có bổ sung BA (0,5ppm) và NAA (0,1ppm). Rao et al., (1981) cho biết rằng có khả năng tái sinh mô sẹo thành cây hoàn chỉnh khi mô sẹo tạo được qua nuôi cấy chồi non cây trưởng thành. Các bộ phận của mẫu nuôi cấy đều có khả năng hình thành mô sẹo (lá, chồi, rễ) nhưng mô sẹo hình thành từ thân chồi thì có hiệu suất tái sinh cao tạo thành chồi khi nuôi cấy trên môi trường MS + BA(2ppm) + IBA hay NAA(1ppm). Rahman (1987) nhận thấy rằng khi phối hợp cytokinin và auxin thì không có khả năng tái sinh mô sẹo từ nuôi cấy đốt thân, và điều này được ghi nhận trên hầu hết các vật liệu nuôi cấy. Nhưng khả năng tái sinh mô sẹo từ việc nuôi cấy chồi ngọn cây còn non (Rao et al., 1981) và cây trưởng thành (Amin, 1987) chứng minh rằng có khả năng tái sinh chồi qua nuôi cấy mô sẹo. 28 Nghiên cứu vận dụng đặc điểm sinh lý cây mít qua nhân giống vô tính in vitro hay bằng phôi vô tính chưa thành công và còn đang tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện. 29 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Vật liệu 3.1.1. Mẫu nuôi cấy Chồi cây mít in vitro sẵn có, được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. 3.1.2. Thiết bị + Tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ lạnh, máy cất nước, pipet, ống đong….cân hóa chất, bể rửa chai lọ, dụng cụ bằng thủy tinh (chai thủy tinh, ống nghiệm….) + Tủ cấy vô trùng + Gía và bàn để môi trường + Môi trường + Các dụng cụ trong thao tác cấy: kéo, ben, ống thủy tinh, đèn cồn, đĩa nhôm đường kính 20cm, cốc… + Các giá có tầng để bình hoặc ống nghiệm nuôi cấy. + Các giá được lắp đèn ống (ánh sáng trắng) để chiếu sáng. + Trong phòng cần có máy móc kiểm tra chính xác: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, máy điều hòa nhiệt độ. + Phòng nuôi tối dùng để nuôi mô sẹo và các xử lý đặc biệt. Giống phòng sáng nhưng không có đèn, cần che bên ngoài bằng vải len hoặc bịt kín. 3.1.3. Hoá chất + Agar + Nước dừa (cw) + Các chất kích thích tăng trưởng: auxin, kinitine, NAA + Glutamine, môi trường MS, sucrose. + Vitamine + Fe-EDTA + Micro 30 + Thành phần của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962): MURASHIGE & SKOOG (1962) Khoáng đa lượng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Khoáng vi lượng (mg/l) MnSO4.4H2O 22,300 H3BO3 6,200 ZnSO4.4H2O 8,600 KI 0,830 Na2MoO4.2H2O 0,250 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Vitamins (mg/l) Glycine 2,0 Pirydoxine (B6) 0,5 Meso-inositol 100,0 Acid nicotinic (pp) 0,5 Thiamin.HCl (B1) 0,1 Fe-EDTA (mg/l) Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Để thuận tiện, môi trường nuôi cấy được pha từ các dung dịch mẹ được chuẩn bị: khoáng đa lượng (micro), khoáng vi lượng (micro), vitamin, Fe-EDTA. Thể tích môi trường nuôi cấy: mỗi bình tam giác có chứa 50 ml môi trường được khử trùng trong nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 120OC trong 25 phút. 31 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy Cường độ ánh sáng phòng nuôi cấy: 3000 Lux Nhiệt độ phòng sáng: 28OC ± 2OC Độ ẩm phòng sáng: 60-75% Quang kỳ: 8 giờ chiếu sáng trong một ngày. 3.2. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần cấy 3 bình. 3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại với 5 mẫu cấy: Thành phần môi trường như bảng 3.1. Mục đích thí nghiệm này là tìm môi trường thích hợp để nuôi cấy phát sinh tế bào soma, tạo nguồn vật liệu ban đầu để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Mẫu nuôi cấy là mẫu thân, lá, cây mít. Cách thức lấy mẫu là cắt các mẫu thân, lá với kích thước khoảng 1-1,5cm, cho vào các môi trường khác nhau, mỗi mẫu cho vào các nghiệm thức khác nhau. Trong thí nghiệm này có sử dụng môi trường cơ bản MS có bổ sung BA, NAA. Bảng 3.1: Thành phần môi trường nuôi cấy phát sinh tế bào soma Nghiệm thức Thành phần môi trường Khoáng BA (mg/l) NAA (mg/l) CW (%) Đường (g) 1.1 MS 1 3 10 30 1.2 MS 1 5 10 30 1.3 MS 1 1 10 30 Chỉ tiêu theo dõi sau 15 ngày. Tỉ lệ tạo tế bào soma: (%) Kích thước trung bình: (mm) 32 3.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của loại mẫu nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 5 mẫu cấy. Mẫu cấy: lá, thân. Cách thức lấy mẫu: cắt mẫu thân,lá (1-1,5cm) có sẵn trong phòng thí nghiệm, trong điều kiện vô trùng mẫu, nuôi trong môi trường nuôi cấy. Mục đích của thí nghiệm này nhằm xác định loại mẫu cấy nào cho tỉ lệ phát sinh tế bào soma tốt nhất. Loại mẫu nào sẽ được chọn cho thí nghiệm tiếp theo. Môi trường được sử dụng cho thí nghiệm này có thành phần các chất giống với môi trường trong thí nghiệm 1. Bảng 3.2: Loại mẫu và thành phần môi trường nuôi cấy Nghiệm thức Mẫu nuôi cấy Thành phần môi trường 2.1 Lá MS + BA (1) + NAA (5) + CW (10%) + Đường (30 g) 2.2 Thân Chỉ tiêu theo dõi sau 15 ngày. Tỉ lệ tạo tế bào soma: (%) Kích thước trung bình: (mm) 3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến tăng sinh khối tế bào soma. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần gồm 5 mẫu cấy. Mẫu cấy: tế bào soma ở thí nghịêm 1. Mục đích của thí nghiệm này là tìm môi trường thích hợp nhất làm tăng sinh khối tế bào soma đã được nuôi cấy phát sinh ở thí nghiệm 1. Môi trường được sử dụng cho thí nghiệm này có thành phần các chất kích thích sinh trưởng giống với môi trường thí nghiệm 1, nhưng nồng độ các chất này được tăng lên. 33 Bảng 3.3: Thành phần môi trường nuôi cấy tăng sinh khối tế bào soma Nghiệm thức Thành phần môi trường Khoáng BA (mg/l) Ki (mg/l) NAA (mg/l) CW (%) Đường (g) 3.1 MS 1 0 5 10 30 3.2 MS 0 0 5 10 30 3.3 MS 0 1 5 10 30 Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày Khối lượng trung bình ban đầu: (g) Khối lượng trung bình sau khi cấy truyền: (g) Khối lượng trung bình tăng sinh khối: (g) 3.2.4. Thí nghiệm 4: Nuôi cấy tế bào soma trên môi trƣờng lỏng Thành phần môi trường như bảng 3.4. Cấy một lượng xác định (1g) vào các môi trường lỏng rồi đặt trên máy lắc, với tốc độ máy là 80 vòng/phút. Xác định môi trường nuôi cấy lỏng tốt nhất. Sau đó, tiếp tục cân các khối lượng khác nhau (1g, 2g, 3g) cấy vào môi trường tốt nhất đã được xác định, để xác định khối lượng, mật độ phát triển tốt nhất. Bảng 3.4: Thành phần môi trường nuôi cấy lỏng Nghiệm thức Thành phần môi trường Khoáng BA (mg/l) NAA (mg/l) CW (%) Đường (g) 4.1 MS 1 3 10 30 4.2 MS 1 5 10 30 4.3 MS 1 1 10 30 Mục đích thí nghiệm: tìm môi trường lỏng thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối của tế bào soma Chỉ tiêu theo dõi sau 15 ngày 34 Mật độ tế bào sau 15 ngày nuôi cấy: (tế bào/ml) (x 10 6) 3.2.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh tế bào soma Mô sẹo đã được làm tăng sinh khối và có khả năng tạo nhiều chồi. Khả năng này phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret, 1966) và sự hình thành tế bào xốp (Thorpe). Những mô sẹo cứng không có sự phát sinh phôi và phân hoá cơ quan nên được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy tế bào đơn. Thí nghiệm đước bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại. Mẫu cấy: tế bào mô sẹo ở thí nghiệm 3. Môi trường nuôi cấy ở bảng 3.5. Bảng 3.5 Thành phần môi trường tái sinh tế bào soma Nghiệm thức Thành phần môi trường Khoáng BA (mg/l) NAA (mg/l) CW (%) Đường (g) 5.1 MS 2,5 0,5 0 30 5.2 MS 2,5 0 0 30 5.3 MS 2,5 0,5 10 30 5.4 MS 2,5 0 10 30 Mục đích thí nghiệm: tìm môi trường tốt nhất cho sự hình thành chồi, xác định loại mẫu tốt nhất cho việc tái sinh tế bào soma. Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày Số cụm tái sinh/ bình Số chồi/cụm 35 3.2.6. Thí nghiệm 6: Nhân chồi cây mít Mẫu sau khi tái sinh được chuyển qua môi trường thích hợp nhằm tăng số chồi trong một cụm phôi ban đầu. Mẫu còn non và chứa nhiều dinh dưỡng, có nhu mô phân sinh cho khả năng tạo chồi cao. Thí nghiệm đước bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Mẫu cấy: cụm chồi tái sinh ở thí nghiệm 5. Môi trường nuôi cấy: ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Nhân chồi cây mít Nghiệm thức Thành phần môi trường Khoáng BA (mg/l) PVP (mg) NAA (mg/l) CW (%) Đường (g) 6.1 MS 3 200 0,2 10 30 6.2 MS 3 0 0 10 30 6.3 MS 3 0 0 10 30 Mục đích thí nghiệm: tìm môi trường tốt nhất cho sự nhân chồi và tạo ra những chồi tốt nhất từ mô sẹo cây mít. Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày Số chồi trung bình/cụm Chiều cao chồi: (mm) 3.2.7. Thí nghiệm 7: Nuôi cấy phát sinh rễ Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu cấy. Mẫu thí nghiệm: sử dụng mẫu trong thí nghiệm 6, những chồi phát triển mạnh có chiều cao 4-6 cm, đường kính lớn, lá phát triển mới được chọn để nuôi cấy kích thích tạo rễ.Auxin cần thiết cho sự tạo rễ, thường dùng IBA hay IBA + NAA. Môi trường nuôi cấy: như ở bảng 3.7. 36 Bảng 3.7 Thành phần môi trường nuôi cấy phát sinh rễ Nghiệm thức Thành phần môi trường Khoáng BA (mg/l) IAA (mg/l) IBA (mg/l) CW (%) Đường (g) 7.1 MS 0 1 1 10 30 7.2 MS 0 2 1 10 30 7.3 WPM 0,1 0 5 10 30 Mục đích thí nghiệm: xác định môi trường tốt nhất cho sự phát sinh rễ. Chỉ tiêu theo dõi sau 45 ngày Tỉ lệ phát sinh rễ:(%) Chiều dài rễ: (mm) 3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Kết quả Khi xử lý thống kê số liệu của các chỉ tiêu, là sử dụng các trị trung bình của từng lần lặp lại. Phân tích ANOVA, sau đó kiểm tra trắc nghiệm phân hạn bằng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Duncan’s cho từng chỉ tiêu của thí nghiệm, với mức xác suất có ý nghĩa p= 0,05 hoặc p= 0,01. Các số liệu thể hiện trong bảng là các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại, sau khi xử lý thống kê có được. Số liệu thu thập được xử lý thống kê trên phần mềm MstatC, Excel 37 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma (sau 15 ngày nuôi cấy) Nhận xét : Từ kết quả 4.1a cho thấy Về tỉ lệ tế bào soma: giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức: P = 0,05 Về kích thước trung bình: giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức: P = 0,05 Qua bảng thời gian tạo phôi cho thấy: thời gian tạo phôi của mẫu lá sớm hơn so với mẫu thân. Qua quá trình thí nghiệm cho thấy: Kết quả tất cả các nghiệm thức thí nghiệm điều phát sinh tế bào soma. Ở nghiệm thức 1.2: BA (1mg/l) + NAA (5mg/l) có tỉ lệ phát sinh tế bào soma cao nhất, tế bào soma có tốc độ phát triển nhanh nhất và kích thước cũng lớn nhất. Mô sẹo tốt, có màu vàng ngay vết cắt. Mô sẹo càng về sau càng chuyển sang màu đen. Ở nghiệm thức 1.1: BA (1mg/l) +NAA (3mg/l) mô sẹo phát triển tương đối tốt, nhưng ít hơn nghiệm thức 1.2. Mô sẹo có màu trắng, xốp, hơi ngả vàng. Mô sẹo càng về sau cũng có màu đen. Nghiệm thức 1.3: mô sẹo lên khá chậm và nhỏ hơn so với nghiệm thức khác. Cytokinin là những chất mà khi kết hợp với auxin sẽ kích thích sự phân chia tế bào trong cây và khi tương tác với auxin sẽ dẫn tới sự biệt hoá các tế bào. BA thuộc nhóm cytokinin tổng hợp. Sự có mặt của cytokinin trong môi trường quyết định sự phân chia hay phân hoá của tế bào trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, hiệu quả kích thích sự phân chia tế bào này được tăng cường nếu bổ sung thêm auxin vào môi trường nuôi cấy. 38 Bảng 4.1a: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma (sau 15 ngày nuôi cấy) Nghiệm thức Tỉ lệ tạo tế bào soma (%) Kích thước trung bình (mm) Lá Thân Lá Thân 1.1 37,80b 43,33b 5,38b 8,5b 1.2 62,95a 73,33a 7,53a 12,33a 1.3 24,09c 30,00b 4,67b 7,17b CV % 13,89 15,25 8,73 11,43 LSD 0.05 11,55 14,89 1,028 2,132 Bảng 4.1b: Thời gian phát sinh tế bào soma. Nghiệm thức Mẫu Thời gian (ngày) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1.1 Lá - - - + + + + + + Thân - - - - - + + + + 1.2 Lá - - - + + + + + + Thân - - - - + + + + + 1.3 Lá - - - + + + + + + Thân - - - - - - + + + 39 Hình 4.1 Tế bào soma cây mít phát sinh trên môi trƣờng nuôi cấy (MS + BA (1 mg/l) + NAA (5 mg/l) + CW (10 %) + Đƣờng (30 g)) (A): Mẫu lá (B): Mẫu thân A B 40 4.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của mẫu nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma Nhận xét: Từ bảng 4.2 cho thấy Giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05 Qua quá trình thí nghiệm nhận thấy Mẫu thân có sự tăng nhanh về tỷ lệ và kích thước khối mô sẹo hơn so với mẫu lá. Vậy, mẫu nuôi cấy từ thân sẽ cho kết quả nghiên cứu cao hơn so với mẫu lá. Do đó, trong những thí nghiệm tiếp theo sẽ sử dụng mẫu thân nhiều hơn. Bảng 4.2: Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma Mẫu Khả năng phát sinh tế bào soma Tỷ lệ tạo tế bào soma (%) Kích thước trung bình (mm) Lá 63,33b 7,33b Thân 73,33a 12,33a CV % 15,00 11,33 LSD 0,05 13,32 1,49 41 4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến cấy chuyền tế bào (trên agar) Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền cũng có chất sinh trưởng nhưng với nồng độ giảm hơn so với môi trường tạo phôi. Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền là 30 ngày. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng giảm. Bảng 4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến cấy chuyền tế bào soma (trên agar). Nghiệm thức Khối lượng trung bình ban đầu (g) Khối lượng sau 30 ngày cấy chuyền (g) Sinh khối tăng lên (g) Lá Thân Lá Thân Lá Thân 3.1 1,03 2,43 1,72a 2,98a 0,63a 0,54a 3.2 1,03 2,40 1,32c 2,54c 0,29b 0,28b 3.3 1,13 2,43 1,51b 2,81b 0,42b 0,40ab CV % 4,00 2,30 16,94 15,57 LSD0,05 0,1264 0,1264 0,1548 0,1264 Nhận xét: Qua bảng 4.3 ta thấy: Các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05 Qua quá trình thí nghiệm ta thấy: Cả 2 mẫu lá và thân điều phát triển tốt ở nghiệm thức 3.1, khối lượng tăng trưởng tế bào ở nghiệm thức này là nhiều nhất. Mô sẹo được cấy chuyền và theo dõi nhiều lần cấy chuyền tiếp theo cũng điều thu được kết quả tương tự, nhưng sau một thời gian phát triển, mô bắt đầu cứng và đen. Những mô này đã được thử nghiệm tái sinh và cấy truyền thì thấy không có khả năng tái sinh, mô cũng giảm sự phát triển khi cấy chuyền. Kết quả thực nghiệm cho thấy, nghiệm thức 3.1 với sự kết hợp của cytokinin và auxin với tỉ lệ phù hợp đã kích thích sự phát triển và biệt hoá tế bào soma. 42 Hình 4.2 Tế bào soma cây mít tăng sinh khối trên môi trƣờng nuôi cấy (MS + BA(1mg/l) + NAA(5mg/l) + CW(10%) + Đường(30g)) A B 43 4.4. Thí nghiệm 4: Nhân sinh khối tế bào soma trên môi trƣờng lỏng Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó sinh ra, cho nên từ mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn thế ở thế giới thực vật. Nuôi cấy tế bào đơn là nuôi cấy dịch huyền phù chứa nhiều tế bào liên kết lại với nhau. Mẫu nghiệm thức là mô sẹo từ thí nghiệm 3, được cấy vào dịch lỏng có chứa nồng độ chất sinh trưởng thích hợp. Sau đó đặt trên máy lắc, tốc độ 70-80 vòng/phút cho sự trao đổi khí thuận lợi. Sau một thời gian nuôi cấy, dịch huyền phù trở nên đục, màu vàng rất đậm. 4.4.1. Thí nghiệm 4-1: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy lỏng đến tăng sinh khối tế bào soma Bảng 4-1.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lỏng đến tăng sinh khối tế bào soma. Nghiệm thức Mật độ tế bào sau 15 ngày nuôi cấy (tế bào/ml) (x106) 4.1 0,34b 4.2 0,65a 4.3 0,36b CV % 12,03 LSD0,05 0,1094 Nhận xét: Từ bảng 4-1.5 ta thấy Giữa nghiệm thức 4.2 nghiệm thức 4.1, 4.3 có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0.05. Giữa nghiệm thức 4.1 và 4.3 không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê P = 0.05. Trong quá trình thí nghiệm cũng cho thấy Nghiệm thức 4.2 cho kết quả tốt với mật độ tế bào là 0,657 x 10 6 tế bào/ml. 44 Nghiệm thức 4.2 có công thức môi trường tương tự như công thức 1.2, phôi được cấy vào môi trường này cũng được tăng trưởng mạnh nhờ tác động thích hợp của chất kích thích sinh trưởng nên tăng trưởng rất nhanh. Dịch huyền phù nhận được sau 15 ngày nuôi cấy có màu vàng rất đậm, đục, có nhiều tế bào bám thành bình. 4.4.2. Thí nghiệm 4-2: Ảnh hƣởng của mật độ nuôi cấy ban đầu đến khả năng tăng sinh khối tế bào soma. Bảng 4-2.4: Ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy ban đầu đến khả năng tăng sinh khối tế bào soma. Khối lượng Mật độ trung bình sau 15 ngày nuôi cấy (tế bào) (x106) 1 2,96c 2 4,98b 3 7,77a CV % 7,27 LSD 0,05 0,7608 Nhận xét: Từ bảng 4-2.5 ta thấy Môi trường sử dụng để nuôi cấy: MS + BA (1mg/l) + NAA (5 mg/l) + CW (10%) + Đường (30g). Các nghiệm thức cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05 Qua quá trình thí nghiệm cho thấy Mật độ tế bào tăng nhanh nhất ở mật độ nuôi cấy ban đầu 3g. Dịch huyền phù thu được là dung dịch đục, màu vàng rất đậm, trên thành bình có bám rất nhiều tế bào. Kết quả cho thấy: Mật độ nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh khối tế bào soma. Môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy dịch huyền phù tế bào soma là môi trường: MS + BA (1mg/l) +NAA (5 mg/l) + CW (10%) + Đường (30g). 45 Hình 4.3:Dịch huyền phù tế bào soma trên các môi trƣờng và ở các mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu khác nhau. (A) Dịch huyền phù tế bào soma trên môi trường BA (1mg/l) + NAA (5mg/l) (B) Dịch huyền phù tế bào soma ở mật độ 3 (g) A B 46 4.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh tế bào soma Mô sẹo có khả năng hình thành nhiều chồi. Khả năng này phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret, 1966) và sự hình thành tế bào xốp (Thorpe). Những mô sẹo cứng không có khả năng phát sinh phôi và phân hoá cơ quan nên được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy tế bào đơn. Qua bảng 4.5 cho thấy Giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05 Qua quá trình thí nghiệm cho thấy: Tất cả các nghiệm thức điều cho khả năng tái sinh chồi. Nếu so sánh 2 cặp nghiệm thức 5.1 và 5.3; 5.2 và 5.4, ta thấy thành phần chất sinh trưởng giống nhau nhưng chỉ khác ở sự có mặt của nước dừa. Nước dừa có tác dụng kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành kích thích sự phát triển phôi. Vì vậy, nếu nghiệm thức nào không có nước dừa thì số chồi sẽ không cao. Nghiệm thức 5.1 và 5.3 chứa chất điều hoà sinh trưởng NAA thì ở gốc của mẫu nuôi cấy có hình thành mô sẹo và chất phenol loang ra môi trường nuôi cấy nhiều dẫn đến môi trường bị đen. Nghiệm thức 5.2 có số chồi nhiều, nhưng vì nồng độ BA quá cao nên ức chế sự vươn cao của chồi. Ở nghiệm thức 5.4: BA (5mg/l) số chồi phát sinh trong cụm là nhiều nhất vì nồng độ cytokinin cao nhất. Nhưng về chiều cao trung bình, thì lại thấp vì hàm lượng BA cao sẽ ức chế sự vươn cao của chồi. Đồng thời chồi phát sinh trong môi trường này rất tốt. Xét về chiều cao thì nghiệm thức 5.3 cho chiều cao lớn nhất do sự kết hợp cuả các chất sinh trưởng hợp lý. 47 Bảng 4.5: Tái sinh tế bào soma Nghiệm thức Số chồi trung bình /cụm Chiều cao trung bình chồi (mm) 5.1 3,65c 8,75a 5.2 7,57b 2,82c 5.3 4,64c 10,25a 5.4 9,46a 6,78b CV% 8,91 13,37 LSD 0,05 1,062 1,799 48 Hình 4.4: Tái sinh phôi soma cây mít (sau 30 ngày nuôi cấy) trên (A): Môi trƣờng (MS + BA(2,5mg/l) + NAA(0,5mg/l) + Đƣờng(30g)) (B): Môi trƣờng (MS + BA(2,5mg/l) + NAA(0,5mg/l) + CW(10%) + Đƣờng(30g)) (C): Môi trƣờng (MS + BA(2,5mg/l) + CW(10%) + Đƣờng(30g)) C B A 49 4.6. Thí nghiệm 6: Nhân chồi cây mít Nhận xét Qua bảng 4.6 ta thấy Về số chồi và chiều cao: các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05 Qua quá trình thí nghiệm cho thấy: Ngiêm thức 6.1:BA (3) + NAA(0,2) + PVP có chiều cao lớn nhất và ít hiện tượng phù gốc. Đồng thời PVP là một chất thuộc loại polyamide, sẽ hấp thu phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn sự hoá nâu. Nghiệm thức 6.2, BA (3)Có số chồi trung bình ít hơn so với nghiệm thức 6.3 có BA (5), nhưng chiều cao chồi lớn hơn vì nồng độ cytokinin thấp hơn. Nghiệm thức 6.3 có hàm lượng BA cao (5mg/l) nên sẽ có số chồi tái sinh rất nhiều, nhưng lại ức chế chiều cao sự phát triển chồi. Nhưng nếu BA tiếp tục tăng nữa thì khả năng hình thành chồi mới không tăng nữa. Bảng 4.6: Nhân chồi cây mít Nghiệm thức Số chồi trung bình /cây Chiều cao trung bình (mm) 6.1 7,67b 10,18a 6.2 9,33ab 7,20b 6.3 11,13a 4,53c CV % 10,37 12,60 LSD 0,05 1,998 1,733 50 Hình 4.5: Nhân chồi cây mít nuôi cấy sau 30 ngày trên các môi trƣờng (A), (B): BA (5mg/l) (C), (D): BA (3mg/l) B C D A 51 4.7. Nuôi cấy phát sinh rễ Sự tạo rễ chịu ảnh hưởng của auxin như: IBA, NAA… với tỉ lệ thích hợp. Bảng 4.7: Khả năng ra rễ của cây mít in vitro Nghiệm thức Số rễ/cây Chiều dài rễ (mm) 7.1 23,19a 39,17a 7.2 17,15b 31,83a 7.3 9,67c 25,50b CV % 4,28 14,04 LSD 0,05 1,427 8,740 ` Nhận xét: Qua bảng 4.7 ta thấy Về số rễ/cây: giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất p= 0,05 Về chiều dài rễ: nghiệm thức 7.3 và 7.1, 7.2 có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất P = 0,05 Giữa nghiệm thức 7.1 và 7.2 không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức xác suất P = 0,05 Qua quá trình thí nghiệm ta thấy Kết quả ghi nhận trong 45 ngày nuôi cấy ta thấy rằng tất cả các nghiệm thức đều có khả năng phát sinh rễ. Ở nghiệm thức 7.1 có số rễ và chiều dài lớn nhất, sau đó là nghiệm thức 7.2. Trong các môi trường này rễ của cây có nhiều rễ nhỏ và một số rễ lớn hơn, rễ có màu vàng, dài, nhưng rất dễ gãy khi đem ra vườn ươm. Còn nghiệm thức 7.3, số rễ và chiều dài rễ tuy thấp hơn các nghiệm thức kia nhưng rễ lại to hơn, có màu vàng. Đồng thời, do có chứa BA nên nghiệm thức này có hiện tượng phù gốc. Nghiệm thức 7.3 ra rễ đồng đều hơn các nghiệm thứ khác nhưng tốc độ ra rễ chậm hơn. 52 Tất cả các nghiệm thức đều có bổ sung auxin, thích hợp cho sự phát sinh rễ. Nhưng ở nghiệm thức 7.3 có kết hợp giữa auxin (IBA) và cytokinin (BA) nên rễ to hơn nhưng lại không dài như các nghiệm thức còn lại. Vì vậy, để kích thích tạo rễ cho cây mít thích hợp nhất là trên môi trường có IAA (1mg/l) + IBA (1mg/l) 53 Hình 4.6: Cây mít in vitro ra rễ tốt trên môi trƣờng kích thích ra rễ (A): Rễ cây mít in vitro (B): Cây mít in vitro ra rễ hoàn chỉnh A B 54 Hình 4.7: Cây mít ra rễ in vitro được thuần hóa và ra bầu đất 55 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Môi trường tạo phôi tốt nhất là MS + BA (1mg/l) + NAA (5mg/l) + CW (10%) + Đường (30g). Môi trường cấy chuyền tốt nhất MS + BA (1mg/L) + NAA (5mg/l) + CW (10%) + Đường (30g). Môi trường nhân sinh khối lỏng tốt nhất là môi trường MS + BA (1mg/l) + NAA (5mg/l) + CW (10%) + Đường (30g). Môi trường tái sinh tốt nhất là MS + BA (2,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) + CW (10%) + Đường (30g). Môi trường nhân chồi tốt nhất là MS + BA (5mg/l) + CW (10%) + Đường (30g) Môi trường ra rễ tốt nhất là MS + IAA (1mg/l) + IBA (1mg/l) + Đường. 5.2. Đề nghị Trong quá trình cấy phôi và tạo phôi, có hiện tượng mô sẹo bị đen làm giảm tỉ lệ tái sinh và chất lượng mô sẹo. Vì vậy, cần nghiên cứu tìm hiểu nguyên nhân và tìm cách khắc phục. Thiết lập biểu đồ sinh trưởng của tế bào soma trong nuôi cấy lỏng để việc nhân sinh khối được tốt hơn. Khảo sát sinh trưởng của cây mít in vitro ở vườn ươm. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đường Hồng Dật, 2000. Nghề làm vườn cây ăn quả 3 Miền (trang 46-48). 2. TS. Trần Thị Dung, 2005. Nuôi cấy mô tế bào thực vật, bài giảng. Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 3. Trần Quang Hoàng, 2005. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến nuôi cấy in vitro của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Khoá luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 4. PGS.TS Trần Văn Minh, 2000. Công nghệ sinh học thực vật. Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh. 5. PGS.TS Trần Văn Minh, 1997, Công nghệ sinh học cây ăn trái. Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh. 6. Liêu Hồng Phú, 2005. Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp). Khoá Luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 7. www.Sggp. Orgorg.Vn/phongsudieutra/nam2004/thang12/30276. 8. www.Cismi. Org.vn/chamsocsuckhoecongdong/12-08-05-1.htm 9. Vi. Wikipedia. Org/Wiki/Mit 10. Hanoitv. Org.vn/tintuc/vn/detail. Asp. 11. www.vnexpress.net/vietnam/doi-song/2006/04 57 PHỤ LỤC Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến phát sinh phôi soma Tỉ lệ tạo tế bào soma (lá) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 2330.510 1165.255 34.851 0.0005 Within 6 200.610 33.435 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 2531.120 Coefficient of Variation = 13.89% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 37.80 B Mean 2 = 62.95 A Mean 2 = 62.95 A Mean 1 = 37.80 B Mean 3 = 24.09 C Mean 3 = 24.09 C  Least Significant Difference Test LSD value = 11.55 at alpha = 0.050 58 TN1: Tỉ lệ tạo tế bào soma (thân) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 2955.556 1477.778 26.600 0.0010 Within 6 333.333 55.556 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 3288.889 Coefficient of Variation = 15.25% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 43.33 B Mean 2 = 73.33 A Mean 2 = 73.33 A Mean 1 = 43.33 B Mean 3 = 30.00 B Mean 3 = 30.00 B Least Significant Difference Test LSD value = 14.89 at alpha = 0.050 TN1: Kích thước trung bình (lá) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 13.354 6.677 25.488 0.0012 Within 6 1.572 0.262 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 14.926 Coefficient of Variation = 8.73% 59 TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 5.380 B Mean 2 = 7.530 A Mean 2 = 7.530 A Mean 1 = 5.380 B Mean 3 = 4.670 B Mean 3 = 4.670 B Least Significant Difference Test LSD value = 1.028 at alpha = 0.050 TN1:Kích thước trung bình(thân) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 43.167 21.583 18.951 0.0026 Within 6 6.833 1.139 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 50.000 Coefficient of Variation = 11.43% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 8.500 B Mean 2 = 12.33 A Mean 2 = 12.33 A Mean 1 = 8.500 B Mean 3 = 7.167 B Mean 3 = 7.167 B Least Significant Difference Test LSD value = 2.132 at alpha = 0.050 60 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của mẫu nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma TN2:Tỉ lệ tạo tế bào soma Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 9155.556 4577.778 103.000 0.0000 Within 6 266.667 44.444 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 9422.222 Coefficient of Variation = 15.00% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 60.00 B Mean 2 = 73.33 A Mean 2 = 73.33 A Mean 1 = 60.00 B Mean 3 = 0.0000 C Mean 3 = 0.0000 C Least Significant Difference Test LSD value = 13.32 at alpha = 0.050 TN2:Kích thước trung bình Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 230.889 115.444 207.800 0.0000 Within 6 3.333 0.556 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 234.222 Coefficient of Variation = 11.37% 61 TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 7.333 B Mean 2 = 12.33 A Mean 2 = 12.33 A Mean 1 = 7.333 B Mean 3 = 0.0000 C Mean 3 = 0.0000 C Least Significant Difference Test LSD value = 1.490 at alpha = 0.050 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến cấy chuyền tế bào soma TN3:Khối lượng sau 30 ngày cấy chuyền (lá) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 0.248 0.124 33.651 0.0005 Within 6 0.022 0.004 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 0.270 Coefficient of Variation = 4.00% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 1.720 A Mean 1 = 1.720 A Mean 2 = 1.320 C Mean 3 = 1.510 B Mean 3 = 1.510 B Mean 2 = 1.320 C Least Significant Difference Test LSD value = 0.1264 at alpha = 0.050 62 TN3: Khối lượng sau 30 ngày cấy chuyền (thân) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 0.295 0.148 36.320 0.0004 Within 6 0.024 0.004 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 0.320 Coefficient of Variation = 2.30% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 2.980 A Mean 1 = 2.980 A Mean 2 = 2.540 C Mean 3 = 2.810 B Mean 3 = 2.810 B Mean 2 = 2.540 C Least Significant Difference Test LSD value = 0.1264 at alpha = 0.050 TN3: Khối lượng trung bình tăng sinh khối(lá) B ảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 0.179 0.090 15.664 0.0042 Within 6 0.034 0.006 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 0.214 Coefficient of Variation = 16.94% 63 TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 0.6300 A Mean 1 = 0.6300 A Mean 2 = 0.2900 B Mean 3 = 0.4200 B Mean 3 = 0.4200 B Mean 2 = 0.2900 B Least Significant Difference Test LSD value = 0.1548 at alpha = 0.050 TN3: Khối lượng trung bình tăng sinh khối (thân) Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 0.107 0.053 13.234 0.0063 Within 6 0.024 0.004 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 0.131 Coefficient of Variation = 15.57% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 0.5400 A Mean 1 = 0.5400 A Mean 2 = 0.2800 B Mean 3 = 0.4000 B Mean 3 = 0.4000 B Mean 2 = 0.2800 B Least Significant Difference Test LSD value = 0.1264 at alpha = 0.050 64 Thí nghiệm 4: Nuôi cấy tế bào soma trên môi trƣờng lỏng TN4: Mật độ tế bào sau 15 ngày nuôi cấy B ảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 0.178 0.089 30.298 0.0007 Within 6 0.018 0.003 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 0.196 Coefficient of Variation = 12.03% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 0.3400 B Mean 2 = 0.6500 A Mean 2 = 0.6500 A Mean 3 = 0.3600 B Mean 3 = 0.3600 B Mean 1 = 0.3400 B Least Significant Difference Test LSD value = 0.1094 at alpha = 0.050 65 TN4: Ảnh hƣởng của mật độ cấy ban đầu đến khả năng tăng sinh khối tế bào soma TN4: Mật độ trung bình sau 15 ngày nuôi cấy Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 35.102 17.551 121.125 0.0000 Within 6 0.869 0.145 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 35.971 Coefficient of Variation = 7.27% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 2.957 C Mean 3 = 7.773 A Mean 2 = 4.977 B Mean 2 = 4.977 B Mean 3 = 7.773 A Mean 1 = 2.957 C Least Significant Difference Test LSD value = 0.7608 at alpha = 0.050 66 Thí nghiệm 5: Tái sinh tế bào soma TN5: Số chồi trung bình/cụm Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 3 64.231 21.410 67.313 0.0000 Within 8 2.545 0.318 --------------------------------------------------------------------------- Total 11 66.776 Coefficient of Variation = 8.91% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 3.650 C Mean 4 = 9.460 A Mean 2 = 7.570 B Mean 2 = 7.570 B Mean 3 = 4.640 C Mean 3 = 4.640 C Mean 4 = 9.460 A Mean 1 = 3.650 C Least Significant Difference Test LSD value = 1.062 at alpha = 0.050 67 TN5: Chiều cao trung bình chồi Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 3 93.328 31.109 34.071 0.0001 Within 8 7.305 0.913 --------------------------------------------------------------------------- Total 11 100.633 Coefficient of Variation = 13.37% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 8.750 A Mean 3 = 10.25 A Mean 2 = 2.820 C Mean 1 = 8.750 A Mean 3 = 10.25 A Mean 4 = 6.780 B Mean 4 = 6.780 B Mean 2 = 2.820 C Least Significant Difference Test LSD value = 1.799 at alpha = 0.050 68 Thí nghiệm 6: Nhân chồi cây mít TN6: Số chồi trung bình/cây Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 14.249 7.124 7.320 0.0246 Within 6 5.840 0.973 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 20.089 Coeffic ient of Variation = 10.37% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 7.667 B Mean 3 = 11.13 A Mean 2 = 9.333 AB Mean 2 = 9.333 AB Mean 3 = 11.13 A Mean 1 = 7.667 B Least Significant Difference Test LSD value = 1.998 at alpha = 0.050 69 TN6: Chiều cao trung bình Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 47.876 23.938 28.259 0.0009 Within 6 5.083 0.847 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 52.959 Coefficient of Variation = 12.60% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 10.18 A Mean 1 = 10.18 A Mean 2 = 7.200 B Mean 2 = 7.200 B Mean 3 = 4.530 C Mean 3 = 4.530 C Least Significant Difference Test LSD value = 1.733 at alpha = 0.05 70 Thí nghiệm 7: Nuôi cấy phát sinh rễ TN7: Số rễ/cây Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 275.222 137.611 270.055 0.0000 Within 6 3.057 0.510 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 278.280 Coefficient of Variation = 4.28% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 23.19 A Mean 1 = 23.19 A Mean 2 = 17.15 B Mean 2 = 17.15 B Mean 3 = 9.670 C Mean 3 = 9.670 C Least Significant Difference Test LSD value = 1.427 at alpha = 0.050 71 TN7: Chiều dài rễ Bảng ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 2 418.667 209.333 10.938 0.0100 Within 6 114.833 19.139 --------------------------------------------------------------------------- Total 8 533.500 Coefficient of Variation = 14.04% TRẮC NGHIỆM PHÂN HẠNG Original Order Ranked Order Mean 1 = 39.17 A Mean 1 = 39.17 A Mean 2 = 31.83 A Mean 2 = 31.83 A Mean 3 = 22.50 B Mean 3 = 22.50 B Least Significant Difference Test LSD value = 8.740 at alpha = 0.050 72 TÓM TẮT LÝ THỊ LẸ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.Tháng 9/2006. “TÁI SINH PHÔI SOMA CÂY MÍT”. Hội đồng hướng dẫn: PGS.TS TRẦN VĂN MINH. CÔ: BÙI THỊ TƯỜNG THU. Đề tài được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 8/2006 tại phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ tế bào thực vật phía Nam Viện Sinh học Nhiệt đới TP.Hồ Chí Minh. Tiến hành thí nghiệm với mẫu cấy là chồi cây mít đã được khử trùng và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.Gồm 7 thí nghiệm: -Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma Mục đích: là tìm môi trường thích hợp để nuôi cấy phát sinh tế bào soma -Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của loại mẫu nuôi cấy đến phát sinh tế bào soma Mục đích: xác định loại mẫu cấy cho tỉ lệ phát sinh tế bào soma tốt nhất -Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tăng sinh khối tế bào soma Mục đích: tìm môi trường thích hợp nhất làm tăng sinh khối tế bào soma -Thí nghiệm 4: Nuôi cấy tế bào soma trên môi trường lỏng Mục đích: tìm môi trường lỏng thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối của tế bào soma -Thí nghiệm 5: Tái sinh tế bào soma Mục đích: tìm môi trường tốt nhất cho sự phát sinh chồi -Thí nghiệm 6: Nhân chồi cây mít Mục đích: tìm môi trường tốt nhất cho sự nhân chồi -Thí nghiệm 7: Nuôi cấy phát sinh rễ Mục đích: xác định môi trường tốt nhất cho sự phát sinh rễ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: Sử dụng phần mềm MSTATC để tính toán và phân tích số liệu 73 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM Tp. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÝ THỊ LẸ TÁI SINH PHÔI SOMA CÂY MÍT (Artocarpus heterophyllus Lam) Luận văn kỹ sƣ Ngành:công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 74