Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase

y đổi. Hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nồng độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 từ 0-2% CMC, đạt cực đại tại nồng độ 2% (0,81 IU/ml). Sau đó, khi nồng độ CMC tiếp tục tăng vƣợt quá 2% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 3% CMC thì hoạt tính endoglucanase còn khoảng 61% (0,49 IU/ml) và ở nồng độ 4% hoạt tính chỉ còn 0,42 IU/ml, đạt khoảng 52% so với hoạt tính khi đạt cao nhất (Hình 3.6, Bảng 3.5). Nhƣ vậy, CMC với nồng độ 2% có vai trò cảm ứng tốt nhất khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ngoại bào của chủng A. awamori VTCC-F-099. 0 40 80 120 0 1 2 3 4 5 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nồng độ CMC (%) Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá (2006) thấy rằng, chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,5% CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy [10]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 4.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 chứa 2% CMC, cao nấm men đƣợc thay thế bằng một số nguồn carbon khác, ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau có sự sai khác đáng kể. Trong đó, hoạt tính enzyme này cao nhất khi lõi ngô đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thay cho cao nấm men (0,87 IU/ml), tiếp theo là bã mía (0,75 IU/ml) và glucose (0,70 IU/ml) (Bảng 3.6). Nhƣ vậy, với mục đích tìm nguồn nguyên liệu sắn có, nhất là nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp thì lõi ngô đƣợc xem là nguồn carbon thay thế thích hợp cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase. Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon Nguồn carbon Hoạt tính endoglucanase IU/ml % Bã mía 0,75 ± 0,146 86 Cao nấm men 0,65 ± 0,166 74 Glucose 0,70 ± 0,134 80 Lactose 0,28 ± 0,084 32 Lõi ngô 0,87 ± 0,158 100 Mùn cƣa 0,39 ± 0,101 45 Xơ dừa 0,54 ± 0,129 62 Sucrose 0,60 ± 0,019 69 Vỏ cà phê 0,64 ± 0,127 74 Vỏ cám trấu 0,57 ± 0,052 65 Vỏ lạc 0,51 ± 0,026 59 Vỏ quýt 0,65 ± 0,166 74 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Theo một số nghiên cứu trƣớc đây, các chủng nấm mốc sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhóm cellulase mạnh trong những môi trƣờng có nguồn carbon tự nhiên nhƣ mùn cƣa, bã mía, lõi ngô [18], [50]. Ở một số chủng Penicillium có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase và -glucosidase mạnh trong môi trƣờng có nguồn cơ chất cellulose tự nhiên còn đối với nguồn cơ chất là xylan yến mạch và birchwood xylan thì hoạt tính rất thấp [33]. Chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,6% rơm đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn carbon [10]. Sau khi tìm đƣợc nguồn carbon thay thế thích hợp là lõi ngô, chúng tôi tiến hành tối ƣu nồng độ nguồn carbon thay thế trên. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ lõi ngô trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong dải nồng độ khảo sát (0,5-5%) thì nồng độ lõi ngô thích hợp nhất cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 3%, hoạt tính đạt 0,90 IU/ml (Hình 3.7, Bảng 3.7). 40 80 120 0 1 2 3 4 5 Ho ạt tín h en do gl uc an as e t ươ ng đố i ( % ) Nồng độ lõi ngô (%) Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Theo nghiên cứu của một số tác giả thì lõi ngô không chỉ thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhóm cellulase mà còn là nguồn cơ chất cảm ứng cho một số loài vi sinh vật sinh tổng hợp một số enzyme khác nhƣ xylanase [16], [17]. 4.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi nuôi trong môi trƣờng có chứa các nguồn nitrogen khác nhau có sự khác nhau đáng kể. Trong số các nguồn nitrogen đƣợc khảo sát thì ammonium acetate đƣợc xem là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase (4,88 IU/ml) (Bảng 3.8). Đây là một nguyên liệu khá dễ kiếm nên đƣợc chọn là nguồn nitrogen để thay thế cho các nguồn nitrogen có trong môi trƣờng cơ bản MT1. Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen Nguồn nitrogen Hoạt tính endoglucanase IU/ml % Ammonium acetate 4,88 ± 0,129 100 Ammonium nitrate 3,91 ± 0,104 80 Ammonium sulphate 4,19 ± 0,124 86 Bột cá 4,10 ± 0,118 84 Bột đậu tƣơng 3,51 ± 0,115 72 Casein 3,44 ± 0,128 71 Peptone 3,67 ± 0,105 75 Urea 3,87 ± 0,077 79 Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cũng cho thấy, các nguồn nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) thích hợp cho Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt [5]. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger RNNL-363 [11]. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) cho thấy, chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 1,6% bột đậu tƣơng đƣợc sử dụng nhƣ nguồn nitrogen trong quá trình lên men [10]. Sau khi tìm đƣợc nguồn nitrogen thay thế thích hợp là ammonium acetate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nguồn nitrogen này đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu. 0 40 80 120 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nồng độ ammonium acetate (%) Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi lƣợng amonium acetate trong thành phần môi trƣờng. Hoạt tính enzyme tăng nhẹ trong dải nồng độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 0,1-0,25%, sau đó tiếp tục tăng mạnh và đạt cực đại tại 0,3% amonium acetate (4,97 IU/ml). Tiếp theo, khi nồng độ amonium acetate tiếp tục tăng vƣợt quá 0,3% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 0,35% ammonium acetate thì hoạt tính endoglucanase là 4,03 IU/ml, đạt 81% và ở nồng độ 0,5% ammonium acetate thì hoạt tính chỉ còn 3,51 IU/ml, đạt 71% so với hoạt tính enzyme khi đạt cực đại (Hình 3.8, Bảng 3.9). 4.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu là một trong những yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các enzyme của các loài vi sinh vật. Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 chứa 2% CMC, 3% lõi ngô, 0,3% ammonium acetate đƣợc điều chỉnh pH từ 3,0 đến 8,0 bằng các dung dịch HCl/NaOH, lắc 200 vòng/phút, ở 30C, trong 96 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.9 và bảng 3.10. 0 40 80 120 2 3 4 5 6 7 8 9 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) pH Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Kết quả trên hình 3.9 và bảng 3.10 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase tăng dần trong dải pH 3,0-6,5, đạt cực đại tại pH 6,5 (5,22 IU/ml). Sau đó, khi pH tiếp tục tăng vƣợt qua pH 6,5 thì hoạt tính enzyme bắt đầu giảm dần. Ở pH 7 hoạt tính là 4,84 IU/ml, đạt 93% và đến pH 8 thì hoạt tính enzyme chỉ là 4,57 IU/ml, đạt 88% so với hoạt tính cực đại. Nhƣ vậy, pH 6,5 là tối ƣu cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase. Nghiên cứu của Đặng Minh Hằng (1999) trên một số chủng nấm sợi cho thấy, khả năng sinh tổng hợp cellulase của chúng mạnh nhất trong khoảng pH 4,5-6,0 [8]. Các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Trong khi đó, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]. 4.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 4.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợc đƣa lên cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 với tổng thể tích là 10 ml. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn (Bảng 3.11) cho thấy, endoglucanase tập trung ở các phân đoạn từ 6 đến 16. Điện di đồ hình 3.10 cho thấy, ở các phân đoạn vẫn còn khá nhiều băng protein, tuy nhiên xuất hiện một băng protein đậm có khối lƣợng dƣới 35 kDa. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 (1-5: các phân đoạn 7-11 qua cột sephadex G-100; 6: Marker; 7: dịch enzyme thô) 4.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE Những phân đoạn qua cột sephadex G-100 có hoạt tính endoglucanase cao (phân đoạn 6-16) đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Tốc độ dòng chảy là 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn cho thấy, các phân đoạn từ 3 đến 7 có hoạt tính riêng cao hơn hẳn so với các phân đoạn khác (Bảng 3.12). Các phân đoạn có hoạt tính cao: từ phân đoạn 3 đến phân đoạn 7 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide. Điện di đồ hình 3.11 cho thấy, enzyme thu đƣợc ở các phân đoạn trên là khá sạch. Các phân đoạn trên đều có duy nhất một loại protein có khối lƣợng phân tử khoảng 32 kDa. Enzyme thu đƣợc có độ sạch 3,08 lần so với dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.13). kDa 166 66 45 35 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg protein/ml) Hoạt tính endoglucamase Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) IU/ml IU/mg protein Dịch thô 0,79 16,69 21,19 1 100 Sắc kí lọc gel Sephadex G-100 0,28 6,30 22,44 1,06 76 Sắc ký trao đổi ion DEAE 0,02 1,19 65,30 3,08 7 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide (1: dịch enzyme thô; 2: marker; 3-7: các phân đoạn 3-7 qua cột DEAE). 4.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE 4.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất Khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là hoạt tính của enzyme tăng. Tuy nhiên, vận tốc phản ứng đạt cực đại ở một giới hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, có thể vận tốc phản ứng lại giảm xuống [4]. kDa 66 45 35 25 18 14 Endoglucanase (32 kDa) Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 0 40 80 120 0 0.5 1 1.5 2 2.5 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nồng độ CMC (%) Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất CMC đến hoạt tính xúc tác của endoglucanase, phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ 50C, pH 6,5 với nồng độ cơ chất từ 0,2-2% CMC. Kết quả cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng tuyến tính khi tăng nồng độ cơ chất trong dải từ 0,2 đến 1,2% CMC, đạt cực đại ở nồng độ 1,2% CMC. Sau đó, nồng độ cơ chất tiếp tục tăng vƣợt quá 1,2% CMC thì hoạt tính endoglucanase lại giảm, chỉ đạt 75% so với hoạt tính cực đại ở nồng độ 1,4% CMC và ở nồng độ 2% CMC thì hoạt tính chỉ bằng 43% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.12, Bảng 3.14). Nhƣ vậy, nồng độ cơ chất 1,2% CMC là tối ƣu cho phản ứng xúc tác của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. 4.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Trong giới hạn Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 nhiệt độ chƣa làm biến tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì hoạt tính của enzyme lại giảm. Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC- F-099, phản ứng đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-70C với nồng độ cơ chất tối ƣu 1,2% CMC pha trong đệm 100 mM potassium photphate, pH 6,5. Khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 50C, hoạt tính tƣơng đối của endoglucanase cũng tăng dần từ 42% đến 100%. Sau đó, khi nhiệt độ tiếp tục tăng vƣợt quá 50C thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nhiệt độ 70C hoạt tính chỉ còn 32% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.13, Bảng 3.15). Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao đã làm đứt gãy một số liên kết yếu trong phân tử protein enzyme, làm thay đổi cấu trúc của phân tử này, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó ảnh hƣởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme. Nhƣ vậy, nhiệt độ thích hợp cho phản ứng phân giải cơ chất CMC của endoglucanase từ A. awamori VTCC-F-099 là 50C, đây là một enzyme ƣa nhiệt. Chủng A. awamori VTCC-F-099 và endoglucanase của nó có thể đƣợc sử dụng vào một số quá trình công nghiệp không đòi hỏi điều kiện nhiệt độ quá cao nhƣ công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp xử lý rác thải, công nghiệp giấy. Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, Cellulase của A. niger NRRL- 363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11]; trong khi đó cellulase của A. niger Z10 là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt cao nhất ở 55C [46]. Theo kết quả nghiên cứu của Kitamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 0 40 80 120 20 30 40 50 60 70 80 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nhiệt độ (oC) Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 4.4.3 pH phản ứng tối ƣu Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trƣờng, do đó pH có ảnh hƣởng rất lớn với tốc độ của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một trị số pH thích hợp cho sự hoạt động của nó. Ảnh hƣởng của pH đối với phản ứng enzyme có thể do nhiều tác dụng khác nhau: pH có thể ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng enzyme do tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzyme, nhất là các nhóm hoạt động của enzyme. Để tìm ra khoảng pH tối ƣu cho hoạt động của endoglucanase từ A. awamori VTCC-F-099, phản ứng giữa enzyme và cơ chất đƣợc thực hiện ở nhiệt độ tối ƣu 50C, với nồng độ cơ chất tối ƣu 1,2% CMC pha trong các đệm sodium acetate và potassium phosphate có pH thay đổi trong khoảng 4,0-8,0. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 0 40 80 120 3 4 5 6 7 8 9 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) pH Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng mạnh trong khoảng pH 4,0-5,0. Hoạt tính tƣơng đối đạt 17% ở pH 4,0 và đạt tối đa ở pH 5,0 (4,08 IU/ml). Sau đó, hoạt tính tƣơng đối giảm dần xuống còn 82% ở pH 5,5 và giảm mạnh xuống 37% ở pH 8,0 (Hình 3.14, Bảng 3.16). pH thích hợp đối với cellulase từ A. niger RNNL-363 là 5,5 [11]; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5 [25]. Nhƣ vậy, endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 hoạt động tốt trong dải pH 5,0-5,5 (100-82%), thuộc loại endoglucanase ƣa acid yếu. 4.4.4 Độ bền nhiệt độ Hầu nhƣ tất cả các enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣởng tới hoạt tính dƣới tác động của nhiệt độ. Nhiệt độ có thể làm cho một số liên kết hydro trong mạng lƣới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 của enzyme bị đứt gẫy. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào nhiệt độ cao hay thấp và thời gian ủ. Để đánh giá độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-70C, sau những khoảng thời gian nhất định hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định. 0 40 80 120 0 20 40 60 80 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Thời gian ủ (giờ) Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 30C; (): 40C; (): 50C; (): 60C; (): 70C Kết quả trên hình 3.15 và bảng 3.17 cho thấy, hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 đều giảm tuyến tính theo thời gian và nhiệt độ ủ càng cao thì hoạt tính giảm càng mạnh. Sau 24 giờ ủ ở 30C và 40C hoạt tính enzyme giảm nhẹ, hoạt tính tƣơng đối còn 94% và 85%. Ở 50C hoạt tính tƣơng đối còn 79% sau 24 giờ ủ và giảm mạnh sau 36 giờ ủ, còn ở 70C hoạt tính giảm mạnh chỉ sau 6 giờ ủ. Nhƣ vậy, enzyme nghiên cứu tƣơng đối bền ở dải nhiệt độ 30-50C, có thể bảo quản ở nhiệt độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 phòng và ứng dụng trong một số quá trình công nghiệp không đòi hỏi nhiệt độ quá cao nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp sản xuất thức ăn cho vật nuôi, công nghiệp xử lý rác thải. 4.4.5 Độ bền pH Do pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến độ bền của protein enzyme nên việc lựa chọn đệm có pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Ở đây, độ bền của endoglucanase đƣợc khảo sát trong các đệm sodium acetate với dải pH 3,5-5,5 và đệm potassium phosphate với dải pH 6,0-8,0. Sau 2 giờ ủ với đệm ở 37C, hoạt tính enzyme đƣợc xác định. 40 80 120 160 ĐC 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) pH Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 Kết quả nhƣ hình 3.16 và bảng 3.18 cho thấy, sau 2 giờ ủ, endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bền trong dải pH 4,0-6,0 (đệm acetate pH 4,0-5,5; đệm phosphate pH 6,0). Hoạt tính enzyme sau khi ủ với các đệm có pH 4,0-6,0 giảm không đáng kể, thậm chí hoạt tính còn tăng nhẹ sau khi ủ với đệm acetate pH 4,5-5,5. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 Tiếp theo, đệm sodium acetate pH 4,0-5,5 và potassium phosphate pH 6,0 trong số các pH thích hợp cho endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát độ bền pH của enzyme nghiên cứu theo thời gian. Kết quả cho thấy, hoạt tính endoglucanase đƣợc duy trì khá tốt trong đệm sodium acetate pH 4,5-5,5. Sau 24 giờ ủ, hoạt tính tƣơng đối giảm không quá 20% so với nhóm đối chứng (Hình 3.17, Bảng 3.19). Nhƣ vậy, đệm sodium acetate pH 4,5-5,5 thích hợp để duy trì hoạt tính endoglucanase trong quá trình bảo quản. 0 40 80 120 0 12 24 36 48 60 72 84 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Thời gian ủ (giờ) Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian (): pH 4; (): pH 4,5; (): pH 5,0; (): pH 5,5; (×): pH 6,0 4.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính của enzyme. Khi thêm dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein [14]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Để khảo sát ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ cùng các dung môi hữu cơ với các nồng độ khác nhau ở 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định. Kết quả cho thấy, cả 4 dung môi hữu cơ ở tất cả các nồng độ khảo sát đều có ảnh hƣởng ức chế hoạt động của endoglucanase, trong đó ethanol làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh nhất. Sau 2 giờ ủ với 30% (v/v) ethanol ở 37C, hoạt tính tƣơng đối của endoglucanase giảm chỉ còn 53% so với nhóm đối chứng (Hình 3.18, Bảng 3.20). Nhƣ vậy, ethanol là dung môi hữu cơ làm ức chế mạnh nhất và acetone là dung môi ức chế yếu nhất hoạt tính endoglucanase trong 4 dung môi hữu cơ khảo sát. 0 40 80 120 ĐC Act BtOH EtOH IsOH MtOH Ho ạt tín h e nd og luc an as e t ươ ng đố i (% ) Dung môi hữu cơ Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 10%; (): 20%; (): 30%; Act: Acetone; BtOH: n-Butanol; EtOH: Ethanol; IsoOH: Isopropanol; MtOH: Methamol. 4.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại Để đánh giá ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme đƣợc thêm vào các ion kim loại khác nhau với nồng độ 5, 10 và 15 mM. Sau 2 giờ ủ ở 37C hoạt tính endoglucanase còn Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 lại đƣợc xác định và so sánh với mẫu đối chứng. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ bảng 3.21 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại Kim loại Nồng độ (mM) Hoạt tính endoglucanase sau 2 giờ ủ (%) 5 10 15 Ag + 74 70 43 Ca 2+ 97 95 90 Co 2+ 99 96 79 Cu 2+ 126 137 148 EDTA 146 153 155 Fe 2+ 129 120 107 K + 92 86 87 Mn 2+ 70 63 54 Ni 2+ 96 93 74 Zn 2+ 94 79 78 Kết quả trên bảng 3.21 cho thấy, tính chất và mức độ ảnh hƣởng của các ion kim loại đối với hoạt tính của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 là khác nhau. Một số ion kim loại (Fe2+, Cu2+) và EDTA làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme. Khi nồng độ các ion trên thay đổi thì hoạt tính của endoglucanase cũng thay đổi theo các chiều hƣớng khác nhau. Khi nồng độ Cu 2+ và EDTA tăng từ 5 mM lên 15 mM thì hoạt tính enzyme tƣơng đối cũng tăng tƣơng ứng từ 126% lên 148% (đối với Cu2+), từ 146% lên 155% (đối với EDTA). Trong khi đó, khi nồng độ của Fe2+ tăng từ 5 mM lên 15 mM thì hoạt tính tƣơng đối của enzyme lại giảm từ 129% xuống còn 107%. Ngƣợc lại, các ion kim loại khác (Ag+, Ca2+, Co2+, K+, Mn2+, Ni2+, Zn 2+ ) lại làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme nghiên cứu với các mức độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 khác nhau. Ở nồng độ thấp, các ion Ca2+, K+, Co2+, Ni2+, Zn2+ làm giảm nhẹ hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Khi nồng độ các ion này càng tăng, hoạt tính enzyme giảm càng mạnh. Riêng ion Ag+ và Mn2+ làm ức chế rõ rệt hoạt tính endoglucanase. Ở nồng độ 15 mM, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 43% (đối với Ag+) và 54% (đối với Mn2+) so với mẫu đối chứng. 4.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa Một số loại chất tẩy rửa có đặc tính hoạt động bề mặt nên khi đƣợc ủ cùng enzyme sẽ làm ảnh hƣởng đến cấu trúc và hoạt động của enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme đƣợc ủ cùng các dung dịch chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, SDS, Triton X-100) ở các nồng độ khác nhau từ 0,5; 1,0; 1,5; 2%. Sau 2 giờ ủ ở 37C hoạt tính còn lại đƣợc xác định. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.19 và bảng 3.22 cho thấy, các chất tẩy rửa trên đều có ảnh hƣởng ức chế hoạt động xúc tác của enzyme nghiên cứu. tween 20 ở nồng độ 0,5-1,0% ảnh hƣởng yếu đến hoạt tính endoglucanase. Hoạt tính tƣơng đối giảm còn 90-78% so với đối chứng sau khi ủ enzyme cùng với 0,5-1% (v/v) Tween 20. Ở nồng độ 1,5-2% Tween 20, hoạt tính tƣơng đối chỉ còn 75-61%. Tween 80 làm giảm hoạt tính endoglucanase từ 83 xuống 64% khi tăng nồng độ từ 0,5 lên 2%. Triton X-100 làm giảm mạnh hoạt tính từ 82 xuống 59% so với đối chứng khi tăng nồng độ từ 0,5-2%. Riêng đối với SDS, thì hoạt tính endoglucanase bị ức chế rõ rệt. Nồng độ SDS càng cao thì hoạt tính tƣơng đối càng giảm, ngay ở nồng độ rất thấp 0,5% hoạt tính chỉ đạt 45% còn ở nồng độ cao 2% thì hoạt tính chỉ còn 16% so với đối chứng. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 0 40 80 120 ĐC Tween 20 Tween 80 SDS Triton X-100 Ho ạt tín h en do gl uc an as e t ươ ng đố i ( % ) Chất tẩy rửa Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 0,5%; (): 1%; (): 1,5%; (): 2%. Thƣờng SDS ức chế rất mạnh hoạt động của enzyme nói chung do có khả năng hình thành một lớp điện tích âm xung quanh phân tử protein enzyme và làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzyme. Do đó, enzyme mất khả năng liên kết và phân giải cơ chất. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa trên tới hoạt tính xúc tác của cellulase từ chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá (2006) cũng thấy rằng cả 4 chất trên đều là chất ức chế hoạt động của cellulase. Trong đó, SDS là chất ức chế mạnh nhất, hoạt tính enzyme giảm xuống còn 18% sau khi ủ với 2% SDS trong 2 giờ ở 37ºC [10]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Chủng Aspergillus awamori VTCC-F-099 có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori đƣợc khảo sát. Chủng này đƣợc định loại bằng chỉ thị gene 28S rRNA. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA của chủng này đã đƣợc đăng ký trong GeneBank với mã số GQ892590. 2. Chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất sau 96 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 pH 6,5, lắc 200 vòng/phút ở 30C. Nồng độ cơ chất cảm ứng tối ƣu là 2% CMC, nguồn carbon và nitrogen thích hợp là lõi ngô (3%) và ammonium acetate (0,3%). 3. Đã tinh sạch đƣợc endoglucanase có khối lƣợng phân tử khoảng 32 kDa từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bằng phƣơng pháp sử dụng kết hợp cột sắc ký lọc gel sephadex-G100 và cột sắc ký trao đổi ion DEAE. Hiệu suất thu hồi endoglucanase khoảng 7%, độ sạch 3,1 lần. 4. Nhiệt độ và pH phản ứng tối ƣu của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 là 50C và 5,0. Enzyme này bền trong dải nhiệt độ 30-50C và dải pH 4,5-5,5. Ở các nồng độ 5 mM, 10 mM, 15 mM hoạt tính endoglucanase đều tăng nhẹ dƣới ảnh hƣởng của các ion kim loại: Fe2+, Cu2+ và EDTA. Ngƣợc lại, các ion Ag+, Ca2+, Co2+, K + , Mn 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ làm hoạt tính endoglucanase giảm. Đặc biệt là Ag+ làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh, chỉ còn 43% ở nồng độ 15 mM sau 2 giờ ủ ở 37C. Các dung môi: acetone, ethanol, methanol, iso propanol và n-butanol đều làm giảm hoạt tính endoglucanase. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Đặc biệt, dung môi 30% methanol làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh, còn 52% sau khi ủ 2 giờ ở 37C. Các chất tẩy rửa khảo sát đều làm giảm hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Đặc biệt là SDS làm giảm mạnh hoạt tính enzyme, chỉ còn 20% sau khi ủ với 2% SDS trong 2 giờ ở 37C. KIẾN NGHỊ 1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với các nguồn cơ chất sẵn có, rẻ tiền nhƣ: lõi ngô, bột giấy, bột đầu cá, bột đỗ tƣơng. 2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endoglucanase từ môi trƣờng nuôi cấy. 3. Nhân dòng, biểu hiện gene mã hóa endoglucanase, xây dựng quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp. 4. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nâng cao chất lƣợng của vật nuôi. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999), Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551. 2. Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thùy Dƣơng (2002), "Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi." Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, 2: 34-36. 3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2006), Danh mục thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi đƣợc nhập khẩu vào Việt Nam. Số 01/2006/QĐ-BNN. 4. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục. 5. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797. 6. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003), Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinase và cellulase của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phƣớc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập 2 và 3, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 8. Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339. 9. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003), Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, cellulose hoặc dầu ô lƣu trong quá trình phân hủy chất thải hữu cơ. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291. 10. Trịnh Đình Khá (2006), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase. Luận văn Thạc sỹ Khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003), Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL-363. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307. 12. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 177-182. 13. Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 804-809. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 14. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 15. Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ và cellolose tập 2, Nxb Khoa học và Kỹ thuật: 7-14. 16. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008), "Tối ƣu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863 và Aspergillus niger DSM1957 sinh tổng hợp xylanase", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(3): 349-355. Tài liệu tiếng Anh 17. Achary A, Prapulla S (2008), "Corncob-Induced endo-β-D-1,4 xylanase of Aspergillus oryzae MTCC 5154: Production and characterization of xylobiose from glucuronoxylan", J Agric Food Chem, 56(11): 3981-3988. 18. Acharya P, Acharya D, Modi H (2008), "Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate", Afr J Biotechnol, 7(22): 4147-4152. 19. Akiba S, Kimura Y, Yamamoto K, Kumagai H (1995), "Purification and characterizationof a protease-resistant cellulase from Aspergillus niger", J Ferment Bioeng, 79(2): 125-130. 20. Bagnara C, Gaudin C, Bélaïch JP (1987), "Physiological properties of Cellulomonas fermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium", Appl Microbiol Biotechnol, 26: 170-176. 21. Bagnara C, Toci R, Gaudin C, Bélaïch JP (1985), "Isolation and characterization of a cellulolytic microorganism, Cellulomonas fermentans, sp. nov", J Syst Bacteriol, 35: 502-507. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 22. Bergquist PL, Gibbs MD, Morris DD, Teo VSJ, Saul DJ, Morgan HW (1999), "Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria", FEMS Microbiol Ecol, 28: 99-110. 23. Campillo ED (1999), "Multiple endo-1,4--D-glucanase (cellulase) genes in Arabidopsis", Curr Top Dev Biol, 46: 39-61. 24. Cheryan MS, Shah PM, Witjitra K (1997), "Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum", Adv Appl Microbiol, 43: 1-33. 25. Coral G, Arikan B, Unaldi M, Guvenmes H (2002), "Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type Strain", Turk J Biol, 26: 209-213. 26. Dahot MU, Noomrio MH (1996), "Microbial production of cellulases by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source", J Islamic Acad Sci, 9(4): 119-124. 27. Das M, Prasad J, Ahmad S (1997), "Endoglucanase production by paper-degrading mycoflora", Appl Microbiol, 25: 313-315. 28. Dürre P (1998), "New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation", Appl Microbiol Biotechnol, 49: 639-648. 29. Gao J, Weng H, Xi Y, Zhu D, Han S (2008), "Purification and characterization of a novel endo-β-1,4-glucanase from thermoacidophilic Aspergillus terreus", Biotechnol Lett, 30: 323-327. 30. Gielkens M, Dekker E, Visser J, Graaff L (1999), "Two cellubiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D- Xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression", Appl Environ Microbiol, 65(10): 4340-4345. 31. Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC, Warren RAJ (1991), "Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families", Microbiol Rev, 55: 303-315. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 32. Gordon R, Haynes W, Pang C (1973), The genus Bacillus, Agriculture handbook, Washington DC. 33. Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR, Olsson L (2005), "Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis", Enzyme Microb Technol, 36: 42-48. 34. Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999), "Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase", Eur J Biochem, 259: 88-95. 35. Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon JP (1989), "Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene, 81(1): 83-95. 36. Hong J, Tamaki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumaga H (2001), "Cloning of a gene encoding a highly stable endo-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast", J Biosci Bioeng, 92(5): 434-441. 37. Howard RL, Abotsi E, van Rensburg ELJ, Howard S (2003), "Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production", Afr J Biotechnol, 2(12): 602-619. 38. Hsu CK, Liao JW, Chung YC, Hsieh CP, Chan YC (2004), "Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides\ affect the intestinal micro biota and precancerous colonic lesion development in rats", J Nutr, 134: 1523-1528. 39. Kang S, Ko E, Lee J, Kim S (1999), "Over production of β-glucosidase by Aspergillus niger mutant from lignocellulsic biomass", Biotechnol Lett, 21: 647-650. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 40. Karisson J, Saloheimo M, Siika-aho M, Tenkanen M, Penttilä M, Tjerneld F (2001), "Homologous expression and characterization of Cel61A (EG IV) of Trichoderma reesei", Eur J Biochem, 268: 6498- 6507. 41. Khan M, Ali S, Fakhru’l-Razi A, Alam M (2007), "Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme", J Environ Sci Health Part B, 42: 381-386. 42. Kim BH (1987), "Carbohydrate catabolism in cellulolytic strains of Cellulomonas, Pseudomonas, and Nocardia", Korean J Microbiol, 25: 28-33. 43. Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996), "Molecular cloning, purification and characterization of two endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus oryzae KBN616", Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544. 44. Laemmli U (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227: 680-685. 45. Lee RL, Weimer PJ, Zyl WH, Pretorius IS (2002), "Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology", Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506–577. 46. Macarrón R, Acebal C, Castiilón MP, Domínguez JM, Manta IDL (1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei", Biochem J, 289: 867-873. 47. Miller G (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem, 31: 426-428. 48. Nakakuki T (2003), "Development of functional oligosaccharides in Japan", Trends Glycosci Glycotechnol, 15(82): 57-64. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 49. Narasimha G, sridevi A, Buddolla V, Subhosh C, Rajsekhar R (2006), "Nutrient effect on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger", Afr J Biotechnol, 5(5): 472-476. 50. Ojumu T, Solomon B, Betiku E, Layokun S, Amigun B (2003), "Cellulase production by Aspergillus flavus Linn isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob", Afr J Biotechnol, 2(6): 150-152. 51. Ole K, Borchert TV, Fuglsang CC (2002), "Industrial enzyme applications", Curr Opin Biotech, 13: 345-351. 52. Omogbenigun OF, Nyachoti CM, Slominski BA (2004), "Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs", J Anim Sci, 82: 1053-1061. 53. Palonen H, Tenkanen M, Linder M (1999), "Dynamic interaction of Trichoderma reesei cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose at equilibrium and during hydrolysis", Appl Environ Microbiol, 65: 5229-5233. 54. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 55. Sandgren M, Gualfetti PJ, Christian P, Sigrid P, Shaw A, Gross LS, Saldajeno M, Berglund GI, Jones TA, Mitchinson C (2003), "The Humicola grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability", Protein Sci, 12: 2782-2793. 56. Sang JH, Yong JY, Hyen SK (1995), "Characterization of a bifunctional cellulase and its structural gene. The cel gene of Bacillus sp. D04 has exo- and endoglucanase activity", J Biol Chem, 270: 26012-26019. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 57. Sharma VK, Hagen JC (1995), "Isolation and characterization of Clostridium hobsonii comb. nov", Biores Technol, 51: 61-74. 58. Siddiqui K, Shemsi A, Anwar M, Rashid M, Rajoka M (1998), "Partial and coplete alteration of surface charges of carboxymethylcellulase by chemical modification: thermostabilization in water-miscible organic solvent", Enzyme Microbiol Technol, 24: 599-608. 59. Takada G, Kawasaki M, Kitawaki M, Kawaguchi T, Sumitani J-I, Izumori k, Arai M (2002), "Cloning and trascription analysis of the Aspergillus aculeatus No. F-50 endoglucanase 2 (cmc2) gene", Biosci and Bioeng, 94(5): 482-485. 60. Takashima S, Nakamura A, Hidaka M (1998), "Isolation of the creA gene from the cellulolytic fungus Humicola grisea and analysis of CreA binding sites upstream from the cellulase genes", Biosci Biotechnol Biochem, 62: 2364-2370. 61. Wachinger G, Bronnenmeier K, Staudenbauer WL, Schrempf H (1989), "Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli", Appl Environ Microbiol, 55: 2653-2657. 62. Watanabe H, Tokuda G (2001), "Animal cellulases", Cell Mol Life Sci, 58: 1167-1178. 63. Xu B, Janson JC, Sellos D (2001), "Cloning and sequencing of a molluscan endo--1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus edulis", Eur J Biochem, 268: 3718-3727. 64. Yasuda K, Roneker KR, Miller DD, Welch RM, Lei XG (2006), "Supplemental dietary Inulin affects the bioavailability of Iron in corn and soybean meal to young pigs", J Nutr, 136: 3033-3038. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 PHỤ LỤC Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori VTCC-F-099 Trình tự nucleotide Vị trí GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACCA ACCGGGATTG CCTCAGTAAC GGCGAGTGAA GCGGCAAGAG CTCAAATTTG AAAGCTGGCT CCTTCGGAGT CCGCATTGTA ATTTGCAGAG GATGCTTTGG GTGCGGCCCC CGTCTAAGTG CCCTGGAACG GGCCGTCAGA GAGGGTGAGA ATCCCGTCTT GGGCGGGGTG TCCGTGCCCG TGTAAAGCTC CTTCGACGAG TCGAGTTGTT TGGGAATGCA GCTCTAAATG GGTGGTAAAT TTCATCTAAA GCTAAATACT GGCCGGAGAC CGATAGCGCA CAAGTAGAGT GATCGAAAGA TGAAAAGCAC TTTGAAAGGA GAGTTAAACA GCACGTGAAA TTGTTGAAAG GGAAGCGCTT GCGACCAGAC TCGCCCGCGG GGTTCAGCCG GCATTCGTGC CGGTGTACTT CCCCGTGGGC GGGCCAGCGT CGGTTTGGGC GGCCGGTCAA AGGCCCCTGG AATGTAGTGC CCTCCGGGGC ACCTTATAGC CAGGGGTGCA ATGCGGCCAG CCTGGACCGA GGAACGCGCT TCGGCACGGA CGCTGGCATA ATGGTCGTAA ACGACCCGTC TTGAAACACG GACC 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 614 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian Thời gian (giờ) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 24 0,30 0,31 0,31 0,41 ± 0,002 74 48 0,39 0,38 0,38 0,49 ± 0,006 89 72 0,39 0,39 0,39 0,49 ± 0,002 91 96 0,45 0,43 0,44 0,55 ± 0,012 100 120 0,28 0,30 0,29 0,39 ± 0,008 71 144 0,27 0,26 0,26 0,36 ± 0,002 66 168 0,21 0,30 0,25 0,35 ± 0,043 64 192 0,23 0,23 0,23 0,33 ± 0,001 60 216 0,22 0,29 0,25 0,35 ± 0,036 64 240 0,22 0,24 0,23 0,33 ± 0,011 60 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ (C) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 25 0,21 0,21 0,25 0,32 ± 0,003 56 28 0,33 0,34 0,35 0,44 ± 0,013 78 30 0,47 0,49 0,41 0,56 ± 0,045 100 32 0,40 0,38 0,39 0,50 ± 0,007 88 37 0,33 0,34 0,34 0,44 ± 0,007 78 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng Nồng độ CMC (%) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 0 0,09 0,05 0,05 0,15 ± 0,023 19 0,2 0,11 0,07 0,08 0,18 ± 0,021 22 0,5 0,16 0,22 0,16 0,27 ± 0,035 34 1,0 0,52 0,55 0,51 0,64 ± 0,020 79 1,5 0,63 0,65 0,63 0,75 ± 0,010 93 2,0 0,62 0,73 0,71 0,81 ± 0,056 100 2,5 0,47 0,47 0,48 0,58 ± 0,005 72 3,0 0,38 0,39 0,38 0,49 ± 0,006 61 3,5 0,32 0,32 0,32 0,42 ± 0,003 52 4,0 0,32 0,32 0,32 0,42 ± 0,002 52 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô Lõi ngô (%) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 0,5 0,44 0,58 0,53 0,65 ± 0,067 70 1,0 0,54 0,49 0,97 0,78 ± 0,263 87 1,5 0,60 0,70 0,71 0,79 ± 0,058 88 2,0 0,41 0,58 0,79 0,71 ± 0,186 79 2,5 0,41 0,60 0,94 0,76 ± 0,269 85 3,0 0,53 0,78 1,01 0,90 ± 0,238 100 3,5 0,34 0,65 0,83 0,72 ± 0,251 81 4,0 0,38 0,60 0,80 0,71 ± 0,208 79 4,5 0,38 0,54 0,70 0,65 ± 0,159 73 5,0 0,22 0,42 0,64 0,53 ± 0,211 60 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate Ammonium acetate (%) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 0,10 0,28 0,21 0,25 3,44 ± 0,038 69 0,15 0,30 0,23 0,25 3,58 ± 0,039 72 0,20 0,30 0,27 0,28 3,86 ± 0,014 78 0,25 0,31 0,32 0,35 4,25 ± 0,023 85 0,30 0,39 0,34 0,44 4,97 ± 0,050 100 0,35 0,34 0,26 0,31 4,03 ± 0,040 81 0,40 0,29 0,28 0,30 3,90 ± 0,012 78 0,45 0,27 0,28 0,28 3,74 ± 0,001 75 0,50 0,24 0,26 0,27 3,51 ± 0,012 71 0,55 0,24 0,24 0,26 3,40 ± 0,011 68 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu pH OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 3,0 0,26 0,33 0,23 3,67 ± 0,051 70 3,5 0,32 0,34 0,26 4,05 ± 0,042 78 4,0 0,34 0,35 0,31 4,34 ± 0,021 83 4,5 0,36 0,38 0,32 4,58 ± 0,030 88 5,0 0,37 0,40 0,33 4,71 ± 0,036 90 5,5 0,38 0,41 0,33 4,79 ± 0,040 92 6,0 0,39 0,42 0,36 4,93 ± 0,030 94 6,5 0,42 0,46 0,37 5,22 ± 0,047 100 7,0 0,38 0,42 0,34 4,84 ± 0,040 93 7,5 0,37 0,40 0,30 4,62 ± 0,051 88 8,0 0,36 0,40 0,31 4,57 ± 0,048 88 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase IU/ml IU/mg protein IU/ml IU/mg protein 3 1,79 213,71 11 6,66 80,07 4 1,83 169,95 12 6,81 82,83 5 2,01 183,17 13 6,57 87,70 6 4,02 330,37 14 6,46 106,64 7 4,89 288,36 15 4,03 72,49 8 4,52 149,94 16 3,70 93,57 9 4,58 78,66 17 2,70 103,29 10 7,21 109,57 18 2,14 224,31 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase IU/ml IU/mg protein IU/ml IU/mg protein 3 0,76 79,74 11 2,01 48,75 4 0,73 56,86 12 1,91 43,89 5 0,82 55,75 13 1,91 40,60 6 1,53 71,65 14 1,62 34,68 7 1,30 62,10 15 1,01 23,12 8 1,13 57,80 16 0,98 30,99 9 1,07 56,16 17 0,60 24,09 10 1,78 57,59 18 0,49 24,49 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase CMC (%) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 0,2 84,15 ± 0,005 22 0,4 119,71 ± 0,007 32 0,6 179,43 ± 0,008 48 0,8 260,87 ± 0,010 69 1,0 295,95 ± 0,013 78 1,2 377,49 ± 0,060 100 1,4 283,28 ± 0,021 75 1,6 232,33 ± 0,009 62 1,8 173,19 ± 0,006 46 2,0 163,45 ± 0,006 43 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase Nhiệt độ Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 30 45,37 ± 0,005 42 37 60,67 ± 0,025 56 40 93,11 ± 0,004 85 45 95,35 ± 0,001 87 50 109,09 ± 0,004 100 55 64,95 ± 0,006 60 60 50,85 ± 0,001 47 65 45,76 ± 0,003 42 70 34,65 ± 0,004 32 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase Nhiệt độ Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 4,0 37,87 ± 0,009 17 4,5 144,65 ± 0,002 64 5,0 226,68 ± 0,002 100 5,5 184,88 ± 0,007 82 6,0 118,54 ± 0,005 52 6,5 95,25 ± 0,004 42 7,0 90,58 ± 0,003 40 7,5 82,20 ± 0,072 36 8,0 84,54 ± 0,010 37 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase Nhiệt độ Thời gian (giờ) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % ĐC 0 410,23 ± 0,005 100 6 399,02 ± 0,001 97 12 388,99 ± 0,008 95 24 385,77 ± 0,004 94 30 36 382,75 ± 0,002 93 48 285,43 ± 0,004 70 60 258,34 ± 0,001 63 72 236,23 ± 0,006 58 6 368,43 ± 0,007 90 12 355,86 ± 0,001 87 24 346,61 ± 0,005 84 40 36 314,85 ± 0,006 77 48 277,92 ± 0,006 68 60 254,15 ± 0,007 62 72 228,53 ± 0,005 56 6 361,13 ± 0,001 88 12 324,98 ± 0,004 79 24 302,38 ± 0,025 74 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 50 36 210,12 ± 0,001 51 48 150,88 ± 0,024 37 60 130,33 ± 0,005 32 72 124,09 ± 0,006 30 6 255,61 ± 0,014 62 12 179,33 ± 0,009 44 24 131,79 ± 0,006 32 60 36 91,36 ± 0,001 22 48 65,83 ± 0,008 16 60 59,60 ± 0,001 15 72 38,94 ± 0,001 9 6 202,22 ± 0,002 49 12 143,77 ± 0,010 35 24 112,50 ± 0,007 27 70 36 54,92 ± 0,002 13 48 26,57 ± 0,003 6 60 23,94 ± 0,001 6 72 23,35 ± 0,000 6 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase Đệm pH Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % Đối chứng 6,5 234,57 ± 0,008 100 3,5 56,48 ± 0,028 24 4,0 266,53 ± 0,008 114 Acetate 4,5 322,93 ± 0,020 138 5,0 347,29 ± 0,004 148 5,5 285,43 ± 0,004 122 6,0 241,78 ± 0,011 103 6,5 229,21 ± 0,008 98 Phosphate 7,0 245,38 ± 0,020 105 7,5 223,27 ± 0,004 95 8,0 210,21 ± 0,004 90 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase pH Thời gian (giờ) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 4,0 0 259,02 ± 0,002 100 6 217,52 ± 0,031 84 12 166,28 ± 0,005 64 24 105,38 ± 0,001 41 36 73,33 ± 0,001 28 48 67,88 ± 0,004 26 60 54,24 ± 0,004 21 72 36,70 ± 0,002 14 4,5 0 322,35 ± 0,016 100 6 310,56 ± 0,014 96 12 269,06 ± 0,005 83 24 267,21 ± 0,006 83 36 264,19 ± 0,004 82 48 185,66 ± 0,000 58 60 122,34 ± 0,009 38 72 104,90 ± 0,004 33 5,0 0 310,76 ± 0,008 100 6 301,21 ± 0,002 97 12 281,14 ± 0,004 90 24 277,53 ± 0,001 89 36 275,00 ± 0,004 88 48 202,42 ± 0,006 65 60 149,52 ± 0,008 48 72 116,68 ± 0,003 38 5,5 0 253,47 ± 0,004 100 6 244,02 ± 0,001 96 12 217,62 ± 0,008 86 24 210,02 ± 0,005 83 36 203,59 ± 0,004 80 48 174,26 ± 0,006 69 60 175,82 ± 0,002 69 72 173,58 ± 0,007 68 6,0 0 209,43 ± 0,001 100 6 198,72 ± 0,001 95 12 192,58 ± 0,000 92 24 143,09 ± 0,008 68 36 137,73 ± 0,006 66 48 136,56 ± 0,005 65 60 125,45 ± 0,005 60 72 115,42 ± 0,010 55 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase Dung Môi Nồng độ (%) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % Đối chứng 0 372,91 ± 0,016 100 10 349,04 ± 0,031 94 Acetone 20 333,75 ± 0,004 89 30 325,95 ± 0,004 87 10 287,28 ± 0,003 77 n- Butanol 20 225,12 ± 0,025 60 30 213,53 ± 0,003 57 10 229,60 ± 0,001 62 Ethanol 20 198,52 ± 0,001 53 30 195,79 ± 0,002 53 10 365,02 ± 0,050 98 isopropanol 20 276,27 ± 0,044 74 30 258,24 ± 0,004 69 10 307,64 ± 0,001 82 Methanol 20 271,30 ± 0,011 73 30 266,82 ± 0,004 72 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase Chất tẩy rửa Nồng độ (%) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % Đối chứng 0,0 213,53 ± 0,004 100 Tween 20 0,5 191,22 ± 0,008 90 1,0 167,83 ± 0,004 79 1,5 160,43 ± 0,006 75 2,0 131,30 ± 0,008 61 Tween 80 0,5 177,48 ± 0,001 83 1,0 160,43 ± 0,004 75 1,5 144,55 ± 0,003 68 2,0 136,56 ± 0,001 64 SDS 0,5 97,01 ± 0,005 45 1,0 83,17 ± 0,001 39 1,5 51,70 ± 0,001 24 2,0 33,48 ± 0,004 16 Triton X-100 0,5 175,73 ± 0,004 82 1,0 147,67 ± 0,002 69 1,5 134,32 ± 0,003 63 2,0 125,56 ± 0,010 59 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87