Luận văn Trích ly collagen từ da cá basa

cất vào để đạt được tổng thể tích là 1 ml. Sự oxy hóa hydroxyproline xảy ra khi cho 1 ml Chloramine B vào mỗi ống nghiệm, hỗn hợp được lắc và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Lượng dư Chloramine T được phân hủy bằng cách cho 1 ml dung dịch HClO4 3,15 M vào, hỗn hợp được lắc trộn. Sau 5 phút, cho 1 ml dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde 20 % vào mỗi ống nghiệm và tiến hành lắc một lần nữa. Các ống nghiệm được giữ trong bể điều nhiệt ở 60 0C trong 20 phút và sau đó được làm mát với nước lạnh trong vòng 5 phút. Bước kế tiếp, 5 ml Ethyl Cellosolve được thêm vào mỗi ống nghiệm để đạt tổng thể tích lá 10 ml. Ta thu được các dung dịch chứa 0,5, 0,75, 1 và 1,5 mg hydroxyproline. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 557 nm (màu đỏ sẫm). Nước cất được dùng làm mẫu trắng. Ta xây dựng được đường chuẩn biểu diễn độ hấp thu theo các hàm lượng của hydroxyproline. Dung dịch thử được chuẩn bị với cùng một cách thức. Pha loãng dung dịch thử để nồng độ hydroxyproline nằm trong vùng từ 0,5 ¸1,5 mg/ml, tương ứng với phần tuyến tính trên phổ quang kế. Nồng độ của hydroxyproline được xác định dựa trên đường chuẩn. Lượng collagen được tính như sau: Collagen = hydroxyproline 14,7 Xác định bằng phương pháp trích ly sử dụng lactic acid [13] Da cá sau khi xử lý sẽ được trích ly bằng dung dịch lactic acid 0,5 M. Da cá được xay nhỏ, ngâm vào lactic acid với tỉ lệ 1:6. Tiến hành trích ly trong khoảng thời gian là 48 h. Phần da cá sau khi trích sẽ được tiếp tục ngâm vào dung dịch acid mới để trích ly một cách triệt để lượng collagen có trong da cá. Tổng số lần trích ly là 3, thời gian cho mỗi lần là 48 h. Theo nghiên cứu đã công bố thì lactic cho khả năng trích ly cao, hiệu suất trích sau 48 h là khoảng 90 %. Sau 3 lần trích ly trên cùng một lượng mẫu da, lượng collagen trích được là 99,99 %, xem như là tổng lượng collagen có trong da. Xác định độ sáng và màu sắc của da cá Giới thiệu không gian màu CIELAB Để tuận lợi cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống sắp xếp màu sắc CIELAB. Trong đó sử dụng 3 thông số: L*: độ sáng a*: tọa độ màu trên trục đỏ - lục b*: tọa độ màu trên trục vàng – lam Trong hệ thống CIELAB, sự khác nhau giữa các điểm được biểu thị trong không gian màu tương ứng với những khác biệt có thể nhìn thấy được giữa các màu. Không gian màu CIELAB được thiết lập ở dạng lập phương. Trục L* chạy từ đỉnh xuống đáy. Giá trị cực đại của L* là 100, tương ứng với màu trắng. Giá trị cực tiểu của L* là 0, tượng trưng cho màu đen. Các trục a* và b* không có giới hạn các giá trị số cụ thể. Giá trị dương của a* biểu thị cho màu đỏ, giá trị âm biểu thị màu xanh lục. Giá trị dương của b* thể hiện màu vàng, giá trị âm thể hiện màu xanh lam. Có những giá trị delta đi kèm với hệ thống CIELAB. Các giá trị ∆L*, ∆a*, ∆b* cho biết mẫu chuẩn và mẫu thử khác nhau như thế nào về các giá trị L*, a*,b*. Những giá trị delta này thường được sử dụng cho sự quản lý chất lượng và hiệu chỉnh công thức. Cần thiết lập những mức giới hạn cho các giá trị delta này. Các giá trị delta nằm ngoài giới hạn cho biết có quá nhiều khác biệt giữa mẫu chuẩn và mẫu thử. ∆L* = : sự khác nhau về độ sáng giữa 2 màu Nếu ∆L* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng sáng lên, mẫu thử sáng hơn mẫu chuẩn Nếu ∆L* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng tối hơn, mẫu thử tối hơn mẫu chuẩn ∆a* = : sự khác nhau về tọa độ trên trục đỏ - lục Nếu ∆a* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng đỏ lên, mẫu thử có sắc đỏ hơn mẫu chuẩn Nếu ∆a* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lục hơn, mẫu thử có sắc xanh lục hơn mẫu chuẩn ∆b* = : sự khác nhau về tọa độ trên trục vàng - lam Nếu ∆b* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng vàng hơn, mẫu thử có sắc vàng hơn mẫu chuẩn Nếu ∆b* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lam hơn, mẫu thử có sắc xanh lam hơn mẫu chuẩn Giới thiệu không gian màu CIELCH Không gian màu L*C*h* sử dụng chung giản đồ với không gian màu L*a*b* nhưng thay vì sử dụng trục tọa độ vuông thì nó lại sử dụng trục tọa độ hình trụ. Trong không gian màu này, L* biểu thị độ sáng giống với L* trong không gian màu L*a*b*, C* là cường độ màu và h* là góc tông màu. Giá trị cường độ màu C* bằng 0 ngay tại tâm và gia tăng tùy thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm. Giá trị góc tông màu được xác định khởi điểm tại trục a* và được tính bằng đơn vị độ : 00 là +a* (Đỏ) 900 là +b* (Vàng) 1800 là –a* (Lục) 2700 là –b* (Lam) Các giá trị C* và h* được xác định từ a* và b* theo công thức : Cường độ màu Góc tông màu  : sự khác nhau về độ bão hòa giữa hai màu  : sự khác nhau về tông giữa hai màu * Chú ý Mục đích chính của quá trình tẩy màu là làm cho da trắng, sáng lên. Do đó, trong quá trình này trục màu chính cần quan tâm là trục màu trắng – đen (L*). Trục a* và b* được xem là 2 trục màu phụ để khảo sát sự thay đổi của ánh màu phụ trong quá trình xử lý. Phương pháp phân tích sản phẩm Xác định sự biến tính của collagen theo nhiệt độ bằng phương pháp biến đổi độ nhớt (Denaturation temperature determined by viscosity method) [14-16] Dung dịch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1 M được nạp vào đĩa của máy đo độ nhớt với lượng khoảng 5 ml. Nhiệt độ của đĩa được điều chỉnh thông qua bể điều nhiệt. Cài đặt nhiệt độ của bể điều nhiệt ứng với nhiệt độ ban đầu của thí nghiệm là 30 0C và để khoảng 30 phút cho nhiệt độ của dung dịch collagen cân bằng với nhiệt độ ở bể điều nhiệt. Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 30 0C đến 50 0C. Nhiệt độ được gia tăng từng bước, mỗi bước ứng với 2,5 0C và mỗi mức nhiệt độ được giữ trong 10 phút. Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định tương ứng ở các mức nhiệt độ. Độ nhớt tương đối được tính như sau: Độ nhớt tương đối = Trong đó: ht : độ nhớt đo được tại mỗi mức nhiệt độ hmax : độ nhớt lớn nhất hmin : độ nhớt nhỏ nhất Đường cong biến tính nhiệt được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị độ nhớt tương đối theo nhiệt độ. Phân tích nhiệt vi sai (Differential thermal analysis/ Thermogravimetry analysis (DTA/TG)) [17, 18] DTA là kỹ thuật ghi nhận sự khác biệt về nhiệt độ giữa mẫu thử và một chất đối chứng theo thời gian hoặc nhiệt độ bằng một chương trình nhiệt độ xác định trong một môi trường được đun nóng hoặc làm lạnh với mức độ được kiểm soát. (Thực hiện tại Khoa Công nghệ vật liệu, trường Đại học Bách khoa TP.HCM) Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy [19] Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất, là phương pháp đo độ hấp thụ của mẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại. Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học có trong mẫu thử. Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ những bước sóng riêng biệt. Với nhiều thiết bị phụ tùng, máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí, lỏng đến rắn. Phân tích phổ IR là một công cụ phổ biến và quan trọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định các hợp chất. (Thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia vật liệu Polymer và Composite, trường Đại học Bách khoa TP.HCM) Hàm lượng tro tổng (Total ash content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Hàm lượng béo (Fat content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Hàm lượng đạm (Protein content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Sự hình thành sợi của collagen (Fibril formation experiment - Turbidity) [20] Collagen được cho vào dung dịch đệm (0,1M Na2HPO4, 0,05 Citric acid, pH = 7,2) với sự có mặt của NaCl (nồng độ cuối cùng là 0,15M) ở 4 0C. Nồng độ của mẫu collagen được điều chỉnh bằng 0,5 mg/ml trong dung dịch đệm. Mẫu được làm nóng đến 35 0C để kích thích quá trình hình thành sợi. Tiến hành ghi nhận độ hấp thu của mẫu theo thời gian, 2 phút/lần, trong vòng 30 phút. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 313 nm. Hình thái bề mặt của collagen (Scanning Electron Microscopy - SEM) [20] Hình thái bề mặt của sản phẩm collagen thu được và mẫu gelatin chuẩn được chụp theo phương pháp SEM để quan sát được sự khác biệt về cấu trúc của chúng. (Thực hiện tại Phòng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ) Quy trình thí nghiệm Quy trình loại béo Da cá Basa Ngâm x 3 lần Dd NaOH 0.2% 0,5% LasNa H2O Rửa Dd H2SO4 0.2% Ngâm x 3 lần 0,5% LasNa H2O Rửa Dd Citric 0.7% Ngâm x 3 lần 0,5% LasNa H2O Rửa Da cá đã lọai béo Hình 4.1 Quy trình loại béo Để thu được collagen không có mùi, da cá nguyên liệu cần phải được loại loại bỏ các chất béo. Ta áp dụng phương pháp của Gudmundsson và Hafsteinsson (1997), phương pháp được trình bày như sau: Da cá Basa sau khi được rửa sơ bộ với nước sẽ được tiếp tục xử lý với lần lượt 3 loại dung dịch (NaOH 0,2%, H2SO4 0,2% và Citric Acid 0,7%) với tỉ lệ da : dung dịch là 1:10 (g/ml) nhằm mục đích thu được collagen không mùi. Với mỗi loại dung dịch, da cá được xử lý qua 3 lần, mỗi lần tương ứng với thời gian là 1h. Sau mỗi lần xử lý, da phải được rửa sạch dưới vòi nước đến khi đạt pH = 7 trước khi tiến hành ngâm lần tiếp theo. 0,5% chất hoạt động bề mặt (LasNa) được thêm vào tất cả các dung dịch sử dụng trong quy trình nhằm nâng cao khả năng loại mùi. Tuy nhiên, theo lý thuyết quy trình này có thể làm mất đi một lượng collagen. Ta tiến hành thêm một quy trình dựa trên nguyên tắc của quy trình trên nhưng không sử dụng acid để rửa. 2 mẫu da của 2 quy trình xử lý (có dùng acid và không dùng acid) sẽ được đối chứng với nhau. Quy trình loại màu Áp dụng quy trình tẩy màu của Kolodziejska et al. (1999) Da cá đã loại béo Ngâm dd NaCl 10 % t(0C) = 30 0C τ = 24 h Ngâm, tẩy màu trong NaOH 0,01M Da cá đã xử lý dd 1% H2O2 Hình 4.2 Quy trình tẩy màu Da sau khi loại lipid được ngâm trong dung dịch NaCl 10 % trong vòng 24 h, tỉ lệ da : dung dịch là 1:10 (g/ml), ở nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho quá trình tẩy màu. Việc tẩy màu được tiến hành dưới tác dụng của dung dịch H2O2 trong NaOH 0,01M. Quy trình trích collagen Ly tâm 5000 vòng/phút 1 phút acetic 0,5M hay citric 0,5M NaCl Collagen không tan 1:6 (g/ml) 4 ( 0C) Da cá đã xử lý Xay nhỏ Trích ly Lọc Ly tâm Kết tinh Ly tâm Kết tinh lại 5.000 vòng/phút 30 phút 5.000 vòng/phút 1 h Collagen thành phẩm Hình 4.3 Quy trình trích ly Quá trình trích ly collagen được thực hiện ở nhiệt độ 4 0C trong 24, 48 và 72 h với dung dịch có nồng độ 0,5 M của các acid citric và acetic. Với mỗi loại acid, collagen được trích theo phương pháp toàn phần (A) và từng phần (B). Phương pháp toàn phần (A): da cá được trích trong dung dịch acid một lần duy nhất ứng với các mốc thời gian 24, 48 và 72 h. Phương pháp từng phần (B): da cá được tiến hành trích qua nhiều lần, mỗi lần 24 h, sau đó lượng collagen thu được ở các lần trích được gộp lại để tính hiệu suất. Da cá sau khi xử lý được ngâm trong các dung dịch acid với tỉ lệ da/dung dịch là 1:6 (g/ml). Dịch trích collagen thu được từ quá trình trích ly được tinh chế theo phương pháp của Piez et al. (1963). NaCl rắn được cho vào dịch trích collagen với nồng độ 5% (w/v) để kết tinh collagen. Collagen kết tinh (collagen hòa tan trong acid) được tách ra bằng phương pháp ly tâm với vận tốc 5.000 vòng/phút trong 90 phút, sử dụng máy ly tâm Hermle Z 200A. Để thu được collagen tinh khiết hơn, phần collagen kết tinh được hòa tan lại trong acetic acid 0,5 M và kết tinh lại theo các bước miêu tả ở trên. Quá trình kết tinh lại được lặp lại 2 lần. Các thông số khảo sát trong quá trình thí nghiệm Trong quá trình xử lý nguyên liệu Nồng độ dung dịch H2O2 (%) f = f(0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5) Thời gian tẩy màu (h) f = f(1; 2; 3; 4; 5; 6; 24) Tỉ lệ da/dung dịch (g/ml) f (F) = f(1:10; 1:12,5; 1:15; 1:17,5; 1:20) Trong quá trình trích collagen Loại acid Citric và Acetic acid Phương pháp trích Phương pháp A (từng phần) và phương pháp B (toàn phần) Thời gian trích (h) f = f(24; 48; 72) Đáp ứng Trong quá trình xử lý nguyên liệu Đáp ứng được chọn làm đáp ứng chính là giá trị độ lệch sáng giữa da cá nguyên liệu ban đầu và da cá sau quá trình xử lý ∆L* theo các thông số nồng độ dung dịch H2O2, thời gian tẩy màu và tỉ lệ da/dung dịch. Các giá trị ∆C* và ∆h* là các đáp ứng phụ để đánh giá sự thay đổi màu sắc của da cá trong quá trình xử lý. Trong quá trình trích collagen Đáp ứng chính là hiệu suất trích ly theo các yếu tố như loại acid, phương pháp trích và thời gian trích. CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Đánh giá nguyên liệu Nguồn nguyên liệu Xuất xứ: da cá Basa được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An (Binh An Seafood Joint Stock Company), Lô 2.17, Khu Công Nghiệp Trà Nóc II, TP. Cần Thơ. Da cá được tách ra bằng phương pháp cơ học ở nhà máy. Sau khi mua về, ta rửa sạch bằng nước, loại bỏ sơ bộ các phần mỡ còn sót lại trên da và tồn trữ ở khoảng -200C cho đến khi sử dụng. Khảo sát các thành phần của da cá Basa (Phụ lục 1) Bảng 5.1 Thành phần da cá Basa nguyên liệu Thành phần Hàm lượng (%) Protein 31,1 Lipid 6,5 Độ ẩm 58,7 Độ tro 0,1 Các thành phần khác 3,6 Đánh giá quy trình loại béo nguyên liệu (Phụ lục 1) Bảng 5.2 So sánh thành phần giữa da nguyên liệu và da sau khi xử lý của hai quy trình Chỉ tiêu Da nguyên liệu Xử lý có acid Xử lý không acid Độ ẩm (%) 58,73 66,31 62,89 Cảm quan Dạng Rắn, tươi Rắn, tươi Rắn, tươi Màu Đen Trắng Trắng Mùi Hôi Không mùi Vẫn còn mùi Lý hóa Protein (%) 75,35 39,18 64,40 Lipid (%) 15,75 3,27 15,35 Độ tro (%) 0,24 0,29 0,27 Hiệu suất loại béo Quy trình có sử dụng acid Quy trình không sử dụng acid Lượng protein mất đi sau khi loại béo Quy trình có sử dụng acid Quy trình không sử dụng acid Nhận xét Về mặt cảm quan, da cá sau khi xử lý đều có màu trắng, sáng hơn so với da cá ban đầu nhưng da chỉ qua xử lý với NaOH 0,1M sẽ cho ta cảm giác nhớp nháp khi sờ vào, đồng thời mùi hôi vẫn còn trong khi da qua quy trình xử lý có acid rất sạch và không có mùi. Quy trình loại béo có sử dụng acid có hiệu quả hơn, hiệu suất tương đối cao (đạt 79,24 %), cao gấp 31,2 lần so với hiệu suất của quy trình chỉ sử dụng NaOH 0,1 M. Tuy nhiên, một điểm bất lợi có thể thấy của quá trình loại lipid có sự tham gia của các acid đó là sự mất mát nhiều của các protein, lượng protein mất đi chiếm 48 %. Trong khi đó, quy trình không sử dụng acid chỉ làm mất đi 14,53 % protein. Một phần collagen có thể mất đi trong giai đoạn này. Þ So sánh giữa hai quy trình, ta chọn quy trình xử lý có mặt của acid vì hiệu suất loại béo cao, da sau xử lý tương đối sạch, có thể dùng làm nguyên liệu cho các bước tiếp theo để thu được collagen tinh khiết, không màu và không mùi. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tẩy màu nguyên liệu Nồng độ H2O2 và thời gian tẩy màu Diều kiện khả sát Điều kiện cố định F (g/ml) = 1:10 = 30 Khảo sát ∆L* = f, f ∆C* = f, f ∆h* = f, f Với (%) = 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5 (h) = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24 Kết quả khảo sát (Phụ lục 2) Hình 5.1 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và thời gian lên quá trình tẩy màu Nhận xét Trong 4h đầu tiên của quá trình tẩy màu, khả năng tẩy màu đồng biến theo thời gian. Sự chênh lệch về độ sáng giữa da được tẩy màu và da ban đầu, hay nói cách khác là độ sáng của da đạt giá trị cực đại tại thời điểm 4h. Sau thời điểm này, độ chênh lệch sáng có xu hướng giảm xuống và sau đó gần như duy trì cho đến thời điểm 24h. Xu hướng trên được thể hiện rõ ở cả 5 mức nồng độ. Tuy nhiên, mức nồng độ 1% cho thấy chênh lệch về độ sáng là cao nhất. Từ kết quả trên, ta biết được 2 giá trị tối ưu của 2 thông số trong quá trình tẩy màu: Nồng độ H2O2: 1% Thời gian tẩy màu: 4h Một điểm cần lưu ý là quá trình tẩy màu nếu được kết hợp với sự khuấy trộn sẽ cho kết quả khả quan hơn. Tỉ lệ da/dung dịch Điều kiện khảo sát Điều kiện cố định (%) = 1 (h) = 4 = 30 Khảo sát ∆L* = f ∆C* = f ∆h* = f Với F(g/ml) = 1:10, 1:12.5, 1:15, 1:17.5, 1:20 Kết quả khảo sát (Phụ lục 3) Hình 5.2 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tỉ lệ da/dung dịch lên quá trình tẩy màu Nhận xét Từ đồ thị ta thấy chênh lệch độ sáng tăng mạnh khi tỉ lệ da/dung dịch tăng từ 1:10 đến 1:15. Sau đó, độ chênh lệch này giảm nhẹ khi ta tiếp tục tăng tỉ lệ đến mức 1:20. Da cá được tẩy màu đến mức sáng nhất tương ứng với tỉ lệ da/dung dịch là 1:15. Độ trắng của da ở mức tỉ lệ 1:17,5 không lệch nhiều so với mức 1:15. Trong khi đó, độ bão hòa màu tại tỉ lệ 1:17,5 là thấp nhất Þ chọn mức tỉ lệ 1:17,5 Tổng lượng collagen trong da cá Theo phương pháp định lượng hydroxyproline (Phụ lục 4) Hình 5.3 Đồ thị biểu diễn đường chuản của độ hấp thụ theo nồng độ hydroxyproline Bảng 5.3 Tổng lượng collagen trong da cá (xét trên 30 g da cá) (Phụ lục 5) Loại da cá Lần thí nghiệm Độ hấp thu Hàm lượng Hydroxyproline (g/ml) Giá trị trung bình (g/ml) Lượng collagen (g) Da ban đầu 1 1,342 0,315 0,317 4,66 2 1,371 0,319 Da sau khi xử lý 1 1,229 0,299 0,297 4,37 2 1,194 0.294 Da cá ban đầu Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng ướt (wet weight) Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng khô (dry weight) Da cá sau khi xử lý Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng ướt (wet weight) Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng khô (dry weight) Theo phương pháp trích ly bằng lactic acid (Phụ lục 6) Điều kiện khảo sát Điều kiện cố định mướt (g) = 30 = 4 F (g/ml) = 1:6 CLactic acid = 0,5 = 48 Kết quả Bảng 5..4 Kết quả lượng collagen trích bằng lactic acid (phụ lục 6) Lần trích ly Lần thí nghiệm Lượng collagen (g) Thu được Giá trị trung bình (g) 1 1 3,36 3,32 2 3,28 2 1 0,90 0,89 2 0,89 3 1 0,19 0,19 2 0,18 Lượng collagen tổng cộng: 3,32 + 0,89 + 0,19 = 4,4 (gram) Phần trăm collagen theo khối lượng ướt (wet weight) % collagen = Phần trăm collagen theo khối lượng khô (dry weight) % collagen = Độ chênh lệch giữa 2 phương pháp Qua so sánh, ta thấy phương pháp trích ly bằng lactic acid không chênh lệch nhiều so với phương pháp định lượng hydroxyproline. Phương pháp định lượng collagen thông qua sự định lượng hydroxyproline là phương pháp chuẩn, có tính chính xác cao, đáng tin cậy. Tuy nhiên, phương pháp này tương đối phức tạp và giá thành rất đắt. Do đó, để xác định hiệu suất của quá trình trích ly ta không sử dụng phương pháp này mà xác định lượng collagen bằng quá trình tinh chế. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích collagen Loại acid, phương pháp trích và thời gian trích Điều kiện khảo sát Điều kiện cố định mướt (g) = 30 = 4 F (g/ml) = 1:6 CAcid = 0.5 Khảo sát H (%) = f(Loại acid) H (%) = f(Phương pháp trích) H(%) = f() Với Loại acid Acetic và Citric acid Phương pháp từng phần và toàn phần (h) = 24, 48, 72 Kết quả khảo sát (Phụ lục 7) Hình 5.4 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của loại acid, phương pháp trích và thời gian lên hiệu suất trích collagen Bảng 5.5 Lượng collagen thu được trong quá trình trích ly Loại acid Citric Acetic Phương pháp Thời gian Toàn phần Từng phần Toàn phần Từng phần 24 4,55 4,55 26,14 26,14 48 12,95 14,32 45,68 48,41 72 15,23 20,00 68,18 77,73 Nhận xét Thời gian trích: hiệu suất trích collagen đồng biến theo thời gian đối với cả 2 loại acid. Phương pháp trích: ở mỗi loại acid, lượng collagen thu được theo phương pháp trích từng phần cao hơn so với phương pháp trích toàn phần. Loại acid: từ đồ thị ta thấy Acetic acid thích hợp cho việc trích collagen hơn vì nó cho hiệu suất cao hơn rất nhiều so với Citric acid. Đánh giá tính chất sản phẩm Xác định sự bền nhiệt của collagen (Thermal stability) Phương pháp đo độ nhớt (Phụ lục 8) Hình 5.7 thể hiện sự thay đổi của độ nhớt từng phần (fractional viscosity) của collagen từ da cá Basa theo sự gia tăng của nhiệt độ. Đối với cả 3 loại collagen thu được từ phương pháp trích ly bằng 3 loại acid (acetic, citric và lactic acid), đồ thị cho thấy độ nhớt của dung dịch collagen có khuynh hướng giảm khi đun nóng. Điều này có thể được giải thích do sự biến tính của collagen. Nhiệt độ biến tính, Td, được xác định là nhiệt độ mà tại đó sự thay đổi của độ nhớt đã xảy ra được một nửa. Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá Basa là khoảng 37,5 0C, nhiệt độ này thay đổi không đáng kể giữa collagen trích bằng các loại acid khác nhau. Nhiệt độ ghi nhận được trong thí nghiệm này là tương đối cao so với nhiệt độ biến tính của collagen thu được từ những loài cá khác đã được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây. Nguyên nhân lý giải cho điều này là do điều kiện môi trường sống của cá có ảnh hưởng đến cấu trúc da và qua đó ảnh hưởng lên tính chất của collagen. Collagen thu được từ các loài cá khác nhau sẽ có khả năng bền nhiệt khác nhau. Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (cP) 30 136 32,5 128,2 35 125,6 37,5 115,1 40 99,4 42,5 78,5 45 70,6 47,5 54,9 50 47,1 Td Td Td Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (cP) 30 125,6 32,5 115,1 35 99,4 37,5 83,7 40 66,3 42,5 54,9 45 42,8 47,5 34,9 50 32,3 Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (cP) 30 141,3 32.5 123 35 106,4 37.5 96,8 40 89,8 42.5 75,9 45 62,8 47.5 55,8 50 53,2 Hình 5.5 Đường cong biến tính theo nhiệt độ của collagen Phương pháp DTA/TG (Phụ lục 9) Đường phân tích nhiệt DTA/TG của collagen trích bằng acetic acid Đường phân tích nhiệt DTA/TG của collagen trích bằng citric acid Đường phân tích nhiệt DTA/TG của collagen trích bằng lactic acid Hình 5.6 Đường phân tích DTA/TG của collagen Nhìn chung, đường phân tích nhiệt của collagen trích bằng 3 loại acid có xu hướng giống nhau. Đường biểu diễn của collagen (trích bằng acetic acid) có 2 peak gần sát với collagen (trích bằng lactic acid, xem như là mẫu đối chứng). Độ sạch của các collagen sau khi tinh chế là tương đối cao, nhiệt độ phân hủy vào khoảng 119,2 0C. Mẩu collagen trích bằng citric acid có lẫn tạp chất, không tinh khiết bằng collagen trích từ 2 loại acid còn lại. Nguyên nhân có thể là do các tinh thể citric chưa được thẩm tích hết. Sự hình thành sợi của collagen (Phụ lục 10) a Thời gian (phút) Collagen hòa tan Gelatin 0 0,1357 0,0046 2 0,1363 0,0046 4 0,1377 0,0046 6 0,1422 0,0046 8 0,1446 0,0046 10 0,1463 0,0046 12 0,1529 0,0046 14 0,1565 0,0046 16 0,1603 0,0046 18 0,1623 0,0046 20 0,1637 0,0046 22 0,1645 0,0046 24 0,1660 0,0046 26 0,1660 0,0046 28 0,1660 0,0046 30 0,1660 0,0046 b Thời gian (phút) Collagen hòa tan Gelatin 0 0,0087 0,0046 2 0,0095 0,0046 4 0,0105 0,0046 6 0,0114 0,0046 8 0,0136 0,0046 10 0,0141 0,0046 12 0,0149 0,0046 14 0,0149 0,0046 16 0,0149 0,0046 18 0,0149 0,0046 20 0,0149 0,0046 22 0,0149 0,0046 24 0,0149 0,0046 26 0,0149 0,0046 28 0,0149 0,0046 30 0,0149 0,0046 c Thời gian (phút) Collagen hòa tan Gelatin 0 0,0558 0,0046 2 0,0558 0,0046 4 0,0570 0,0046 6 0,0604 0,0046 8 0,0658 0,0046 10 0,0686 0,0046 12 0,0765 0,0046 14 0,0794 0,0046 16 0,0803 0,0046 18 0,0819 0,0046 20 0,0821 0,0046 22 0,0823 0,0046 24 0,0828 0,0046 26 0,0837 0,0046 28 0,0837 0,0046 30 0,0837 0,0046 Gelatin chuẩn Collagen (trích ly bằng acetic acid) Collagen (trích ly bằng lactic acid) Collagen (trích bằng citric acid) Hình 5.7 Đồ thị biểu diễn độ đục của collagen trích ly bằng acetic acid (a), citric acid (b) và lactic acid (c) theo thời gian Nhận xét Dựa vào đồ thị trên, ta thấy cường độ hấp thụ của dung dịch collagen đồng biến với thời gian. Độ hấp thụ A tăng nhanh trong khoảng 10 phút đầu tiên, sau đó tốc độ tăng chậm lại và có khuynh hướng duy trì ổn định sau một khoảng thời gian nhất định. Theo thời gian dung dịch collagen trở nên đục chúng tỏ có sự hình thành sợi xảy ra trong dung dịch. Trong khi đó, cường độ quang của dung dịch gelatin không thay đổi theo thời gian vì không có sự tạo sợi diễn ra. Collagen thu được từ quá trình trích ly sử dụng acetic acid có độ hấp thụ quang học lớn nhất so với collagen trích ly bằng citric và lactic acid Þ sự hình thành sợi diễn ra mạnh mẽ nhất đối với collagen trích ly bằng acetic acid. Cấu trúc bề mặt của collagen Kết quả phân tích Sự khác biệt về hình thái bề mặt của collagen so với mẫu gelatin chuẩn được quan sát thông qua hình chụp bằng phương pháp SEM. Dưới đây là hình ảnh SEM của collagen thu được từ da cá Basa và của mẫu gelatin chuẩn Hình 5.8 Hình thái bề mặt của A. collagen trích bằng acetic, B. collagen trích bằng citric, C. collagen trích bằng lactic và D. gelatin chuẩn Nhận xét Có sự khác biệt rất rõ ràng giữa cấu trúc của collagen và gelatin. Dựa vào hình trên ta thấy collagen có cấu trúc mạng lưới sợi với bề mặt nhám, xù xì. Trái lại, mẫu gelatin với bề mặt trơn phẳng hơn do nó không có cấu trúc mạng lưới như collagen. Cấu trúc bề mặt của collagen là giống nhau đối với cả 3 loại acid dùng trong quá trình trích ly. Phổ hồng ngoại IR Kết quả phân tích (Phụ lục 11) Phổ hồng ngoại của collagen thu đươc từ da cá Basa bằng quá trình trích ly của 3 loại acid được thể hiện qua những biểu đồ dưới đây. Phổ IR của collagen trích ly từ da cá Basa (sử dụng citric acid) Phổ IR của collagen trích ly từ da cá Basa (sử dụng acetic acid) Phổ IR của collagen trích ly từ da cá Basa (sử dụng lactic acid) Hình 5.9 Phổ IR của collagen Bảng 5.6 Vị trí các đỉnh (peak) trong phổ IR của collagen hòa tan trong acid từ da cá Basa Vùng Wavenumber (cm-1) Collagen (acetic) Collagen (citric) Collagen (lactic) Amide A 3449 3432 3459 Amide B 2925 2627 2925 Amide I 1619 1637 1645 Amide II 1560 1543 Amide III 1241 1226 1226 So sánh với collagen thu được từ các nghiên cứu khác Hình 5.10 Phổ FTIR của collagen thu được từ cá rô non và trưởng thành (young and adult Nile perch) Bảng 5.7 So sánh vị trí các đỉnh trong phổ hồng ngoại của collagen trích ly từ da cá Basa, cá rô (Lates niloticus) và cá ngừ (Thunnus albacares) Vùng Wavenumber (cm-1) Cá Basa Cá rô non Cá rô trưởng thành Cá ngừ Acetic Citric Lactic Amide A 3449 3432 3459 3434 3458 3427 Amide B 2925 2627 2925 2924 2926 Amide I 1619 1637 1645 1650 1654 1651 Amide II 1560 1543 1542 1555 1544 Amide III 1241 1226 1226 1235 1238 1240 Nhận xét Những vùng amide (bao gồm A, B, I, II và III) của collagen từ da cá Basa là tương đương nhau khi so sánh giữa 3 loại acid được sử dụng cho quá trình trích ly. Collagen thu được từ da cá Basa theo phương pháp trích ly bằng acid thể hiện kết quả phổ IR giống với phổ tu được từ những loại collagen khác (so sánh với collagen thu được từ những quy trình đã được công bố). Vùng amide I, II và III có liên quan trực tiếp đến hình dạng của chuỗi polypeptide. Nhóm amide A (3400 ¸ 3440 cm-1) liên hệ với mũi kéo N – H. Nhóm amide I (1600 ¸ 1660 cm-1) biểu thị stretching vibration của các gốc carbonyl trong các peptide, nó là thành phần quan trọng nhất trong việc khảo sát cấu trúc bậc hai của các protein. Nhóm amide II (~ 1550 cm -1) biểu thị NH bending và CN stretching. Nhóm amide III (1220 ¸ 1320 cm-1) biểu diễn CN stretching và NH, có liên quan đến cấu trúc chuỗi xoắn ốc của collagen. Trong phổ hồng ngoại thu được từ collagen của cá Basa, tất cả các đỉnh tương ứng với các dải amide trên được biểu diễn ở các bước sóng tương tự như đối với collagen từ 2 loài cá đã được nghiên cứu (cá rô và cá ngừ). Đỉnh amide I của collagen từ cá Basa có tần suất thấp hơn so với cá rô và cá ngừ. Tần suất của collagen trích bằng acetic acid nhỏ hơn so với collagen trích bằng citric và lactic acid. Vùng amide I có mối liên hệ đến mức độ tương tác giữa các phân tử collagen. Nó còn là thành phần của các chuỗi ngẫu nhiên (random coil). Từ đó ta có thể đưa ra kết luận: Collagen trong da cá Basa có ít các liên kết liên phân tử nên dễ dàng được hòa tan bằng acid hơn cá rô và cá ngừ. Acetic là dung môi trích ly hữu hiệu nhất trong 3 loại acetic, citric và lactic acid. CHƯƠNG 6 NHẬN XÉT – BÀN LUẬN Nhận xét trên nguồn nguyên liệu Cá Basa là loài cá tăng trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng và có giá trị xuất khẩu cao. Ở nước ta, đặc biệt là vùng Đồng bằng sông Cửu Long, việc nuôi cá Basa rất phát triển. Mặt hàng xuất khẩu chủ yếu là fillet cá, lượng xuất khẩu khoảng 30.000 ¸ 35.000 tấn fillet/năm. Trong quá trình chế biến cá, da là nguồn phụ phẩm chiếm khối lượng khoảng 0,5%. Như vậy, ta có khoảng 1.500 ¸1.750 tấn da/năm. Nếu được tận dụng làm nguồn nguyên liệu dùng trong việc sản xuất collagen thì giá trị kinh tế của da cá Basa, vốn dĩ trước đây chỉ làm thức ăn gia súc hay phân bón, sẽ được nâng lên. Về mặt cấu tạo, da cá Basa cũng có lớp biểu bì (epidermis) và lớp bì (dermis) như da người nên collagen có nguồn gốc từ da cá được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Nhận xét trên quy trình thí nghiệm Quy trình thí nghiệm gồm các khâu chính như sau: Khâu 1: Xử lý da, da tươi được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An, Khu công nghiệp Trá Nóc, TP. Cần Thơ, trải qua các giai đoạn xử lý bao gồm loại béo, tẩy màu. Sau khi xử lý, da được trữ trong tủ đông ở nhiệt độ khoảng – 20 0C cho đến khi được sử dụng cho các bước tiếp theo. Khâu 2: Trích chiết collagen, sử dụng acetic acid để lấy collagen từ da cá đã xử lý. Khâu 3: Tinh chế collagen, collagen được kết tinh và lấy ra khỏi dịch trích bằng phương pháp ly tâm. Quy trình thí nghiệm có thể tóm tắt bằng sơ đồ khối như sau: Da nguyên liệu Loại béo Tẩy màu 1 % 4 h F 1:17,5 g/ml 30 0C Trích ly mướt 30 g 0,5M 24 h 3 lần F 1:6 g/ml 4 0C Tinh chế Collagen thành phẩm Hình 6.1 Quy trình sản xuất collagen từ da cá Một điểm bất lợi cần phải đề cập đến của collagen trích ly từ da cá đó là sự lưu tồn dai dẳng của màu và mùi hôi của cá. Do đó, cần phải có giai đoạn xử lý da cá để loại bỏ các chất béo gây mùi hôi và các sắc tố để có thể thu được collagen không màu và không mùi. Quy trình loại béo Áp dụng quy trình của Gudmundsson và Hafsteinsson (1997), da cá được xử lý 3 lần với mỗi loại dung dịch sau 0,2 % NaOH, 0,2 % H2SO4 và 0,7% citric acid. Da sau khi xử lý không còn mùi hôi. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là quy trình khá phức tạp và tốn sức. Da cá được xử lý trải qua một loạt dung dịch, sau mỗi lần xử lý da phải được rửa sạch đến khi pH đạt bằng 7. Đây chính là phần tiêu tốn nhiều thời gian nhất của quy trình. Đồng thời, một lượng collagen trong da bị mất đi sau khi trải qua xử lý. Tuy nhiên, nếu loại bỏ các hợp chất non-collagen chỉ với dung dịch NaOH thì da vẫn còn rất hôi và nhớp nháp. Tất cả các dung dịch dùng trong quá trình xử lý được thêm vào 0,5% chất hoạt động bề mặt LaSNa nhằm làm tăng hiệu quả của quá trình loại mùi. Quy trình tẩy màu Áp dụng quy trình của Kolodziejska et al. (1999), nhìn chung các sắc tố đã được loại một cách khá tương đối. Độ trắng của da cá sau khi xử lý đuợc cải thiện đáng kể so với da cá ban đầu. Hai thông số quan trọng trong quá trình loại pigment của da cá là nồng độ H2O2 và thời gian tẩy màu. Một điểm cần chú ý là màu phụ trong quá trình xử lý. Nếu ngâm da cá quá lâu thì da sẽ bị ngả màu vàng. Quy trình trích ly So sánh tác chất trích ly Trong quy trình trích ly có sử dụng 2 loại acid là acetic và citric acid. Hiệu suất của quá trình trích ly sử dụng acetic acid cao hơn gấp nhiều lần so với sử dụng citric acid. Dịch collagen thu được khi trích ly bằng acetic acid gần như không màu, trong khi đó nếu trích bằng citric acid thì dịch trích có ánh màu hơi vàng. Một đặc điểm nổi trội nữa của acetic đó là ta có thể thu được collagen tinh khiết từ dung dịch collagen trong acetic bằng phương pháp sấy lạnh. Đối với trường hợp collagen trong dung dịch citric acid, sản phẩm của quá trình sấy lạnh không những chỉ có collagen mà còn lẫn các hạt tinh thể của citric. Do đó, thẩm tích để loại tinh thể citric là một việc làm cần thiết để collagen trích ly được có thể dùng cho những ứng dụng xa hơn nữa. Theo các nghiên cứu đã công bố, lactic acid cho hiệu suất trích ly cao, khoảng 90%. Trong dung dịch lactic acid, collagen được hoà tan hoàn toàn sau khi trích ly 24 h. Tuy nhiên, giá thành của lactic acid tương đối cao so với acetic acid. Từ đó có thể kết luận, acetic acid là dung môi lý tưởng nhất cho quá trình trích ly collagen từ da cá Basa. Quá trình trích ly collagen từ da cá Basa chủ yếu sử dụng các acid hữu cơ như acetic, citric hay lactic. Các acid vô cơ là những acid mạnh, chẳng hạn như HCl, có pH thấp làm giảm khả năng hoà tan của collagen vào trong dung dịch do đó hiệu suất trích ly không cao. Điều này được lý giải là do những nhóm amine mang điện tích dương của protein tạo liên kết với anion Cl-, làm cấu trúc sợi của collagen chặt chẽ hơn, khả năng tạo liên kết với nước bị hạn chế làm cho sự hoà tan của collagen giảm. Ở pH nhỏ hơn 2 các protein bị biến tính. Sợi collagen co lại làm cho sự hydrat hoá không thể xảy ra do giữa các đại phân tử có ít không gian cho phân tử nước. Các thông số quan trọng trong quá trình trích ly Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly chẳng hạn như loại acid, phương pháp trích ly, thời gian trích, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly,… Kích cỡ nguyên liệu và tỉ lệ nguyên liệu : dung môi được xem là hai thông số quan trọng bởi vì quá trình tiếp xúc giữa hai pha rắn – lỏng càng tốt khi bề mặt tiếp xúc pha càng lớn. Nguyên liệu có kích thước nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc pha làm quá trình trích ly xảy ra hoàn toàn, ngược lại thì trích ly sẽ bị hạn chế do không có sự tiếp xúc tốt giữa hai pha. Tỉ lệ da : dung dịch acid lớn thì da sẽ phân tán đều trong dung dịch, nếu lượng acid quá ít thì bề mặt da không được tiếp xúc hoàn toàn với dung dịch, trích ly không hoàn toàn. Thông số thời gian quyết định hiệu suất trích ly. Nếu thời gian ngắn thì collagen hòa tan vào acid chưa nhiều nên hiệu suất thấp. Tuy nhiên, thời gian quá dài cũng không tốt vì mạch collagen có thể bị cắt sâu xuống hình thành gelatin. Trong đề tài luận văn này, quy trình trích ly còn tương đối đơn giản, chỉ có sự hỗ trợ của sự khuấy gián đoạn. Do đó, hiệu suất thu được vẫn chưa cao lắm, collagen chưa hoà tan hoàn toàn. Ta có thể nâng cao hiệu suất trích ly collagen bằng cách tiền xử lý cơ học, hóa học hay enzyme. Nguyên liệu cần được xay nhỏ để tăng khả năng tiếp xúc với dung dịch. Đồng thời trong quá trình trích ly cần kết hợp với sự khuấy trộn cơ học. Sự khuấy nhằm giúp cho sự hoà trộn giữa nguyên liệu và dung môi được tốt hơn và cung cấp năng lượng cho quá trình trích ly. Một phương pháp nữa để làm tăng lượng collagen trích ly được là áp dụng sự tiền xử lý với enzyme. Các enzyme thường được sử dụng như pepsin, trypsin, pancreatin, ficin, bromelin hay papain. Các enzyme này chỉ cắt bỏ những phần đầu mút không xoắn ốc (telopeptide) của collagen. Chính nhờ sự cắt đứt các telopeptide này đã làm đứt các liên kết giữa các phân tử do đó làm tăng khả năng hoà tan của collagen. Mức độ gia tăng của sự hoà tan collagen tuỳ thuộc vào từng loài cá. Collagen trong da của một số loài cá có thể hoà tan hoàn toàn trong dung dịch acetic acid sau khi xử lý enzyme. Tuy nhiên, ở một số loài khác, hiệu suất trích ly sau khi xử lý với enzyme chỉ tăng khoảng 5%. Sự khác biệt này được gây ra bởi sự khác nhau về vị trí cũng như loại liên kết liên phân tử của các loài cá. Đánh giá kết quả Quá trình tẩy màu Qua quá trình khảo sát, điều kiện thích hợp rút ra cho quá trình tẩy màu là: Nồng độ H2O2 1 % Thời gian tẩy màu 4 h Tỉ lệ da : dung dịch 1:17,5 g/ml Nhiệt độ 30 0C Thời gian là thông số quan trọng nhất ảnh hưởng đến quá trình tẩy màu. Trong khoảng thời gian 4 giờ đầu tiên, khả năng tẩy màu của dung dịch H2O2 đồng biến theo thời gian. Thời gian tăng thì độ trắng, sáng của da cá tăng theo và đạt giá trị cực đại tại 4 0C. Sau đó, độ trắng có khuynh hướng giảm xuống và duy trì cho đến 24 h. Hai thông số quan trọng tiếp theo là nồng độ H2O2 và tỉ lệ da : dung dịch. Giữa các mức giá trị của 2 thông số vừa nêu, độ trắng của da cá chênh lệch nhau không quá nhiều. Trong số đó thì nồng độ H2O2 và tỉ lệ 1:17,5 cho kết quả khả quan nhất. Quá trình trích ly Loại acid sử dụng có ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu suất trích ly. Hiệu suất trích ly bằng acetic cao hơn so với citric. Khi thời gian trích ly tăng, lượng collagen hoà tan tăng nên hiệu suất cao. Ta chỉ khảo sát 3 mốc thời gian 24, 48 và 72 h mà không khảo sát trong khoảng thời gian lâu hơn nữa vì collagen có thể bị cắt mạch mạnh xuống thành gelatin. Còn nếu thời gian quá ngắn thì không đủ để cho acid lôi kéo collagen. Phương pháp trích ly từng phần với 3 lần trích ly trên cùng một lượng da, mỗi lần 24 h cho kết quả khả quan hơn phương pháp trích ly toàn phần thực hiện 1 lần trong 72 h. Nguyên nhân có thể là do nếu chỉ sử dụng cùng một lượng dung dịch acid trong một khoảng thời gian dài thì dung dịch có thể bị bão hoà không hoà tan được thêm collagen nữa. Nếu thay đổi dung dịch nhiều lần thì có thể trích ly triệt để hơn lượng collagen có trong da cá. Tuy nhiên, sự chênh lệch giữa 2 phương pháp này không nhiều lắm. Điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly thông qua khảo sát có được là: Loại acid Acetic acid Thời gian trích ly 72 h Phương pháp trích ly Từng phần Nồng độ acid 0,5M Nhiệt độ trích ly 4 0C Tỉ lệ da : acid 1:6 g/ml Đánh giá tính chất sản phẩm Nhiệt độ biến tính (Denaturation temperature) Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá Basa là khoảng 37,5 0C, cao hơn so với collagen tu được từ những loài cá đã được nghiên cứu như cá tuyết (15 0C), cá thu (26,1 0C), cá chép (32,5 0C), cá rô (36,5 0C). Nhiệt độ biến tính cao của collagen từ da cá Basa là do cấu trúc da của nó có chứa nhiều thành phần imino acid (proline và hydroxyproline). Hàm lượng imino acid, đặc biệt là hydroxyproline, phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường sống của cá và nó có ảnh hưởng lên sự bền nhiệt của collagen. Collagen có nguồn gốc từ các loài cá sống trong môi trường nước lạnh có thành phần hydroxyproline thấp hơn so với những loài sống ở vùng nước ấm. Các imino acid, proline và hydroxyproline, có trong các liên kết hydrogen giữa các chuỗi. Các liên kết này góp phần làm ổn định cấu trúc chuỗi xoắn ốc của collagen. Cá Basa là loài cá sống ở vùng nước ấm nên có chứa nhiều hydroxyproline nên nhiệt độ biến tính cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của collagen Độ tuổi của động vật Độ tuổi của cá ảnh hưởng đến các mô liên kết cũng như số lượng, chất lượng của các protein cơ bản của nó. Số lượng liên kết trong collagen gia tăng theo độ tuổi. Tuy nhiên, phần lớn các mô liên kết trong cá được tái tạo hàng năm và các protein có cấu trúc với nhiều liên kết không được tìm thấy trong cá. Collagen từ những động vật còn non dễ được trích ly hơn nhưng cho cấu trúc có độ bền thấp. Ngược lại, collagen từ động vật trưởng thành khó hoà tan hơn và cấu trúc của nó có độ bền cao. Chế độ ăn uống Ở một số loài cá, lượng collagen và số lượng liên kết trong nó gia tăng cùng với sự thiếu thốn thức ăn. Theo nghiên cứu, những con cá thiếu ăn sẽ sản sinh ra nhiều collagen, đặc biệt là collagen có nhiều liên kết, hơn là những con được ăn uống đầy đủ. Thành phần imino acid Khả năng bền nhiệt của collagen liên quan đến thành phần imino acid (proline và hydroxyproline). Thành phần imino acid càng cao thì cấu trúc chuỗi xoắn ốc của collagen càng ổn định. Thành phần proteoglycan và glycoprotein cũng ảnh hưởng đến sự bền nhiệt của collagen. Sự hình thành sợi của collagen Collagen có thể kết hợp lại tạo thành sợi dưới những điều kiện sinh lý học. Quá trình tái tạo sợi trong quy mô phòng thí nghiệm có thể chia ra làm 3 bước bao gồm giai đoạn khơi mào phụ thuộc và nhiệt độ, giai đoạn phát triển phụ thuộc nhiệt độ và giai đoạn phát triển không phụ thuộc nhiệt độ. Những loại collagen khác nhau với những cấu trúc khác nhau của các chuỗi xoắn ốc ảnh hưởng đến thời gian và mức độ tạo sợi. Những quy trình điều chế khác nhau của cùng một loại collagen cũng cho những đáp ứng và điều kiện khác nhau trong quá trình tạo sợi. Sự tái tạo sợi của collagen chịu ảnh hưởng của loại collagen, phương pháp trích ly và điều kiện trong quá trình tạo sợi (chất đệm, nhiệt độ và nồng độ protein,…). Gelatin được điều chế ở điều kiện nhiệt độ cao, các nhóm amide bị thuỷ phân và cấu trúc chuỗi xoắn ốc collagen bị phá huỷ. Cấu trúc của gelatin không có trật tự và khối lượng phân tử phân bố trong một khoảng rộng là cho sự tái tạo sợi không thể xảy ra. Thêm vào đó, sự tổ hợp của các đơn phân collagen trong quá trình tạo sợi liên quan đến sự tương tác tĩnh điện, kỵ nước qua lại giữa các chuỗi collagen. Quá trình điều chế collagen dựa vào sự gia tăng của các điện tích âm, điều này góp phần làm cho sự tương tác giữa các phân tử khó khăn do lực đẩy giữa các điện tích âm. Do đó, gelatin không có khả năng hình thành sợi. Phổ hồng ngoại của collagen IR là phương pháp đo chiều dài sóng và cường độ hấp thụ bức xạ hồng ngoại của mẫu. Những thành phần polypeptide và protein cho ta 9 loại dải hấp thụ là amide A, B và I – VII. Trong số đó, amide I và II là 2 dải nổi bật nhất trong chuỗi protein. Vùng phổ nhạy nhất trong thành phần cấu trúc bậc hai của protein là dải amide I (1700 ¸ 1600 cm-1), chủ yếu dựa vào nối đôi C = O trong liên kết peptide (khoảng 80 %). Phổ hồng ngoại của collagen trích ly từ da cá Basa bằng acetic acid phản ánh sự hiện diện của dải amide A (3449 cm-1), amide B (2925 cm-1), amide I (1619 cm-1), amide II (1560 cm-1) và amide II (1241 cm-1). Dải amide I có liên đới với cấu trúc bậc hai của protein và amide chứng minh sự có mặt của cấu trúc chuỗi xoắn ốc. kết quả phổ IR cho thấy có cấu trúc xoắn ốc trong collagen thu được từ da cá Basa. Sản phẩm phụ của quy trình sản xuất collagen từ da cá Basa Sản phẩm chính của quy trình là collagen hoà tan trong acid (acid soluble collagen ASC). Phần dư còn lại còn chứa một lượng collagen và được xem như là collagen không hoà tan (insoluble collagen). Thay vì làm tan rã và chuyển thành vật liệu hòa tan, collagen với nhiều liên kết ngang có thể được phân tán thành những huyền phù sợi màu trắng sữa bằng những tác nhân biến tính nhẹ hoặc làm vụn bằng phương pháp cơ học ở điều kiện pH acid. Sợi collagen bền hơn với sự thủy phân so với những thành phần khác trong mô không phải là collagen, được tách khỏi trong suốt quá trình thủy phân và rửa. Trong những bước xử lý được bổ sung thêm vào, vật liệu collagen có thể được dùng cho những ứng dụng hóa học như sự acetyl hóa, sự methyl hóa hoặc có thể dùng để gắn kết với các polymer khác. Hình 6.2 Kết quả đo kích thuớc hạt của insoluble collagen xử lý bằng acetic acid Hình 6.3 Kết quả SEM của insoluble collagen xử lý bằng 3 loại acid A. Acetic acid, B. Citric acid, C. Lactic acid Kết luận – kiến nghị Kết luận Collagen là một loại protein cấu trúc chính của cơ thể, có rất nhiều chức năng trong cơ thể con người. nó có phạm vi ứng dụng rộng rãi trong những ngành quan trọng như y học, công nghiệp và trong mỹ phẩm. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trong việc tìm ra các nguồn thay thế nhằm đáp ứng nhu cầu collagen của thị trường. Những phụ phẩm từ cá đã được chứng minh là nguồn thay thế lý tưởng nhất cho việc cung cấp collagen. Cá Basa là loài cá phổ biến ở Việt Nam, có giá trị kinh tế cao với sản lượng nuôi và xuất khẩu lớn. Da là một nguồn phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến thủy, hải sản với một khối lượng khổng lồ. Việc tận dụng nguồn phế phẩm này để điều chế collagen góp phần đem lại hiệu quả kinh tế. Trong phạm vi khảo sát của luận văn này, có thể rút ra điều kiện tối ưu cho quá trình trích chiết như sau: acetic acid là loại acid tốt nhất cho quá trình trích ly collagen từ da cá Basa. Các mức giá trị cho kết quả khả quan nhất của các thông số như nồng độ acid, tỉ lệ da : dung dịch, nhiệt độ, thời gian lần lượt là 0,5 M, 1 : 6 g/ml, 4 0C và 72 h. Phương pháp trích ly từng phần cho hiệu suất cao hơn. Kiến nghị Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn cũng như máy móc, thiết bị còn thiếu thốn nên không thể khảo sát hết tất cá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly collagen từ da cá Basa. Do đó, tôi đề nghị một số nghiên cứu cần khảo sát như sau : Khảo sát nồng độ acid, tỉ lệ da : acid Khảo sát nhiệt độ trích ly Khảo sát quá trình trích ly collagen từ xương cá Basa Khảo sát tính năng, thăm dò ứng dụng của sản phẩm collagen TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Wolfgang Friess, U.o.E., Erlangen, Germany, Collagen - biomaterial for drug delivery. 1997. 2. Fratzl, P., Collagen Structure and Mechanics. 2008. 3. Frederic M.Richards, D.S.E., John Kuriyan, Advances in Protein Chemistry. 2005. Fibrous Proteins Coiled-Coils, Collagen and Elastomers, Volume 70 4. A.de Meijere, K.N.H., Collagen Primer in Structure, Processing and Assemblyics. 2005. Topics in Current Chemistry. 5. Garg, F.H.S.a.A.K., Handbook of Biodegradable Polymers. Collagen: Characterization, Processing and Medical Applications. 6. Shuai Zhao, M.Z., Guoying Li, Preparation of collagen from the pigskin shavings by alkali extraction. 7. Rume Sakai, S.I., Toshizo Isemura, Soluble collagen of chicken leg tendon; Its denaturation temperature and Hydrodynamic properties. 1967. 8. Nagai, T., Collagen from diamondback squid. 2003. 9. Maria Sadowska, I.K.o., Celina Niecikowska, Isolation of collagen from the skins of Baltic cod (Gadus morhua). 2002. 10. L.S. Senaratne, P.-J.P., Se-Kwon Kim, Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish (Lagocephalus gloveri) skin. 2005. 11. Food and Agricultural Organisation - Food and Nutrition Paper. 14/7/1986. 12. N.Yu. Ignat'eva, N.A.D., Determination of Hydroxyproline in Tissues and the Evaluation of the Collagen Content of the Tissues. 2005. 13. Elzbieta Skierka, M.S., The influence of different acids and pepsin on the extractability of collagen from the skin of Baltic cod. 2006. 14. J.H. Muyonga, C.G.B.C., K.G. Duodu, Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus). 2003. 15. Phanat Kittiphattanabawon, S.B., Wonnop Visessanguan, Takashi Nagai, Munehiko Tanaka, Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus). 2004. 16. Jin-Wook Woo, S.-J.Y., Seung-Mock Cho, Yang-Bong Lee, Seon-Bong Kim, Extraction optimization and properties of collagen from yellowfin tuna (Thunnus albacares) dorsal skin. 2007. 17. V. Vijayasundaram, V.R. and P.R. Palaniappan, The study of the changes in the thermal properties of Labeo rohita bones due to arsenic exposure. 2009. 18. Yun Shana, Y.Z., Yong Caoa,Qunhua Xua, Huangxian Jub, Zonghan Wuc, Preparation and infrared emissivity study of collagen-g-PMMA/In2O3 nanocomposite. 2003. 19. HaiYing Liu, D.L., ShiDong Guo, Studies on collagen from the skin of channel catfish (Ictalurus punctaus). 2006. 20. S.Rama, G.C., Physico - chemical characterisation and molecular organisation of hte collagen from the skin of an air - breathing fish (Ophiocephalus striatus). 1983. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) 2 Hình 1.2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide 2 Hình 1.3 Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen 4 Hình 1.4 Cấu trúc sợi của collagen 4 Hình 1.5 Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen 5 Hình 1.6 Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi 6 Hình 1.7 Hình ảnh của bó sợi (a) và sợi (b) collagen 7 Hình 1.8 Một vài dạng sinh học của collagen 8 Hình 1.9 Keo dán collagen 10 Hình 1.10 Collagen dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ 11 Hình 1.11 Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng 12 Hình 1.12 Sự lão hóa da 14 Hình 1.13 Tác dụng chống lão hóa của collagen 16 Hình 1.14 Tác dụng trị sẹo mụn của collagen 16 Hình 1.15 Bột collagen sản xuất từ da và vảy cá 18 Hình 1.16 Collagen dạng gel 18 Hình 1.17 Collagen EX 19 Hình 1.18 Collagen Update 19 Hình 1.19 Ediva collagen……………………………………………………………………20 Hình 1.20 Viospring collagen active essence 20 Hình 1.21 Collagen essential mask sheet 21 Hình 2.1 Quy trình trích ly collagen từ da heo 22 Hình 2.2 Quy trình trích ly collagen từ gân chân gà 23 Hình 2.3 Quy trình trích ly collagen từ da mực 24 Hình 2.4 Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết 25 Hình 2.5 Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen trích ly từ cá và từ lợn 29 Hình 3.1 Cá Basa 30 Hình 4.1 Quy trình loại béo 48 Hình 4.2 Quy trình tẩy màu 49 Hình 4.3 Quy trình trích ly 50 Hình 5.1 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và thời gian lên quá trình tẩy màu 56 Hình 5.2 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tỉ lệ da/dung dịch lên quá trình tẩy màu 58 Hình 5.3 Đồ thị biểu diễn đường chuản của độ hấp thụ theo nồng độ hydroxyproline 59 Hình 5.4 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của loại acid, phương pháp trích và thời gian lên hiệu suất trích collagen 62 Hình 5.5 Đường cong biến tính theo nhiệt độ của collagen 64 Hình 5.6 Đường phân tích DTA/TG của collagen 66 Hình 5.7 Đồ thị biểu diễn độ đục của collagen trích ly bằng acetic acid (a), citric acid (b) và lactic acid (c) theo thời gian 68 Hình 5.8 Hình thái bề mặt của A. collagen trích bằng acetic, B. collagen trích bằng citric, C. collagen trích bằng lactic và D. gelatin chuẩn 69 Hình 5.9 Phổ IR của collagen 71 Hình 5.10 Phổ FTIR của collagen thu được từ cá rô non và trưởng thành (young and adult Nile perch) 72 Hình 6.1 Quy trình sản xuất collagen từ da cá 76 Hình 6.2 Kết quả đo kích thuớc hạt của insoluble collagen xử lý bằng acetic acid 83 Hình 6.3 Kết quả SEM của insoluble collagen xử lý bằng 3 loại acid A. Acetic acid, B. Citric acid, C. Lactic acid 84 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide 3 Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người…….9 Bảng 2.1 Thành phần collagen trong thịt cá 27 Bảng 3.1 Hai vụ chính để thả cá giống vào bè 33 Bảng 3.2 Sức chịu đựng của cá Basa trong môi trường nước có độ mặn khác nhau 33 Bảng 3.3 Những điều kiện môi trường để cá Basa sống và phát triển 34 Bảng 5.1 Thành phần da cá Basa nguyên liệu 53 Bảng 5.2 So sánh thành phần giữa da nguyên liệu và da sau khi xử lý của hai quy trình 53 Bảng 5.3 Tổng lượng collagen trong da cá 59 Bảng 5.4 Kết quả lượng collagen trích bằng lactic acid 61 Bảng 5.5 Lượng collagen thu được trong quá trình trích ly 63 Bảng 5.6 Vị trí các đỉnh (peak) trong phổ IR của collagen hòa tan trong acid từ da cá Basa 72 Bảng 5.7 So sánh vị trí các đỉnh trong phổ hồng ngoại của collagen trích ly từ da cá Basa, cá rô (Lates niloticus) và cá ngừ (Thunnus albacares) 73