Luận văn Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điêu khiên D-Loop DNA ty thể của gà ri, gà ác, gà tre

1. Đặt vấn đề Mở đầu Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá. Đặc biệt, ngành chăn nuôi gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân. Sự phát triển nhanh chong của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại hình .chăn nuôi. Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung với quy mô lớn tăng lên. Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu khắc nghiệt. Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất và tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn trong gia đình đã được cải thiện rất nhiều. Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã mắc rất nhiều bệnh khác nhau. Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não . Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước phát triển thuộc thế giới tây phương. Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới nhưng căn bênh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao. Khi chế độ ăn uống tha y đổi thì hàm lượng cholesterol cũng thay đổi theo. Những nguồn thực phẩm giàu cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục, não, tim, lòng đỏ trứng . Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình. Trong trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao. Có nhiều loại trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt . Mỗi giống gà khác nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau. Như vậy việc lựa chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng. Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D- loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà. - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của 3 giống gà. - Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre. - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác, gà Tre. + Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên. + Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR. + Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà trên. - Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop. Lơi cam đoan Lơi cam ơn Danh muc cac bang Danh muc cac hinh MỤC LỤC Mở đầu 1 1.Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu . 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm . 3 1.1.1 Gà Á . 4 1.1.2 Gà Ri . 5 1.1.3 Gà Tre. 6 1.2 Cholesterol 6 1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà . 6 1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người . 7 1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể . 7 1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường. 8 1.3 Đặc điểm DNA ty thể 10 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể . 10 1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể 11 1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà . 12 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam . 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 16 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Nguồn gốc mẫu . 18 2.1.2 Đia điểm thí nghiệm 18 2.2 Hoá chất và thiết bị . 18 2.2.1 Hóa chất . 18 2.2.2 Thiết bị sử dụng 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol 19 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử . 22 2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật . 22 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose . 25 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR . 26 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 29 2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. . 31 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33 3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu . 35 3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà . 35 3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể . 36 3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể . 37 KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHI 1. Kết luận 48 2. Đề nghị . 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54

62 trang | Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1988 | Lượt tải: 0

Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điêu khiên D-Loop DNA ty thể của gà ri, gà ác, gà tre, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

̣c đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy. Hơn nữa pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 hợp chloroform: isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần. Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50l CH3COONa3M, pH=5,2 và 1 ml ethanol 100%. Ethanol có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẫy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -200C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa trong máy sấy và hòa tan tủa trong nước cất 2 lần. Trong dung dịch này có nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại bỏ RNA bằng RNAase, ủ ở 370C trong 2- 3 giờ. Quy trình tách chiết DNA tổng số theo Sambrook và Russell [30] có thể được tóm tắt như sau : (1): Ủ máu đông lạnh trong 37oC trong 1 giờ cho máu tan. (2): Hút vào mỗi eppendorf (epp, loại 1,5 ml) 500 l máu. (3): Bổ sung 500 l dung dịch PBS 1X, sau đó vortex và li tâm 6000 vòng/phút trong 15 - 20 phút, 4 0C, đổ dịch và thu cặn. (4): Bổ sung 1ml dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 l protease K (20 mg/ml). Mẫu được ủ ở 650C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng. (5): Chia vào mỗi epp 500 l dịch. (6): Bổ sung một lượng tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên cùng sang ống mới. (7): Thêm một thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên cùng sang ống mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 (8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ qua đêm ở - 20oC. (9): Thu tủa bằng cách li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15-20 phút, 4oC. Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào mỗi epp. (10): Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Bỏ dịch và thu cặn. (11): Làm khô tủa trong máy sấy và hòa tủa vào 50 l nước khử ion vô trùng, búng nhẹ. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose * Nguyên tắc chung Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do có sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích thước lớn) hoặc polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ). Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% bởi gel agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1- 20kb) [2]. * Quy trình kỹ thuật - Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X. Đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30 phút, khi gel đông cứng thì rút răng lược ra và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE 1X sao cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ 1 – 2 mm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với một lượng thích hợp (3 - 8 l) được trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ trên gel. Chạy điện di với dòng điện một chiều có cường độ dòng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế 100-120 V. Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc nào cần ngừng điện di. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm bản gel trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml. Sau khi ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa trong nước sạch và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad). 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản khuếch đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền. Kỹ thuật này được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền [26]. * Nguyên tắc chung PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA taq polymerase. Enzyme này được chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (950C), làm nguội (37- 65 0 C) và ủ lâu ở 720C. Trong dung dịch có chứa 4 loại deoxynucleotide (dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonucleotide, mỗi mồi sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn của DNA khuôn tương ứng, từ đó mạch được tổng hợp kéo dài. * Nguyên liệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 - DNA khuôn phải được tinh sạch và ít bị đứt gãy , có chứa trình tự đích cần nhân lên . Nồng độ DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100 ng/phản ứng. - Mồi: là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất lượng sản phẩm PCR. Nồng độ mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong thí nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l). Cặp mồi được sử dụng đó là : + Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’. + Mồi ngược L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’. H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ số là vị trí nucleotide trên mtDNA trong trình tự đầy đủ của gà mà đầu 3’ của mồi tiếp hợp vào (Desjadins và Morais, 1990) [17]. Cặp mồi H1255- L16725 được lựa chọn vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ gà. - Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong môi trường đệm phù hợp với hoạt động của enzyme và nó có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đệm là buffer dream taq. Nó phù hợp với hoạt động của emzyme taq polymerase và trong dung dịch đệm này có chứa Mg2+. Vai trò của ion Mg 2+ là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzyme. Sau khi khảo sát chúng tôi sử dụng nồng độ Mg2+ là 10 mM cho kết quả PCR tốt nhất. - 4 loại dNTPs: nồng độ của 4 loại dNTPs phải bằng nhau và phụ thuộc nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ các dNTPs lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy, nồng độ của các dNTPs là 1mM là phù hợp. - Taq DNA polymeaza của hãng Fermentas - Nước khử ion vô trùng. Thông thường phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm các thành phần sau: Nước 14,8 l Buffer dream taq 2,5 l dNTPs 2,5 l H1255 (mồi xuôi ) 1 l L16725 (mồi ngược) 1 l Taq DNA polymeraza 0,2 l DNA khuôn 3 l Tổng thể tích 25 l PCR là một quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 35 chu kì), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94-950C trong khoảng một phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lượng G-C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94 0C trong một phút. Trước khi bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ biến tính được đặt ở 940C trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến tính hoàn toàn. - Giai đoạn gắn mồi: ở giai đoạn này, nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi. Chúng tôi đã thử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 chạy phản ứng ở một số giá trị nhiệt độ khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 550C. - Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 720C để cho enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Tốc độ tổng hợp của phản ứng khoảng 1000 nuleotide/ phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là 1 phút 20 giây. Sản phẩm cuối cùng của chu kỳ trước sẽ là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ đó mà có đủ lượng DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi kết thúc 35 chu kì, chúng tôi đặt nhiệt độ ở 720C trong mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ 40C. * Quy trình nhiệt của phản ứng PCR có thể được tóm tắt như sau: Bước 1: 94oC - 4 phút Bước 2: 94oC - 1 phút Bước 3: 55oC - 1 phút Bước 4: 72oC - 1 phút 20 giây Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 34 lần. Bước 5: 72oC - 10 phút. Sản phẩm PCR được giữ ở 4oC. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 l sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR. 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR Sau khi điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di toàn bộ sản phẩm PCR thu được ở mỗi mẫu. Sau đó chúng tôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 tiến hành thôi gel theo protocol của hãng Promega để thu sản phẩm PCR tinh sạch. Quy trình được tiến hành như sau: - Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR. - Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml. - Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân. - Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng của băng gel ta vừa cắt). - Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ 1 mg gel: 1 l dung dịch 1. - Ngâm trong nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết. - Chuyển sang cột và để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 4 0 C, trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch phía dưới. - Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/ phút, 4 0C, trong một phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới. - Bổ sung thêm 500 l dung dịch 2 và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong 5 phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới. - Ly tâm lại một phút, 12000 vòng/ phút, 40C. - Cho vào máy sấy 5 phút. - Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nước cất 2 lần, để ở nhiệt độ phòng trong khoảng một phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 4 0C, trong một phút. Sau khi đã thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di để kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 0,8%. Nếu điện di xuất hiện băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước đoạn DNA cần nhân trong phản ứng PCR thì sản phẩm thôi gel đủ chất lượng để tiến hành đọc trình tự. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA *Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [2], [10] tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng BigDye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như: dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase... Do đó chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sử dụng sản phẩm thôi gel của phản ứng PCR) và mồi phù hợp (cặp mồi H1255- L16725). Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuyếch đại gene để đọc trình tự bao gồm: mồi 3.2 pM, DNA của sản phẩm PCR và nước với tổng thể tích 15l. Vì đoạn gen cần xác định có chiều dài khoảng 1,3 kb nên chúng tôi đã xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn DNA có trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần mềm Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu được trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre. * Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt cho máy PCR trong máy luân nhiệt Genamp PCR System 9700 như sau: 940C- 1 phút; (960C- 10 giây, 500C- 5 giây, 600C- 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4 0C. 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu Những số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính bằng chương trình Excel theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn [9] với các thông số: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Giá trị trung bình mẫu    n i Xi n X 1 1 Độ lệch chuẩn: 2 1 )( 1    n i X XXi n S với n  30 2 1 )( 1 1      n i X XXi n S với n < 30 m X = n S X ( với n  30) m X = 1n S X ( với n < 30) Trong đó: X S : Độ lệch chuẩn. X : Là giá trị trung bình mẫu. Xi: Là giá trị của từng mẫu. n: Là số lần lặp lại thí nghiệm. m X : Sai số trung bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lƣợng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu Chúng tôi thu thập mẫu trứng của các giống gà nghiên cứu đồng thời chúng tôi cũng thu thập thêm trứng của vịt Bầu và trứng gà Tam Hoàng mà chúng ta hay sử dụng hàng ngày. Mục đích là để có thể so sánh hàm lượng cholesterol của các mẫu gà nghiên cứu với hàm lượng cholesterol của các loại trứng mà chúng ta hay sử dụng trong các bữa ăn hàng ngày để có thể rút ra kết luận về việc sử dụng loại trứng mà không lo hàm lượng cholesterol cao. Sau đó, chúng tôi tiến hành phân tích theo các bước trình bày ở chương 2 và cuối cùng dung dịch chứa cholesterol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol trong mẫu với diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol chuẩn. Kết quả c hiều cao và diện tích của các peak cholesterol trong trứng của các mẫu gà nghiên cứu được thể hiện qua bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu Thời gian chạy máy (phút) Diện tích Chiều cao gà Ri 31,508 1017035 25295 gà Ác 32,233 845304 20628 gà Tam Hoàng 31,836 819183 20477 gà Tre 32,418 1105818 26763 vịt Bầu 31,632 1195163 29586 Chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dựa vào công thức xác định hàm lượng cholesterol đã trình bày ở chương 2 thì hàm lượng cholesterol tỷ lệ thuận với diện tích (hoặc chiều cao) của peak mẫu nghiên cứu . Nếu diện tích (chiều cao) peak mẫu nghiên cứu càng lớn thì hàm lượng cholesterol của mẫu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 nghiên cứu càng cao. Chúng tôi đã xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí nghiệm và được thể hiện qua bảng 3.2 và hình 3.1. Bảng 3.2. Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Trung ga Ri Trung ga Ac Trung Ga Tre Trung ga Tam Hoang Trung vit Bau Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu Qua bảng 3.2 và hình 3.1, chúng tôi nhận thấy hàm lượng cholesterol trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100 g, sau đó là trứng gà Tre 465,9 mg/100 g, trứng gà Ri 438 mg/100 g, trứng gà Ác 340 mg/100 g. Hàm lượng cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100 g. Tuy nhiên, hàm Các mẫu nghiên cứu Hàm lượng cholesterol (mg/100 g) X mX  Trứng gà Ri 438,1  0,09 Trứng gà Ác 340,6  0,11 Trứng gà Tre 465,9  0,15 Trứng gà Tam Hoàng 318,8  0,1 Trứng vịt Bầu 477,7  0,13 Mẫu nghiên cƣ́u H à m l ƣ ợ n g ch o le st er o l (m g /1 0 0 g ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 lượng cholesterol trong một quả trứng thì chủ yếu tập trung ở lòng đỏ, còn ở lòng trằng không đáng kể. Nhu cầu cholesterol tối đa của một người bình thường/một ngày là 300 mg/một ngày. Như vậy, chúng ta thấy rằng hàm lượng cholesterol trong trứng gà là khá cao. Chính vì vậy , người sử dụng cần phải c ăn cứ vào tình hình sức khỏe của bản thân (có hay không có những bệnh về tim mạ ch liên quan đến cholesterol ) và dựa vào hàm lượng cholesterol của các loại trứng mà chúng tôi đã xác định để ch ọn loại trứng và số lượng trứng phù hợp để đảm bảo một ngày cung cấp cho cơ thể tối đa 300 mg cholesterol/một ngày . Đồng thời những người mà có hàm lượng cholesterol trong máu cao hơn 5,6 mmol/lít thì mỗi tuần chỉ nên ăn tối đa 4 quả trứng/một tuần và cũng nên lựa chọn trứng gà Tam Hoàng để ăn, hạn chế ăn các loại trứng vịt Bầu, trứng gà Tre và gà Ri để đảm bảo sức khỏe , ngăn ngừa và hạn chế các bệnh về tim mạch . 3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu Để xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số, dùng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển trong ty thể nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này với mộ t số trình tự công bố trên GenBank để tìm ra sự đa dạng di truyền của chúng . 3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu nhận và tinh sạch DNA đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo. Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2. Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số M: marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3. Gà Tre Kết quả cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Ác, Tre đều sáng tập trung và tương đối rõ nét. Ba băng DNA thu được có kích thước khoảng 21kb. Như vậy, có thể đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã khuyếch đại được vùng điều khiển D- loop. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% với thể tích là 8 l. Kết quả PCR được thể hiện trên hình 3.3. M 1 2 3 21kb 5,1kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR M:Marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3.Gà Tre Kết quả cho thấy, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA có kích thước khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung, chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản phẩm PCR sẽ được sử dụng ở các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel sản phẩm PCR), chúng tôi tiến hành xác định trình tự đoạn D-loop trên máy đọc trình tự tự động trên cơ sở của phương pháp Sanger. Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả trong mục 2.3.2.5. Xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn DNA có trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần mềm Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu được trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre. Sau khi đã xác định được trình tự vùng D-loop của 3 mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác ,Tre, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng D -loop của chúng với nhau và với hai trình tự D-loop đã được công bố trên GenBank là 3 1.3kb M 1 2 1.5kb 1.0 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 trình tự D-loop của gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật mã số AB114078 [24] và gà Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC007236 [27], chúng tôi thu được kết quả hình 3.4. 10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg AC -......... .......... .......... .......... .......... .......... RI C......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE C......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat AC .......... .......... .......... .......... ......t... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... ......t... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... ......t... .......... 190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac AC .......... .......... .......... .a........ ....c..... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .a......T. ....c..... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... ....c..... .......... 250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc AC .....t.... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .....t.... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 ..c....... .....c.... t......... .......... g......... .....t.... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 310 320 330 340 350 360 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact AC .......... ....t..... .......... .......... .......... ....T..... RI .......... .......... .......... .......... .......... ....T..... TRE .......... ....t..... .......... .......... .......... ....T..... NC007236 .....c...t .......... .......... .......... .......... ....T..... 370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 430 440 450 460 470 480 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 490 500 510 520 530 540 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag AC .......... .......... ...t...... .......... .......... .......... RI .......... .......... ...t...... .......... .......... .......... TRE .......... .......... ...t...... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... ...t...... .......... .......... .......... 550 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 610 620 630 640 650 660 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 670 680 690 700 710 720 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .....a.... .......... .......... .......... 730 740 750 760 770 780 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 790 800 810 820 830 840 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta AC .......... .a........ .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 850 860 870 880 890 900 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt AC .......... ........-. .......... .......... .......... .......... RI .......... ........-. .......... .......... .......... .......... TRE .......... ........c. .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... ........c. .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 910 920 930 940 950 960 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt AC .-........ .......... .......... .T........ .......... .......... RI .-........ .......... .......... .T........ .......... .......... TRE .-........ .......... .......... .T........ .......... .......... NC007236 .t........ .......... .......... .T........ .......... .......... 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata AC .......... .g........ .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... .......... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta AC .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..A....... NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 1210 1220 ....|....| ....|....| ... AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt cta AC .......... .....A.... ... RI .......... .......... ... TRE .......... .....A.... ... NC007236 .......... .......... ... Hình 3.4. So sánh trình tự đoạn D-loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 * So sánh trình tự của gà Ri, gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang với trình tự tham khảo mã số NC007236, chúng tôi nhận thấy có 21 điểm đa hình/đột biến (tức là khác biệt nucleotide). Mẫu gà Ác có 17 điểm (chiếm 1,39%), mẫu gà Ri có 13 điểm (chiếm 1,06 %) và mẫu gà Tre có 15 điểm khác biệt so với NC007236 (chiếm 1,23 %). Trong 21 điểm khác biệt này, phần lớn là đột biến thay thế. Ngoài ra còn có đột biến mất nucleotid e tại 3 vị trí đó là : tại vị trí số 1 bị mất nucleotide A ở gà Ác , tại vị trí 859 mất nucleotid e C ở gà Ác và gà Ri, tại vị trí 962 mất nucleotid e T ở gà Ri, Ác, Tre. Những đột biến thay thế làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu khác với NC007236 như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 167 ở gà Ri, ở vị trí 261, 296, 310 ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 của gà Ác và gà Tre, tại vị trí 281 ở gà Ri , Ác, Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193 của mẫu gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 219 của gà Tre , tại vị trí 225 của gà Ri, tại vị trí 246, tại vị trí 315 của gà Ác và Tre , tại vị trí 243, tại vị trí 306 ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 686 của gà Ác, Ri, Tre, tại vị trí 1032 ở gà Ác. * So sánh trình tự gà Ri, gà Ác, gà Tre với trình tự tham khảo mã số AB114078 chúng tôi nhận thấy có 15 điểm đa hình/đột biến. Mẫu gà Ác có 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 điểm (chiếm 0,9%), mẫu gà Ri có 4 điểm (chiếm 0,33%) và mẫu gà Tre có 13 điểm khác biệt so với trình tự tham khảo (chiếm 0,98%). Trong 15 điểm khác biệt này, phần lớn là đột biến thay thế. Riêng ở mẫu gà Ác, tại vị trí nucleotide số 1 bị mất nucleotide A so với trình tự tham khảo, đồng thời ở mẫu gà Tre tại vị trí nucleotide số 859 có thêm nucleotide là C trong khi trình tự tham khảo, mẫu gà Ri và mẫu gà Ác không có nucleotide này. Còn lại là các đột biến thay thế làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu khác với trình tự tham khảo như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 167, 246, 315 của mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 355 của cả 3 mẫu gà Ri, Ác và Tre, tại vị trí 219 của mẫu gà Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 của 2 mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193 của mẫu gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 225 của mẫu gà Ác và Tre; thay thế A thành T (AT) tại vị trí 504, 992 của cả 3 mẫu gà Ri, Ác và Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 1032 của mẫu gà Ác. Ngoài ra giữa 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre còn khác biệt nhau ở 11 điểm đa hình (chiếm 0,9%). Cụ thể : giữa gà Ác và gà Tre khác nhau 6 điểm, giữa gà Ác và gà Ri khác nhau 9 điểm và giữa gà Tre và gà Ri khác nhau 9 điểm đa hình. Như vậy , trình tự nucleotide của 2 mẫu gà Ác và Tre tương đối giống nhau nhưng lại có nhiều điểm khác biệt so với mẫu gà Ri . Sự khác biệt nucleotide giữa 2 mẫu gà Ác và gà Tre so với gà Ri được thể hiện trên bảng 3.3. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Bảng 3.3. Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so với gà Ri Vị trí nucleotide trên ty thể gà Ri gà Ác và Tre 167 C T 212 G A 225 T C 246 C T 315 C T 1216 G A Sự sai khác nucleotid e giữa 3 mẫu gà Ri , Ác, Tre với 2 trình tự tham khảo là NC007236 và AB114078 được thống kê ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 STT So với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 So với gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 Mẫu gà Thay đổi nucleotide Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị Mẫu gà Thay đổi nucleotide Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị 1 Ác del A 1 Mất 1 nucleotide Ác del A 1 Mất 1 nucleotide 2 Tre, Ri AC 1 Dị hoán Tre, Ri AC 1 Dị hoán 3 Ri TC 167 Đồng hoán Ác, Tre CT 167 Đồng hoán 4 Ác, Tre GA 212 Đồng hoán Ác, Tre GA 212 Đồng hoán Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 5 Tre CT 219 Đồng hoán Tre CT 219 Đồng hoán 6 Ri CT 225 Đồng hoán Ác, Tre TC 225 Đồng hoán 7 Ác, Tre, Ri CT 243 Đồng hoán Ác, Tre CT 246 Đồng hoán 8 Ác, Tre CT 246 Đồng hoán Ác, Tre CT 315 Đồng hoán 9 Ác, Tre, Ri CT 256 Đồng hoán Ác, Tre, Ri CT 355 Đồng hoán 10 Ác, Tre, Ri TC 261 Dị hoán Ác, Tre, Ri AT 504 Dị hoán 11 Ác, Tre, Ri GA 281 Đồng hoán Tre Thêm C 859 Thêm 1 nucleotide 12 Ác, Tre, Ri TC 296 Đồng hoán Ác GA 792 Đồng hoán 13 Ác, Tre, Ri CT 306 Đồng hoán Ác, Tre, Ri TC 992 Đồng hoán 14 Ác, Tre, Ri TC 310 Đồng hoán Ác TC 1032 Đồng hoán 15 Ác,Tre CT 315 Đồng hoán Tre GA 1193 Đồng hoán 16 Ác, Tre, Ri AG 686 Đồng hoán 17 Ác GA 792 Đồng hoán Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 18 Ác, Ri del C 859 Mất 1 nucleotide 19 Ác, Tre, Ri del T 962 Mất 1 nucleotide 20 Ác AG 103 2 Đồng hoán 21 Tre GA 119 3 Đồng hoán Để đánh giá sự đa dạng di truyền của vùng D -loop nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các mẫu gà nghi ên cứu , chúng tôi đã sử dụng phần mềm Mega để so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop của 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự các chủng gà đã được công bố đó là: gà Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC 007236 [27] và Gallus gallus (gà rừng đỏ) gốc Nhật lấy trình tự GenBank mang mã số AB114078 [24] để so sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa chúng, kết quả được thể hiện qua bảng 3.5 và hình 3.5. Bảng 3.5. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide vùng D-loop ở mẫu nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank 1 2 3 4 5 1 99,67 99,1 99,02 98,77 1 AB114078 2 0,33 99,26 99,26 98,94 2 Ri 3 0,9 0,74 99,51 98,61 3 Ác 4 0,98 0,74 0,49 98,77 4 Tre 5 1,23 1,06 1,39 1,23 5 NC007236 1 2 3 4 5 Qua bảng 3.5 thấy rằng, các mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao so với các mẫu trên Ngân hàng gen NCBI (98,61 - 99,67 %), mẫu gà Ri có độ tương đồng cao nhất với mẫu có mã số AB 114078 (99,67%), sau đó là mẫu gà Ác và mẫu gà Tre có độ tương đồng với nhau là 99,51%, cặp có hệ số tương đồng thấp nhất là mẫu gà Ác so với NC007236 (98,61 %). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Từ các kết quả so sánh trình tự nucleotid e vùng D -loop của các mẫu gà ở trên, chúng tôi thể hiện kết quả trên biểu đồ hình cây (hình 3.5). Hình 3.5. Quan hệ di truyền của một số giống gà Kết quả thu được hình 3.5 cho thấy các giống gà trên được chia thành 2 nhánh lớn: nhánh I gồm AB 114078, gà Ri, gà Ác, và gà Tre ; nhánh II chỉ có gà NC 007236. Trong nhánh I lại chia thành 2 nhánh: nhánh I 1 gồm gà AB114078 và gà Ri có mức độ đồng nhất về mặt di truyền rất cao là 99,67%. Nhánh I2 gồm 2 giống gà Ác và gà Tre, mức độ đồng nhất về mặt di truyền giữa chúng là 99,51 %. Nhìn chung, sự sai khác giữa các giống gà này không nhiều. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100g, sau đó là trứng gà Tre 465,9 mg/100g, trứng gà Ri 438 mg/100g, trứng gà Ác 340 mg/100g. Hàm lượng cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100g. 1.2 Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số từ máu gà thuộc 3 mẫu nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre. Nhân bản thành công vùng D-loop của 3 mẫu gà này với kích thước khoảng 1,3 kb bằng kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi chuyên biệt là H1255-L16725. 1.3 Xác định được trình tự vùng điều khiển D-loop gồm 1223 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu Ri, Ác, Tre và phát hiện được 15 điểm đa hình về nucleotide giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham khảo mang mã số AB114078 và 21 điểm đa hình giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham khảo mang mã số NC007236. 1.4 Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với một số chủng gà đã được công bố đó là gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật Bản (mã số AB114078) lấy trình tự GenBank quốc tế, Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC007236 lấy trình tự GenBank và thấy rằng giữa gà Gallus gallus (gà rừng đỏ) gốc Nhật Bản mã số AB114078 và gà Ri có mức độ đồng nhất về mặt di truyền rất cao là 99,67%. Hai mẫu gà Ác và gà Tre có mức độ đồng nhất về mặt di truyền là 99,51%. Nhìn chung, sự sai khác giữa các giống gà này không nhiều. 2. Đề nghị 2.1 Chúng tôi mới chỉ xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 5 mẫu nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, vịt Bầu, Tam Hoàng trong cùng điều kiện nuôi dưỡng. Vậy để đánh giá một cách toàn diện về hàm lượng cholesterol trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 các mẫu nghiên cứu trên, chúng tôi đề nghị xác định hàm lượng cholesterol trong các mẫu nghiên cứu ở các điều kiện nuôi dưỡng khác nhau. 2.2 Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi mới chỉ lấy mẫu máu từ một cá thể thuộc mỗi giống, do đó chúng tôi chỉ đưa ra được số liệu ban đầu về các điểm đa hình của vùng D-loop trên ty thể của 3 mẫu nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre thuộc loài Gallus gallus domesticus. Để có thể đánh giá được toàn diện hơn về các điểm đa hình trên vùng D-loop hoặc có thể đưa ra các kết luận đầy đủ về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu, cần phải tiến hành nghiên cứu và phân tích trên một số lượng mẫu lớn hơn. CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Vũ Thị Như Trang , Nguyễn Trọng lạng : Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của gà Ri , gà Tre, gà Ác đƣợc nuôi tại Bắc Giang. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên , 2009 tập 58, số 10, trang 86-89. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục. 3. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp nghành công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 4. Nguyễn Duy Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao học và nghiên cứu sinh), NXB Nông nghiệp Hà Nội. 5. Địch Thị Kim Hương (2006), Phân định một số chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) qua DNA ty thể, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐHKHTN Hà Nội. 6. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa sinh thịt và đánh giá sự sai khác di truyền của gà Mông nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên 7. Lê Viết Ly (2001), gà Ri-chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam, tập II phần gia cầm, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Mai (2007), Giáo trình chăn nuôi gia cầm dùng trong các trường THCN, NXB Hà Nội. 9. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội. 10. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, NXB ĐHSP. 11. Kim Thị Phương Oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà Lôi Việt Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 12. Trần Thị Mai Phương (2004), Nghiên cứu khả năng sinh sản, sinh trưởng và phẩm chất thịt của giống gà Ác Việt Nam, luận án tiến sĩ chuyên nghành chăn nuôi, Viện Chăn nuôi, Hà Nội. 13. Tôn Thất Sơn, Đặng Vũ Bình, Nguyễn Quang Mai (2001), Chăn nuôi- tập I, NXB Giáo dục. 14. Bùi Thị Kiều Vân (2008), So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15. Anderson RG., Joe Goldstein and Mike Brown (2003), “from cholesterol homeostasis to new paradigms in membrane biology”, Trends cell Biol, 13: 534-539, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE): 14507481. 16. Ascherio A, Willett WC (1995), “New directions in dietary studies or coronary heart disease”, Journal of Nutrition. 17. Desjardins P., Morais R., (1990), “Sequence and gene ogranization of the chicken mitochondrial genome”, J. Mol. Biol, 212: 599-635. 18. E. Moyer (1998), Cholesterol, London: Thorston. 19. E.M.Roth (1995), Good cholesterol, bad cholesterol, New York: Prima Publications. 20. Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S. (1996), Monophylectic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls, Pro. Natl. Acad. Sci.USA, 93 (13), pp.6792- 6795. 21. Hu FB, Manson JE, Willett WC (2001), “Types of dietary fat anh risk of coronary heart: acritical review”, Journal of the American College of Nutrition. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 22. John Wiley and Sons, Inc (2005), Ref. Current proticol in food analytical chemistry, D1.3. 23. Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M. (1999), Ligon J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggest that these lineages are not monophyletic, Mol. Phylogenet. Evol., 11(1) tr.38- 54. 24. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2004), “The evolutionary origin of long- crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks disclosed by the mtDNA sequence analysis”, Gene 333, pp. 91-99, GenBank, Accession AB114078. 25. Lewin B. (1997), Gene VI, Oxford University Press, 713-723& 1222. 26. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. (1991), PCR – A Pratical Approach, IRL Press at Oxford University Press. 27. Nishibori M., Shimogiri T., HayashiT. and Yasue H. (2005), “Molecular evidence for hybridization of species in the genus Gallus except for Gallus varius”, Anim. Genet. 36 (5), 367-375, GenBank, Accession NC007236, D-loop region: 1..1232. 28. Ockene IS, Chiriboga DE, Stanek EJ 3rd, Harmatz MG, Nicolosi R, Saperia G, Well AD, Freedson P, Merriam PA, Reed G, Ma Y, Matthews CE, Hebert JR., (2004), “Seasonal variation in serum cholesterol levels: treatment implications and possible mechanisms”, Arch Intern Med Arch Intern Med, 164: 863-870, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE): 15111372. 29. Randi E., Lucchini V., Hennache A . (1997), Searching for mtDNA genetic diversity in captive Edwards’ pheasants, The Internation Studybook For The Edwards’ Pheasant (Lophura edwardsi) And Its Conservation, Paris: 117-120. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 30. Sambrook J., Russell D. W (2001), Molecular Cloning: A labroratory manual, Cold Spring Harbor labroratory press, New York. 31. Zhang Y., Wang J., He z., Ruan J., Dai M., Chen J., Hu C., Li S., Cong L., Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D.W., Ka G., Wong S., Yu J., Yang H., Wang J. (2005), “Chick VD: A sequence variation database for the chicken genome”, Nucleic Acids Res., 33 (5), pp. 438-441. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 PHỤ LỤC Ảnh 1: Gà Ri Ảnh 2: Gà Ác Ảnh 3: Gà Tre Ảnh 4: 1. Trứng gà Ác 2. Trứng gà Tre 3. Trứng gà Ri 4. Trứng gà Tam Hoàng 5. Trứng vịt Bầu 1 2 3 4 5

Các file đính kèm theo tài liệu này:

doc225.pdf