Luận văn Thử nghiệm điều chế Auto-Vaccine phõng bệnh tiêu chảy do E. Coli trên heo sau cai sữa

,025mg/100ml, dễ biến tính khi xử lý bằng nhiệt ở 560C/30 phút. IgE có khả năng hoạt hóa đại thực bào và bạch cầu ái toan, tăng cƣờng thực bào hay tăng cƣờng độc tính của bạch cầu trung tính đối với giun sán. IgE có ít trong huyết thanh và dễ bị phân huỷ. IgE đóng vai trò trung gian trong phản ứng quá mẫn, trực tiếp gây ra những triệu chứng nhƣ sốt mùa hè, hen suyễn, sốt phát ban, và shock quá mẫn.  Sự hình thành kháng thể: nhờ phƣơng pháp đánh dấu kháng thể bằng đồng vị phóng xạ hay chất huỳnh quang, ngƣời ta thấy các kháng thể đƣợc tổng hợp ở tủy đỏ và ở các nang của lách, ở các nang và dây tuỷ của các hạch bạch huyết, ở tuỷ xƣơng, mảng Peyer và những tổ chức lympho khắp cơ thể (phổi, gan…). Một trong những tổ chức quan trọng nhất tham gia vào việc tổng hợp kháng thể là “trung tâm mầm” của lách và hạch bạch huyết. Trung tâm mầm xuất phát từ những “clone” là những tế bào gốc ở tuỷ xƣơng. Ban đầu khi chƣa tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” ở trạng thái “ngủ”, khi tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” bị kích thích và hoạt hoá để tạo ra những tế bào đáp ứng miễn dịch (các lympho bào B và T). Lympho bào B sẽ sản sinh ra dòng lympho B nhớ và tƣơng bào. Tƣơng bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể. Nhƣ vậy, tế bào B và “con cháu” của chúng hoạt động theo từng “clone”: chúng biệt hoá, tăng sinh và trƣởng thành theo sự đáp ứng miễn dịch. Trong các tình thế khác nhau, mức độ khác nhau, sự tổng hợp kháng thể phụ thuộc vào tế bào T: nhƣ sự tổng hợp IgE, IgG phụ thuộc rất nhiều vào tế bào T 16 (Ishisaka Bankhurst và cộng sự, 1973). Còn các kháng thể IgM, IgA ít hoặc không phụ thuộc vào tế bào T. Kháng thể đƣợc tổng hợp trong các polyribosome trong tƣơng bào. Các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể đƣợc tổng hợp riêng sau đó chúng kết hợp với nhau ngay trong polyribosome tạo ra 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ. Ngay sau khi các chuỗi globulin miễn dịch đã hình thành xong thì các đƣờng hydratecacbon sẽ liên kết với nhau và kháng thể ra khỏi tƣơng bào. 2.4. Auto-vaccine 2.4.1. Định nghĩa vaccine Vaccine là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có khả năng tạo cho cơ thể đáp ứng miễn dịch, đƣợc dùng với mục đích phòng bệnh hoặc với mục đích khác. 2.4.2. Phân loại vaccine 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) Sử dụng virus hoặc vi khuẩn sống đã đƣợc xử lý để giảm tính độc. Ví dụ: vaccine sabin chống bại liệt, vaccine sởi, vaccine quai bị. 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) Vi khuẩn hay virus đƣợc giết chết bằng phƣơng pháp vật lý (nhiệt độ cao, bức xạ, tia cực tím…) hay hoá học (formaldehyde, ethylen imine…). Ví dụ: vaccine salk chống bại liệt dạng tiêm, vaccine dại. Vaccine bất hoạt an toàn hơn vaccine sống nhƣng có hiệu lực miễn dịch yếu hơn. Ngƣời ta thƣờng trộn với chất bổ trợ nhằm tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch. 17 2.4.2.3. Các "toxoid” Là các hợp chất độc bất hoạt đƣợc trích từ các vi sinh vật (trong trƣờng hợp chính các độc chất này là phƣơng tiện gây bệnh của vi sinh vật). Chúng đƣợc tiêm cho vật chủ khác (nhƣ ngựa) để tạo kháng thể, rồi chiết lấy kháng thể này để chữa bệnh. Ví dụ: các huyết thanh ngừa uốn ván và bạch hầu. 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) i. Vaccine tái tổ hợp: gen mã hoá kháng nguyên đƣợc chuyển nạp vào genome của tế bào nấm men, tế bào vi khuẩn hoặc tế bào động vật thích hợp để tạo ra nhiều kháng nguyên tinh khiết nhờ phƣơng thức nhân bản. Quá trình chuyển nạp gen mã hoá kháng nguyên đƣợc thực hiện qua yếu tố trung gian plasmid. ii. Sử dụng protein tinh sạch hay glycoprotein của virus. 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu i. Vaccine DNA trần (naked DNA vaccine): gen mã hoá cho một kháng nguyên của tác nhân gây bệnh cũng có thể tách rời rồi đƣa vào vật chủ thông qua vectơ là plasmid hay virus. ii. Vaccine peptide: trên đó có epitope bảo vệ. Peptid có thể liên kết với một protein tải để tăng tính phụ thuộc tế bào lympho T. iii. Vaccine liên kết: chất polysaccharid liên kết với protein có phân tử lƣợng cao để tiếp cận dễ dàng với tế bào lympho T. Ví dụ: virosomes … iv. Vaccine khảm hay vaccine lai ghép (hydrid vaccine): là kết quả của sự kết hợp kĩ thuật tái tổ hợp và kĩ thuật di truyền sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tƣợng "phản tác dụng". Chủng vi sinh vật vaccine đƣợc cấy ghép gen mã hoá kháng nguyên lấy từ vi sinh vật gây bệnh. Vi sinh vật đƣợc cấy ghép là vi sinh vật vectơ. Ví dụ: dùng virus Vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại. Vaccine lai ghép một lúc kích thích cơ thể tạo ra hai đáp ứng miễn dịch là đáp ứng bảo vệ đối với vi sinh vật gây bệnh (virus viêm gan B hay virus dại) và đáp ứng đối với vi sinh vật vectơ (Vaccinia). 18 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine Auto-vaccine là vaccine mang mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) của vật chủ hay vùng dịch nào đó và đƣợc sử dụng để chủng ngừa cho chính vật chủ hay vùng dịch đó. 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vaccine Việc đầu tiên trong quy trình sản xuất auto-vaccine là cần phân lập mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) từ mô bệnh hoặc dịch chiết của vật chủ mang bệnh. Tiếp theo, mầm bệnh sẽ đƣợc làm chết hoặc làm yếu bởi các tác nhân hóa học, nhiệt, điện hay phóng xạ… Sau cùng kháng nguyên đƣợc tinh sạch và bổ sung một số chất cần thiết để thành phẩm auto-vaccine. 2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto- vaccine 2.4.5.1. Ƣu điểm Là giải pháp phòng ngừa nhanh chóng trong trƣờng hợp không có vaccine hay với những bệnh hiếm gặp. Hạn chế sử dụng những chủng không cần thiết trong vaccine khi tiêm phòng cho vật chủ. Có tính đặc hiệu cao vì tạo miễn dịch chuyên biệt. Phƣơng pháp hiệu quả chống lại vi khuẩn có tính kháng rộng. Phƣơng pháp phòng ngừa hữu hiệu đối với virus biến chủng nhanh hay vi khuẩn kháng kháng sinh nhanh. Có thể đƣợc sử dụng để phòng ngừa những tác nhân gây bệnh ở dạng phân tử (nhƣ prion…) 2.4.5.2. Nhƣợc điểm Quy trình sản xuất auto-vaccine rất khó khăn vì cần phải tinh sạch kháng nguyên. 19 Hạn chế trong việc sử dụng rộng rãi, chỉ đƣợc sử dụng tại nơi mà mầm bệnh đƣợc phân lập để sản xuất auto-vaccine. Chi phí sản xuất cao, giá thành phẩm cao. Khó để thƣơng mại hóa auto-vaccine thành phẩm. 2.5. Chất bổ trợ Ngày nay các hãng sản xuất vaccine luôn bổ sung chất bổ trợ vào sản phẩm của mình. Sử dụng chất bổ trợ nào để đem lại hiệu quả cho vaccine là bí quyết riêng của mỗi công ty. Vậy chất bổ trợ là gì? Chúng có những tác dụng gì để nâng cao hiệu quả của vaccine? 2.5.1. Định nghĩa chất bổ trợ Chất bổ trợ là một tác nhân đƣợc bổ sung vào vaccine có tác dụng tăng cƣờng kích thích hệ miễn dịch, tạo nên sự đáp ứng với vaccine mạnh và dài hơn, qua đó nâng cao hiệu quả của vaccine. Một trong những chất bổ trợ đƣợc sử dụng nhiều và sớm trong vaccine, đặc biệt là vaccine cho ngƣời, là muối nhôm. Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy chất bổ trợ nhôm là nguyên nhân gây chết các neuron vận động sau khi tiêm. Một số chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong vaccine thú y và tác dụng của chúng:  Muối nhôm: kéo dài sự biểu hiện của kháng nguyên.  Yếu tố bề mặt (saponin, lysolecithin…): hoạt hóa sự biểu hiện của kháng nguyên.  Nhũ dầu: kéo dài sự biểu hiện kháng nguyên.  Thành phần cấu tạo của vi khuẩn: hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho.  Phức hợp carbonhydrate: hoạt hóa đại thực bào. 20 2.5.2. Tác dụng của chất bổ trợ  Chất bổ trợ giúp kháng nguyên di chuyển đến các hạch lympho, tại đây chúng đƣợc các tế bào lympho T nhận diện. Nhờ vậy mà có nhiều tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa để tham gia tạo kháng thể.  Chất bổ trợ nhƣ một tác nhân bảo vệ vật lý giúp kháng nguyên kéo dài sự biểu hiện bên trong cơ thể đƣợc tiêm vaccine. Qua đó hệ miễn dịch có thêm thời gian để tăng cƣờng điều chỉnh tế bào lympho T và B.  Chất bổ trợ giúp tăng sức chịu đựng tại nơi tiêm, giải tỏa những phản ứng phụ nguy hiểm.  Chất bổ trợ không chỉ tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. 2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong đề tài này) Montanide đƣợc sản xuất bởi công ty SEPPIC (trụ sở chính công ty tại Paris, nƣớc Pháp), là chất bổ trợ tăng cƣờng tính hiệu quả và sự ổn định của vaccine, ngoài ra nó còn làm giảm những phản ứng phụ trên cơ thể đƣợc tiêm vaccine và rất dễ sử dụng. Montanide đƣợc sử dụng rộng rãi cho các vaccine thƣơng phẩm trên nhiều loài nhƣ heo, bò, cá… và chỉ đƣợc sử dụng trong thú y. Đặc điểm Montanide:  Dạng dung dịch dầu hỗn hợp Anhydro mannitol ether octodecenoate.  pH: 5 - 7  Không mùi, có màu vàng.  Điểm sôi: > 100oC.  Điểm bốc cháy: > 100oC.  Không tự bốc cháy, không tự nổ.  Không hòa tan trong nƣớc, hòa tan trong các dung môi.  Lƣu trữ: cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh. 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian: 4 tháng 3.1.2. Địa điểm - Phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi - Thú Y, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM. - Trại heo tƣ nhân ở Bình Dƣơng. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Heo con từ 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi chƣa tiêm vaccine phòng tiêu chảy do E. coli hoặc chƣa tiến hành điều trị kháng sinh. Số lƣợng : 16 bầy heo con. 3.2.2. Vật liệu và thiết bị Mẫu phân đƣợc lấy từ những heo trong trại có biểu hiện tiêu chảy. 54 mẫu huyết thanh heo con thí nghiệm. 22 Nƣớc muối sinh lý. Môi trƣờng phân lập và thử sinh hóa vi khuẩn E. coli: EMB, KIA, TSA, TSB, môi trƣờng và thuốc thử các phản ứng IMViC. Bộ kít huyết thanh chuẩn để định type đối với vi khuẩn E. coli (F4, F5, F6). Chất bổ trợ Montanide Dung dịch formol 0,3% dùng để bất hoạt vi khuẩn. Tăm bông tiệt trùng, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi, tủ ấm, tủ lạnh, nhiệt kế, cylindre, máy hấp autoclave... 3.3. Nội dung - Sản xuất auto-vaccine trong phòng thí nghiệm. - Đánh giá hiệu quả của auto-vaccine trên heo con thí nghiệm. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Chọn những heo có dấu hiệu tiêu chảy, chƣa sử dụng kháng sinh. Đầu tiên, dùng bông gòn thấm cồn để sát trùng hậu môn, tiếp theo sử dụng tampon tiệt trùng đƣa vào trong trực tràng khoảng 3cm, ngoáy một đến hai vòng rồi cắm sâu tampon vào giữa ống nghiệm có chứa nƣớc muối sinh lý, đậy nút bông vào cẩn thận. Mẫu đƣợc bảo quản ở 0-4oC trong thùng đá sau đó đem về phòng xét nghiệm để phân lập. Hình 3.1. Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con 23 3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật 3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập Sử dụng môi trƣờng chuyên biệt EMB (Eosin Methylen Blue). Thực hiện phân lập vi khuẩn trực tiếp từ mẫu sang môi trƣờng chuyên biệt EMB trên đĩa petri bằng que cấy vòng. Sau đó đem ủ đĩa EMB đã đƣợc cấy vi khuẩn trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC, 24 giờ. Vi khuẩn E. coli trong môi trƣờng EMB cho khuẩn lạc đƣờng kính khoảng 1- 2mm, màu tím ánh kim, có vùng sậm đục ở giữa khuẩn lạc. Để bắt E. coli, chúng tôi chỉ chọn khuẩn lạc từ những đĩa có trên 2/3 số khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli. 3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa Từ những khuẩn lạc đặc trƣng của E. coli trên môi trƣờng EMB (hơi dẹt, bóng, nhỏ, tím ánh kim, không nhô cao lên thạch), chúng tôi sẽ chọn 3 - 5 khuẩn lạc để cấy chuyển sang môi trƣờng KIA (Kliger Iron Agar), ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ. Vi khuẩn E. coli lên men đƣờng glucose và lactose có sinh hơi. Hình 3.2. Phân lập E. coli trên môi trƣờng EMB Chỉ chọn khuẩn lạc của mẫu A Không chọn khuẩn lạc của mẫu B Khuẩn lạc nghi ngờ E. coli 24 Kết quả trên môi trƣờng KIA của vi khuẩn E. coli là cả phần nghiêng và phần đứng của môi trƣờng đều có màu vàng, có hơi. Từ môi trƣờng KIA, vi khuẩn đƣợc cấy truyền sang môi trƣờng TSA (Tryptone Soya Agar) ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ để nhuộm Gram và thực hiện các phản ứng sinh hóa, phản ứng huyết thanh học. i. Nhuộm Gram: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc nhuộm Gram. Kết quả: E. coli có màu hồng Gram âm. Hình 3.4. Vi khuẩn E. coli hình que, màu hồng Gram âm Hình 3.3. Vi khuẩn E. coli lên men đƣờng sinh hơi trong môi trƣờng KIA 25 ii. Xác định phản ứng sinh hóa: E. coli cho kết quả nghiệm pháp IMViC là ++-- a. Phản ứng Indol: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào các ống môi trƣờng canh tryptone, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử Kovacs’ để thực hiện phản ứng Indol. Kết quả: E. coli cho phản ứng dƣơng tính có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng. b. Phản ứng Methyl Red: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi trƣờng canh Clark-Lubs, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử Methyl Red để thực hiện phản ứng. Kết quả: E. coli có phản ứng dƣơng tính dịch nuôi cấy màu đỏ. Hình 3.5. Phản ứng Indol Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red 26 c. Phản ứng Voges Proskauer: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi canh trƣờng Clark-Lubs, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử là α-naphtol và KOH 40% để thực hiện phản ứng. Kết quả: E. coli có phản ứng âm tính môi trƣờng không có màu đỏ hồng. d. Phản ứng Citrate: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi trƣờng thạch nghiêng SCA (Simmons Citrate Agar), ủ 24 giờ. Kết quả: E. coli có phản ứng âm tính giữ nguyên màu lục môi trƣờng. Hình 3.7. Phản ứng Voges Proskauer Hình 3.8. Phản ứng Citrate 27 iii. Phản ứng huyết thanh học định type kháng nguyên của vi khuẩn E. coli: bằng phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh của các type F4, F5, F6. Tiến hành: sử dụng lame sạch, nhỏ lên lame 10µl kháng huyết thanh và 10µl nƣớc muối sinh lý bên cạnh. Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn trong ống TSA, trộn vào giọt nƣớc muối sinh lý, trộn đều rồi hòa kháng huyết thanh và vi khuẩn với nhau. Kết quả của phản ứng ngƣng kết đƣợc đọc trong vòng 30 giây sau khi vi khuẩn và kháng huyết thanh đã đƣợc trộn lẫn.Trong trƣờng hợp vi khuẩn có kháng nguyên phù hợp với kháng thể có trong kháng huyết thanh, trong huyễn dịch sẽ hình thành nên các hạt ngƣng kết lớn, màu trắng đục, nhìn thấy rất rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính. Nếu huyễn dịch vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản ứng đƣợc đọc là âm tính (Diagnostic Pasteur Manual. 3e ed). Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập và định danh vi khuẩn E. coli (Nguyễn Ngọc Hải, 1999) Mẫu phân Nhuộm Gram EMB KIA TSA Thử phản ứng ngưng kết Thử phản ứng sinh hóa 28 3.4.3. Điều chế auto-vaccin Việc chọn lựa kháng nguyên sẽ theo các tiêu chí Vi khuẩn phải có đầy đủ các tính chất về hình dạng khuẩn lạc, màu sắc nhuộm gram, các phản ứng sinh hóa, lên men đƣờng,… nhƣ đã đề cập ở trên. Chủng tuyển chọn đƣợc phân lập từ các heo khác nhau. Chủng định đƣợc type kháng nguyên (F4, F5 hoặc F6), có kết quả ngƣng kết rõ ràng. Sau khi nhuộm Gram, thực hiện phản ứng sinh hóa và phản ứng huyết thanh định type, chúng tôi chọn ra 5 chủng E. coli cho kết quả phản ứng định type rõ nhất. 5 chủng này đƣợc nuôi cấy tăng sinh trong môi trƣờng canh TSB, trong 5 bình thủy tinh khác nhau, có lắc đảo trong quá trình tăng sinh. Sau 24 giờ nuôi tăng sinh, chúng tôi trộn lẫn dịch nuôi ở 5 bình để đếm số lƣợng, xử lý làm chết vi khuẩn và li tâm rửa. Sau lần ly tâm cuối cùng, vi khuẩn đƣợc hòa vào một thể tích nƣớc muối sinh lý thích hợp để đạt nồng độ 2.109 tế bào/ml. Chuẩn bị auto-vaccine: dịch vi khuẩn có nồng độ 2.109 tế bào/ml đƣợc cho vào các flacon đã tiệt trùng, sau đó cho chất bổ trợ Montanide vào (theo tỷ lệ 50 chất bổ trợ và 50 dịch vi khuẩn). Bảo quản các flacon vaccine này ở 00C - 40C. 29 5 chủng E. coli đƣợc chọn lọc Môi trƣờng canh TSB Li tâm bỏ dịch nổi 4000 vòng/phút trong 15 phút. 2 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý Hòa trong nƣớc muối chứa 0,3% formalin Hòa trong nƣớc muối sinh lý, điều chỉnh để đạt nồng độ 2.10 9 tế bào/ml Sơ đồ 3.2. Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo Ørskov, 1977) Đếm số lƣợng trên môi trƣờng EMB Ủ qua đêm ở 40C Làm chết vi khuẩn Ủ 370C, 24 giờ Rửa trong 10ml nƣớc muối sinh lí. Thu dịch rửa. 3 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý 30 3.4.4. Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine Vaccine đƣợc kiểm tra trên các môi trƣờng: thạch máu, thạch thƣờng, thạch nuôi cấy nấm, nƣớc thịt đƣờng, nƣớc thịt yếm khí. Lắc kĩ lọ chứa vaccine trƣớc khi lấy, hút 0,1ml cho vào mỗi môi trƣờng. Mỗi loại môi trƣờng dùng hai ống. Sau đó đem ủ ấm 37oC, riêng môi trƣờng nấm ủ ở nhiệt độ phòng để kiểm tra kết quả. Đọc kết quả sau 7 ngày nuôi cấy. Vaccine đƣợc xem là vô trùng khi tất cả ống của các loại môi trƣờng nuôi cấy không mọc bất kì loại sinh vật nào. Nếu có mặt của vi sinh vật phải kiểm tra đợt 2 và xác định kết quả. 3.4.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto – vaccine 3.4.5.1. Yếu tố thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố (số lần tiêm) với 2 mức độ : tiêm 1 lần vào lúc bắt đầu thí nghiệm (14 – 20 ngày tuổi) và tiêm 2 lần: lần 1 lúc bắt đầu thí nghiệm (14 – 20 ngày tuổi) và lần 2 sau lần 1 mƣời ngày (24 – 30 ngày tuổi). Ngoài ra, chúng tôi còn bố trí thêm một lô heo đối chứng, lô heo này chỉ tiêm chất bổ trợ 2 lần. 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm Chọn 8 bầy heo con khỏe mạnh, 14 – 20 ngày tuổi. Phân thành 3 lô: Lô thứ nhất: 3 bầy. Lô thứ hai: 3 bầy. Lô đối chứng: 2 bầy. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. 31 Sơ đồ 3.3. Tóm tắt bố trí thí nghiệm Chọn 8 bầy heo con khỏe mạnh, 14 – 20 ngày tuổi Lô 2 (3 bầy) Tiêm vaccin 2 lần Lô 1 (3 bầy) Tiêm vaccin 1 lần Lô đối chứng (2 bầy) Tiêm chất bổ trợ Lấy máu theo dõi biến động hàm lƣợng kháng thể Theo dõi các phản ứng phụ trên heo Tỉ lệ tiêu chảy. Tăng trọng tuyệt đối Heo thí nghiệm Liều tiêm Số lần tiêm Vị trí tiêm Lô 1 3 bầy 2 ml 1 Dƣới da vùng cổ Lô 2 3 bầy 2 ml 2 Lô đối chứng 2 bầy 2 ml 2 Bảng 3.1. Phân lô và liều tiêm heo con ngày Bắt đầu thí nghiệm Ngày thứ 10 Ngày thứ 20 Rút máu, tiêm vaccine lần 1 Rút máu, tiêm vaccine lần 2 Rút máu Sơ đồ 3.4. Lịch trình thực hiện của 1 lần thí nghiệm Kết thúc thí nghiệm Ngày thứ 40 32 3.4.6. Phƣơng pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm 3.4.6.1. Lấy mẫu máu và bảo quản Thời điểm lấy : bắt đầu thí nghiệm, ngày thứ 10 và ngày thứ 20 của thí nghiệm. Mỗi thời điểm, lấy máu 3 heo con ở mỗi bầy. Lật ngửa heo cần lấy máu sao cho đầu hƣớng về phía ngƣời kĩ thuật viên. Tiến hành sát trùng vị trí hõm tam giác phía trƣớc xƣơng đòn. Sau đó, sử dụng ống tiêm rút ra một cách từ từ 2 – 3 ml máu. Rút kim ra, sát trùng và day chặt nơi tiêm tránh sƣng và phản ứng cục bộ. Rút hết pittông về phía sau, đặt ống tiêm nằm ngang để máu đông tự nhiên ở nhiệt độ thƣờng khoảng 30 phút. Vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4oC. Về đến phòng thí nghiệm bảo quản mẫu qua đêm ở 4oC để thu đƣợc nhiều huyết thanh hơn (Phạm Kim Ngọc, 2002) Tách phần huyết thanh nổi phía trên cục máu đông trong ống chích cho vào các ống nghiệm vô trùng, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Chiết huyết thanh sang các eppendof vô trùng, ly tâm lần 2 cũng với tốc độ và thời gian nhƣ trên. Chiết huyết thanh sang các ống nghiệm sạch để thực hiện phản ứng ngƣng kết. Hình 3.9: Rút máu heo con 33 3.4.6.2. Chuẩn bị dịch kháng nguyên Quy trình và phƣơng pháp chuẩn bị kháng nguyên tƣơng tự nhƣ chuẩn bị kháng nguyên sản xuất auto-vaccine. Dịch kháng nguyên sử dụng cho phản ứng ngƣng kết có nồng độ từ 108 – 109 tế bào/ml và từ những chủng sản xuất auto-vaccine. Sau sản xuất, dịch kháng nguyên đƣợc bảo quản ở 4oC đến khi sử dụng. Làm chết vi khuẩn Ủ 370C, 24 giờ 5 chủng E. coli đƣợc chọn lọc Môi trƣờng canh TSB Li tâm bỏ dịch nổi 4000 vòng/phút trong 15 phút. 2 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý Hòa trong nƣớc muối chứa 0,3% formalin Hòa trong nƣớc muối sinh lý, điều chỉnh để đạt nồng độ 109 tế bào/ml Sơ đồ 3.5. Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo Ørskov, 1977) Đếm số lƣợng trên môi trƣờng EMB Ủ qua đêm ở 40C Rửa trong 10ml nƣớc muối sinh lí. Thu dịch rửa. 3 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý 34 3.4.6.3. Tiến hành phản ứng Chuẩn bị 9 bộ ống nghiệm có nắp đậy, mỗi bộ 10 ống. Mỗi ống cho vào 500 µl nƣớc muối sinh lý, riêng ống đầu tiên của mỗi bộ cho vào 800 µl. Sau đó, cho vào ống đầu tiên của mỗi bộ ống nghiệm 200 µl dịch huyết thanh của mỗi mẫu máu tƣơng ứng. Trộn đều rồi hút 500 µl cho vào ống tiếp theo. Cứ nhƣ vậy đến ống thứ 8 thì hút bỏ 500 µl dịch đã trộn. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 500 µl dịch kháng nguyên, để ở 37oC trong 2 giờ và để qua đêm ở 4oC. Ngoài ra, chúng tôi còn bố trí một ống đối chứng âm chứa 200 µl dịch kháng nguyên và 800 µl nƣớc muối sinh lí. Nƣớc muối sinh lí (µl) 800 500 500 500 500 500 500 500 500 500 Huyết thanh 200 Hiệu giá 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 Kháng nguyên (µl) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 Hiệu giá mới 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 3.4.6.4. Đọc kết quả Qua một đêm ủ ở 4oC, chúng tôi tiến hành đọc kết quả phản ứng ngƣng kết, xác định ở độ pha loãng nào có kết quả âm tính thì độ pha loãng trƣớc là hiệu giá kháng huyết thanh của mẫu máu tƣơng ứng. Phản ứng ngƣng kết trong ống nghiệm đƣợc đọc: 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl Sơ đồ 3.6. Cách tiến hành phản ứng ngƣng kết xác định hiệu giá kháng huyết thanh 35 Ống đối chứng âm: kết quả âm tính, có lắng tụ kháng nguyên dƣới đáy ống nghiệm Kháng nguyên lắng mạng lƣới đều khắp ống nghiệm: phản ứng dƣơng tính. Kháng nguyên lắng tụ giữa đáy ống nghiệm: phản ứng âm tính. 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi tăng trọng tuyệt đối của heo trong khoảng thời gian theo dõi (14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi) - Theo dõi tỉ lệ tiêu chảy - Theo dõi phản ứng của heo. Run rẩy, ói mửa, ủ rủ, bỏ bú. Theo dõi trong 2 giờ sau khi tiêm (Lê Văn Hùng, 2002). Theo dõi phản ứng cục bộ tại chỗ tiêm (sƣng, nóng, đỏ, đau) sau khi tiêm. Theo dõi heo: sức ăn, vận động, hô hấp trong suốt thí nghiệm. Heo/lô Tỷ lệ heo dị ứng/lô(%) Heo có triệu chứng dị ứng/lô = x 100 = Tăng trọng trung bình tuyệt đối (gam/ngày/con) Tổng trọng lƣợng kết thúc TN – Tổng trọng lƣợng bắt đầu TN Số heo x Số ngày nuôi x 100 Tỷ lệ heo tiêu chảy/lô (%) Heo có triệu chứng tiêu chảy của lô Heo của lô = 36 - Theo dõi hiệu giá kháng thể ngƣng kết. Hiệu giá kháng thể đƣợc tính bằng hệ số chuyển dƣơng hay trung bình hình học MGT (Medium Geometry Titer): 3.6. Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý theo trắc nghiệm F và trắc nghiệm χ2 trong phần mềm Minitab. MGT ∑ Mẫu số của hiệu giá kháng thể ngƣng kết ∑ Mẫu xét nghiệm = 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine Trong quá trình thu hoạch mẫu, chúng tôi đã lấy đƣợc 60 mẫu phân tiêu chảy trên heo con. Sau khi phân lập trên môi trƣờng EMB, chúng tôi lựa chọn đƣợc 20 khuẩn lạc đặc trƣng của E. coli. 20 chủng vi khuẩn này đƣợc kiểm tra bằng phản ứng lên men đƣờng và nghiệm pháp IMViC thì đều cho kết quả dƣơng tính của E. coli. 20 chủng E. coli này tiếp tục đƣợc kiểm tra định type F4, F5, F6 thì cho kết quả:  7 chủng là F4.  6 chủng là F5.  2 chủng là F4 + F5.  5 chủng âm tính. Qua kết quả định type, chúng ta thấy đƣợc rằng heo con ở trại bị nhiễm E. coli type F4 và F5 với tỷ lệ khá cao. Mà F4 và F5 là kháng nguyên rất mạnh. E. coli có yếu tố bám F4, F5 là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên heo con. Từ kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc 5 chủng E. coli có phản ứng định type dƣơng tính rõ ràng để sản xuất auto-vaccine. Bao gồm: 2 chủng F4, 1 chủng F5, 2 chủng F4 + F5. 38 4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (số lần tiêm). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. Mỗi thí nghiệm gồm 3 lô: Lô đối chứng (tiêm chất bổ trợ): 2 bầy heo con. Lô 1(tiêm vaccine 1 lần): 3 bầy heo con. Lô 2 (tiêm vaccine 2 lần): 3 bầy heo con. Trong đó, các bầy heo đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên, từ 14 – 20 ngày tuổi, khỏe mạnh, không bị tiêu chảy, chƣa đƣợc tiêm vaccine phòng tiêu chảy do E. coli kể cả đối với heo mẹ. Với phƣơng pháp bố trí thí nghiệm nhƣ trên thì chúng tôi nhận thấy có những ƣu điểm của phƣơng pháp này:  Số heo trong mỗi lô rất lớn (trung bình là 30 con) nên thí nghiệm đƣợc đảm bảo tính đồng đều trong cùng một lô.  Heo con và heo mẹ đƣợc chọn không bị tiêu chảy và chƣa đƣợc tiêm vaccine ngừa E. coli nên không ảnh hƣởng đến kết quả tạo hiệu giá sau khi tiêm vaccine.  Vì đƣợc lựa chọn nguyên bầy nên sự phát triển khác nhau của mỗi cá thể heo con giúp thí nghiệm có tính ngẫu nhiên cao, tránh đƣợc các yếu tố khách quan và chủ quan tác động đến kết quả thí nghiệm. Tuy nhiên trong lúc tiến hành thí nghiệm, chúng tôi cũng còn nhận thấy những khuyết điểm của thí nghiệm:  Vì không có một lƣợng lớn heo cùng tuổi mà tuổi heo từ 14 – 20 ngày tuổi nên tuổi heo giữa các lô và trong cùng một lô khác nhau. Sự không đồng đều này chắc hẳn sẽ tác động một phần làm sai lệch kết quả thí nghiệm. 39  Heo thí nghiệm mặc dù đƣợc nuôi nhốt ở các ô riêng, tuy nhiên các ô này vẫn trong cùng một nhà với heo không đƣợc thí nghiệm. Vì vậy kết quả thí nghiệm sẽ bị tác động sai lệch.  Chƣa loại trừ đƣợc các yếu tố khách quan tác động đến đáp ứng miễn dịch và gây tiêu chảy ở heo thí nghiệm. 4.3. Hiệu giá kháng thể Việc xác định hiệu giá kháng thể nhƣ đã đƣợc trình bày ở chƣơng 3: tại độ pha loãng của huyết thanh còn phản ứng ngƣng kết tạo mạng lƣới ở đáy ống nghiệm thì đó là hiệu giá kháng thể của mẫu huyết thanh. Chỉ số pha loãng của huyết thanh là một phân số, ta đảo ngƣợc phân số này đƣợc một số thập phân là chỉ số hiệu giá kháng thể. 4.3.1. Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 1 Lô đối chứng Lô 1 Lô 2 P Lần rút máu thứ nhất 40 80 80 80 80 80 40 40 160 0,906 Trung bình: 66,7 Trung bình: 80 Trung bình: 80 Lần rút máu thứ hai 320 80 40 1280 640 1280 1280 1280 640 0,017 Trung bình: 146,7 Trung bình: 1066,7 Trung bình: 1066,7 Lần rút máu thứ ba 1280 320 1280 1280 1280 1280 640 1280 640 0,422 Trung bình: 960 Trung bình: 1280 Trung bình: 853,3 Bảng 4.1. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) 40 4.3.1.1. Lần rút máu thứ nhất Dựa vào biểu đồ 4.1 và bảng kết quả thống kê 4.1, chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể của 3 lô ở lần rút máu thứ nhất (lúc bắt đầu thí nghiệm) không có sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học. Điều này chứng tỏ heo thí nghiệm có sự đồng đều về đáp ứng miễn dịch ở cả 3 lô trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. 4.3.1.2. Lần rút máu thứ hai Biểu đồ 4.2. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ hai (thí nghiệm 1) Biểu đồ 4.1. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ nhất (thí nghiệm 1) 41 Dựa vào biểu đồ 4.2 và bảng kết quả thống kê 4.1, chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể của lô 1 và 2 bằng nhau và cao hơn lô đối chứng. Bằng xử lý thống kê thì chúng tôi thấy sự khác biệt này rất có ý nghĩa. Nhƣ vậy auto-vaccine đã gây đáp ứng miễn dịch rất rõ ràng sau khi tiêm auto-vaccine lần 1. 4.3.1.3. Lần rút máu thứ 3 Dựa vào biểu đồ 4.3 và bảng kết quả thống kê 4.1, chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể lô 1 là cao nhất và hiệu giá kháng thể của lô 2 là thấp nhất. Nhƣng về phƣơng diện thống kê học thì sự khác biệt này không có ý nghĩa nên hiệu giá kháng thể của lô 1 cao hơn không đáng kể đối với lô 2 và lô đối chứng. Tuy lô 2 đƣợc tiêm vaccine 2 lần nhƣng đáp ứng miễn lại thấp hơn lô 1 (tiêm 1 lần), nguyên nhân có thể là do auto-vaccine không làm tăng đáp ứng miễn dịch khi tiêm lần 2, hoặc do tình trạng sức khỏe của heo không tốt để sinh miễn dịch đáp ứng với auto-vaccine. Và cũng trong lần rút máu này, hiệu giá kháng thể của lô đối chứng (không tiêm auto-vaccine) lại cao hơn cả lô 2 và gần bằng với lô 1. Nguyên nhân dẫn đến điều này có thể heo ở lô đối chứng đã nhiễm type E. coli trùng với type trong auto- Biểu đồ 4.3. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ 3 (thí nghiệm 1) 42 vaccine. Khả năng này rất cao vì điều kiện nuôi thí nghiệm hoàn toàn không loại trừ sự nhiễm E. coli cho heo con. Tổng kết thí nghiệm 1: Ở lô đối chứng (tiêm chất bổ trợ): hiệu giá kháng thể của lần rút máu thứ nhất và hai là gần bằng nhau, nhƣng ở lần rút máu thứ ba thì hiệu giá kháng thể lại tăng rất đáng kể và gần bằng với lô 1 và 2. Qua đó chứng tỏ heo ở lô đối chứng đã bị nhiễm type E. coli giống với type trong auto-vaccine thực nghiệm. Điều này dẫn đến sự khác nhau không có ý nghĩa của hiệu giá kháng thể ở 3 lô trong lần rút máu thứ ba. Qua lần rút máu thứ 2, auto-vaccine có tạo đáp ứng miễn dịch rõ ràng giữa lô đối chứng (không tiêm auto-vaccine) với lô 1 và 2. Auto-vaccine có tạo đáp ứng miễn dịch và kéo dài, điều này thể hiện ở lô 1 (tiêm auto-vaccine 1 lần). Chƣa thấy đƣợc auto-vaccine thực nghiệm có làm tăng đáp ứng miễn dịch sau 2 lần tiêm hay không, điều này thể hiện ở lô 2 (tiêm auto-vaccine 2 lần). Biểu đồ 4.4. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) 43 4.3.2. Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 2 Lô đối chứng Lô 1 Lô 2 Chỉ số P Lần rút máu thứ nhất 40 80 80 320 40 1280 80 640 320 0,409 Trung bình: 66,7 Trung bình: 546,7 Trung bình: 346,7 Lần rút máu thứ hai 1280 320 320 5120 2560 2560 5120 2560 2560 0,054 Trung bình: 640 Trung bình: 3413,3 Trung bình: 3413,3 Lần rút máu thứ ba 80 1280 640 1280 2560 640 5120 5120 2560 0,015 Trung bình: 666,7 Trung bình: 1493,3 Trung bình: 4266,7 4.3.2.1. Lần rút máu thứ nhất Dựa vào biểu đồ 4.5 và bảng kết quả thống kê 4.2 , chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể lúc bắt đầu thí nghiệm của lô 1 là cao nhất và của lô đối chứng là thấp nhất. Tuy nhiên trên phƣơng diện thống kê học thì sự khác nhau này không có ý nghĩa nên có thể coi hiệu giá của 3 lô là nhƣ nhau. Điều đó chứng tỏ heo bắt đầu thí nghiệm có sự tƣơng đồng về đáp ứng miễn dịch ở cả 3 lô trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Bảng 4.2. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) Biểu đồ 4.5. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ nhất (thí nghiệm 2) 44 4.3.2.2. Lần rút máu thứ hai Dựa vào biểu đồ 4.6 và bảng kết quả thống kê 4.2 , chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể của lô 1 và 2 cao hơn rất nhiều so với lô đối chứng. Tuy nhiên sự khác biệt này chƣa có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học (P = 0,054), điều này chứng tỏ auto-vaccine thử nghiệm gây đáp ứng miễn dịch chƣa hoàn toàn rõ ràng so với lô đối chứng. Và sau lần tiêm thứ nhất thì đáp ứng miễn dịch của lô 1 và 2 là nhƣ nhau. 4.3.2.3. Lần rút máu thứ ba Biểu đồ 4.7. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ ba (thí nghiệm 2) Biểu đồ 4.6. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ hai (thí nghiệm 2) 45 Dựa vào biểu đồ 4.7 và bảng kết quả thống kê 4.2 , chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể của lô 2 là cao nhất, của lô đối chứng là thấp nhất. Và sự khác biệt này rất có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học. Nhƣ vậy, sau khi tiêm 2 lần thì auto-vaccine đã tạo đáp ứng miễn dịch cao hơn tiêm 1 lần. Tổng kết thí nghiệm 2: Hiệu giá kháng thể của lô đối chứng ở lần rút máu thứ 2 và 3 hầu nhƣ không thay đổi. Điều đó chứng tỏ heo ở lô đối chứng của thí nghiệm 2 không bị nhiễm type E. coli trong quá trình thí nghiệm nên chúng ta có thể đánh giá đƣợc hiệu quả đáp ứng miễn dịch của auto-vaccine. Auto-vaccine có tạo đáp ứng miễn dịch kéo dài, điều này thể hiện ở lô 1 (tiêm vaccine 1 lần). Auto-vaccine tạo đáp ứng miễn dịch cao hơn sau hai lần tiêm, điều này thể hiện ở lô 2 (tiêm vaccine 2 lần). Biểu đồ 4.8. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) 46 4.3.3. Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể Lô ĐC Lô 1 Lô 2 Lần rút máu thứ nhất 66,7 313,4 213,4 Lần rút máu thứ hai 393,4 2240 2240 Lần rút máu thứ ba 813,4 1386 2560  Ở lần rút máu thứ nhất, chúng ta nhận thấy hiệu giá kháng thể của lô 1 và 2 cao hơn hiệu giá kháng thể của lô đối chứng, điều đó chứng tỏ trƣớc khi thí nghiệm heo con ở 2 lô này có kháng thể type E. coli nhƣ trong auto-vaccine. Nguyên nhân dẫn đến điều này có thể là do heo con bị nhiễm E. coli hoặc heo con nhận đƣợc kháng thể từ sữa mẹ (có thể heo mẹ bị nhiễm sẳn E. coli).  Cũng nhƣ vậy ở lô đối chứng, hiệu giá kháng thể tăng dần qua lần rút máu thứ hai và thứ ba, điều đó chắc chắn là heo con ở lô đối chứng bị nhiễm type E. coli giống trong auto-vaccine.  Từ hai thảo luận trên, chúng ta nhận thấy hiệu giá kháng thể của lô 1 và 2 chắc chắn đã bị tác động làm tăng cao hơn. Nhƣng vì cả 3 lô thí nghiệm đều chịu tác động nhƣ nhau bởi các yếu tố trên mà hiệu giá kháng thể của lô 1 và 2 vẫn cao hơn rất rõ ràng so với lô đối chứng (P < 0,05) nên có thể kết luận rằng auto-vaccine đã gây đáp ứng miễn dịch tốt cho heo con.  Nhƣ vậy, auto-vaccine thực nghiệm đã gây đáp ứng miễn dịch tốt, kéo dài và cao hơn nếu đƣợc tiêm 2 lần. Bảng 4.3. Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm 47 4.4. Tỷ lệ heo tiêu chảy 4.4.1. Thí nghiệm 1 Dựa vào bảng kết quả thống kê 4.4 và biểu đồ 4.9, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ heo bị tiêu chảy của lô 1 và 2 tuy có thấp hơn lô đối chứng nhƣng sự khác biệt không có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê. Tuy nhiên theo kết quả hiệu giá kháng thể của thí nghiệm 1 là auto-vaccine có tạo đáp ứng miễn dịch rõ ràng và kéo dài sau 1 lần tiêm, thì chúng tôi có thể cho rằng heo con thí nghiệm bị tiêu chảy là do nhiễm type E. coli khác với type trong auto-vaccine hoặc những nguyên nhân khác ngoài E. coli. Theo Bergeland (1980), trƣờng hợp heo bị tiêu chảy do những nguyên nhân khác ngoài E. coli là rất cao và chiếm đến 54,4% (Bergeland, 1980), mà điều kiện bố trí thí nghiệm của chúng tôi không có khả năng loại trừ những nguyên nhân đó. Thí nghiệm 1 Lô ĐC Lô 1 Lô 2 Chỉ số P Số heo tiêu chảy bầy 1 (con) 6 4 5 Số heo tiêu chảy bầy 2 (con) 5 3 3 Số heo tiêu chảy bầy 3 (con) 4 4 Tổng heo của lô (con) 16 26 28 Tỷ lệ tiêu chảy (%) 68,75 42,31 42,86 0,184 Bảng 4.4. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 Biểu đồ 4.9. Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 48 4.4.2. Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 2 Lô ĐC Lô 1 Lô 2 Chỉ số P Số heo tiêu chảy bầy 1 (con) 4 3 4 Số heo tiêu chảy bầy 2 (con) 5 3 2 Số heo tiêu chảy bầy 3 (con) 4 3 Tổng heo của lô (con) 22 28 28 Tỷ lệ tiêu chảy (%) 40,91 35,71 32,14 0,814 Dựa vào bảng kết quả thống kê 4.5 và biểu đồ 4.10, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ heo bị tiêu chảy của lô 2 thấp nhất và lô đối chứng cao nhất, nhƣng sự khác biệt này cũng không đáng kể và gần nhƣ là tƣơng đƣơng (vì P = 0,814). Tuy nhiên, theo kết quả hiệu giá kháng thể của thí nghiệm 2 đã chứng tỏ hiệu giá kháng thể của lô 1 và 2 cao hơn rất rõ ràng so với lô đối chứng, và hiệu giá kháng thể của lô 2 tăng rất cao sau 2 lần tiêm. Nhƣ vậy heo ở lô 1 và 2, cũng không loại trừ heo của lô đối chứng đã bị tiêu chảy do nhiễm type E. coli khác với type trong auto-vaccine hoặc do những nguyên nhân khác. Bảng 4.5. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 Biểu đồ 4.10. Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí nghiệm 49 Tổng kết tỷ lệ heo bị tiêu chảy của cả 2 thí nghiệm: mặc dù auto-vaccine tạo đáp ứng miễn dịch rõ ràng và kéo dài cho heo con nhƣng tỷ lệ heo bị tiêu chảy của 3 lô là tƣơng đƣơng, nhƣ vậy heo con đã bị nhiễm type E. coli gây tiêu chảy khác với type của auto-vaccine hoặc heo con bị tiêu chảy do những nguyên nhân khác. Mặt khác đây chỉ là tỷ lệ heo tiêu chảy đƣợc tính trên tổng số heo tiêu chảy, chứ không phải là số liệu heo tiêu chảy theo ngày. Và thêm một nguyên nhân làm heo con tiêu chảy: vi khuẩn E. coli là tác nhân tấn công đƣờng ruột, trong khi kháng thể trong huyết thanh lại gây miễn dịch toàn thân, do đó lƣợng kháng thể tác động đến vi khuẩn E. coli qua đƣờng ruột là rất ít. Vì vậy chúng tôi chƣa thể đánh giá chính xác đƣợc hiệu quả bảo hộ heo con chống tiêu chảy do E. coli của auto-vaccine thực nghiệm. Lô ĐC Lô 1 Lô 2 Số heo tiêu chảy (con) 20 21 21 Tổng heo của lô (con) 38 54 56 Tỷ lệ tiêu chảy (%) 52,6 38,9 37,5 50 4.5. Tăng trọng tuyệt đối 4.5.1. Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 1 Tổng trọng lƣợng bắt đầu TN (kg) Tổng trọng lƣợng kết thúc TN (kg) Tăng trọng trung bình tuyệt đối mỗi bầy (g/ngày/con) Tăng trọng trung bình tuyệt đối mỗi lô (g/ngày/con) Lô ĐC Bầy 1 (8 con) 38,1 130,3 288,13 280,63 ± 10,6 Bầy 2 (8 con) 44,2 131,6 273,13 Lô 1 Bầy 1 (10 con) 53,6 165,7 280,25 279 ± 1,2 Bầy 2 (9 con) 43 143,4 278,89 Bầy 3 (7 con) 36,8 114,6 277,86 Lô 2 Bầy 1 (10 con) 36,6 150,1 283,75 288,81 ± 4,4 Bầy 2 (8 con) 37 130,1 290,94 Bầy 3 (10 con) 57 173,7 291,75 Chỉ số P 0,168 Dựa vào biểu đồ 4.11 và bảng kết quả thống kê 4.6, chúng tôi nhận thấy tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê học. Điều đó chứng tỏ auto-vaccine thực nghiệm đã không làm ảnh hƣởng đến tăng trọng của heo con. Bảng 4.7. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 1) Biểu đồ 4.11. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 1) 51 4.5.2. Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 2 Trọng lƣợng trung bình bắt đầu TN (kg) Trọng lƣợng trung bình kết thúc TN (kg) Tăng trọng trung bình tuyệt đối mỗi bầy (g/ngày/con) Tăng trọng trung bình tuyệt đối mỗi lô (g/ngày/con) Lô ĐC Bầy 1 43,4 170,8 289,55 286,36 ± 4,5 Bầy 2 44,4 169 283,18 Lô 1 Bầy 1 45,8 136,9 284,55 279,51 ± 9,9 Bầy 2 43,2 146,1 286,00 Bầy 3 45,4 152,6 268,00 Lô 2 Bầy 1 43,1 159,7 291,75 288,25 ± 2,9 Bầy 2 35,4 127,4 287,38 Bầy 3 51,5 165,8 285,75 Chỉ số P 0,349 Dựa vào biểu đồ 4.12 và bảng kết quả thống kê 4.7, chúng tôi nhận thấy tăng trọng tuyệt đối của 3 lô không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê học. Điều đó chứng tỏ auto-vaccine thực nghiệm không làm ảnh hƣởng đến tăng trọng của heo con. Bảng 4.8. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 2) Biểu đồ 4.12. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 2) 52 4.5.3. Tổng kết tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua 2 thí nghiệm Theo kết quả thống kê bảng 4.8, chúng ta nhận thấy tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua cả 2 thí nghiệm không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê học. Điều đó chứng tỏ auto-vaccine thực nghiệm không gây ảnh hƣởng đến tăng trọng của heo con thí nghiệm. 4.6. Các chỉ số khác Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tôi quan sát heo con không bị run rẩy, ói mửa, ủ rủ, bỏ bú, không có phản ứng cục bộ tại chỗ tiêm. Heo con vẫn ăn uống, vận động, hô hấp bình thƣờng. Điều này chứng tỏ auto-vaccine thực nghiệm không gây những phản ứng phụ và không ảnh hƣởng đến sức khỏe heo con. 4.7. Kết quả chung Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch rất cao và kéo dài. Auto-vaccine tạo đáp ứng miễn dịch cao hơn sau 2 lần tiêm. Chƣa thể đánh giá đƣợc chính xác hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy do E. coli của auto-vaccine thực nghiệm. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của từng TN Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô P Lô ĐC Thí nghiệm 1 280,63 283,5 ± 4,05 0,065 Thí nghiệm 2 286,36 Lô 1 Thí nghiệm 1 279 279,26 ± 0,36 Thí nghiệm 2 279,51 Lô 2 Thí nghiệm 1 288,81 288,53 ± 0,4 Thí nghiệm 2 288,25 Bảng 4.9. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua cả 2 TN 53 Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác động xấu đến tăng trọng của heo con. Auto-vaccine thực nghiệm không ảnh hƣởng đến sức ăn, sự vận động và hô hấp của heo con. Auto-vaccine không gây những phản ứng phụ nhƣ ói mửa, ủ rủ, run rẩy và hoàn hoàn không gây phản ứng cục bộ tại nơi tiêm. 54 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch cao và kéo dài. Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác dụng phụ sau tiêm và không ảnh hƣởng đến tăng trọng heo con. Chƣa thể đánh giá chính xác đƣợc hiệu quả bảo hộ tiêu chảy do E. coli của auto-vaccine. 5.2. Đề nghị Cần sử dụng bộ kit với nhiều type huyết thanh hơn khi định type chọn chủng E. coli sản xuất auto-vaccine. Heo thí nghiệm cần đồng nhất một độ tuổi. Đảm bảo điều kiện chăm sóc tốt nhất cho heo thí nghiệm nhằm tránh những nguyên gây tiêu chảy khác ngoài E. coli và giúp heo thí nghiệm đƣợc khỏe mạnh để đáp ứng miễn dịch đồng đều với auto-vaccine. Thiết kế thí nghiệm tiêm auto-vaccine cho heo mẹ đang mang thai để đánh giá hiệu quả bảo hộ trên heo con. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO  TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Trần Linh Thƣớc. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. NXB Giáo Dục. 2. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm. Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản. NXB Nông Nghiệp-Hà Nội, 2004. 3. Nguyễn Ngọc Hải. Phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu trên heo sau cai sữa và khảo sát khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh. Luận án Thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, 1999. Tủ sách ĐH Nông Lâm Tp HCM. 4. Thái Quốc Hiếu. Ảnh hưởng của việc bổ sung kháng sinh và chế phẩm sinh học vào thức ăn để phòng tiêu chảy do E. coli trên heo con tại tỉnh Tiền Giang. Luận án Thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, 2002. Tủ sách ĐH Nông Lâm Tp HCM. 5. Nguyễn Đình Bảng, Nguyễn Thị Kim Hƣơng. Vaccine & chế phẩm miễn dịch trong phòng & điều trị. NXB Y Học, 2003. 6. Nguyễn Đình Giậu. Sinh lý học người và động vật. NXB Đại Học Quốc Gia Tp. HCM, 2000 7. “Vắc-xin”, Wikipedia, 08/03/2007. 8. “E. coli”, Wikipedia, 13/03/2007.  TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 9. “Escherichia coli”, Wikipedia, 17/05/2007. 56 10. ”Vaccine”, Wikipedia. 11. “Diarrhea”, Wikipedia, 09/07/2007. 12. “Autovaccination”, Wikipedia, 14/05/2007. 13. “Immunologic adjuvant”, Wikipedia, 28/07/2007. 14. “Montanide for antibodies production”, SEPPIC company. 57 PHỤ LỤC  THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG – HÓA CHẤT 1. EMB (pH: 7,2) Pepton 10 g Lactose 5 g Succrose 5 g K2HPO4 2 g Agar 13,5 g Eosin 0,4 g Methylen Blue 0,065 g Nƣớc cất 1000 ml 2. KIA (pH: 7,4 +/- 0,2) Polypepton peptone 20 g Lactose 20 g Dextrose 1 g NaCl 5 g Ferric ammonium citrate 0,5 g Sodium thiosulfate 0,5 g Agar 15 g Phenol red 0,025 g Nƣớc cất 1000 ml 3. TSA (pH: 7,3 +/- 0,2) Soya peptone 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g 58 Agar 18 g Nƣớc cất 1000 ml 4. TSB Soya peptone 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml 5. Canh tryptone Cao thịt 5 g Peptone 10 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml 6. Clark – Lubs Peptone 5 g Glucose 5 g Phosphate buffer 5 g Nƣớc cất 1000 ml 7. Simmons Citrate Agar (pH: 6,9) Sodium citrate 2 g K2PO4 1 g MgSO4 0,2 g Brothynol blue 0,08 g NaCl 5 g NH4H2PO4 1 g Agar 18 g Nƣớc cất 1000 ml 59 8. Nƣớc muối sinh lý NaCl 9 g Nƣớc cất 1000 ml 9. Thuốc thử Kovac’s p-Dimethylaminobenzaldehyde 10 g Isoamyl alcohol 150 ml HCl đậm đặc 50 ml 10. Thuốc thử Methyl Red Methyl red 0,1 g Ethanol 95% 300 ml Nƣớc cất (vừa đủ) 500 ml 11. Crystal violet Crystal violet 0,4 g Cồn 960 10 ml Phenol 1 g Nƣớc cất 100 ml 12. Lugol KI 2 g Iod tinh thể 1 g Nƣớc cất 300 ml 13. Fuschine Fuschine kiềm 0,3 g Cồn 960 10 ml Phenol 5 g Nƣớc cất 35 ml 60  CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 1. Phản ứng Indol Chuẩn bị môi trƣờng canh tryptone. Cấy vi khuẩn, ủ 370C, 24 – 48 giờ. Thuốc thử Kovacs, nhỏ 2 – 4 giọt vào môi trƣờng sau khi cấy ủ. Kết quả: Dƣơng tính: màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng. Âm tính: bề mặt môi trƣờng giữ nguyên màu vàng thuốc thử. 2. Phản ứng Methyl Red Chuẩn bị môi trƣờng Clark – Lubs. Cấy vi khuẩn, ủ 370C, 24 – 48 giờ. Thuốc thử Methyl Red, nhỏ 2 – 4 giọt vào môi trƣờng sau cấy ủ. Kết quả: Dƣơng tính: dịch cấy màu đỏ. Âm tính: dịch cấy màu vàng. 3. Phản ứng Voges Proskauer Chuẩn bị môi trƣờng Clark – Lubs. Cấy vi khuẩn, ủ 370C, 24 – 48 giờ. Thuốc thử α-naphtol và KOH 40%. Kết quả: Dƣơng tính: môi trƣờng có màu đỏ hồng. Âm tính: môi trƣờng khôngcó màu đỏ hồng. 4. Phản ứng Citrate Chuẩn bị môi trƣờng thạch nghiêng Simmons Citrate Agar. Cấy vi khuẩn, ủ 370C, 24 – 48 giờ. Kết quả: Dƣơng tính: có khuẩn lạc, môi trƣờng chuyển màu xanh dƣơng. Âm tính: môi trƣờng giữ nguyên màu xanh lục. 61  KẾT QUẢ THỐNG KÊ Hiệu giá KT lần rút máu thứ nhất của thí nghiệm 1 Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS F P Lo 2 356 178 0,10 0,906 Error 6 10667 1778 Total 8 11022 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+------- 1 3 80,00 0,00 (--------------*--------------) 2 3 80,00 69,28 (--------------*--------------) dc 3 66,67 23,09 (--------------*--------------) ---------+---------+---------+------- Pooled StDev = 42,16 40 80 120 Hiệu giá KT lần rút máu thứ hai của thí nghiệm 1 Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS F P Lo 2 1692800 846400 8,58 0,017 Error 6 592000 98667 Total 8 2284800 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 1 3 1066,7 369,5 (--------*--------) 2 3 1066,7 369,5 (--------*--------) dc 3 146,7 151,4 (--------*--------) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 314,1 0 500 1000 1500 Hiệu giá KT lần rút máu thứ ba của thí nghiệm 1 Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS F P Lo 2 295822 147911 1,00 0,422 Error 6 887467 147911 Total 8 1183289 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-- 1 3 1280,0 0,0 (----------*---------) 2 3 853,3 369,5 (----------*----------) dc 3 960,0 554,3 (----------*----------) ----+---------+---------+---------+-- Pooled StDev = 384,6 500 1000 1500 2000 62 Hiệu giá KT lần rút máu thứ nhất của thí nghiệm 2 Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS F P Lo 2 348800 174400 1,04 0,409 Error 6 1004800 167467 Total 8 1353600 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+----- 1 3 546,7 650,3 (-----------*----------) 2 3 346,7 281,0 (-----------*----------) dc 3 66,7 23,1 (----------*-----------) -+---------+---------+---------+----- Pooled StDev = 409,2 -500 0 500 1000 Hiệu giá KT lần rút máu thứ hai của thí nghiệm 2 Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS F P Lo 2 15382756 7691378 4,93 0,054 Error 6 9352533 1558756 Total 8 24735289 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 1 3 3413 1478 (--------*--------) 2 3 3413 1478 (--------*--------) dc 3 640 554 (--------*--------) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 1249 0 2000 4000 6000 Hiệu giá KT lần rút máu thứ ba của thí nghiệm 2 Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS F P Lo 2 21334756 10667378 9,14 0,015 Error 6 7001600 1166933 Total 8 28336356 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+- 1 3 1493 978 (------*-------) 2 3 4267 1478 (------*-------) dc 3 667 600 (------*-------) -----+---------+---------+---------+- Pooled StDev = 1080 0 2000 4000 6000 63 Số heo tiêu chảy của 3 lô thí nghiệm 1 Expected counts are printed below observed counts Lo 1 Lo 2 Lo DC Total Tchay 11 12 11 34 12,63 13,60 7,77 Kotchay 15 16 5 36 13,37 14,40 8,23 Total 26 28 16 70 Chi-Sq = 0,210 + 0,188 + 1,341 + 0,198 + 0,178 + 1,267 = 3,382 DF = 2, P-Value = 0,184 Số heo tiêu chảy của 3 lô thí nghiệm 2 Expected counts are printed below observed counts Lo DC Lo 2 Lo 1 Total Tchay 9 9 10 28 7,90 10,05 10,05 Kotchay 13 19 18 50 14,10 17,95 17,95 Total 22 28 28 78 Chi-Sq = 0,154 + 0,110 + 0,000 + 0,086 + 0,062 + 0,000 = 0,412 DF = 2, P-Value = 0,814 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô thí nghiệm 1 Analysis of Variance for Tang tro Source DF SS MS F P Lo 2 160,6 80,3 2,60 0,168 Error 5 154,2 30,8 Total 7 314,7 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- 1 3 279,00 1,20 (----------*---------) 2 3 288,81 4,40 (---------*---------) DC 2 280,63 10,61 (------------*-----------) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 5,55 272,0 280,0 288,0 296,0 64 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô thí nghiệm 2 Analysis of Variance for Tang tro Source DF SS MS F P Lo 2 123,9 62,0 1,31 0,349 Error 5 236,9 47,4 Total 7 360,9 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-- 1 3 279,51 9,98 (-----------*------------) 2 3 288,25 2,95 (-----------*------------) DC 2 286,36 4,50 (---------------*---------------) ----+---------+---------+---------+-- Pooled StDev = 6,88 272,0 280,0 288,0 296,0 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua 2 TN Analysis of Variance for TTTBTD Source DF SS MS F P Lo 2 86,24 43,12 7,74 0,065 Error 3 16,70 5,57 Total 5 102,94 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-- 1 2 279,26 0,36 (-------*--------) 2 2 288,53 0,40 (--------*--------) DC 2 283,50 4,05 (-------*--------) ----+---------+---------+---------+-- Pooled StDev = 2,36 276,0 282,0 288,0 294,0