Luận văn Tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp của atenolol

tylaxetat theo tỷ lệ 1g: 10ml được đun hồi lưu 20 phút trên nồi cách thuỷ, lọc nóng và bay hơi ở áp suất giảm đến khi còn 1/2 thể tích, để nguội, atenolol sẽ kết tinh, lọc và rửa vài lần bằng etylaxetat lạnh, làm khô. 2.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH HẠ HUYẾT ÁP CỦA ATENOLOL Độc tính cấp và hoạt tính hạ huyết áp của atenolol được thực hiện ở Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu độc tính cấp của atenolol Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 18 – 22g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 4 ngày trước khi nghiên cứu, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do. Chuột được cân để xác định trọng lượng và được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con. Sau đó xác định LD50 của atenolol trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon [3]. Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt được uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 3g/kg đến 21g/kg, uống 3 lần trong 24 giờ, mỗi lần uống cách nhau ít nhất 2h. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu và tính toán LD50. Nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp của atenolol 2.3.2.1 Đối tượng, thiết bị và hoá chất Đối tượng: Gồm 75 con chuột cống trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 195 – 243g do Học viện Quân y cung cấp. Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi nghiên cứu, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do. Chuột được cân để xác định trọng lượng và được phân thành 5 lô ngẫu nhiên, mỗi lô 15 con. Thiết bị: + Hốt khử mùi của hãng ESCO, Singapore + Máy đo huyết áp từ đuôi chuột (LE 5002 Storage pressure meter, Italy) + Và các thiết bị nhỏ lẻ khác (bộ đồ mổ, kim cong, chỉ...). Hoá chất: Dung dịch nước muối sinh lý, cồn 900 và ete, thuốc atenolol (vỉ 50mg của hãng STADApharm GmbH, Germany sản xuất). 2.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu mô phỏng theo phương pháp của Evant [28] Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của dược chất atenolol trên chuột cống trắng theo mô hình thắt động mạch thận. Đo huyết áp gián tiếp từ đuôi chuột cống trắng. Dùng ete để gây mê chuột và phẫu thuật thắt động mạch thận trong hốt khử mùi. Đo huyết áp và nhịp tim trước 24 giờ và sau 6 - 7 ngày thắt động mạch thận. Các lô nghiên cứu bao gồm: Lô 1 (n = 15): uống nước bình thường (Lô đối chứng âm) Lô 2 (n = 15): uống liều 56mg/kg trọng lượng/ngày Lô 3 (n = 15): uống liều 84mg/kg trọng lượng/ngày Lô 4 (n = 15): uống liều 112mg/kg trọng lượng/ngày Lô 5 (n = 15): uống thuốc atenolol (viên 50mg/kg) 14mg/kg trọng lượng/ngày (Lô đối chứng dương) Chuột được uống thuốc trong 3 ngày liên tiếp sau 7 ngày thắt động mạch thận. Mỗi ngày uống 1 liều duy nhất vào khoảng 7 – 8 giờ sáng. Đo huyết áp và nhịp tim sau uống thuốc 3 giờ và 7 giờ mỗi ngày. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tổng hợp 3.1.1. Kết quả tổng hợp axit p-hydroxymadelic Axit p-hydroxymadelic là hợp chất trung gian quan trọng trong tổng hợp atenolol. Ngoài axit p-hydroxymadelic, 2 đồng phân nữa của nó là các axit o và m-hydroxymandelic cùng được biết đến như là các hợp chất kháng khuẩn in vitro ( Kháng E.typhi và staphylococcus aureus). Về mặt cấu tạo, axit p-hydroxymandelic có trung tâm bất đối, do đó axit này xuất hiện các đồng phân quang học. Trong thực tế, khi điều chế các axit này bằng phương pháp hoá học chúng ta nhận được hỗn hợp raxemic của các axit hydroxymandelic. Để tổng hợp hỗn hợp raxemic của axit p-hydroxymandelic, có khá nhiều phương pháp được giới thiệu. Tuy nhiên, hai con đường thường hay được sử dụng nhất là đi qua dẫn xuất nitrin và hydroxyankyl hoá trực tiếp phenol, ví dụ tổng hợp axit p-hyđroxymanelic qua con đường nitrin: Ngoài ra một con đường khác được lựa chọn để tổng hợp các axit p-hydroxymandelic là thực hiện phản ứng trực tiếp giữa phenol và axit glyoxylic So với các phương pháp trên thì phương pháp này thực hiện ở điều kiện nhiệt độ và áp suất thường, quy trình phản ứng không phức tạp và hiệu suất có thể chấp nhận được. Do đó chúng tôi lựa chọn phương pháp này để tổng hợp axit p-hydroxymandelic từ phenol và axit glyoxylic loại 50% trong nước trong môi trường kiềm. Theo lý thuyết phản ứng thì sản phẩm tạo thành luôn là 2 dạng đồng phân axit o và p-hydroxymandelic và tỷ lệ 2 dạng này phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng. Ở đây chúng tôi tiến hành phản ứng ở nhiệt độ lúc đầu là 10-150C, sau đó nâng nhiệt độ phản ứng lên 350C trong thời gian 3 giờ, sau khi axit hoá, loại bỏ phenol dư và chiết bằng etylaxetat (EtOAc) để thu lấy sản phẩm axit p-hyđroxymanelic màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy 98-1000C phù hợp với tài liệu [49], hiệu suất 65%. Thực nhiệm cho thấy, hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ lúc nhỏ giọt và nhiệt độ lúc duy trì phản ứng. Ảnh hưởng của các yếu tố này đến hiệu suất của phản ứng cũng đã được khảo sát và kết quả được đưa ra ở bảng 2. Bảng 2: ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng tổng hợp axit p-hydroxymandelic Ảnh hưởng của nhiệt độ lúc nhỏ giọt Ảnh hưởng của nhiệt độ lúc phản ứng STT Nhiệt độ Hiệu suất STT Nhiệt độ Hiệu suất 1 2 3 4 5 10-15 20 30 50 Không k/ soát 65 62 45 28 0 1 2 3 4 5 35 45 60 80 100 65 60 56 40 30 Kết luận: Phản ứng tổng hợp axit p-hydroxymandelic được tiến hành với lượng dư phenol trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 350C cho hiệu suất tốt trong điều kiện nghiên cứu. Nhiệt độ khi cho dung dịch NaOH vào và nhiệt độ phản ứng được khống chế lần lượt là 10-150C và 350C. Nhiệt độ cao hơn sẽ ưu tiên cho phản ứng phụ tạo dẫn xuất axit o-hydroxymandelic và phản ứng Canizzaro làm giảm hiệu suất của phản ứng tạo axit p-hydroxymandelic. Cấu trúc của sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Phổ hồng ngoại FT-IR của sản phẩm đo ở dạng viên nén với KBr (phụ lục 1.1). Trên phổ hồng ngoại xuất hiện các băng sóng rộng, cường độ lớn với đỉnh ở 3477,36 cm-1 của dao động hoá trị tự do nhóm –OH, dao động hoá trị đặc trưng của vòng benzen xuất hiện tại 3241,25 cm-1 (C-H thơm), các băng sóng 2940,76 của liên kết C-H thẳng; 1693,45 của liên kết C=O của axit; 1610,52 cm-1 của liên kết C=C trong vòng thơm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (hình 1) của sản phẩm đo trên máy Bruker Advance 500MHz cho thấy sản phẩm chứa vòng thơm có kiểu thế 1,4 với các vị trí proton của vòng thơm xuất hiện lần lượt tại 6,73 ppm và 7,19 ppm, tín hiệu của nhóm –CH– ngoài vòng gắn với nhóm COOH và OH xuất hiện như vạch đơn có dH = 4,89 ppm, proton gắn với nguyên tử oxi đính vào vòng thơm có dH =5,65ppm với cường độ tín hiệu thấp, proton của nhóm OH ngoài vòng có tín hiệu ở 3,45ppm và proton của nhóm cacboxy (COOH) có tín hiệu thấp tại 9,39ppm. Hình 1: Phổ 1H-NMR của axit p-hydroxymandelic Trên phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của sản phẩm (phụ lục 1.3) xuất hiện 8 tín hiệu các bon, trong đó có 2 tín hiệu chập đôi của 4 nguyên tử các bon trong vòng thơm, điều này càng khẳng định kiểu cấu trúc thế 1,4 của vòng thơm này. Ngoài ra 1 tín hiệu các bon xuất hiện tại 175,34 ppm được gán cho nguyên tử các bon của nhóm COOH và tín hiệu ở 72,00 ppm được quy cho nhóm –CH– ngoài vòng. Kết quả xác định cấu trúc phổ 1H-NMR và 13C-NMR của sản phẩm p-hydroxymandelic được đưa ra ở bảng sau. Bảng 3. Độ chuyển dịch hoá học trong phổ 1H-NMR và 13C-NMR Phổ 13C-NMR Phổ 1H-NMR C (vị trí) d (ppm) H (vị trí) ppm J(Hz) C1 131,45 2 H3,5; ddd 6,72 j1=8, j2=3, j3=2 C3,5 115,73 2 H2,6; d 7,19 j=8 C4 157,79 1 H7; s 4,89 C2,6 128,80 1 H (-OH); 5,65 C7 72,00 1H (COOH) 9,39 C8 175,34 1 H (C7OH) 3,45 Cũng trên phổ 1H-NMR; 13C-NMR còn cho thấy ngoài sản phẩm chính axit p-hydroxymandelic còn có một lượng nhỏ sản phẩm phụ là axit o-hydroxymandelic. Dựa vào phổ 1H-NMR ta có thể tính được tỷ lệ giữa hai dạng là 47:3. 3.1.2. Kết quả tổng hợp axit p-hydroxyphenylaxetic Quá trình khử hóa axit p-hydroxymandelic thành axit p-hydroxyphenylaxetic có thể được thực hiện bằng các tác nhân khử hóa khác nhau như H2 xúc tác Pd/C 5% [20 ]; CrCl3 [38] hoặc KH2PO4 và SnCl2.2H2O [7], trong các phương pháp trên xúc tác Pd/C 5% quá đắt, CrCl3 và KH2PO4 phải điều chế tại chỗ khi tiến hành phản, như vậy sử dụng SnCl2.2H2O để khử axit p-hydroxymandelic là thuận lợi hơn cả, phỏng theo tài liệu [7] chúng tôi tiến hành phản ứng khử hoá axit p-hydroxymandelic bằng SnCl2.2H2O trong môi trường axit ở 85 – 900C và sản phẩm dễ dàng tách ra khi làm lạnh hỗn hợp xuống 100C. Lọc thu lấy sản phẩm, tinh chế bằng nước thu đựơc axit p-hydroxyphenylaxetic sạch với hiệu suất 95%, có nhiệt độ nóng chảy là 1500C, phù hợp với tài liệu [7]. Phản ứng xảy ra như sau: Để xác định cấu trúc của sản phẩm axit p-hydroxyphenylaxetic tạo thành, chúng tôi đã tiến hành đo phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối MS. Phổ hồng ngoại được đo ở dạng viên nén với KBr (phụ lục 2.1). Từ phổ hồng ngoại các nhóm chức và liên kết được quy kết như sau: υ: 3246,82 cm-1 (O-H); 3057,83 cm-1 (C-H thơm); 2915,07 cm-1 (C-H thẳng); 1705,11cm-1 (C=O); 1603,33 cm-1 (C=C). Phổ MS của sản phẩm ở giai đoạn này (phụ lục 2.5) cho thấy, sản phẩm có M=152 trùng với khối lượng phân tử của axit p-hydroxyphenylaxetic. Trên phổ MS còn có các mảnh phân rã với các giá trị m/z lần lượt là 107, 79 và 77 cho phép chúng ta đưa ra sơ đồ phân mảnh của axit p-hydroxyphenylaxetic như sau: Trong phổ 13C-NMR của sản phẩm axit p-hydroxyphenylaxetic có 8 nguyên tử các bon trong đó δC=173,10 ppm của cácbon axit, 2 tín hiệu cácbon chập đôi có δ = 115,01 ppm và 130,23ppm chứng tỏ vòng benzem này bị thế 1,4, một nhóm -CH2 - xuất hiện ở 39,00 ppm. Các vị trí tín hiệu, cường độ của các nguyên tử cacbon trong phổ 13C-NMR và DEPT hoàn toàn phù hợp với công thức cấu tạo của axit p-hydrophenylaxetic. Các dữ kiện trong phổ proton (phụ lục 2.2) cũng khẳng định sản phẩm là axit p-hydrophenylaxetic. Sự quy kết các tín hiệu trên phổ 1H-NMR; 13C-NMR của sản phẩm được đưa như sau: 1H-NMR δ(ppm): H3,5 6,69 (d,J=8Hz); H2,6 7,04 (d, J=8Hz); 2H7 3,44 (s); H axit 12,15 13C-NMR δ(ppm): C1 125,10; C4 156,03; C3,5 115,01; C2,6 130,23; C7 39,00; C8 173,10 Cũng từ phổ NMR cho thấy, sản phẩm khử hóa thu được chỉ có axit p-hydroxyphenylaxetic mà không thấy xuất hiện sản phẩm phụ axit o-hydroxyphenylaxetic. 3.1.3. Kết quả tổng hợp p-hydroxyphenylaxetamit. Theo các tài liệu tham khảo, amit có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm đi từ axit tương ứng, đi từ dẫn xuất nitrin, từ p-hydroxyphenylmetylxeton (như đã nêu ở phần tổng quan) hoặc đi từ các dẫn xuất halogen [39; 41], ngoài ra amit cũng có thể được tổng hợp từ axit cacboxylic và phương pháp chung để chuyển axit sang amit là thực hiện phản ứng thế ái nhân với NH3. Tuy nhiên, do khả năng phản ứng thế ái nhân của axit kém [39] nên để cho quá trình chuyển hóa được thuận lợi, bước đầu tiên là chuyển axit thành este, trong trường hợp này, axit p-hydroxyphenylaxetic được chuyển thành dạng metyleste với methanol trong dung môi isobutylmetylxeton và xúc tác HCl ở nhiệt độ sôi, axit p-hydroxyphenylaxetic được điều chế từ axit p-hydroxymandelic không cần phải làm khô và được hoà trong isobutylmetylxeton và đun nóng đến 1050C để loại bỏ hết nước trong hỗn hợp phản ứng nhờ hỗn hợp đẳng phí của dung môi này và nước sôi ở nhiệt độ đó, tiếp theo đó làm lạnh hỗn hợp đến 100C và lượng dư metanol và xúc tác HCl được thêm vào, sản phẩm este thu được cho phản ứng trực tiếp với NH3 dư (28-30%) trong khoảng 12 – 14 giờ ở nhiệt độ phòng để thu được p-hydroxyphenylaxetamit có màu trắng ngà, T0 nóng chảy 172-1740C. Phản ứng xảy ra như sau: Để xác định cấu trúc của sản phẩm phản ứng chuyển hoá axit p-hydroxyphenylaxetic, chúng tôi sử dụng các phổ như FT-IR, MS và các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ IR của sản phẩm được đo ở dạng viên nén với KBr (phụ lục 3.1). Từ phổ hồng ngoại, các băng sóng hấp thụ và các liên kết được quy kết như sau: 3390,30 cm-1 (N-H), 3225,32 cm-1 (C-H thơm); 2931,23 cm-1 (C-H thẳng); 1659,55 cm-1 (C=O amit), 1613,55 cm-1 (C=C). Từ phổ hồng ngoại có thể sơ bộ nhận dạng được sự có mặt của các nhóm amin. –OH, liên kết C=C thơm trong cấu trúc của sản phẩm. Để xem xét sản phẩm có phải là chất mong muốn không, phương pháp đơn giản nhất là đo phổ khối lượng trước khi đo phổ NMR. Phổ MS được đo trên máy LC-MS/ Agilent 6310 Ion Trap của Mỹ cho pic ion phân tử có M=151 (M + 1 = 152), điều này chứng tỏ phân tử có một nguyên tử N nên số khối lẻ, phù hợp với khối lượng phân tử của p-hydroxyphenylaxetamit. Hình 2: Phổ khối của p-hydroxyphenylaxetamit Phổ 13C-NMR (125 Hz) cho thấy phân tử của nó có chứa 8 nguyên tử C với 2 tín hiệu của các nguyên tử Cacbon bị chập đôi có δ = 114,94ppm và 129,94ppm chứng tỏ vòng benzen này bị thế 1,4, một tín hiệu C bậc 4 ở 172,78ppm của C=O trong amit, ngoài ra các tín hiệu các bon ở nhóm -CH2- xuất hiện ở 41,44ppm. Kết hợp với phổ DEPT (Phụ lục 3.4) có thể nhận định các tín hiệu của các nguyên tử cacbon trong phổ hoàn toàn phù hợp với công thức của p-hydroxyphenylaxetamit. Hình 3: Phổ 1H-NMR của p-hydroxyphenylaxetamit Hình 4: Phổ 13C-NMR của p-hydroxyphenylaxetamit Kết quả xác định cấu trúc của p-hydroxyphenylaxetamit được đưa ra như sau : 1H-NMR δ(ppm): H3,5 6,69 (ddd, J1=8,5Hz; J2=3Hz; J3=1,5 Hz) ; H2,6 7,04 (d, J=8,5Hz); 2H7 3,24 (s); H8amit 6,79 (s); H8amit 7,33 (s); H(OH) 9,19 13C-NMR δ(ppm): C1 126,62; C4 155,81; C3,5 114,94; C2,6 129,94; C7 41,44; C8 172,87 Như vậy, các dữ kiện vật lý và dữ kiện phổ đều phù hợp với cấu trúc của p-hydroxyphenylaxetamit và sản phẩm thu được chính là chất trung gian chìa khóa quan trọng p-hydroxyphenylaxetamit. 3.1.4. Kết quả tổng hợp hỗn hợp epoxi và halohydrin của p-hydroxyphenyl axetamit Sau khi đã điều chế được chất trung gian chìa khoá p-hydroxyphenylaxetamit, bước tiếp theo chúng tôi tiến hành tổng hợp atenolol. Bước đầu tiên trong quá trình này là thực hiện phản ứng giữa p-hydroxyphenylaxetamit với epiclohydrin. Theo các tài liệu tham khảo được, phản ứng giữa các chất này có thể sử dụng kiềm hoặc xúc tác chuyển pha. Trước hết chúng tôi tiến hành phản ứng tổng hợp hỗn hợp epoxi và halohydrin của p-hydroxyphenylaxetamit trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH) theo tỷ lệ về khối lượng giữa p-hydroxyphenylaxetamit : epiclohydrin là 1:3. Phản ứng được khuấy trộn trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Lọc thu sản phẩm và xác định khả năng chuyển hóa và tỷ lệ giữa hai dạng epoxi : halohydrin bằng (HPLC). Kết quả cho thấy, trong điều kiện nghiên cứu tỷ lệ giữa hai dạng là 2:1 và hiệu suất của phản ứng là 94%. Còn theo tài liệu [8] tỷ lệ hai dạng là 3:1 và hiệu suất 93 % (tính theo HPLC). Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu phản ứng tổng hợp hai dạng epoxi và halohydrin nêu trên có sử dụng xúc tác chuyển pha N,N,N-trimetylamoniclorua ở 900C trong một giờ với tỷ lệ giữa p-hydroxylphenylaxetamit : epiclohydrin là 1:4. Sau khi thu sản phẩm, xác định khả năng chuyển hóa tỷ lệ và tỷ lệ giữa hai dạng epoxi và halohydrin bằng HPLC (của LC-MS). Đối với xúc tác chuyển pha N,N,N-trimetylamoniclorua, hiệu suất đạt 84 % và tỷ lệ giữa hai dạng là 4:1, còn theo tài liệu [50] thì tỷ lệ này là 4:1 Đối với phản ứng này, khi sử dụng xúc tác chuyển pha, hiệu suất phản ứng cũng khá cao 84% so với 94% của phản ứng sử dụng kiềm. Tuy nhiên, thời gian phản ứng chỉ còn là một giờ thay vì 5 ngày. Như vậy, hướng sử dụng xúc tác chuyển pha có thể ứng dụng ở quy mô lớn trong thực tiễn và khi sử dụng xúc tác này, nhiệt độ của phản ứng cũng đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng chuyển hóa. Để xác định nhiệt độ thích hợp nhất cho phản ứng này, các thí nghiệm nghiên cứu được tiến hành với các điều kiện như nhau nhưng ở các nhiệt độ 700C, 800C, 900C, 1000C và không khống chế nhiệt độ. Kêt quả nghiên cứu được chỉ ra ở bảng sau: Bảng 4: Hiệu suất của phản ứng và tỷ lệ giữa hai dạng epoxi và halohydrin STT Nhiệt độ (0C) Tỷ lệ 2 dạng nepoxi nhalohydrin ntổng Hiệu suất(%) 1 70 1 : 3,35 0,0051 0,0057 0,0108 45,4 2 80 2,04 : 1 0,0131 0,0056 0,0189 79,4 3 90 3,9 : 1 0,0166 0,0036 0,0202 84,9 4 100 4,09 : 1 0,0160 0,0033 0,0193 81,1 5 Không khống chế 30 Kết quả ở bảng 2 cho thấy, phản ứng giữa p-hydroxyphenylaxetamit và epiclohydrin với xúc tác N,N,N-trimetylamoniclorua cho hiệu suất tốt nhất 84,9% với tỷ lệ hai dạng sấp xỉ 4:1. Khi không khống chế nhiệt độ phản ứng tạo ra rất nhiều sản phẩm phụ và hiệu suất chỉ đạt 30%. Cuối cùng, chúng tôi tiến hành thử nghiệm điều chế hỗn hợp epoxi và halohydrin của p-hydroxyphenylaxetamit bằng hỗn hợp kiềm NaOH và xúc tác chuyển pha N,N,N-trimetylamoniclorua. Các phản ứng được thực hiện ở các nhiệt độ từ 40- 800 C trong một giờ. Sau khi xác định khả năng chuyển hóa và tỷ lệ giữa hai dạng, chúng tôi thấy phản ứng sử dụng hỗn hợp kiềm và xúc tác chuyển pha (xem phần phụ lục) cho hiệu suất cao hơn (91% so với 85%) xúc tác chuyển pha và trong cùng điều kiện nghiên cứu. Trên phổ LC-MS của tất cả các mẫu khảo sát chỉ có hai pic lớn của sản phẩm cần quan tâm có các thời gian lưu tương ứng là tR1 và tR2 lần lượt là 10,9 và 12,4 phút tương ứng với các số khối là 207 và 243 hoàn toàn trùng khớp với số khối của hai dạng epoxi và halohydrin. Ngoài ra, trong tất cả các phổ LC-MS đều xuất hiện một pic có tR = 12,9 phút tương ứng với số khối là 358 là sản phẩm phản ứng thế SN2 2 lần, các kết quả đo LC-MS cũng cho thấy sản phẩm phụ không mong muốn có hàm lượng không đáng kể (chiếm từ 1-6,5%). Từ đó chúng tôi dự đoán sản phẩm chính và sản phẩm phụ của phản ứng này như sau: Về mặt cơ chế, theo các tài liệu chúng tôi tham khảo được phản ứng xảy ra theo cơ chế SN2. Tốc độ và hướng của phản ứng cùng thay đổi tùy theo xúc tác được sử dụng. Do đặc điểm cấu trúc của epiclohydrin có chứa vòng epoxi không bền, không đối xứng và một liên kết phân cực C-Cl nên đây là chất chứa nhiều trung tâm cho phản ứng nucleophin, tuy nhiên phản ứng thế SN2 chủ yếu xảy ra ở các vị trí 1 và 3 và như vậy phản ứng chỉ có thể xảy ra theo hai hướng như sau : Hướng thứ nhất : Trong môi trường kiềm, p-hydroxyphenylaxetamit sẽ chuyển thành dạng phenolat của nó chính là tác nhân nucleoplin tấn công vào liên kết C-Cl để tạo ra dạng epoxi: Hướng thứ hai : Tác nhân nucleoplin tấn công vào liên kết -CH2-O- của vòng epoxi không bền để tạo thành dạng halohydrin, tiếp theo đó dạng này đóng vòng trở lại để tạo ra dạng epoxi như sau : Về mặt lý thuyết, phản ứng này có thể tạo ra hỗn hợp gồm 4 dạng: epoxi, halohydrin, dạng diol và dạng amit đối xứng (M=358). Tuy nhiên ,trong các điều kiện nghiên cứu phản ứng này, chúng tôi chỉ thấy có hỗn hợp hai dạng epoxi và halohydrin và sản phẩm phụ có M=358 là dạng amit đối xứng như dự đoán của chúng tôi. Từ các kết quả này, chúng tôi đưa ra sơ đồ chung cho các phản ứng này như sau : Hình 8: Phổ LC-MS của sản phẩm khi sử dụng hỗn hợp xúc tác Hình 5: Phổ LC-MS của sản phẩm khi sử dụng hỗn hợp kiềm và xúc tác chuyển pha Sau khi khảo sát ảnh hưởng của xúc tác và nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng, chúng tôi quyết định chọn hỗn hợp xúc tác chuyển pha N,N,N-trimetylamoniclorua và NaOH cho phản ứng này nhằm giảm bớt thời gian phản ứng mà hiệu suất chênh nhau không đáng kể. 3.1.5. Kết quả tổng hợp atenolol Giai đoạn cuối cùng trong tổng hợp atenolol là thực hiện phản ứng mở vòng. Do đặc điểm cấu trúc của vòng epoxi mà các hợp chất này dễ dàng tham gia phản ứng cộng hợp nucleophin mở vòng. Các tác nhân nucleophin sẽ dễ dàng tham gia phản ứng với các epoxi. Trong đó: R là các gốc hydrocacbon Y là tác nhân nucleophin Đây là phản ứng của các anion nucleophin trong môi trường trung tính hoặc môi trường kiềm. Đối với phản ứng này, người ta thường sử dụng nước hoặc ancol làm dung môi để dạng anion ankoxit dễ dàng chuyển thành ancol. Phản ứng cộng hợp nucleophin mở vòng cũng có thể được tiến hành với sự xúc tác của axit Một điều rất quan trọng ở đây là với xúc tác khác nhau, sự tấn công của các tác nhân nucleophin vào vòng epoxi không đối xứng cũng có sự khác biệt [30]: Với quá trình tổng hợp atenolol, dựa vào cấu trúc của sản phẩm tạo thành mà chúng ta có thể xác định được rằng, sự chuyển hóa dạng epoxi thành atenolol được tiến hành trong môi trường nước hoặc môi trường bazơ. Hơn nữa, tác nhân của phản ứng này là isopropylamin, một hợp chất có tính bazơ. Do vậy, môi trường cho phản ứng chuyển hóa này chính là môi trường bazơ. Hợp phần amin được sử dụng để tổng hợp atenolol là một tác nhân nucleophin mạnh nên quá trình mở vòng epoxi khá dễ dàng. Phản ứng giữa dạng epoxi với isopropylamin: Cơ chế phản ứng: trong đó R: Cơ chế của phản ứng này là sự cộng hợp mở vòng. Tác nhân nuleophin là isopropylamin tấn công vào nguyên tử cacbon bậc 1 để mở vòng. Tiếp đến là quá trình tách proton từ hợp phần amin. Anion ankoxit sẽ kết hợp với proton này và sản phẩm cuối cùng tạo thành là atenolol. Nếu lượng amin bậc 1 (trong trường hợp này là isopropylamin) chỉ được dùng với lượng thiếu hoặc vừa đủ thì sản phẩm vừa được tạo ra là amin bậc 2 (chính là atenolol) sẽ trở thành tác nhân phản ứng, nó sẽ tiếp tục tấn công vào dẫn xuất halogen để tạo ra amin bậc 3, bậc 4: Như vậy, với mục đích chỉ thu lấy sản phẩm amin bậc 2 là atenolol, số mol isopropylamin phải được lấy dư và phản ứng chỉ dùng lại ở giai đoạn đầu. Mặt khác phản ứng phải thực hiện ở nhiệt độ sôi của isopropylamin với việc sử dụng sinh hàn hồi lưu hiệu lực. Sau phản ứng, lượng dư của isopropylamin dễ dàng được loại bỏ nhờ phương pháp cất thông thường ở 950C. Sản phẩm atenolol được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong etylaxetat. Atenolol thu được có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 153 – 154oC, hiệu suất thu hồi của giai đoạn này đạt 73%. Phổ UV-VIS của sản phẩm trong metanol cho 3 đỉnh hấp thụ cực đại ở giá trị lmax 226, 276 và 282 nm tương ứng của dải E và dải B của vòng benzen liên hợp với nguyên tử O còn cặp đôi điện tử tự do, phù hợp với cấu trúc phân tử atenolol. Hình 6: Phổ UV-VIS của sản phẩm Phổ hồng ngoại FT-IR (hình 7): băng sóng hấp thụ tại 2251,14 cm-1 đã bị biến mất hoàn toàn, băng sóng hấp thụ sắc, nhọn xuất hiện tại 3356,50 cm-1 được cho là dao động hoá trị của nhóm –N-H. Ngoài ra, các tín hiệu của nhóm -C=O trong nhóm amit cũng xuất hiện tại 1637,38 cm-1. Kết quả xác định các nhóm trong trong phân tử atenolol bằng phổ hồng ngoại được đưa ra ở bảng 5. Hình 7: Phổ hồng ngoại của sản phẩm Bảng 5: Các giá trị hấp thụ của các nhóm chức trong phổ hồng ngoại STT Số sóng (cm-1 ) Nhóm chức tương ứng 1 3356,50 -OH (hoá trị) 2 3175,19 -NH (hoá trị) 3 2966,37 2924 2870 C-CH3 (hoá trị) CH2 (hoá trị) CH (hoá trị) 3 1637,78 -C=O amit (hoá trị) 4 1612,99 và 1515,34 -C=C vòng thơm (hoá trị) 5 1412,77 CH(CH3)2 (hoá trị) 6 1244,44 -C-O (hoá trị) 7 900 – 800 C-H benzen (biến dạng ngoài vòng) Từ các đỉnh hấp thụ và vị trí số sóng của chúng trên phổ hồng ngoại cho thấy được sự có mặt các nhóm chức –OH, –NH, –C=O (amit) và các liên kết C=C trong vòng thơm của sản phẩm, có trong cấu trúc phân tử của atenolol. Phổ cộng hưởng từ proton : Phổ 1H-NMR của atenolol được đo trong dung môi DMSO (dimetyl sulphoxide). Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của sản phẩm cho thấy các vạch phổ ứng với các proton có độ dịch chuyển hoá học, cường độ tích phân tín hiệu, độ bội hoàn toàn phù hợp với cấu trúc sản phẩm. Trong đó có 2 cặp với 4 proton trong vòng thơm xuất hiện ở độ dịch chuyển hoá học 7,25 ppm và 6,95 ppm; 6 proton trong 2 nhóm -CH3 có độ dịch chuyển hoá học tại 0,97 và 0,99 ppm, các nhóm CH và CH2 ngoài vòng xuất hiện tại các vị trí có độ dịch chuyển từ 0,97 ppm đến 3,95 ppm , trên phổ còn xuất hiện các tín hiệu proton ở δ = 6,83 ppm và 7,39 ppm được quy cho 2 hidro của nhóm amit, các tín hiệu tại 7,17 ppm và 6,86 ppm được quy cho 4 proton của vòng thơm, các tín hiệu từ 0,97 ppm đến 3,94 ppm là các proton mạch ngoài. Kết quả phân tích được đưa ra trong bảng 3.7. Hình 8: Phổ 1H-NMR của sản phẩm Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR (hình 9) của sản phẩm cho thấy phân tử của nó có 14 nguyên tử cacbon, trong đó có xuất hiện ba tín hiệu chập đôi lần lượt tại các vị trí có độ dịch chuyển δC = 22,95 ppm ứng với hai nhóm metyl trong nhóm isopropyl; 114,22 ppm ứng với 2 nguyên tử các bon ở vị trí ortho và 130,00 ppm ứng với 2 nguyên tử các bon ở vị trí meta. Các tín hiệu chập đôi (C2’, C6’) và (C3’,C5’) chứng tỏ vòng benzen có hai nhóm thế ở vị trí 1,4, đồng thời sự có mặt của nhóm C=O được khẳng định bởi tín hiệu có độ dịch chuyển δC = 172,69 ppm. Ngoài ra, các tín hiệu xuất hiện trong vùng có độ dịch chuyển hóa học từ δC = 41,38 ppm đến δC = 70,68 ppm chứng tỏ rằng trong phân tử atenolol có các nhóm CH và CH2 gắn với các dị tố oxi và nitơ. Kết quả phân tích được đưa ra trong bảng 6. Hình 9: Phổ 13C-NMR của sản phẩm Các quy kết bằng các phổ 1H-NMR và 13C-NMR ở trên càng được củng cố thêm trong phổ DEPT (hình 10), trên phổ DEPT 14 nguyên tử các bon được phân bố như sau: 6 nhóm CH bao gồm hai cặp chập vào nhau có δC = 114,22 ppm và 130,00 ppm – là một đặc trưng rất dễ nhận của vòng benzen thế 1,4; hai tín hiệu CH còn lại có δC = 48,21 ppm và δC = 68,41 ppm của C9 và C7; 3 nhóm CH2 có δC = 41,38 ppm; 50,06 ppm và 70,86 ppm lần lượt là của C10, C8 và C6. Ba nguyên tử cacbon bậc 4 xuất hiện tại δC = 128,40 ppm; 157,34 ppm và 172,69 ppm lần lượt là các nguyên tử C4’, C8’ và C1’ hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của atenolol. Hình 10: Phổ DEPT của sản phẩm Bảng 6. Kết quả phân tích phổ NMR của atenolol Phổ 13C-NMR Phổ 1H-NMR C(vị trí) σ (ppm) C(vị trí) σ (ppm) H(vị trí) σ (ppm, Hz) H(vị trí) σ(ppm, Hz) 2’’,3’’ 7’ 1’’ 3 2 22,8 41,32 48,18 49,97 68,32 1 2’,6’ 4’ 3’,5’ 1’ 8’ 70,80 114,18 128,37 129,95 157,29 172,57 3H2’’, d 3H3’’, d H3a, m (H3b,H1’’),m 2H7’,s H2,H1a,m 0,97, J=2 0,98, J=2 2,54 2,67 3,28 3,83 H1b,m H (OH) H8a(NH2) H2’,H6’ H3’,H5’ H8b(NH2) 3,90 4,9 6,80 6,86(J1= 8,5; J2= 3; J3=2) 7,14 (J1= 8,5; J2= 3) 7,36 Phổ khối lượng MS của sản phẩm: Các dữ kiện trên phổ khối cho biết sản phẩm có một pic ion phân tử (M-H)+ = 267, tức là số khối của phân tử là 266, vì số khối M là chẵn nên trong phân tử phải có 2 nguyên tử N. Các dữ kiện này hoàn toàn phù hợp với atenolol. Hình 11: Phổ khối (MS) của sản phẩm Bằng các phương pháp vật lý và hoá lý, chúng tôi có thể kết luận sản phẩm cuối cùng của phản ứng thu được là atenolol có công thức cấu tạo như sau: 3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính của atenolol 3.2.1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của atenolol Sau khi uống thuốc thử, ở những lô dùng thuốc liều thấp dưới 6g/kg, chuột không có hiện tượng gì đặc biệt: ăn uống, vận động bình thường, chuột không bị khó thở, đi ngoài phân khô. Ở những lô chuột uống thuốc thử liều cao, chuột giảm vận động, có khi co rúm người lại, có hiện tượng khó thở, tai và đuôi tím tái. Từ liều 6g/kg trở lên có chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc thử lần đầu. Số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ được ghi lại ở bảng 7: Bảng 7: Số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ STT Liều dùng (g/kg) n Số chuột chết (con) Tỉ lệ % 1 3 10 0 0 2 6 10 1 10 3 9 10 2 20 4 12 10 4 40 5 15 10 7 70 6 18 10 8 80 7 21 10 10 100 Từ kết quả bảng trên ta xây dựng được đồ thị về mối liên quan giữa liều dùng và số chuột chết trên hình 11. Liều g/kg Số chuột chết Hình 11. Biểu đồ về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết Với R2 = 0,9776 đã cho thấy hai đại lượng này có mối tương quan rất chặt, do đó ta có thể sử dụng phương trình y = 0,5833x – 2,4286 để tính được LD50 = 12,7g/kg. Liều % chuột chết Tính độ lệch chuẩn: Biểu diễn mối liên quan này qua tỉ lệ % (hình 12), tính LD16 và LD84 (tức là liều dùng làm chết lần lượt 16% và 84%) Hình 12. Biểu đồ về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết theo tỉ lệ % Từ phương trình trên hình 2 ta tính được: LD16 = 6,9g/kg; LD84 = 18,5g/kg; với hệ số k = 0,66, d = 3. Như vậy, độ lệch chuẩn = 1,52. Kết luận LD50 của thuốc thử atenolol là: 12,7± 1,52g/kg 3.2.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp 3.2.2.1. Kết quả đo huyết áp và nhịp tim trước và sau khi thắt động mạch thận (bảng 8) Bảng 8. Giá trị huyết áp và nhịp tim trước và sau khi thắt động mạch thận Các lô nghiên cứu N Trước khi thắt (1) Sau khi thắt (2) Huyết áp (mmHg) Nhịp tim (nhịp/phút) Huyết áp (mmHg) Nhịp tim (nhịp/phút) Tâm thu Tâm trương Tâm thu Tâm trương Lô 1 15 107,7±11,8 60,8±8,5 384,4±9,3 146,7±11,2 89,5±6,4 400,9±12,6 Lô 2 15 109,3±14,2 63,9±12,8 385,8±16,8 148,3±16,6 90,3±11,8 401,9±14,5 Lô 3 15 111,0±13,9 62,9±13,6 382,2±16,8 150,1±13,7 92,1±11,9 406,6±14,9 Lô 4 15 108,3±13,3 64,0±12,8 390,2±11,7 148,7±9,6 90,7±6,0 410,1±15,5 Lô 5 15 112,5±15,2 63,1±12,1 389,1±18,9 150,7±12,3 91,9±12,2 402,9±13,2 P (1),(2) < 0,05 Kết quả cho thấy các giá trị huyết áp và nhịp tim sau khi thắt động mạch thận cao hơn rõ rệt so với trước khi thắt (p<0,05), điều này chứng tỏ đã xây dựng thành công mô hình tăng huyết áp thực nghiệm bằng cách thắt động mạch thận. Theo lý thuyết, khi giảm máu tới thận thì thận tăng tiết renin, chất có tác dụng chuyển angiotensinogen thành angiotensin I, sau đó angiotensin I chuyển thành angiotensin II (dưới tác dụng của emzym chuyển dạng ACE: angiotensin converting enzyme) làm co mạch dẫn đến tăng huyết áp nhưng lại làm giảm nhịp tim [42, 43]. Tuy nhiên, thực tế trong nghiên cứu của chúng tôi, sau khi thắt động mạch thận, huyết áp tăng cao và kèm theo rối loạn tăng nhịp tim. 3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp * Đối với huyết áp tâm thu (bảng 9) Bảng 9. Kết quả đo huyết áp tâm thu của các lô sau 3 ngày uống thuốc Lô N BP sau thắt động mạch Ngày thứ 1 (mmHg) Ngày thứ 2 (mmHg) Ngày thứ 3 (mmHg) 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 1 15 146,7±11,2 (a) 150,2±10,4 (1) 151,0±10,2 (2) 153,6±8,7 (3) P (1),(2),(3) với (a) >0,05 2 15 148,3±16,6 (b) 144,7±16,1 143,8±16,5 140,0±12,5 140,3±12,8 137,6±13,6 137,2±13,0 P (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) >0,05 3 15 150,1±13,7 (c) 141,8±10,1 141,8±10,3 129,2±9,7 129,9±10,2 128,3±7,1 126,0±5,9 P (1,3),(1,7) với (c) >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 4 15 148,7±9,6 (d) 142,3±8,7 142,4±8,9 123,8±11,9 121,5±10,2 122,1±10,9 118,9±9,7 P (1,3),(1,7) với (d) >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (d) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 5 15 150,7±12,3 (e) 125,8±9,6 126,9±10,9 121,3±9,7 122,6±12,3 118,6±10,2 120,2±8,2 P Tất cả các ngày so với (e) <0,05 Ghi chú. BP: Blood Pressure – Huyết áp; (1,3): ngày thứ 1 vào lúc 3 giờ Đối với huyết áp tâm trương (bảng 10) Bảng 10. Kết quả đo huyết áp tâm trương của các lô sau 3 ngày uống thuốc Lô N BP sau thắt động mạch Ngày thứ 1 (mmHg) Ngày thứ 2 (mmHg) Ngày thứ 3 (mmHg) 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 1 15 89,5±6,4 (a) 91,0±5,4 (1) 91,1±4,5 (2) 93,6±4,0 (3) P (1),(2),(3) với (a) >0,05 2 15 93,8±11,8 (b) 89,0±11,2 87,1±10,5 86,0±10,3 84,9±9,2 83,9±9,1 82,7±9,3 P (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) >0,05 3 15 92,1±11,9 (c) 97,3±8,6 86,3±8,4 73,9±4,8 75,8±4,9 73,5±5,9 73,8±7,4 P (1,3),(1,7) với (c) >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 4 15 90,7±6,0 (d) 87,6±6,1 86,5±8,0 76,0±9,8 75,7±10,6 75,6±9,1 77,9±7,2 P (1,3),(1,7) với (d) >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (d) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 5 15 91,9±12,2 (e) 78,8±8,7 79,9±8,9 76,3±7,7 76,0±9,1 73,7±9,2 74,9±8,2 P Tất cả các ngày so với (e) <0,05 * Đối với nhịp tim (bảng 11) Bảng 11. Kết quả đo nhịp tim của các lô sau 3 ngày uống thuốc Lô N BP sau thắt động mạch Ngày thứ 1 (nhịp/phút) Ngày thứ 2 (nhịp/phút) Ngày thứ 3 (nhịp/phút) 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 1 15 400,9±12,6 (a) 400,9±11,8 (1) 405,5±8,1 (2) 410,1±8,9 (3) P (1),(2),(3) với (a) >0,05 2 15 401,9±14,5 (b) 399,1±14,7 398,3±13,8 397,8±12,2 396,5±12,5 394,5±10,4 394,6±12,9 P (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) >0,05 3 15 406,6±14,9 (c) 400,1±11,2 397,6±9,9 385,5±8,2 387,0±7,1 383,3±9,8 382,0±9,6 P (1,3),(1,7) với (c) >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 4 15 410,1±15,5 (d) 404,3±14,9 403,6±13,9 392,8±12,2 393,1±11,1 391,3±9,3 393,8±10,7 P (1,3),(1,7) với (d) >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (d) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 5 15 402,9±13,2 (e) 388,7±8,7 390,3±10,5 384,9±8,3 386,7±9,1 380,3±11,2 382,1±11,6 P Tất cả các ngày so với (e) <0,05 Từ các bảng kết quả trên cho thấy, ở lô đối chứng âm, các chỉ số về huyết áp và nhịp tim hầu như không thay đổi so với sau khi thắt động mạch (p>0,05). ở các lô thí nghiệm (từ lô 3 – lô 4) các chỉ số có xu hướng giảm dần trong 3 ngày uống thuốc thử ở 3 liều tương ứng (56mg/kg, 84mg/kg và 112mg/kg). Tuy nhiên: Ở lô 2, các chỉ số về huyết áp và nhịp tim có giảm nhưng chưa thấy có sự giảm khác biệt so với giá trị sau thắt động mạch (P>0,05). Ở lô 3 và 4, các chỉ số về huyết áp và nhịp tim cũng đều giảm so với các giá trị đó sau khi thắt động mạch, đặc biệt giảm rõ rệt sau 3 giờ uống thuốc của ngày thứ 2 (P<0,05). Chưa thấy có sự khác biệt về tác dụng hạ huyết áp của hai lô 3 và lô 4. So sánh kết quả của các lô thí nghiệm với lô chuột uống thuốc atenolol (thuốc bán trên thị trường). Lô này được coi như lô đối chứng dương vì atenolol là một dược phẩm thường được kê đơn cho bệnh nhân cao huyết áp, bệnh mạch vành, làm chậm và điều hoà nhịp tim (thuốc nhập ngoại). Kết quả cho thấy tác dụng hạ huyết áp rõ rệt của thuốc atenolol này, làm hạ huyết áp ngay sau 3 giờ uống thuốc của ngày thứ nhất (P<0,05). Kết quả thu được cho thấy dược chất atenolol tổng hợp cũng có tác dụng làm giảm huyết áp và điều hoà nhịp tim nhưng có tác dụng chậm hơn so với thuốc atenolol nhập ngoại, theo chúng tôi điều này cũng có thể do các chỉ số sinh khả dụng của chúng là khác nhau. Mặc dù vậy, về hiệu quả hạ huyết áp và điều hoà nhịp tim của hai loại này là chưa thấy có sự khác biệt. * Khi so sánh các giá trị huyết áp và nhịp tim ở 3 ngày uống thuốc với các giá trị ban đầu (trước khi thắt động mạch) ta có các bảng kết quả sau: Bảng 12. Giá trị huyết áp tâm thu sau 3 ngày uống thuốc so với trước thắt động mạch Lô N BP trước thắt động mạch Ngày thứ 1 (mmHg) Ngày thứ 2 (mmHg) Ngày thứ 3 (mmHg) 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 2 15 139,3±14,2 (a) 144,7±16,1 143,8±16,5 140,0±12,5 140,3±12,8 137,6±13,6 137,2±13,0 P (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (a) <0,05 3 15 111,0±13,9 (b) 141,8±10,1 141,8±10,3 129,2±9,7 129,9±10,2 128,3±7,1 126,0±5,9 P (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) <0,05 4 15 108,3±13,3 (c) 142,3±8,7 142,4±8,9 123,8±11,9 121,5±10,2 122,1±10,9 118,9±9,7 P (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) <0,05 5 15 112,5±15,2 (d) 125,8±9,6 126,9±10,9 121,3±9,7 122,6±12,3 118,6±10,2 120,2±8,2 P (1,3),(1,7) với (d) 0,05 Bảng 13. Giá trị huyết áp tâm trương sau 3 ngày uống thuốc so với trước thắt động mạch Lô N BP trước thắt động mạch Ngày thứ 1 (mmHg) Ngày thứ 2 (mmHg) Ngày thứ 3 (mmHg) 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 2 15 63,9±12,8 (a) 89,0±11,2 87,1±10,5 86,0±10,3 84,9±9,2 83,9±9,1 82,7±9,3 P (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (a) <0,05 3 15 62,9±13,6 (b) 97,3±8,6 86,3±8,4 73,9±4,8 75,8±4,9 73,5±5,9 73,8±7,4 P (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) <0,05 4 15 64,0±12,8 (c) 87,6±6,1 86,5±8,0 76,0±9,8 75,7±10,6 75,6±9,1 77,9±7,2 P (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) <0,05 5 15 63,1±12,1 (d) 78,8±8,7 79,9±8,9 76,3±7,7 76,0±9,1 73,7±9,2 74,9±8,2 P Tất cả các ngày so với (d) <0,05 Bảng 14. Kết quả đo nhịp tim sau 3 ngày uống thuốc so với trước thắt động mạch Lô N BP trước thắt động mạch Ngày thứ 1 (nhịp/phút) Ngày thứ 2 (nhịp/phút) Ngày thứ 3 (nhịp/phút) 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 3 giờ 7 giờ 2 15 385,8±16,8 (a) 399,1±14,7 398,3±13,8 397,8±12,2 396,5±12,5 394,5±10,4 394,6±12,9 P (1,3),(1,7) với (a)0,05 3 15 382,2±16,8 (b) 400,1±11,2 397,6±9,9 385,5±8,2 387,0±7,1 383,3±9,8 382,0±9,6 P (1,3),(1,7) với (b) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) >0,05 4 15 390,2±11,7 (c) 404,3±14,9 403,6±13,9 392,8±12,2 393,1±11,1 391,3±9,3 393,8±10,7 P (1,3),(1,7) với (c) <0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) >0,05 5 15 389,1±18,9 (d) 388,7±8,7 390,3±10,5 384,9±8,3 386,7±9,1 380,3±11,2 382,1±11,6 P Tất cả các ngày so với (d) >0,05 Kết quả bảng 7 cho thấy hiệu quả tác dụng hạ huyết áp tâm thu ở các lô thí nghiệm kém hơn lô đối chứng dương vì khi so sánh giá trị huyết áp tâm thu trung bình ở các lô thí nghiệm sau 3 ngày uống thuốc với giá trị này trước khi thắt động mạch là vẫn còn cao hơn một cách có ý nghĩa (P0,05). Tuy vậy, hiệu quả này đối với huyết áp tâm trương (bảng 10) lại không rõ rệt vì ngay cả lô đối chứng dương cũng còn có trị số huyết áp tâm trương trung bình cao hơn trước khi thắt một cách có ý nghĩa (P<0,05). Kết quả bảng 12 lại cho thấy tác dụng điều hoà nhịp tim, làm giảm nhịp tim của dược chất atenolol tổng hợp phát huy tác dụng ngay sau 7 giờ ngày thứ hai uống thuốc ở liều 56mg/kg trọng lượng (lô 2) (P>0,05), mặc dù tác dụng đối với huyết áp ở lô 2 này là chưa rõ rệt (bảng 5 và 6). ở lô 3 và lô 4 có tác dụng rõ rệt sau 3 giờ ngày thứ 2 uống thuốc (P>0,05). Còn ở lô đối chứng dương thì hiệu quả thể hiện rõ rệt ngay ngày đầu uống thuốc. 3.2.2.3 Kết luận - Dược chất atenolol tổng hợp có tác dụng hạ huyết áp, điều hoà và làm giảm nhịp tim. - Tác dụng hạ huyết áp, điều hoà và làm giảm nhịp tim rõ rệt ở liều 84mg/kg sau khoảng 3 giờ ngày thứ 2 uống thuốc. - Dược chất atenolol tổng hợp có tác dụng chậm hơn so với thuốc atenolol nhập ngoại, KẾT LUẬN 1. Từ phenol, bằng con đường hóa học, đã đưa ra qui trình tổng hợp khả thi atenolol với hiệu suất tổng 32%. 2. Đã nghiên cứu độc tính cấp (LD50) của atenolol và nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp và giảm nhịp tim của chất này trên mô hình chuột cống trắng đã gây tăng huyết áp bằng phương pháp thắt động mạch thận, so sánh với thuốc chuẩn atenolol đang lưu hành ngoài thị trường. Kết quả cho thấy atenolol tổng hợp có LD50=12,7 ± 1,52g/kg thể trọng và hiệu quả hạ huyết áp và giảm nhịp tim tương đương với thuốc atenolol nhập ngoại nhưng thời gian phát huy tác dụng chậm hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Phan Quốc Đống (2003). Vài nhóm thuốc điều trị cao huyết áp. Thuốc và sức khỏe số 224 trang 7-8. 2. Thạch Nguyễn (2007): Một số vấn đề cập nhật trong chẩn đoán và điều trị bệnh tim mạch. Nhà xuất bản y học 2007, trang 8. 3. Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, Trần Thanh Lâm (1995). Toán Thống kê và tin học ứng dụng trong sinh y dược. Nhà Xuât bản Quân đội Nhân dân 4. Nguyễn Đình Triệu (2007), Các phương pháp phổ trong hoá học hữu cơ và hoá sinh, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội. 5. Nguyễn Minh Tuyển, Phạm Văn Thiêm (2000). Kỹ thuật hệ thống công nghệ Hóa học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 6. Lưu Văn Chính (2009): Đề tài “Nghiên cứu tổng hợp atenolol trong điều trị bệnh huyết áp và tim mạch”. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tiếng Anh 7. Alan Mitchell (1983). Process for producing p-hydroxyphenylacetic acid. Patent US 4393235. S.H. Bevinakatti (1992). Lipase catalysis in organic solvents. Application to the synthesis of (R)- and (S)-atenolol. Journal of Organic Chemistry 22, 57, 6003-6005 Graham N. Mott (1991). Preparation of Aromatic Acetamides from Arylmethyl ketones. Patent US 5041657. K. Kitaori; Y. Furukawa; H. Yoshimoto and J. Otera (1999). CsF in Organic Synthesis. Regioselective Nucleophilic Reactions of Phenols with Oxirannes Leading to Enatiopure β-Blockers. Tetrahedron 55, 14381 – 14390 The Merck Index 13th edition 2001 Merck & Co., Inc. Clarke's Analysis of Drugs and Poisons 3e edition (Pharmaceutical Press, 2005). Arnold C. Ott., Leonard A., Mattano and Gerald H. Coleman (1946). Preparation of hydroxyphenyl alkanoic by the Willgerodt reaction. J. Am. Chem. Soc. Vol. 68, pp. 2633-2634. D. Subhas Bose and A. Venkat Narsaiah (2005). An Efficient Asymmetric Synthesis of (S)-Atenolol: Using Hydrolytic Kinetic Resolution. Bioorganic & Medicinal Chemistry 13, 627 – 630. 15. M. Degueil-Castaing ; B. De Jeso; S. Drouillard and B. Maillard (1987). Enzymatic reactions in organic synthesis: 2- ester interchange of vinyl esters. Tetrahedron Letters Vol. 28 (9), 953-954. 16. Rajyalakshmi G, Shireesha B, Rama Narsimha Reddy A, Achaiah G and Raghu Ram Rao A (January 2009). A modified asymmetric synthesis of (s)-atenolol: An enzymatic Resolution. Journal of Pharmacy Research Vol.2.Issue 1. 17. Jonathan Hutton (1981). Process for the manufacture of p-hydroxybenzyl cyanide. US patent 4,317,781. 18. Joseph Akisanya, Adrian W. Parkins and Jonathan W. Steed (1988). A synthesis of atenolol using a nitrile hydration catalyst. Organic Process Research and Development, pp. 274 – 276. 19. Akisanya, J.; et al.; A synthesis of atenolol using a nitrile hydration catalyst. Organic Process Research and Development 1998, pp. 2, 4, 274 20. K. Nakajima (1980). Process for preparing 4-hydroxyphenylacetic acid. Patent GB 2078011A. 21. N. Kaniss and A. Bauer (1982). Method for the production of 4-hydroxyphenylacetic acid. Patent US 4329497 22. W. Spielman (1986). Process for the manufacture of p- hydroxyphenyl acetic acid. Patent US 4590295 23. Kitaori, K.; et al(1987).; A practical synthesis of optically active atenolol from chiral epichlorohydrin. Chem. Pharm. Bull., 45, 2, 412 24. Kitaori, K.; et al (1998).; Convenient preparation of enantiopure atenolol by means of preferential crystallization. Chem. Pharm. Bull., 46, 3, 505 25. Damle, S.V.; et al (1999).; One pot synthesis of (R/(S)-atenolol and (R/(S)-propranolol by employing polymer supported reagent. Synth. Commun., 29, 10, 1639 26. Damle, S.V.; et al (2000).; Biotransformations with Rhizopus arrhizus and Geotrichum candidum for the preparation of (S)-atenolol and (S)-propranolol. Bio. Org. Med. Chem.; 8, 8, 2067 27. Damle, S.V.; et al (1999).; Chemoenzymatic synthesis of (R)- and (S)-atenolol and propranolol employing lipase catalyzed enantioselective esterification and hydrolysis. Synth. Commun.; 29, 22, 3855 28. J. M. Evans; C. S. Fake; T. C. Hamilton and A. E. Watts (1983) J. Med. Chem. 26, 1582 – 1589. 29. Saragai, N.; Takehira, Y.; Kitaori, K. (Daiso Co., Ltd.); Process for producing optically active atenolol and intermediate thereof. EP 0435068 30. United Kingdom Specification No. 1,476,073 31. Martin A. Schwartz, Michael Zoda, Baburao Vishnuvajjala, and Ismail Mami (1976). A Convenient Synthesis of o- and p-Hydroxy Substituted Phenylacetonitriles and Phenethylamines. Journal of Organic Chemistry, 41, 2502-2503 32. UK Patent Application GB 2 212 801 A. Preparation of an alkanolamine derivatives. 33. Reza Mehvar and Dion R. Brocks: Stereospecific Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Beta-Adrenergic Blockers in Humans, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 4 (2001) 185-200. 34. J L Montastruc, P Montastruc. Antihypertensive effects of intra-cisternal beta-blocking agents in dogs with acute nerogenic hypertension. Arch Int Pharmacodyn Ther Feb 1979 (Vol. 237, Issue 2, Pages 275-81) 35. T.W. Graham Solomons (1997), Fundamentals of Organic Chemistry, fifth Edition, Jonh Wiley & Son. INC 36. P.Y. Bruice, Organic Chemistry, Prentice Hall; 4 edition (May 1, 2003) 37. Thomas Laue and Andeas Plagens (2005). Named Organic Reactions, 2nd Edition. John Wiley & Son, Ltd 38. Ewards (1980). Process for the manufacture of p-hydroxyphenylacetic acid. Patent US 4198526. 39. T. G. Solomoms (1998). Fundamentals of Organic Chemistry. Fifth Edition, John Wiley & Son, Ltd 40. S. S. Jovanovic; D. D. Djokovic and D. S. Balic (1992). Phase-Transfer Catalysis in the alkylation Reaction of α-Naphthol with Epichlorohydrin. Journal of Molecular Catalysis 73, 9-16. 41. Jan Chlebicki , Larisa Yu. Shiman , Andrey K. Guskov , Mikhail G. Makarov , Valerij F. Shvets (1999). The kinetics and mechanism of the reaction between 1-chloro-2,3-epoxypropane and p-cresol in the presence of basic catalysts. International Journal of Chemical Kinetics, Vol.29(1), 73-79 42. Christian Schmitz, Michael Gothardt, et al (2000), Normal blood pressure and plasma renin activity in mice lacking the renin-binding protein, a cellular renin inhibitors. The Journal of Biological Chemistry, Vol.275, No.20, Issue of May 19, pp 15357-15362. 43. Martin Paul, Ali Poyan Mehr and Reinhold Kreutz (2006), Physiology of local renin-angiotensin systems. Physiol. Rev. Vol.86, pp. 747-789. 44. Ashok Kumar;  Ramkrishna A. Rane;  Vaikyparambil K. Ravindran; Suneel Y. Dike (1997). Facile 1,2-Aryl Migration of 2-Halomethyl-2-(4'-Hydroxyphenyl) Ketals: A Novel Single Step Synthesis of 4-Hydroxyphenylacetic Acid and Its Derivatives. Synthetic communication 27(7), 1133 – 1141 45. Tatsuya Tono (1982). Process for preparing aryl acetic acid derivatives  Patent US 4544766. 46. Osamu Yonemitsu and Shunji Naruto (1969). Photo-induced friedel-crafts reaction. Tetrahedron Letters 28, 2387 – 2389. 47. Clayden J. (2000). Organic Chemistry (Oxford). 48. J. S. Yadav; A. R. Reddy; A. V. Narsaiah and B. V. S. Reddy (2007). An Efficient Protocol for Regioselective ring opening of epoxides using samarium triflate: synthesis of Propranolol, atenolol and RO363. Journal of Molecular Catalysis A; Chemical 261, 207 – 212. 49. Landenburg, Folkers, and Major (1936). The synthesis of 3-hydroxy-2-(3)-benzofuranone and of 4-hydroxymandelic Acid. J.Am.Chem.Soc., 58,1249-1257. 50. Shyne-Ming Jang, Tian-shy Shich (1994). UK patent Aplication, GB 2276167. 51. Amy Adams Peason, Thomas E.Gaffney, Thomas Walle and Philip J. Privitera(1989). A Stereoselective Central Hypotensive Action of Atenolol. Department of Cellular and molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics and Medicine, Medial University of South Carolina, Charleston, South Carolina. 52. Day, M. D. and Roach, A.G.(1974): Cardiovascular effects of ß-adrenoreceptor blocking agents after intracerebroventricular administration in conscious normotensivecats. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1: 333-339. 53. Strickland, J. A., Thibodeaux, H. and Pmvrrsa, P. J.: Site and mechanism of the central hypotensive action of -l-atenolol in spontaneously hypertensive rats. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 2: A362, 1988. 54. Daniell, H. B., Webb, J. G., Walle, T., Oatis, J. E. and Gaffney, T. E (1988).: Inhibitors of prostaglandin synthesis reverse the effects of chronic fl-receptor blockade to attenuate adrenergic neurovaseular transmission in dogs. J. Cardiovasc. Pharinacol. 12: 300-307. 55. Rahn, K. H., Hawlins, A., Kersting, F. and Planz, G (1974).: Studies on the antihypertensive action of the optical isomers of propranolol in man. Naunyn-Schmiedelberg’s Arch. Pharmacol. 286: 319-323. 56. Tackett, R. L., Webb, J. G. and Privitera, P. J (1985).: Site and mechanism of the centrally mediated hypotensive action of propranolol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 235: 66-70. 57. Street, J. A., Hemsworth, B. A., Roach, A. G. and Day, M. D (1979).: Tissue levels of several radiolabelled fl-adrenoceptor antagonists after intravenous administration in rats. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 237: 180-190. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1.1: PHỔ IR CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC PHỤ LỤC 1.2: PHỔ 1H-NMR CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC PHỤ LỤC 1.3: PHỔ 13C-NMR CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC PHỤ LỤC 1.5: PHỔ MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC PHỤ LỤC 1.6: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHỎ GIỌT Ở 10-150C) PHỤ LỤC 1.7: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC VỚI THỜI GIAN LƯU LÀ 3,1 PHÚT PHỤ LỤC 1.8: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC VỚI THỜI GIAN LƯU LÀ 4,7 PHÚT PHỤ LỤC 1.9: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHỎ GIỌT Ở 200C) PHỤ LỤC 1.10: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHỎ GIỌT Ở 300C) PHỤ LỤC 1.11: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHỎ GIỌT Ở 500C) PHỤ LỤC 1.12: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHIỆT ĐỘ PHẢN ỨNG Ở 450C) PHỤ LỤC 1.13: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHIỆT ĐỘ PHẢN ỨNG Ở 600C) PHỤ LỤC 1.14: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHIỆT ĐỘ PHẢN ỨNG Ở 800C) PHỤ LỤC 1.15: PHỔ LC-MS CỦA AXIT P-HYDROXYMANDELIC (NHIỆT ĐỘ PHẢN ỨNG Ở 1000C) PHỤ LỤC 2.1: PHỔ IR CỦA AXIT P-HYDROXYPHENYLAXETIC PHỤ LỤC 2.2: PHỔ 1H-NMR CỦA AXIT P-HYDROXYPHENYLAXETIC PHỤ LỤC 2.3: PHỔ 13C-NMR CỦA AXIT P-HYDROXYPHENYLAXETIC PHỤ LỤC 2.4: PHỔ DEPT CỦA AXIT P-HYDROXYPHENYLAXETIC PHỤ LỤC 2.5: PHỔ MS CỦA AXIT P-HYDROXYPHENYLAXETIC PHỤ LỤC 3.1: PHỔ IR CỦA P-HYDROXYPHENYLAXETAMIT PHỤ LỤC 3.2: PHỔ 1H-NMR CỦA P-HYDROXYPHENYLAXETAMIT PHỤ LỤC 3.3: PHỔ 13C-NMR CỦA P-HYDROXYPHENYLAXETAMIT PHỤ LỤC 3.4: PHỔ DEPT CỦA P-HYDROXYPHENYLAXETAMIT PHỤ LỤC 3.5: PHỔ MS CỦA P-HYDROXYPHENYLAXETAMIT PHỤ LỤC 3.6: PHỔ LC-MS CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG KIỀM PHỤ LỤC 3.7: PHỔ LC-MS CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG KIỀM VỚI THỜI GIAN LƯU LÀ 11,1 PHÚT PHỤ LỤC 3.8: PHỔ LC-MS CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG KIỀM VỚI THỜI GIAN LƯU LÀ 12,6 PHÚT PHỤ LỤC 3.9: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG XÚC TÁC CHUYỂN PHA Ở 700C PHỤ LỤC 3.10: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG XÚC TÁC CHUYỂN PHA Ở 800C PHỤ LỤC 3.11: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG XÚC TÁC CHUYỂN PHA Ở 900C PHỤ LỤC 3.12: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG XÚC TÁC CHUYỂN PHA Ở 1000C PHỤ LỤC 3.13: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG XÚC TÁC CHUYỂN PHA KHÔNG KHỐNG CHẾ NHIỆT ĐỘ PHỤ LỤC 3.14: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG HỖN HỢP KIỀM VÀ XÚC TÁC CHUYỂN PHA Ở 400C PHỤ LỤC 3.15: PHỔ LC-MS CỦA CỦA SẢN PHẨM KHI SỬ DỤNG HỖN HỢP KIỀM VÀ XÚC TÁC CHUYỂN PHA PHỤ LỤC 4.1: PHỔ IR CỦA ATENOLOL PHỤ LỤC 4.2: PHỔ 1H-NMR CỦA ATENOLOL PHỤ LỤC 4.3: PHỔ 13C-NMR CỦA ATENOLOL PHỤ LỤC 4.4: PHỔ DEPT CỦA ATENOLOL PHỤ LỤC 4.5: PHỔ MS CỦA ATENOLOL PHỤ LỤC 4.6: PHỔ UV CỦA ATENOLOL