Luận văn Tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa interferon alpha 2B của người trên hệ thống pichia pastoris
TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI TRÊN HỆ THỐNG PICHIA PASTORIS
PHẠM THỊ KIM TRÂM
Trang nhan đề
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ
Mở đầu
Chương_1: Tổng quan tài liệu
Chương_2: Vật liệu và phương pháp
Chương_3: Kết quả và biện luận
Chương_4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
MC LC
TRANG
MC LC . i
DANH MC CÁC KÝ HIEU VÀ CH VIÊT TAT iii
DANH MC CÁC BNG iv
DANH MC CÁC HÌNH VE . v
M ðÂU 1
Chương I TONG QUAN TÀI LIEU . 2
I.1. INTERFERON 2
I.1.1. Các dng Interferon . 2
I.1.2. Cơ chê hot ñong ca Interferon 4
I.1.3. Các ng dng ca Interferon . 6
I.1.4. Tình hình nghiên cu Interferon hien nay 8
I.2. HE THÔNG BIEU HIEN PICHIA PASTORIS 8
I.2.1. Các he thông bieu hien Interferon alpha 2b . 8
I.2.2. Ưu nhưc ñiem ca he thông bieu hien Pichia pastoris . 10
Chương II VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 12
II.1. VAT LIEU 12
II.1.1. Dng c và thiêt b 12
II.1.2. Hóa chât và môi trưng . 13
II.1.3. Nguyên vat lieu . 15
II.2. PHƯƠNG PHÁP . 20
II.2.1. Tách chiêt DNA ngưi tong sô bang Chelex 20
II.2.2. Phương pháp PCR (dùng ñe khuêch ñi ñon gene mc tiêu và kiem tra
khuan lc mang gene mc tiêu) 20
II.2.3. Phương pháp tinh sch DNA t gel agarose . 21
II.2.4. Phương pháp ñien biên np cho E. coli 21
II.2.5. Phương pháp cat DNA bang enzyme cat gii hn 22
II.2.6. Phương pháp nôi DNA bang enzyme T4 ligase 22
II.2.7. Phương pháp tách chiêt plasmid t tê bào E. coli . 23
II.2.8. Phương pháp ñien biên np cho Pichia pastoris . 23
II.2.9. Phương pháp lai khuan lc . 24
II.2.10. Phương pháp lên men Pichia pastoris 24
II.2.11. Phương pháp Bradford dùng ñe ño hàm lưng protein . 25
II.2.12. Phương pháp ñien di SDS-PAGE 25
II.2.13. Phương pháp Western blot . 27
Trang ii
Chương III KÊT QU VÀ BIEN LUAN . 28
III.1. TO DÒNG ESCHERICHIA COLI MANG GENE MÃ HÓA CHO
INTERFERON ALPHA 2B CA NGƯ I 28
III.1.1. Tong hp gene mã hóa cho Interferon alpha 2b ca ngưi . 28
III.1.2. To dòng Escherichia coli DH5α mang vector nhân dòng gene mã hóa
Interferon alpha 2b ca ngưi 30
III.2. TO DÒNG PICHIA PASTORIS BIEU HIEN INTERFERON ALPHA
2B CA NGƯ I . 34
III.2.1. To dòng Escherichia coli DH5α mang vector bieu hien Interferon alpha
2b ca ngưi 34
III.2.2. To dòng Pichia pastoris có kh" năng bieu hien Interferon alpha 2b ca
ngưi 37
III.3. BIEU HIEN INTERFERON ALPHA 2B CA NGƯ I . 38
Chương IV KÊT LUAN VÀ KIÊN NGH . 43
IV.1. Kêt luan 43
IV.2. Kiên ngh 43
TÀI LIEU THAM KHO . 44
16 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1945 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa interferon alpha 2B của người trên hệ thống pichia pastoris, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Chương III
KẾT QUẢ
VÀ
BIỆN LUẬN
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 28
III.1 TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI MANG GENE MÃ HÓA
CHO INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI
III.1.1. Tổng hợp gene mã hóa cho Interferon alpha 2b của người
Protein hIFN-α2b có kích thước 165 aa, trọng lượng khoảng 19,2 kDa. Gene
mã hóa cho hIFN-α2b nằm ở vị trí 9p22, là một gene không có intron. Chiều dài của
gene là 498 bp. Với mục tiêu là nhân dòng gene mã hóa hIFN-α2b, hai mồi chuyên
biệt ñược thiết kế tại hai ñầu của gene, với trình tự gốc lấy từ ngân hàng gene
(NM_000605.2). Mồi xuôi (IFN-F) bắt ñầu từ vị trí 138, kéo dài 31bp và ñược gắn
thêm trình tự cắt của EcoRI ở ñầu 5’ và mồi ngược (IFN-R2) bắt ñầu từ vị trí 632,
kéo dài 30 bp ñược gắn trình tự cắt của NotI. ðoạn gene mục tiêu sẽ ñược khuếch
ñại bằng phương pháp PCR (Hình 3.1).
Hình 3.1. Cơ chế khuếch ñại gene mã hóa hIFN-α2b bằng phương pháp PCR
Vì gene mã hóa hIFN-α2b chỉ bao gồm extron không có intron nên DNA bộ
gene ñược tách từ tế bào biểu bì má ñược trực tiếp sử dụng làm khuôn khuếch ñại
trình tự gene mã hóa cho hIFN-α2b trong phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt
IFN-F/IFN-R2. Sản phẩm khuếch ñại có kích thước mong muốn là 516bp tương
ứng với trình tự gene mã hóa cho hIFN-α2b có kích thước là 498bp và trình tự
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 29
enzyme cắt giới hạn có kích thước là 18bp. Sản phẩm PCR ñược tiến hành ñiện di
trên gel agarose 2% ñể kiểm tra. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR khuếch ñại ñoạn
gene hIFN-α2b (Hình 3.2) cho thấy ở giếng 1 xuất hiện 1 vạch có kích thước
khoảng 500bp so với thang chuẩn tương ñương với kích thước của gene mã hóa
hIFN-α2b trên lý thuyết, ñồng thời không xuất hiện ở ñối chứng âm là hỗn hợp PCR
không chứa bản mẫu (Giếng 2, Hình 3.2). Như vậy, ñoạn gene hIFN-α2b ñã ñược
khuếch ñại thành công bằng phương pháp PCR.
Hình 3.2. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% của sản phẩm PCR. M: thang
DNA 100 bp; 1: sản phẩm PCR; 2: chứng âm
Nhằm mục ñích thu nhận ñoạn DNA mục tiêu tinh sạch dùng cho các công
ñoạn tạo dòng tiếp theo, sản phẩm PCR ñược ñiện di và tinh chế vạch mục tiêu bằng
kit tinh sạch từ gel của Qiagen. Kết quả tinh sạch ñược tiến hành ñiện di DNA trên
gel agarose 2% ñể kiểm tra (Hình 3.3) cho thấy chỉ có duy nhất ñoạn DNA có kích
thước khoảng 500bp tương ứng với kích thước của gene hIFN-α2b như mong muốn
khi so với thang chuẩn (Giếng 1, Hình 3.3). Sản phẩm này ñược dùng ñể thực hiện
cho bước nhân dòng tiếp theo.
500
2 M 1
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 30
Hình 3.3. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% của sản phẩm PCR sau khi
ñược tinh sạch từ gel. M: thang DNA 100 bp; 1: sản phẩm tinh sạch
III.1.2. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector nhân dòng
gene mã hóa Interferon alpha 2b của người
ðoạn DNA mục tiêu sau khi tinh sạch ñược gắn chèn vào plasmid pJET1.2
(Fermentas). Plasmid tái tổ hợp ñược biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng
phương pháp ñiện biến nạp. ðể sàng lọc các chủng E. coli mang vector chứa gene
mã hóa hIFN-α2b, 20 khuẩn lạc mọc ñược trên môi trường LB có Amp 50µg/ml (kí
hiệu từ EJ1 ñến EJ20) ñược chọn ngẫu nhiên ñể làm mẫu thực hiện PCR khuẩn lạc
với cặp mồi pJET-F/pJET-R (Hình 3.4).
Kết quả ñiện di DNA sản phẩm PCR khuẩn lạc cho thấy có 4 chủng EJ4, EJ8,
EJ15, EJ16 (Giếng 4, 8, 15 và 16, Hình 3.5) cho vạch có kích thước khoảng 600bp
phù hợp với kích thước ñoạn gene hIFN-α2b khi khuếch ñại với cặp mồi pJET-
F/pJET-R. ðồng thời, ñối chứng âm không có bản mẫu (Giếng (-), Hình 3.5) của
phản ứng PCR khuẩn lạc không cho vạch. Dựa vào kết quả này có thể khẳng ñịnh 4
chủng EJ4, EJ8, EJ15 và EJ16 có mang ñoạn gene hIFN-α2b mục tiêu.
M 1
500
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 31
Hình 3.4. Cơ chế kiểm tra sự hiện diện của ñoạn gene mục tiêu trong plasmid
pJET1.2 tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với cặp mồi pJET-F/pJET-R
Hình 3.5. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% sản phẩm PCR khuẩn lạc. M: thang DNA
100 bp; 1-20: sản phẩm PCR khuẩn lạc từ các khuẩn lạc trắng lấy ngẫu nhiên theo thứ
tự từ EJ1 ñến EJ20; (-): Chứng âm
Bốn chủng dự tuyển ñược tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra plasmid tái
tổ hợp bằng phản ứng cắt với cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI/NotI (Hình 3.6). Kết
quả ñiện di DNA sản phẩm cắt cho thấy, ở các giếng 1, 2, 3 và 4 là sản phẩm cắt
của plasmid tách chiết từ các chủng EJ4, EJ8, EJ15 và EJ16 với hai enzyme trên
ñều cho hai vạch có kích thước lần lượt là khoảng 500bp và khoảng 3kb tương ứng
với kích thước ñoạn gene hIFN-α2b và kích thước của plasmid pJET1.2 khi mở
vòng ñược dự ñoán trên lý thuyết.
634bp
118bp
pJET-F pJET-R
Trước khi chèn ñoạn
gene hIFN-α2b
plasmid pJET1.2
ðoạn gene hIFN α2b
pJET-F pJET-R
Sau khi chèn ñoạn
gene hIFN-α2b pJET1.2 pJET1.2
plasmid pJET1.2
ðoạn gene hIFN α2b
600
X X X X
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 () M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 32
Hình3.6. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% của sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn
plasmid pJET1.2 tái tổ hợp bằng EcoRI và NotI. M: thang DNA 100 bp; 1-4: sản phẩm
cắt plasmid tách từ 4 chủng tương ứng EJ4, EJ8, EJ15, EJ16
Bên cạch ñó, nhằm xác ñịnh trình tự chính xác của ñoạn gene hIFN-α2b thu
nhận, plasmid pJET1.2 mang gene mã hóa hIFN-α2b ñã kiểm tra ñược tiến hành gửi
giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy, chủng EJ15 mang plasmid pJET1.2
chứa ñoạn gene hIFN-α2b có trình tự tương ñồng 100% với trình tự gene mã hóa
cho hIFN-α2b trên Ngân hàng Gene (Hình 3.7).
Như vậy, chúng tôi ñã tạo và nhân dòng ñược gene mã hóa cho hIFN-α2b của
người trong tế bào E. coli DH5α.
M 1 2 3 4
500
500
M 1 2 3 4
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 33
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự giữa gene hIFN-α2b từ chủng EJ15 (IFNsyn) và gene hIFN-α2b từ ngân hàng gene
(NM_000605.2)
Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 34
III.2. TẠO DÒNG PICHIA PASTORIS BIỂU HIỆN INTERFERON
ALPHA 2B CỦA NGƯỜI
III.2.1. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector biểu hiện
Interferon alpha 2b của người
Gene mã hóa cho hIFN-α2b ñược thu nhận từ vector nhân dòng pJET1.2 bằng
phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn EcoRI và NotI. Sản phẩm cắt ñược ñiện di và
tinh chế từ gel agarose ñể tiến hành thu nhận gene chuẩn bị cho giai ñoạn gắn chèn
vào vector biểu hiện pPIC9K. Kết quả thu nhận gene kiểm tra trên gel agarose
(Hình 3.8) cho thấy ở giếng 1 xuất hiện một vạch có kích thước tương ứng với kích
thước gene hIFN-α2b vào khoảng 500bp. ðồng thời plasmid pPIC9K cũng ñược cắt
bằng hai enzyme trên. Sản phẩm cắt sau khi tinh sạch ñược ñiện di trên gel agarose
(Giếng 2, Hình 3.8) cho một vạch có kích thước khoảng 9.3kb tương ứng với kích
thước pPIC9K ñã mở vòng bằng hai enzyme trên.
Hình 3.8. Kết quả ñiện di trên gel agarose 1% sản phẩm tinh sạch từ gel ñoạn gene
hIFN-α2b và plasmid pPIC9K sau khi ñược cắt bằng cặp enzyme EcoRI/NotI. M:
thang DNA 100bp; 1: sản phẩm tinh sạch từ gel của ñoạn gene hIFN-α2b; 2: sản
phẩm tinh sạch từ gel của plasmid pPIC9K
M 1 2
500
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 35
Plasmid pPIC9K ñã mở vòng ñược nối với ñoạn gene hIFN-α2b ñã qua xử lý
với cặp enzyme EcoRI/NotI bằng T4 ligase. (Hình 3.9). Sản phẩm nối ñược chuyển
vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp ñiện biến nạp.
Chỉ có những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp mang ñoạn
gene kháng Amp mới có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường LB có chứa Amp
(50µg/ml). Các khuẩn lạc dự tuyển (EP1, EP2, EP3, EP4, và EP5) ñược tiến hành
kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi chuyên biệt cho gene mã
hóa hIFN-α2b (IFN-F và IFN-R2) (Hình 3.10) và bằng phản ứng cắt giới hạn với 2
enzyme EcoRI và NotI (Hình 3.11).
Kết quả ñiện di sản phẩm PCR khuẩn lạc (Hình 3.10) cho thấy cả 5 chủng ñều
cho sản phẩm có kích thước khoảng 500bp tương ứng với kích thước ñoạn gene
hIFN-α2b, trong khi chứng âm (Giếng 2, Hình 3.10) không xuất hiện vạch, chứng
tỏ, cả 5 chủng này ñều có mang ñoạn gene chèn. Kết quả kiểm tra chủng EP3 bằng
phản ứng cắt giới hạn với cặp enzyme EcoRI/NotI (Hình 3.11) cho thấy ở giếng 1
có 1 vạch có kích thước khoảng 500bp tương ứng với kích thước của ñoạn gene
hIFN-α2b và 1 vạch có kích thước khoảng 9.3kb tương ứng với kích thước của
plasmid pPIC9K khi mở vòng. Như vậy, chủng EP3 là chủng tế bào E. coli DH5α
mang plasmid pPIC9K có chứa gen mã hóa hIFN-α2b.
Hình 3.9. Cấu trúc vector biểu hiện có mang gene mã hóa cho hIFN-α2b
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 36
Hình 3.10. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% sản phẩm PCR khuẩn lạc với
mồi IFN-F và IFN-R2. M: thang DNA 100 bp; 1, 3, 4, 5, 6: sản phẩm PCR từ
khuẩn lạc EP1, EP2, EP3, EP4, EP5 lấy ngẫu nhiên; 2: chứng âm
Hình 3.11. Kết quả ñiện di trên gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid bằng
EcoRI và NotI. 1: sản phẩm cắt từ plasmid lấy từ chủng EP3. 2: sản phẩm
cắt từ plasmid pPIC9K không mang gene. M: thang DNA 1kb
1 2 3 M 4 5 6
500bp
1 2 M
500
516
10000
9300
E
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 37
III.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris có khả năng biểu hiện Interferon
alpha 2b của người
Plasmid pPIC9K mang gene mã hóa cho hIFN-α2b ñã qua kiểm tra ñược xử lý
bằng enzyme cắt giới hạn SalI ñể tăng khả năng trao ñổi chéo giữa plasmid và bộ
gene của tế bào nấm men, cũng như ñể tạo ñược chủng Pichia pastoris tái tổ hợp
dạng Mut+. Plasmid pPIC9K dạng thẳng ñược chuyển vào tế bào Pichia pastoris
GS115 bằng phương pháp ñiện biến nạp. Trong tế bào, do có sự tương ñồng giữa
trình tự gene mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ gene của tế bào và trên
plasmid nên xảy ra trao ñổi chéo, dẫn ñến việc gene mục tiêu từ plasmid ñược
chuyển vào trong bộ gene của tế bào (Hình 3.12). Nhờ vậy, gene mục tiêu tồn tại ổn
ñịnh trong tế bào.
Hình 3.12. Cơ chế trao ñổi chéo xảy ra tại locus his4 giữa bộ gene của tế bào với vector
biểu hiện
Tế bào có mang gene mã hóa cho hIFN-α2b sẽ mọc ñược trên môi trường
YPD có kháng sinh G418 (4mg/ml). Kết quả nhóm thu nhận ñược 27 khuẩn lạc
(ñược ñặt tên từ P1 ñến P27). 27 chủng này ñược chuyển sang môi trường MM có
methanol là chất ñể cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu và ñược kiểm tra khả năng
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 38
biểu hiện hIFN-α2b bằng phương pháp lai khuẩn lạc với kháng thể ñơn dòng kháng
hIFN-α2b. Khuẩn lạc có khả năng biểu hiện ñược hIFN-α2b sẽ hiện màu trên màng
lai. Kết quả hiện màu cho thấy có 23 khuẩn lạc cho tín hiệu dương tính trên màng
lai và 5 khuẩn lạc không cho tín hiệu (Hình 3.13). Như vậy, trong 27 chủng thu
nhận ñược có 23 chủng có khả năng biểu hiện hIFN-α2b.
Hình 3.13. Kết quả lai khuẩn lạc, có 23 khuẩn lạc cho kết quả dương tính
khi lai với kháng thể kháng hIFN-α2b
III.3. BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI
Căn cứ sơ bộ trên kết quả lai khuẩn lạc, chủng P9 ñược chọn ñể tiến hành lên
men trong ñiều kiện nuôi cấy lắc ñể kiểm tra mức ñộ biểu hiện hIFN-α2b.
ðiều kiện lên men ñược thiết lập theo ñiều kiện nuôi cấy chuẩn cho Pichia
pastoris là pH 6.0, nhiệt ñộ tăng sinh và nhiệt ñộ cảm ứng là 28oC, thời gian nuôi
cấy là 96 giờ và nồng ñộ methanol cảm ứng là 0.5% ñược thêm vào sau mỗi 24 giờ.
Kết quả phân tích dịch môi trường sau lên men bằng SDS-PAGE cho thấy tại các
thời ñiểm cảm ứng là 72 giờ và 96 giờ (Giếng 2, 3, Hình 3.14-A) ñều có xuất hiện
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 39
vạch protein có kích thước tương ứng với kích thước của hIFN-α2b (19.2 kDa),
ñồng thời ở ñối chứng âm là dịch môi trường tại thời ñiểm 0 giờ (Giếng 1, Hình
3.14 - A) không xuất hiện vạch protein này. Như vậy kết quả cho thấy chủng P9 có
khả năng biểu hiện protein có kích thước 19.2 kDa tương ứng với kích thước của
hIFN-α2b khi có sự cảm ứng biểu hiện của MeOH.
Nhằm xác nhận protein có kích thước 19.2 kDa ñược ghi nhận trên SDS-
PAGE là hIFN-α2b, các mẫu tương ứng ñược tiến hành lai Western blot với kháng
thể ñơn dòng kháng hIFN-α2b. Kết quả hiện màu (Hình 3.14 - B) cho thấy xuất
hiện tín hiệu dương tính tại vị trí tương ứng với vạch protein có kích thước 19.2
kDa ñã ghi nhận trên SDS-PAGE. Như vậy, có thể kết luận chủng P9 có khả năng
biểu hiện protein hIFN-α2b ở dạng tan tiết vào môi trường.
Tuy nhiên, kết quả phân tích bằng SDS-PAGE cũng cho thấy hàm lượng
hIFN-α2b ñược biểu hiện từ chủng P9 chưa cao. Mặt khác, dịch môi trường sau cảm
ứng lại có nhiều protein tạp với hàm lượng cao hơn rất nhiều so với hIFN-α2b mục
tiêu.
Hình 3.14. Kết quả ñánh giá hàm lượng hIFN-α2b ñược biểu hiện ở ñiều kiện nuôi cấy
chuẩn cho Pichia pastoris bằng SDS-PAGE (A) và Western blot (B). M: thang protein
thường (97.4, 66.2, 45, 31, 21.5, và 14.4 (kDal) ); Giếng 1-3 tương ứng dịch nổi thu sau
0 giờ, 72 giờ, 96 giờ cảm ứng biểu hiện;
M 1 2 3 1 2 3
97.4
66.2
45.0
31.0
21.5
14.4
A B
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 40
Phân tích trên kết quả SDS-PAGE cho thấy, các protein tạp này giống nhau
giữa các mẫu trước và sau biểu hiện, nên có thể ñây là các protein của tế bào nấm
men tiết ra trong quá trình sinh trưởng của chúng. Vì vậy, ñể tối ưu hóa sự cảm ứng
biểu hiện hIFN-α2b tiết vào môi trường, ñiều kiện nuôi cấy và cảm ứng cần ñược
thay ñổi. Trong các ñiều kiện nuôi cấy, nhiệt ñộ cảm ứng và pH là hai yếu tố có thể
kiểm soát ñược, nhưng pH 6.0 theo các nghiên cứu trước cho thấy là tối ưu cho biểu
hiện protein ở nấm men, vì vậy, nhiệt ñộ cảm ứng là yếu tố ñược thay ñổi, cụ thể là
từ 28oC xuống còn 20oC. Bên cạnh ñó, nồng ñộ MeOH cũng ñược tăng từ 0.5% lên
1% theo các tài liệu tham khảo [1], [6]. Dịch môi trường sau khi nuôi cấy cảm ứng
ñược tiến hành ño nồng ñộ protein tổng bằng phương pháp Bradford cho thấy hàm
lượng protein tổng thu nhận là 297µg/ml. Kết quả ñiện di dịch môi trường sau khi
nuôi cấy cảm ứng (Hình 3.15) cho thấy mẫu thu nhận tại các thời ñiểm cảm ứng là
24, 48, 72, 96 và 104 giờ (Giếng 2-6, Hình 3.15) ñều có xuất hiện vạch protein
hIFN-α2b với hàm lượng tăng dần theo thời gian cảm ứng. ðồng thời ở mẫu chứng
âm tại thời ñiểm 0 giờ (Giếng 1, Hình 3.15) không xuất hiện vạch protein này. Bên
cạnh ñó, tại các thời ñiểm 72 giờ (Giếng 4, Hình 3.15) cho thấy lượng protein
hIFN-α2b ñược biểu hiện nhiều nhất ở cùng một lượng mẫu ñiện di.
Hình 3.15. Kết quả ñánh giá hàm lượng hIFN-α2b ñược biểu hiện ở ñiều kiện nuôi cấy
cải tiến cho Pichia pastoris bằng SDS-PAGE. (M) thang protein của Biolab; 1-6 tương
ứng dịch nổi thu sau 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 104 giờ cảm ứng biểu hiện;
Vạch protein có kích
thước tương ứng với
hIFN-α2b
1 2 3 4 5 6 M
175
80
58
46
30
23
17
7
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 41
Tuy nhiên ñể khẳng ñịnh phần lớn protein ñược ghi nhận trên SDS-PAGE
(Hình 3.15) là hIFN-α2b, các mẫu tương ứng ñược tiến hành lai Western blot với
kháng thể ñơn dòng kháng hIFN-α2b. Sự hiện diện của hIFN-α2b ñược ghi nhận
bằng vạch màu trên màng lai. Kết quả hiện màu của phản ứng lai Western blot cho
thấy, mẫu dịch môi trường tại các thời ñiểm 24, 48, 72, 96 và 104 giờ sau khi cảm
ứng (Giếng 2, 3, 4, 5, Hình 3.16) ñều cho kết quả dương tính tại vị trí của các vạch
protein ñược ghi nhận trên SDS-PAGE có kích thước tương ứng với hIFN-α2b,
trong khi ñó chứng âm là dịch môi trường khi chưa cảm ứng (Giếng 1, Hình 3.16)
không cho tín hiệu trên màng lai. Bên cạnh ñó, mức ñộ hiện màu tại thời ñiểm 72
giờ là cao nhất, tương ứng với kết quả SDS-PAGE là vạch protein rõ nhất. ðiều này
cho thấy có sự hiện diện của hIFN-α2b trong các dịch môi trường sau cảm ứng và
tại thời ñiểm 72 giờ lượng protein ñích thu nhận ñược cao nhất. Như vậy, giai ñoạn
cảm ứng biểu hiện hIFN-α2b có thể dừng lại sau 72 giờ cảm ứng thay vì 96 giờ theo
ñiều kiện chuẩn.
Hình 3.16. Kết quả ñánh giá protein ñược biểu hiện bằng Western blot; 1-6: dịch
nổi thu sau 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 104 giờ cảm ứng biểu hiện;
Kết quả SDS-PAGE và Western blot cho thấy có sự hiện diện của hIFN-α2b
trong dịch môi trường sau lên men và là protein ñược biểu hiện chủ yếu, vượt trội
1 2 3 4 5 6
hIFN-α2b
Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 42
so với các protein khác. Như vậy, ñiều kiện này cho phép biểu hiện tốt hIFN-α2b, ít
lẫn protein tạp hơn trong môi trường bởi chủng P9.