Luận văn Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

..... 39 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮC HBV Hepatitis B Virus HBsAg Hepatitis B surface Antigen HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B e Antigen kb kilo base kDa kilo Dalton p protein gp glycoprotein DNA Desoxyribose Nucleic Acid RNA Ribose Nucleic Acid TB tế bào KN kháng nguyên ALT Alanine Aminotransfease, SGPT SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel PEG Polyethylene Glycol DTT Dithiothretol APS Ammonium persulfate TEMED Tetra – methylenediamine OD Optical Density MW Molecular Weight IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M PCR Polymerase Chain Reaction vii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Các dạng HBV. .................................................................................. 4 Hình 2.2. Tổ chức genome của HBV ................................................................ 5 Hình 2.3. Mô hình Virus toàn vẹn (virion) ....................................................... 6 Hình 2.4. Lƣợc đồ vòng đời HBV ..................................................................... 8 Hình 2. 5. Quá trình sao chép và nhân lên của HBV. ....................................... 9 Hinh 3.1. Quá trình thẩm tích .......................................................................... 22 Hình 3.2. Sắc ký lọc gel ................................................................................... 24 Hình 3.3. Sắc ký ái lực .................................................................................... 25 Hình 3.4. Nguyên tắc hoạt động của kit Architect®HBsAg (Abbott) ........... 28 Hình 4.1. Kết quả điện di SDS – PAGE 5 -15 % sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà .................................................... 30 Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharyl S 300 ................................................................................. 32 Hinh 4.3. Kết quả điện di SDS – PAGE 5- 15 % sau khi qua cột Sepharyl S 300 ................................................................................. 33 Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate ................................................................... 35 Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE DTT sau khi qua cột S Sepharose CL – 4B Dextran sulfate ................................................................. 36 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân viêm gan B .................................................................................... 11 Bảng 2.2. Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn ................. 11 Bảng 2.3. Phân typ của HBsAg ..................................................................... 13 Bảng 4.1. Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ..... 31 Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sepharyl S 300 ............................................................................. 33 Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau toàn bộ quá trình tinh chế HBsAg ............. 37 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh viêm gan virus B (HBV) là vấn đề mang tính toàn cầu, bởi đây là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Virus viêm gan B cũng chính là tác nhân liên quan đến ung thƣ tế bào gan và một số bệnh liên quan đến xơ gan, viêm gan mạn tính. Ngoài ra, HBV còn có thể lây truyền cho ngƣời khác qua đƣờng máu (tiếp xúc với máu hay các sản phẩm từ máu, dụng cụ dính máu). Theo ƣớc tính, ngƣời mang HBsAg sẽ có 40% có nguy cơ ung thƣ gan, tuy vậy có thể ngăn ngừa bệnh bằng vaccine, đặc biệt là lúc mới sinh bệnh. Theo phân bố dịch tễ học HBV của Tổ chức y tế Thế giới thì Việt Nam là một trong những nƣớc có nguy cơ cao về nhiễm virus viêm gan B, với tỉ lệ ngƣời mang HBsAg trong cộng đồng dân chúng từ 15 - 26%. Do đó, nguồn kháng nguyên tự nhiên ở những ngƣời lành mang HBsAg là rất nhiều. Đồng thời, HBsAg là kháng nguyên đƣợc sản xuất ra gấp bội so với các loại kháng nguyên khác của HBV và có hoạt tính kháng nguyên cao có thể sản sinh đƣợc kháng thể bảo vệ và chống lại HBV. Mặt khác, HBsAg lại rất đặc hiệu để chuẩn đoán bệnh HBV. Vì vậy, y học đã sử dụng HBsAg để làm vaccine, cũng nhƣ làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể nhằm tạo các bộ sinh phẩm chuẩn đoán HBV. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tinh chế kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B”. 2 1.2. Mục đích Tinh chế HBsAg tinh khiết từ dung dịch huyết thanh có HBsAg (+ + +) cao, xác định những ƣu điểm trong quy trình để đạt độ tinh khiết cao nhất có thể. 1.3. Yêu cầu  Loại bỏ lần lƣợt các thành phần protein huyết thanh qua các quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate, sắc ký lọc trên gel Saphacryl S300, sắc ký ái lực trên Sepharose CL - 4B - dextran sulfate.  Xác định tổng lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 280 nm (OD 280nm).  Xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng phƣơng pháp định lƣợng miễn dịch.  Kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên HBsAg đã tách chiết bằng phƣơng pháp điện di trên SDS - PAGE. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN 2.1. Lịch sử phát hiện HBV  1963: Blumberg phát hiện một loại kháng thể có thể phản ứng với một loại kháng nguyên trong mẫu huyết thanh của một thổ dân Úc bị viêm gan. Và đƣợc gọi là kháng nguyên Úc Châu (Au).  1967: phát hiện Au, là kháng nguyên bề mặt của virus gây viêm gan siêu vi loại B (HBsAg).  1970: Dane phát hiện kháng nguyên lõi (HBcAg), có đƣờng kính 42 nm trong máu của bệnh nhân bị viêm gan siêu vi B - gọi là hạt tử Dane.  1973: phát hiện HBeAg (kháng nguyên nội sinh).  1979: nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần.  1983: khuếch đại DNA virus bằng phƣơng pháp PCR do Mullis phát hiện. 2.2. Phân loại HBV Hepatitis B virus (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae do tính hƣớng gan và bộ gen DNA kép của chúng. Họ Hepadnaviridae có 2 nhóm phụ:  Orthohepadnavirus: gây viêm gan B ở loài có vú.  Avihepadnavirus: gây viêm gan B ở loài chim. 2.3. Hình dạng - Cấu trúc HBV [ 2 ] [ 3 ] [ 18 ] 2.3.1. Hình dạng Khi quan sát huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân lên của siêu vi bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta thấy có 3 dạng khác nhau  Hạt tử Dane hoặc virion hoàn chỉnh  Có dạng hình cầu, đƣờng kính 42 nm.  Khi nhuộm âm bản, virion hiện rõ cấu trúc 2 vỏ  Vỏ bọc bên ngoài đƣợc tạo bởi các protein bề mặt (HBsAg)  Vỏ bên trong đƣợc cấu tạo từ các protein lõi (HBcAg), tạo thành hình cầu có đƣờng kính 28 - 34 nm; gồm khoảng 240 bản sao của protein lõi. Bên trong chứa 4 cấu trúc DNA chuỗi đôi và các enzyme nhƣ enzyme DNA polymerase và protein kinase.  Cấu trúc hình cầu  Có đƣờng kính 15 - 25 nm, thƣờng có nồng độ 1013 /ml.  Đƣợc cấu tạo từ các protein bề mặt.  Các cấu trúc hình ống  Có đƣờng kính 20 - 22 nm, có chiều dài thay đổi, có nồng độ 1011/ml.  Các cấu trúc này có thể do cấu trúc hình cầu chồng chất lên nhau tạo ra. Hai cấu trúc hình cầu và hình ống là phần kháng nguyên bề mặt của siêu vi đƣợc sản xuất dƣ thƣờng từ tế bào gan và chúng biểu hiện những đặc tính kháng nguyên HBsAg. Nồng độ HBsAg trong huyết thanh 10 - 1000 µg/ml. Hình 2.1. Các dạng HBV 5 2.3.2. Cấu trúc gen Bộ gen HBV toàn vẹn có chiều dài từ 3.182 - 3.221 base. Bộ gen ở dạng vòng, gồm 2 sợi DNA có chiều dài không bằng nhau.  DNA chuỗi âm: nằm bên ngoài, 3 - 3,3 kb (thay đổi tuỳ loài Hepadnavirus), mã hoá cho các thông tin di truyền, chứa nhiều gen chồng lấp lên nhau, tạo thành vòng tròn liên tục và dƣ ra một đoạn 8 - 9 nucleotide. Đầu 5’ của mạch DNA âm mang vị trí gắn kết DNA polymerase của virus.  DNA chuỗi dƣơng: nằm bên trong, 1,7 - 2,8 kb, có đầu tận cùng 5’ cố định nhƣng đầu 3’ thay đổi. Đa số các bộ gen HBV có một đoạn hổng mạch đơn có chiều dài 300 - 2000 base. Đầu 5’ của mạch DNA dƣơng đƣợc tạo bởi một oligoribonucleotide dài 18 base, đƣợc gắn chóp giống mRNA. Cấu trúc vòng của DNA đƣợc đảm bảo nhờ sự ghép nối hai đầu 5’ của hai sợi DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide gọi là vùng liên kết.Vùng này nằm giữa hai trình tự DR1 và DR2 có 10 - 11 nucleotide. DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA âm và cũng hiện diện ở đoạn dƣ của đầu 3’. DR 2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA dƣơng. Hai trình tự này đóng vai trò khởi sự quá trình sao chép các chuỗi DNA tƣơng ứng. Hình 2.2. Tổ chức genome của HBV ( Trên mạch DNA âm của HBV của loài có vú có 4 khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein tƣơng ứng. Các đoạn đọc mở này nằm chồng lên nhau. Quá trình đọc mã bắt đầu bằng codon mở đầu (AUG) và kết thúc bằng codon kết thúc (TAG). 6  Gen S Bao gồm vùng S, pre –S1, pre-S2, mã hoá để tổng hợp các protein bề mặt.  Đoạn gen S: mã hoá cho protein bề mặt nhỏ (Small Hepatitis B surface) gồm 226 acid amine, có trọng lƣợng phân tử 24 kD. Protein này rất kỵ nƣớc, có thể glycosyl hoá ở asp 146. Là protein chủ yếu chiếm đa số. Ngƣời ta phát hiện ở vùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên. Tuỳ theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên mà ta phân loại đƣợc các chủng loại HBV. Quyết định chung ở tất cả các chủng phân lập HBs là a, kế đến là d và y, cuối cùng là w và r. Quyết định kháng nguyên w lại gồm những biến thể w1, w2, w3, w4. Hình 2.3. Mô hình virus toàn vẹn (virion) (  Nếu trình tự đọc mã bắt đầu từ vùng pre-S2 và tiếp tục cho đến hết vùng S sẽ tổng hợp nên protein bề mặt trung bình (Medium Hepatitis B surface) có trọng lƣợng phân tử 33 kD, gồm 281 acid amine rất ƣa nƣớc. Protein này gồm 2 dạng glycoprotein: gp 33 và gp 36. Vùng pre-S2 có đoạn trùng hợp với albumin huyết thanh (serium albumin) và trên tế bào gan có thụ quan đặc biệt cho albumin và thụ quan này là điểm xâm nhập của virus. Do đó, các vaccine sau này có thêm kháng nguyên pre – S2.  Gen S, pre-S1, pre S2: mã hoá tổng hợp nên protein bề mặt lớn (Large Hepatitis B surface ) có trọng lƣợng phân tử 39 kD mã hoá 389 acid amine gồm 2 dạng protein p 39 và gp 42. Chuỗi protein pre - S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng 7 chủng loại khác nhau.Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt tế bào gan sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào. Kháng thể anti - pre - S1 có thể trung hoà và ức chế siêu vi kết dính vào tế bào gan.  Gen C Gồm 2 vùng pre-C và C. Nếu quá trình đọc mã đƣợc bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg. Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C và C sẽ mã hoá cho việc tạo nên một đoạn peptide gồm 19 acid amine gọi là peptide tín hiệu. Peptide này giúp cho HBeAg đƣợc bài tiết qua hệ thống lƣới nội chất của tế bào gan dƣới dạng hoà tan trong huyết thanh. HBeAg là một protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng chƣa biết rõ. Tuy nhiên sự hiện diện của nó liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân đôi của siêu vi. Nếu quá trình dịch mã bắt đầu từ codon AUG thứ 2 ở vị trí 1901 đi suốt đoạn gen C sẽ tổng hợp nên HBcAg có trọng lƣợng phân tử 21 kDa, gồm 183 - 185 acid amine. Đây là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapside. Protein này không đƣợc bài tiết ra khỏi tế bào gan vì không có đoạn peptide tín hiệu.  Gen P Chiếm 80 % chiều dài bộ gen, chồng lấp lên một phần gen C và gen X, bao trùm toàn bộ gen S. Toàn thể gen P mã hoá cho một polypeptide có trọng lƣợng phân tử 80 - 90 kDa vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA lại vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA. Men DNA polymerase đƣợc dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiền genome mà sợi RNA tiền genome này lại đƣợc tạo ra từ khuôn mẫu là DNA của HBV dƣới tác dụng của men RNA polymerase của tế bào gan. Gồm 4 vùng: Vùng đầu tận cùng N: mã hoá cho primase là đoạn mồi cần thiết cho sự tổng hợp mạch DNA âm. Vùng kế tiếp: là vùng đệm nằm gối lên các vùng pre - S1 và pre - S2 vai trò chƣa hiểu rõ, có lẽ giúp biểu hiện các protein bề mặt trung bình và lớn. Vùng kế tiếp: mã hoá DNA polymerase phụ thuộc RNA hoặc DNA có vai trò là men phiên mã ngƣợc. Vùng này có một trình tự mã hoá các acid amine tƣơng đối ổn 8 định YMDD (tyrosine – methyonine – apartate - aspartate) có lẽ đây là vị trí xúc tác của men phiên mã ngƣợc. Vùng đầu C: là Rnase H có vai trò phân cắt RNA trong các thể lai RNA-DNA làm thoái biến khuôn trong lúc tổng hợp mạch DNA âm.  Gen X Có chiều dài 450 base mã hoá cho đoạn polypeptide khoảng 145 - 154 acid amine tạo nên HBxAg. Vai trò của HBxAg chƣa rõ, chƣa đƣợc chứng minh bằng thành phần cấu trúc của virion. Gần đây, HBx đƣợc chứng minh góp phần làm ung thƣ di căn. 2.4. Quá trình sao chép và nhân lên của HBV [ 18 ] Chu kỳ sống của HBV đƣợc chia thành nhiều bƣớc 1. Gắn virus vào màng tế bào ký chủ. 2. Sự xâm nhập của virus vào tế bào. 3. Sự phóng thích bộ gen của virus. 4. Sự biểu hiện các sản phẩm gen virus. 5. Sự sao chép bộ gen virus. 6. Lắp ráp các hạt virion. 7. Phóng thích virus. Hình 2.4. Lƣợc đồ vòng đời HBV (www.infekt.ch) 9 Virion vào cơ thể, xâm nhập vào tế bào, gắn lên thụ thể trên bề mặt tế bào, có sự dung hợp giữa màng tế bào và vỏ virus. Sau đó, virus sẽ phóng thích bộ gen vào trong nhân. Trong nhân, bộ gen sợi đôi không khép kín của HBV biến đổi thành DNA sợi đôi vòng khép kín đồng hoá trị (cccDNA.). cccDNA của virus sẽ liên kết với histone nhân của tế bào chủ hình thành nhiễm sắc thể nhỏ ngoại thể và đƣợc sử dụng làm khuôn để phiên mã tổng hợp các RNA. Các RNA dịch mã cho ra protein polymerase và protein lõi HBcAg. Hai protein này lắp ráp chung với mRNA hình thành phức hợp sao chép. Vùng primase của polymerase đƣợc dùng nhƣ những đoạn mồi đối với enzyme transcriptase sẽ phiên mã tiền genome RNA hình thành DNA sợi âm. Hình 2. 5. Quá trình sao chép và nhân lên của HBV 10 Khi DNA âm đƣợc tổng hợp, tiền genome mRNA sẽ bị giáng hoá dƣới tác dụng của Rnase H, trừ một đoạn nhỏ khoảng 20 cặp base ở đầu 5’. Đoạn RNA này sẽ hoạt động nhƣ một primer để tổng hợp DNA sợi dƣơng từ DNA sợi âm mới đƣợc tổng hợp, hình thành DNA sợi kép hoàn chỉnh. DNA sợi kép sẽ nhận vỏ bọc chứa HBsAg bằng cách đâm chồi từ màng bào tƣơng và sẽ trở thành những hạt virus gây nhiễm. Các hạt virion hoàn chỉnh này đƣợc giải phóng vào máu tuần hoàn và tiếp tục gây nhiễm các tế bào chủ tiếp theo. 2.5. Các phƣơng pháp xét nghiệm để phát hiện HBV [ 1 ] Hiện nay, việc chẩn đoán HBV thƣờng dựa vào các dấu ấn miễn dịch (finger -print) nhƣ tìm kháng nguyên HBs, HBe và kháng thể anti - HBs, anti - HBe, anti - HBc, tìm DNA hoặc hạt tử Dane trong huyết thanh hoặc trong tế bào gan bị nhiễm, xác định và định lƣợng kháng nguyên của HBV đặc biệt là HBsAg. 2.5.1. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết học Phƣơng pháp này dựa vào sự biến động các thành phần của máu. Khi bị nhiễm virus, bạch cầu đa nhân giảm, lympho bào tăng ở thời kỳ trƣớc vàng da và bình thƣờng khi vàng da. 2.5.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên chức năng gan Khi tế bào gan bị tổn thƣơng sẽ xuất hiện các hội chứng ứ mật làm tăng bilirubin máu, hội chứng viêm mô làm mất sự thăng bằng protein huyết tƣơng hoặc sự thay đổi thuộc tính của transaminase ở hội chứng huỷ hoại tế bào gan. 2.5.3. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học và hoá miễn dịch Phƣơng pháp trực tiếp phát hiện các hạt Dane hoặc kháng nguyên của HBV trong huyết thanh hoặc tế bào gan bằng kính hiển vi điện tử. Phƣơng pháp gián tiếp phát hiện HBV thông qua các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan có trong huyết thanh bằng cách cho chúng tạo phức với kháng nguyên hoặc kháng thể tƣơng ứng, việc đánh giá có thể thực hiện bằng mắt thƣờng hoặc bằng máy. 11 Bảng 2.1. Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn [ 1 ] Dấu ấn Cấp tính Mạn tính HBsAg IgM anti – HBc HBeAg / anti – Hbe HBV DNA Anti - HBs Dƣơng tính, rồi biến mất Dƣơng tính, cao HBeAg dƣơng, chuyển huyết thanh thành anti – HBe Dƣơng tính, rồi biến mất Xuất hiện khi hồi phục Dƣơng tính, tồn tại Thấp hoặc âm tính HBeAg hoặc anti – HBe Cao hoặc thấp, tồn tại Âm Bảng 2.2. Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân viêm gan [ 3 ] HBsAg HBeAg Anti-HBe Anti-HBc Anti-HBs Nhận định + + - - - Thời kỳ ủ bệnh hoặc khởi đầu giai đoạn cấp tính + + - + - Giai đoạn cấp tính hoặc mạn tính - - + + - Giai đoạn cuối hoặc mạn tính - - + + + Giai đoạn hồi phục sau cấp tính - - - + + Hồi phục từ nhiễm trùng - - - - + Nhiễm HBsAg không bị nhiễm trùng - + - Hồi phục sớm của nhiễm trùng mạn tính 12 2.6. Các kiểu lây truyền HBV [ 1 ] Có 4 kiểu lây truyền HBV chủ yếu sau  Lây nhiễm qua đƣờng máu và các dịch sinh lý cơ thể  Lây nhiễm HBV qua tiếp xúc tình dục  Lây nhiễm giữa các trẻ nhỏ qua tiếp xúc  Lây nhiễm qua chu sinh 2.7. Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) [ 3 ] 2.7.1. Bản chất của HBsAg  HBsAg là phần gắn liền với HBV.  Phần lớn là những hạt hình cầu đƣờng kính 22 nm hoặc những hạt hình ống chiều dài thay đổi, đƣờng kính 22 nm hoặc một số hạt đƣờng kính 42 nm. Tất cả các hạt này đều là HBsAg.  Phần lớn HBsAg có tỷ trọng 1,2 g/ cm3 trong chlorua cesium.  HBsAg đƣợc cấu tạo bởi protein và lipid.  HBsAg tinh khiết có trọng lƣợng phân tử cao 3.106 Da, song các quyết định kháng nguyên của HBsAg đƣợc biểu thị bằng các chuỗi polypeptid có kích thƣớc nhỏ hơn nhiều, ví dụ nhƣ 22.000, 27.000 và 49.000 Da, nồng độ từ 10 – 1.000 µg/ml. 2.7.2. Tầm quan trọng của HBsAg Việc phát hiện HBsAg trong huyết thanh của một ngƣời, chứng tỏ ngƣời đó có HBV và có khả năng truyền bệnh cho ngƣời khác. Việc xét nghiệm HBsAg cho những ngƣời cho máu để đề phòng truyền máu hoặc các sản phẩm của máu HBsAg (+) đã làm giảm đƣợc sự truyền máu có liên quan đến viêm gan B. HBsAg là chỉ điểm của một nhiễm trùng HBV ngay cả khi trạng thái của bệnh không rõ ràng. HBsAg có thể là một dấu hiệu duy nhất của một nhiễm trùng viêm gan B cấp tính trong một vài ngày đến vài tuần, trƣớc khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng hoặc các chỉ điểm khác của sự nhiễm trùng (kháng thể kháng kháng nguyên lõi của viêm gan B (anti-HBc) xuất hiện). 13 HBsAg đƣợc tìm thấy trong tất cả các thành phần của máu và các sản phẩm điều chế từ huyết thanh có HBsAg (+). Ngoài ra, HBsAg còn có trong các dịch tiết khác nhau của cơ thể: nƣớc tiểu, nƣớc mắt, sữa, nƣớc bọt… HBsAg là kháng nguyên rất bền vững 2.7.3. Các phân typ của HBsAg Kháng nguyên HBsAg có một quyết định kháng nguyên đặc hiệu nhóm a và hai cặp quyết định kháng nguyên: d và y; w và r. Cả ba quyết định kháng nguyên trên đều có mặt trong ba dạng thể virus. Với ba quyết định kháng nguyên trên sinh ra bốn dòng di truyền thứ là: adw, ayw, adr và ayr. Phân biệt bốn dòng trên có ích trong giám sát dịch tể học nhƣng bốn dòng đều gây bệnh lý nhƣ nhau. Bảng 2.3. Phân typ của HBsAg Quyết định kháng nguyên nhóm Alen quyết định kháng nguyên a Phân typ chính của HBsAg:adw, ayw, adr, ayr Quyết định kháng nguyên phân typ phụ:x, n, t, g, Re, j, k và tên gọi a1(w1), a21(w2),a3(w4) d-y w-r 2.7.4. Tinh khiết HBsAg [ 3 ] [ 11 ] Có thể tách chiết và tinh khiết HBsAg bằng nhiều kỹ thuật khác nhau gồm  Siêu ly tâm  Sắc ký cột.  Tập trung đẳng điện.  Kết tủa bằng ammonium sulfate hoặc polyethylen glycol.  Và các phƣơng pháp phối hợp các quá trình trên. Các thành phần hay liên kết với HBsAg là albumin, lipoprotein, 2-macroglobulin. Việc tinh khiết HBsAg từ bất kỳ nguồn nào cũng là một quá trình thử thách hoàn toàn khác với quá trình tinh khiết các protein khác, bởi vì sản phẩm mong muốn không 14 chỉ là một polypeptide 24 kD đơn thuần mà là một phức hợp của polypeptide lắp ráp với lipide của tế bào chủ vào hạt hình cầu 22 nm, mỗi hạt chứa khoảng 100 polypeptide. Vì lƣợng kháng nguyên có trong nguyên liệu ban đầu (huyết thanh, dung dịch ly giải nấm men…) chỉ khoảng 1% lƣợng protein toàn phần. Vì vậy việc phân tích trực tiếp có thể đƣợc tiến hành với các thử nghiệm dựa vào kỹ thuật hoặc miễn dịch men (ELISA) hoặc là miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA). Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và điện di trên SDS - PAGE đƣợc dùng để kiểm soát quá trình tinh khiết ở các giai đoạn sau khi kháng nguyên đã là thành phần cơ bản. Những kết quả làm biến tính và chạy điện di trên gel polyacrylamid của phòng thí nghiệm, một số tác giả mô tả có tới 11 băng trên HBs hình cầu đã đƣợc tinh chế. Một số khác cho rằng có 2 băng. Tóm lại, có 2 băng protein chủ yếu với MW = 22 - 26 (kD) và MW = 25 - 30 (kD). Theo Peterson (1977), protein lớn là dạng N - glycosyl hoá của protein loại nhỏ chƣa đƣợc glycosyl hoá. Những protein này là P24, PG 27. Rất nhiều tác giả cho rằng P24 và sản phẩm GP27 của nó là HBsAg hoặc protein HBs. Tuy nhiên, quan điểm này không thống nhất với định nghĩa gốc về HBsAg nhƣ là một thực thể của tất cả các thành phần KN có trên bề mặt của virus. Nghiên cứu một cách kỹ lƣỡng hơn tất cả các protein của virion viêm gan B cho thấy ngoài P24 và GP27 còn có ít nhất 4 băng nữa cũng có trên bề mặt của virion: GP33, GP36, P39, GP42. 2.7.5 Định lƣợng HBsAg [ 3 ] Kỹ thuật miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA) đã đƣợc sử dụng trƣớc đây để định lƣợng HBsAg trong huyết thanh. Bộ thuốc thử RIA bán trên thị trƣờng có thể xác định đƣợc 2 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ad và 6 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ay. Phần lớn các bộ thuốc thử HBsAg do Mỹ điều chế có thể xác định đƣợc hàm lƣợng HBsAg thuộc phân týp ad thấp hơn so với phân typ ay. 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng Miễn Dịch, Khoa sản xuất vaccine và sinh phẩm, Viện Pasteur Tp.HCM. Thời gian: từ 15/02/2006 - 30/06/06. 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Dụng cụ Pipetman và đầu tip các loại, erlen, bercher, eppendorf, ống nhựa 5ml, 15ml… 3.2.2. Thiết bị  Máy quang phổ Spectrophotometer U-3310  Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments.  Máy lọc nƣớc Titertek( Microtutration)  Máy đo pH METTLER TOLEDO MP220  Máy khuấy từ CAT M6/1  Cân phân tích Explorer OHAUS  Máy vortex Minishaker MS1  Bộ điện di SNEW  Máy AKTA Explorer , Amersham Bioscience. 3.2.3. Hoá chất và cách chuẩn bị các dung dịch 3.2.3.1. Hoá chất  Ammonium sulfate (NH4)2SO4  Sodium citrate  NaCl  NaN3  Glycerin  Sephacryl S300  Sepharose CL – 4B – Dexxtran sulfate  Acrylamide 16  N-N’- Methylene- bis- acrylamide  Tris base  SDS  Glycine  Coomassie R250  Methanol  Acid acetic  DTT  APS  TEMED 3.2.3.2. Cách chuẩn bị các dung dịch  Dung dịch (NH4)2SO4 100%S: (NH4)2SO4 767g Thêm vào 1lít nƣớc cất. Bảo quản trong chai nhựa.  Dung dịch đệm a (Sodiumcitrate 0,027M, NaCl 0,05M, NaN3 0,05%, pH= 7,4) Sodiumcitrate 6,986 g NaCl 2,922 g NaN3 1g Hoà tan trong 800 ml nƣớc cất, lọc qua giấy lọc Dùng dung dịch NaOH 1M chỉnh pH = 7,4, thêm nƣớc cất vào đủ 1l dung dịch.  Dung dịch đệm b (Sodiumcitrate 0,027M, NaCl 0,6M, NaN3 0,05%, pH= 7,4)  Dung dịch đệm c (Sodiumcitrate 0,027M, NaN3 0,05%, pH= 7,4) Các dung dịch b, c: cách chuẩn bị tƣơng tự dung dịch a. 17  Cách chuẩn bị dung dịch cho điện di SDS - PAGE  Dung dịch 40%T: Acrylamide 38,93 g N- N’- Methylene- bis- acrylamide 1,07 g Hoà tan vào khoảng 80 ml nƣớc, thêm vào một ít MB1, khuấy từ trong 30 phút. Cho thêm nƣớc vào đủ 100 ml.  Dung dịch 9,5 % T: Acrylamide 6,3 g N- N’- Methylene- bis- acrylamide 3,2 g Tiến hành tƣơng tự dung dịch 40% T.  Dung dịch đệm phân giải (1,5 M Tris): Tris - base 18,15 g Hoà vào khoảng 70 ml nƣớc, dùng HCl chỉnh pH = 8,8. Cho thêm nƣớc vào đúng 100 ml, bảo quản ở 40C.  Dung dịch đệm tập trung: Tris - base 3 g Hoà vào khoảng 35 ml nƣớc cất, dùng HCl chỉnh pH = 6,8. Thêm nƣớc vào đúng 50 ml, bảo quản ở 40C.  Dung dịch SDS 10 % SDS: 10 g Hoà trong 1 lít nƣớc cất, bảo quản nhiệt độ thƣờng.  Đệm bình điện di 4X: Tris- base 12 g Glycine 57,6 g Hoà tan vào nƣớc cất và chỉnh đúng 1000 ml, bảo quản ở 40C.  Dung dịch nhuộm protein : Coomassie R250 2,5 g Methanol 600 ml Acid acetic 90 ml 18 Trộn đều bột màu với hai dung dịch hữu cơ này để hoà tan trƣớc khi cho nƣớc vào và chỉnh đúng 1000 ml.  TEMED: 2 µl / ml  Dung dịch tẩy: Methanol 50 ml Acid acetic 75 ml Nƣớc cất đủ 1000 ml  APS: 100 mg/ ml. Pha trƣớc khi sử dụng 15 µg / 4ml  Bề mặt gel phân giải: isobutanol hoặc dung dịch đệm phân giải 0,5 ml dung dịch SDS 10 % 20 µl H2O 1,48 ml  Dung dịch xanh – DTT: Glycerol 2 ml SDS 10 % 2,5 ml DTT 15 mg Bromophenol 80 µl Đệm tập trung 2 ml H2O vừa đủ 10 ml  Các thành phần cần thiết cho điện di 15% SDS – PAGE - DTT Gel phân tích (Running gel) Dung dịch glycerol 1,5 g Dung dịch đệm phân giải 1,5 ml Dung dịch SDS 10% 60 µl Dung dịch 40% T 2,25 ml H2O 0,99 ml TEMED 8 µl APS 30 µl 19 Gel tập trung (Stacking gel) Dung dịch 9,5 % T 2 ml Dung dịch đệm tập trung 1 ml Dung dịch SDS 10 % 40 µl H2O 0,96 ml TEMED 15 µl APS 30 µl  Các thành phần cần thiết cho điện di 5 – 15% SDS – PAGE Gel phân tích %T 5% 15% Dung dịch glycerol (ml) 0,6 0,6 Dung dịch đệm phân giải (ml) 0,75 0,75 Dung dịch SDS 10% (μl) 30 30 Dung dịch 40%T (ml) 0,375 1,125 Nƣớc (ml) 1,245 0,495 TEMED (μl) 8 8 APS (μl) 15 15 Gel tập trung Dung dịch 9,5%T 2ml Dung dịch đệm tập trung 1ml Dung dịch SDS 10% 40μl H2O 0,96 ml TEMED 15μl APS 30μl  Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 thể tích mẫu : 1 thể tích xanh glycerol SDS  Xử lý mẫu : đun cách thuỷ trong 10phút  Tiến hành chạy điện di với : o Cƣờng độ dòng điện I = 50 mA o Hiệu điện thế U = 90 V o Thời gian t = 2giờ 30 phút  Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm gel trong dung dịch nhuộm 10 phút 20 3.3 Bố trí thí nghiệm Quy trình tổng quát tinh chế HBsAg Giai đoạn 1 : Thu mẫu Huyết thanh HBsAg (+++) Tủa phân đoạn bằng Ammonium sulfate Định lƣợng miễn dịch HBsAg Định lƣợng protein Điện di 5 – 15% SDS – PAGE Tinh chế HBsAg bằng sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300 Tinh chế HBsAg bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate Định lƣợng miễn dịch HBsAg Định lƣợng protein Điện di 5 – 15% SDS – PAGE Định lƣợng miễn dịch HBsAg Định lƣợng protein Điện di 15% SDS – PAGE -DTT 21 Mẫu huyết thanh chứa HBsAg (+ + +) thu từ phòng xét nghiệm của Viện Pasteur Tp.HCM (LAM). Bảo quản mẫu trong glycerin 10% và NaN3 0,05%, pH= 7,4,ở -20 0 C. Khi tiến hành, thực hiện tan băng ở 40C, ly tâm 3000 vòng/ phút, thu dịch nổi. Phần dịch nổi thu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh. Trích một phần dịch nổi  tiến hành pha loãng 105 lần  định lƣợng HBsAg trong mẫu bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott). Đ o mật độ quang OD 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số. Giai đoạn 2: Tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà. Giai đoạn 3: Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300. Giai đoạn 4: Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B - Dextran sulfate. Sau mỗi giai đoạn, tiến hành định lƣợng HBsAg trong dịch thu đƣợc bằng kit miễn dịch, đo mật độ quang OD 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số và điện di trên gel polyacrylamide dung dịch thu đƣợc. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate 3.4.1.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 17 ] Đây là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi các phân tử muối ammonium sulfate ở dạng hoà tan, có rất nhiều phân tử nƣớc bao quanh các phân tử muối này. Mặc khác trong dung dịch, protein đƣợc bao quanh bởi các phân tử nƣớc. Vì vậy, khi các nồng độ muối trong dung dịch gia tăng thì muối sẽ lấy những phân tử nƣớc này do đó có ít phân tử nƣớc tƣơng tác với protein. Đến một lúc nào đó sẽ không đủ nƣớc để duy trì dung dịch protein nên tạo thành tủa. Tuy nhiên, các protein khác nhau có độ tan khác nhau và khả năng tủa cũng khác nhau theo sự thay đổi của nồng độ muối, lực ion, pH của môi trƣờng… Dung dịch muối bão hoà thêm vào đƣợc tính theo công thức 22 V CC VCVC i i 000 Trong đó : C0: nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch ban đầu. V0: thể tích dung dịch ban đầu. Ci: nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch lúc sau. Cα: nồng độ dung dịch ammonium sulfate thêm vào. Vα: thể tích dung dịch ammonium sulfate thêm vào. Thực tế trong hầu hết các trƣờng hợp, hoạt tính enzyme đƣợc tìm thấy khi tủa ở 35% S - 45% S và 45% S - 55% S. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa huyết tƣơng qua 2 giai đoạn : 30% S 50%S.  Hai ƣu điểm của tủa bằng muối ammonium sulfate  Có thể loại đến 75% protein thô.  Dung dịch protein đƣợc cô đặc. Để hoà tan protein, cách tốt nhất và đơn giản nhất là làm giảm nồng độ muối trong tủa. Để tránh pha loãng mẫu, công việc có thể tiến hành bằng bao thẩm tích. Đây là loại bao làm bằng vật liệu polymer, trên bao chứa những vi lỗ cho phép sự khuếch tán xảy ra đối với các phân tử có kích thƣớc nhỏ. Các phân tử protein có kích thƣớc lớn hơn lỗ sẽ không thấm đƣợc qua màng nên đƣợc giữ lại trong bao. Nồng độ muối trong bao thẩm tích giảm dần đến khi đạt mức cân bằng giữa trong và ngoài màng thẩm tích. ( Hình 3.1. Quá trình thẩm tích 3.4.1.2. Tiến hành 23 Từ 113,5 ml dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm ở giai đoạn 1, tiến hành tủa bằng dung dịch muối ammonium sulfate 100% bão hoà. Nhỏ từ từ 49 ml ammonium sulfate trong điều kiện lạnh, sau đó bảo quản ở 4oC trong 24h, lúc này, dung dịch đạt nồng độ cuối là 30% bão hoà, ly tâm thu đƣợc 144 ml dịch nổi. Sau đó, tiếp tục tủa 144 ml dịch nổi với 57,6 ml ammonium sulfate 100% bão hoà để dung dịch đạt nồng độ 50% bão hoà. Ly tâm thu tủa, rửa tủa nhiều lần bằng ammonium sulfate 50% bão hoà để tủa trắng hoàn toàn, thu đƣợc 8 ml tủa Thẩm tích tủa trong đệm PBS 1X, NaN3 0,05%, pH = 7, tủa tan, ly tâm 3000 vòng / phút, thu 15 ml dung dịch protein.  Từ 15 ml dịch protein thu đƣợc  Tiến hành định lƣợng HBsAg Trích một phần trong dịch thu đƣợc pha loãng 105 lần trong đệm  định lƣợng miễn dịch bằng kit Architect®HBsAg (Abbott).  Đo mật độ quang OD 280 nm của dịch thu đƣợc bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số. 3.4.2. Phƣơng pháp tinh chế dung dịch protein bằng hệ thống gel lọc - cột Sephacryl S300 3.4.2.1. Nguyên tắc [ 5] [ 13 ] Là phƣơng pháp dùng để phân tách các phân tử có kích thƣớc, trọng lƣợng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Sắc ký lọc dùng những vật liệu là những vi hạt gel có khả năng ngậm nƣớc rất cao. Các hạt gel này là những sợi polymer (polyside, polyacrylamide…) dài, có những cầu nối liên kết ngang để làm giảm bớt độ mềm, chịu đƣợc sức ép khi bị nén mà không bị biến dạng, vẫn cho phép dung môi lƣu thông. Trên bề mặt cũng nhƣ phía trong các hạt gel, kích thƣớc của các kẽ không gian trống giữa các sợi polymer cho phép các phân tử tan trong dung môi có thể thấm vào không gian trong hạt gel và do đó có thể di chuyển quanh co trong cấu trúc của hạt gel. 24 Hình 3.2. Sắc ký lọc gel ( Khi cho hỗn hợp chứa những phân tử có kích thƣớc khác nhau qua cột sắc ký, chứa những lỗ có kích thƣớc giới hạn nhất định thì các phân tử có kích thƣớc lớn hơn không khuếch tán qua lỗ. Do đó, chúng sẽ ra khỏi cột trƣớc. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào trong lỗ gel và di chuyển trong lỗ gel. Sau đó, chúng sẽ đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng một dung dịch đẩy.  Sepharyl S 300: là gel agarose, có khả năng phân tách những protein có kích thƣớc từ 104 – 1,5.106Da. Vì vậy khi cho dung dịch chứa HBsAg qua cột, những phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trƣớc. Những phân tử có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn sẽ đi vào trong gel nên ra sau. 3.4.2.2. Tiến hành Cột gel Sephacryl S300 (dung tích cột V = 180 ml (gel)), rửa cột bằng dung dịch đệm a. Từ 15 ml dịch nổi thu đƣợc ở giai đoạn 3.4.1.2 chúng tôi tiến hành cho qua cột. Khi mẫu qua cột hết, tiến hành rửa cột bằng đệm a đến khi dịch rửa đi ra hết protein (kiểm tra bằng phƣơng pháp Bradford). Cho dung dịch đệm b qua cột để đẩy phần protein bám trên cột ra. 25 Dịch ra khỏi cột đƣợc đo mật độ quang OD 280 nm để đo hàm lƣợng protein tổng số và thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ, dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu, mỗi phân đoạn 5ml, tốc độ dòng 2ml/ phút. Dựa trên sắc ký đồ hình 4.2  Tiến hành thu các phân đoạn thuộc peak A (ống A11) và ống A10 đƣợc V = 20 ml.  Trích một phần trong dung dịch thu đƣợc (V= 20ml)  pha loãng 105 lần  định lƣợng kiểm tra hoạt tính HBsAg bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott)  Điện di trên SDS – PAGE 5 – 15% các peak A (ống A11), peak B (ống A12), peak C (ống B8), peak D (ống B5) thu đƣợc. 3.4.3. Phƣơng pháp tinh chế dung dịch protein bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate 3.4.3.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 8 ] Trong phƣơng pháp này các chất mang trên cột chứa các nhóm hoá học có ái lực đặc biệt với sản phẩm. Vì vậy khi cho một hỗn hợp các chất trong đó có chứa sản phẩm đi qua cột, sản phẩm mục tiêu đƣợc gắn một cách chuyên biệt vào chất mang và tất cả các thành phần khác không có ái lực với chất mang sẽ đi qua cột nhờ một đệm rửa. Sau đó, sản phẩm sẽ đƣợc thu nhờ dung dịch đẩy. Hình 3.3. Sắc ký ái lực ( 26 3.4.3.2. Tiến hành Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate (dung tích cột V = 20 ml), cân bằng cột bằng dung dịch đệm a, tiến hành cho mẫu V = 20 ml (phần dung dịch thu đƣợc ở giai đoạn 3.4.2.2) qua cột Sau khi mẫu qua cột hết, cho đệm a qua đến khi dịch rửa đã hết protein. Tiến hành đẩy phần protein bám ra khỏi cột bằng dung dịch đệm b. Dịch ra khỏi cột đƣợc thu 2 ml/ đoạn, tốc độ dòng 1ml/ phút, đo mật độ quang OD 280 nm của dịch thu đƣợc. Tiến hành thu phần bám trên cột V = 36 ml  Trích một phần trong dung dịch thu đƣợc (V = 36 ml)  pha loãng 105 lần  định lƣợng kiểm tra HBsAg bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott).  Điện di trên gel 15% SDS – PAGE - DTT .  Đo OD 280nm xác định hàm lƣợng protein tổng số 3.4.4. Phƣơng pháp đo mật độ quang OD 280 nm – xác định hàm lƣợng protein tổng số 3.4.4.1. Nguyên tắc [ 5 ] Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 280nm. Sự hấp thụ này có đƣợc chủ yếu là do các amino acid có nhân thơm nhƣ phenylalanine, tryptophan…Tuy nhiên, mỗi protein sẽ có thành phần và số lƣợng các amino acid khác nhau nên mỗi protein sẽ có một hệ số tắt (extintion) tƣơng ứng. Hệ số này là tỷ số giữa độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 280 nm (A280) trên nồng độ protein. 3.4.4.2 Tiến hành Mật độ quang của dung dịch đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 280 nm. 3.4.5. Phƣơng pháp điện di trên thạch SDS - polyacrylamide gel - kiểm tra mức độ tinh chế 3.4.5.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 6 ] Kỹ thuật điện di dựa trên nền tảng các phân tử mang điện tích (DNA, RNA, protein…) có khả năng di chuyển khi đặt chúng trong một điện trƣờng.Tốc độ di 27 chuyển của một protein trong phƣơng pháp điện di dựa vào sự khác biệt: đặc tính, kích thƣớc lỗ gel, trọng lƣợng phân tử, cƣờng độ điện trƣờng, thời gian điện di, nhiệt độ… Những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Các thành phần đƣợc sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là: acrylamide, N, N’- methylene - bis - (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate (APS) Khi tan trong nƣớc, APS tạo nên các gốc tự do theo cơ chế: (S2O8) 2-  2SO4 Các gốc tự do này hoạt hoá các phân tử acrylamide và N, N’- methylene – bis (acrylamide) tạo thành mạng lƣới polymer liên kết chéo giữa các phân tử này. Khi đó, trong mạng lƣới sẽ tạo nên các vi lỗ phụ thuộc vào hai thông số: (1) nồng độ acrylamide, ( 2) mức độ liên kết chéo. Nếu nồng độ acrylamide càng cao thì lỗ tạo nên càng nhỏ. TEMED đƣợc thêm vào ở nồng độ 0,4% để xúc tác cho việc tạo gel. Hệ thống đệm giúp duy trì pH trong thùng chứa đệm, trong gel và có vai trò nhƣ một chất điện phân cho phép dẫn dòng điện ngang qua điện trƣờng..SDS có vai trò làm biến tính protein do SDS kết hợp với vùng kị nƣớc của protein và tách chúng thành các tiểu phần, đồng thời làm âm tính hoá các tiểu phần này. Ngoài ra, nếu các tiểu phần của protein gắn kết với nhau bằng các liên kết disulfite, những liên kết này sẽ bị bẻ gãy khi có mặt SDS và β-Mercaptoethanol hay DTT tạo thành nhóm – SH. Những nhóm này sau đó sẽ bị khoá bởi tác nhân alkyl hoá để chống lại sự tái tạo liên kết disulfite. Để tăng hiệu quả phân tách, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp điện di không liên tục bằng cách dùng hai hệ gel gồm:  Lớp gel tập trung (lớp trên): có vai trò làm cho các đại phân tử tập trung lại tại một vạch xuất phát (bề mặt tiếp xúc giữa hai lớp gel), nồng độ acrylamide thấp.  Lớp gel phân tích (lớp dƣới): là lớp chính dùng để phân tách các đại phân tử trong mẫu, nồng độ acrylamide cao. 28 3.4.5.2 Tiến hành Chuẩn bị gel polyacrylamide có nồng độ 5 - 15 % với các thành phần đuợc ghi trong phần 3.2.3.2. Lần lƣợt đổ gel theo thứ tự gel phân tích trƣớc, gel tập trung sau. Các giếng cho mẫu vào đƣợc tạo bằng cách đặt lƣợc vào lớp gel tập trung. Sau khi gel đặc lại, tiến hành lấy lƣợc ra, lắp gel vào bình điện di, cho dung dịch đệm điện di vào. Thực hiện quá trình điện di, mẫu đƣợc cho vào các giếng, tiến hành chạy (I = 50mA, U = 90V), xử lý gel sau khi điện di bằng cách nhuộm gel với thuốc nhuộm Coomassie trong khoảng 10 phút. Sau đó, tiến hành tẩy bằng cách ngâm gel trong dung dịch tẩy đến khi nền gel trở nên trong suốt. 3.4.1. Phƣơng pháp định lƣợng HBsAg Dùng kit Architect®HBsAg (Abbott) 3.4.1.1. Khái niệm Đây là thử nghiệm miễn dịch sử dụng vi hạt phát quang bằng phƣơng pháp hoá học. Vi hạt đƣợc gắn với kháng thể HBsAg đơn dòng, dùng để định lƣợng HBsAg trong huyết thanh hay huyết tƣơng. 3.4.1.2. Nguyên tắc hoạt động Cơ chất  phát quang 29 3.4.6.3. Mục đích của kit Architect®HBsAg (Abbott)  Chuẩn đoán bệnh viêm gan  Giám sát tình trạng nhiễm bệnh  Chuẩn đoán bệnh cấp tính hay mãn tính 3.4.6.4. Xác định kết quả 3.4.6.4.1. Bố trí  Chuẩn: 0 – 250 UI/ ml  HBsAg + (1)  HBsAg + (2)  Chứng âm  Mẫu > 250 UI/ ml  pha loãng 1/500 3.4.6.4.2. Xác định kết quả Dựa vào đƣờng chuẩn. 3.4.6.5. Đánh giá kết quả thí nghiệm  OD < 0,05 UI/ ml: mẫu không phản ứng (HBsAg -)  OD > 0,05 UI/ ml: mẫu phản ứng  Kiểm tra lại: xem độ lặp lại bằng test trung hoà dùng kháng thể HBsAg ngƣời trung hoà: HBsAg (+) 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả định lƣợng HBsAg trong huyết thanh Hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch huyết thanh ban đầu đã pha loãng 105 lần khi định lƣợng bằng kit miễn dịch là: 0,573 mUI. Vậy hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 113,5 ml huyết thanh ban đầu là: 0,573. 113,5.10 5 = 6505.10 3 mUI. 4.2. Kết quả sau giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà Với mục tiêu tinh chế kháng nguyên HBsAg trong huyết thanh vì vậy chúng tôi tiến hành loại các protein không mong muốn ra khỏi huyết thanh. Do đó, chúng tôi sử dung phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate nhằm mục đích loại protein albumin trong huyết thanh. Đồng thời để xác định hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong dung dịch sau tủa ammonium sulfate chúng tôi tiến hành định lƣợng miễn dịch dung dịch bằng kit Architect®HBsAg (Abbott). Kết quả định lƣợng hoạt tính HBsAg trong 1ml dung dịch sau tủa đã pha loãng 10 5 lần là: 1,89 mUI . Vậy trong 15 ml dung dịch sau tủa ammonium sulfate là: 1,89.15.10 5 = 2830.10 3 mUI Hình 4.1. Kết quả điện di SDS – PAGE 5 - 15 % sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà 31 Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Albumin chuẩn 5,3 2 Huyết thanh HBsAg(+++) 5,1 3 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 5,5 4 Albumin chuẩn 5,3 5 Huyết thanh HBsAg (+++) 9,75 6 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 10,36 Bảng 4.1. Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.10 3 Sau tủa (NH4)2SO4 15 2830.10 3 43,5 2058 23 1,37.10 3 1,86 (V(ml) : là thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau mỗi giai đoạn.) Nhận xét Dựa vào hình 4.1, ta thấy có sự khác biệt giữa các giếng. Giếng 3, 6 là dung dịch huyết thanh đã qua tủa không chứa vạch protein Albumin, trong khi đó giếng 2, 5 là dung dịch huyết thanh ban đầu lại chứa vạch protein Albumin.Kết quả này cùng với bảng 4.1 cho thấy:  Giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate đã loại đƣợc phần lớn albumin có trong huyết thanh.  Từ 113,5 ml huyết thanh ban đầu, sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate chỉ thu đƣợc 15 ml dịch chứa HBsAg. Vậy thể tích dung dịch protein đã đƣợc cô đặc đáng kể.  Hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với protein tổng số theo giá trị OD tăng từ 0,736.103 lên đến 1,37.103 (mUI/ OD) và mức độ tinh khiết giai đoạn này là 1,86 lần. 32 4.3. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300 Do kháng nguyên HBsAg có trọng lƣợng phân tử khá lớn 3.106 Da, lớn nhất trong các loại protein huyết thanh cùng với mục tiêu loại các protein có trọng lƣợng phân tử nhỏ nên chúng tôi sử dụng gel lọc Sepharryl S300 để loại các protein có trong lƣợng phân tử nhỏ, tập trung các protein có trọng lƣợng phân tử lớn. Gel lọc Sephacryl S300 có kích thƣớc lỗ 104- 1,5.106Da. Do đó những protein có trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel sẽ ra trƣớc (protein kháng nguyên HBsAg), những protein có kích thƣớc nhỏ hơn hoặc bằng kích thƣớc lỗ sẽ ra sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy. Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharcyl S 300 Kết quả định lƣợng hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch sau khi qua gel lọc đã pha loãng 105 lần bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) là: 1,5 mUI. Vậy hoạt tính kháng nguyên trong 20 ml dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc là: 1,5.20.10 5 = 3000.10 3 mUI. 33 Hình 4.3. Kết quả điện di 5 – 15% SDS – PAGE sau khi qua cột Sephacryl S 300 Giếng 1: Huyết thanh HBsAg (+++) Giếng 2: Huyết thanh sau tủa NH42SO4 Giếng 3: Đoạn A11 (peak A) sau Sephacryl Giếng 4: Đoạn A12 (peak B) sau Sephacryl Giếng 5: Đoạn B8 (peak C) sau Sephacryl S300 Giếng 6: Đoạn B5 (peak D) sau Seephacryl S300 Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sephacryl S 300 Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.10 3 (NH4)2SO4 15 2830.10 3 43,5 2058 23 1,37.10 3 1,86 Sepharyl 20 3000.10 3 46 118,26 1,3 25,36.10 3 34,4 V (ml) l à thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau mỗi giai đoạn. 34 Nhận xét Dựa vào kết quả của quá trình điện di hình 4.3 cùng với sắc ký đồ hình 4.2 khi chạy 7ml mẫu cho thấy: Ống A11, A12 tƣơng ứng với các peak A, B là những protein có trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc gel lọc nên ra trƣớc so với đoạn B8 và B5 tƣơng ứng các peak C, peak D chứa những protein có trọng lƣợng phân tử nhỏ nên ra sau. Do đó, chúng tôi kết luận sau giai đoạn sắc ký lọc gel, chúng tôi đã:  Loại đƣợc các protein có trọng lƣợng phân tử nhỏ  Tập trung các protein có trọng lƣợng phân tử lớn (peak A v à peak B).  Dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc có hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trên hàm lƣợng protein tổng số (theo giá trị OD) đạt 25,36.103 (mUI/ OD) và độ tinh chế giai đoạn này đạt 34,4 lần. Do đó, chúng tôi dùng dịch protein thu đƣợc của peak A và B ( V= 20 ml) để tiếp tục tinh chế cho giai đoạn tiếp theo. 4.4. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực - cột Serpharose CL – 4B dextran sulfate Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate là cột sắc ký ái lực, do đó khi cho dung dịch protein có chứa HBsAg đi qua, cột sẽ giữ lại HBsAg trên cột nhờ có ái lực với dextran sulfate gắn trên gel. Sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy ta sẽ thu đƣợc HBsAg (peak thứ 2 phần bám trên cột). Dung dịch thu đƣợc (phần bám trên cột) sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate sau khi định lƣợng miễn dịch xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) chúng tôi thu đƣợc kết quả: Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trong 1ml đã pha loãng 105 lần là: 0,39 mUI. Vậy trong 36 ml dịch thu đƣợc có hàm lƣợng là: 0,39.36.105 = 1404.103 mUI. 35 Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharose CL - 4B dextran sulfate. Do HBsAg có trọng lƣợng phân tử lớn 3.106 Da nên chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp điện di trên 15% SDS – PAGE – DTT, với mục đích sử dụng DTT để cắt phân tử protein có cấu trúc phức tạp trong dung dịch thu đƣợc sau khi qua cột (phần bám trên cột) thành những đoạn có cấu trúc đơn giản có thể phân tách đƣợc trên gel. 36 Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE – DTT sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 2 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 3 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 4 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 5 Marker 6 Lysozyme 4 Albumin 5,3 Marker: hãng Invitrogen Vị trí Trọng lƣợng phân tử (kDa) 1. Myosin 250 2. Phosphorylase 148 3. Glutamin dehydrogenase 60 4. Carbonic anhydrase 42 5. Myoglobin – blue 30 6. Myoglobin – red 22 7. Lysozyme 17 8. Aprotinin 6 9. Insulin – B chain 4 37 Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau toàn bộ quá trình tinh chế HBsAg Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN (mUI) Hoạt tính ( %) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.10 3 (NH4)2SO4 15 2830.10 3 43,5 2058 23 1,37.10 3 1,86 Sephacryl 20 3000.10 3 46 118,26 1,3 25,36.10 3 34,4 Sepharose CL 4B – dextran sulfate 36 1406.10 3 21,6 43,4 0,49 32,35.10 3 44 Nhận xét Dựa vào kết quả điện di hình 4.5 cùng với thang chuẩn (marker), chúng tôi rút ra kết luận: Dung dịch sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate:  Chứa các phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa, trùng với các kết quả của các tác giả khác khi nghiên cứu và chạy điện di với HBsAg đã đƣợc tinh chế.  Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số tăng lên đáng kể 32,35.103 mUI/ OD  Độ tinh chế đạt 44 lần so với ban đầu . 38 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua thời gian tƣơng đối ngắn thực hiện đề tài tại Phòng Miễn Dịch, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, với mục tiêu của khoá luận là “tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)”. Với các kết quả thực nghiệm đạt đƣợc trên, chúng tôi đạt một số kết quả sau:  HBsAg đã đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số là 32,35.103 mUI/ OD.  HBsAg đƣợc tinh chế với độ tinh chế 44 lần. Kết quả này tƣơng đƣơng với kết quả tinh chế của các tác giả khác trên thế giới.  HBsAg đƣợc tinh chế khá tốt, kết quả đƣợc thể hiện trên gel điện di: dung dịch HBsAg thu đƣợc chứa các băng có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng ứng với các quyết định kháng nguyên của HBsAg. 5.2. Đề nghị Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, nên chúng tôi chỉ có thể tinh chế HBsAg. Do đó, chúng tôi có đề nghị sau:  Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch thu đƣợc bằng phƣơng pháp Western Blot để đánh giá chính xác kháng nguyên HBsAg .  Tiếp tục tinh chế HBsAg với độ tinh chế cao hơn để có thể sử dụng làm kháng nguyên gây miễn dịch trên súc vật thí nghiệm để thu kháng thể tƣơng ứng.  Và trong tƣơng lai tạo bộ sinh phẩm dùng chẩn đoán phát hiện virus viêm gan B trong máu. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT . 1. TS.BS Trần Hữu Hầu, 2001. Tìm hiểu viêm gan virus B. NXB Y học, TpHCM. 2. PGS.TS Nguyễn Thanh Bảo, 2004. Virut học. ĐH Y Dƣợc TpHCM – Khoa Y - Bộ môn Vi Sinh, NXB Y học TpHCM 3. PGS.TSKH Nguyễn Thu Vân, 2002. Viêm gan virut B và văcxin dự phòng. NXB Y học, Hà Nội. 4. Nguyễn Thu Vân, Hoàng Thuỷ Nguyên và Howard A.Fields,1992. Tình trạng nhiễm các loại virus viêm gan A, B, C, D trong những nhóm người khác nhau và việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine viêm gan B ở Việt Nam.Tạp chí vệ sinh phòng dịch, tập II, số 1. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 5. Terrance G. Cooper, 1977. The tools of biochemistry. 6. David Freifelder, 1976. Physical biochemistry. 7. Pharmacia Fine Chemicals. Ion exchance chromatography: Principle and methods. 8. Amersham Pharmacia Biotech. Affinity chromatography: Principle and methods. 9. Melnick J. W., 1981. Historical aspects of hepatitis B vaccine. (P. Maupas and P. Guesry, eds). INSERM Symposium No 18, Elsevier/ North – Holland Biomedical Press, Amsterdam. 10. Darrel L. Peterson, 1981. Isolation and characterization of major protein and glycoprotein of hepatitis B surface antigen. Journal of biological chemistry. 11. Monica Einarsson, Lennar Kaplan and Govan Utle, 1978. Purification of hepatitis B surface antigen by affinity chromatography. 40 12. Lin JY, Hsieh YS, Chu SC. The isolation and purification of pre – S2 containing Hepatitis B virus surface Antigen by Chemical Affinity Chromatography. Insitute of Biochemistry. 13. Amersham Pharmacia Biotech. Gel Permeation Chromatography: Principle and Methods. INTERNET 14. 15. 16. 17. 18. virolory-online.com 19. tamm.ebc.ee/~iilves/ hepatiit/hepatiit.html 20. www-micro.msb.le.ac.uk/ 3035/HBV.html 21.