Luận văn Xác định sự hoạt hóa của phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-kinase (pip5k) A và C661 trên dòng tế bào hela chuyển gene

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 3: Kết quả và thảo luận. 39 Theo những kết quả nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm, KIF2A và AP-2 là protein partner tương ứng của PIP5KA và PIP5KC661. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng vùng hình cầu của KIF2A và vùng ear của β2-AP2 như “mẫu dò” để phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa trong tế bào COS-7, HeLa clone 3. Nội dung thí nghiệm bao gồm: Tạo dòng cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A và vùng ear của β2-AP2 vào vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238). Sau đó, kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống Split Venus. Và xác định sự hoạt hóa của PIP5KA, PIP5KC661 và những biến đổi kiểu hình trên dòng tế bào HeLa clone 3. 3.1. Tạo dòng và kiểm tra trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A (KIF2A-GD) và vùng ear của protein β2-Adaptin (β2-Adaptin-ear) Đầu tiên, chúng tôi tiến hành dòng hóa hai cDNA mã hóa cho hai “mẫu dò” này vào hệ thống vector biểu hiện pVenus và kiểm tra kết quả tạo dòng bằng phương pháp giải trình tự. 3.1.1. Thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng phương pháp PCR. 1 2 3 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin ear từ DNA plasmid. Giếng 1: Thang 1kb (kích thước các vạch tương ứng từ trên xuống: 10 kb, 8 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb và 500 bp); Giếng 2: sản phẩm PCR cDNA của β2-Adaptin ear; Giếng 3: sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD Chương 3: Kết quả và thảo luận. 40 Để thu nhận được một lượng lớn cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear cần thiết cho quá trình tạo dòng, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR nhân bản trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A và vùng ear của protein β2- Adaptin từ hai plasmid tương ứng là pCMV5-Flag-Kif2a full length (100 ng/µl) và pDNA3-Myc- β2-Adaptin (100 ng/µl). Phản ứng PCR được thực hiện bằng enzyme PrimeSTAR (Takara), là một polymerase có tính trung thực cao và hiệu quả nhân bản lớn để hạn chế những đột biến xảy ra trong quá trình sao chép [41]. Kết quả điện di (hình 3.1- giếng 3) cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi KIF2A-01F và KIF2A-02B có kích thước khoảng 586 bp tương ứng với kích thước cDNA của KIF2A-GD. Giếng (2) là sản phẩm PCR có kích thước khoảng 733 bp phù hợp với kích thước cDNA của β2-Adaptin ear. Như vậy, bằng phương pháp PCR, chúng tôi đã thu nhận được hai sản phẩm cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear có kích thước đúng như dự đoán. 3.1.2. Dòng hóa cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi sử dụng vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1 làm vector biểu hiện trình tự mã hóa cho KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear. Đối với vector pVenus (1-173) N1, protein được biểu hiện dưới dạng dung hợp vào đầu N của mảnh Venus gồm trình tự amino acid thứ 1 đến amino acid thứ 173 (gọi là mảnh N-Venus). Đối với vector pVenus (155-238) N1, protein được biểu hiện dưới dạng dung hợp vào đầu N của mảnh Venus gồm amino acid thứ 155 đến amino acid 238 (gọi là mảnh C-Venus). Sản phẩm PCR nói trên và plasmid pVenus (1-173) N1, pVenus (155-238) N1 được xử lí với enzyme cắt giới hạn XhoI/EcoRI và tiến hành phản ứng nối để tạo plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng Ecoli DH5α, sau đó được sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml). Tách chiết plasmid và sàng lọc các plasmid tái tổ hợp có mang đoạn cDNA mục tiêu Chương 3: Kết quả và thảo luận. 41 bằng phản ứng cắt với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Đối với plasmid pVenus (1-173)- KIF2A-GD (hoặc pVenus (1-173)-β2-Adaptin-ear), khi điện di sản phẩm cắt sẽ có hai vạch có kích thước khoảng 4596 bp và 567 bp (hoặc 714 bp). Tương tự, với plasmid tái tổ hợp pVenus(155-238) có mang cDNA β2-Adaptin-ear (hoặc cDNA KIF2A-GD), kết quả sản phẩm cắt sẽ có một vạch 4313 bp tương ứng với kích thước của plasmid và một vạch 714 bp (hoặc 567 bp). Kết quả hình 3.2 cho phép xác định plasmid tái tổ hợp (2); (3); (4); (5) và (6) có mang trình tự cDNA của KIF2A-GD, các plasmid tái tổ hợp (7); Hình 3.2. Kết quả điện di phản ứng cắt sàng lọc plasmid tái tổ hợp. Giếng 1: Thang 1 kb(kích thước các vạch tương ứng từ trên xuống: 10 kb, 8 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb và 500 bp), Giếng 2, 3, 4 và 5: các plasmid tái tổ hợp pVenus (1-173)-KIF2A-GD được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Giếng 6: plasmid tái tổ hợp pVenus (155-238)-KIF2A-GD được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Giếng 7, 8, 9 và 10: các plasmid tái tổ hợp pVenus (1-173)-β2Adaptin-ear được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Giếng 11, 12 và 13: các plasmid tái tổ hợp pVenus (155-238)-β2Adaptin-ear được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 Chương 3: Kết quả và thảo luận. 42 (8); (9); (10); (11); (12) và (13) có mang trình tự cDNA của β2-Adaptin-ear. Bốn plasmid tái tổ hợp (2); (6); (8) và (12) được tiến hành giải trình tự để kiểm tra. 3.1.3. Kết quả giải trình tự Chúng tôi sử dụng mồi pEGFP #F bao ngoài vùng KIF2A-GD và β2- Adaptin-ear trên plasmid pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1 để giải trình tự các plasmid tái tổ hợp nói trên. Kết quả so sánh trình tự thu được với trình tự trên ngân hàng gene (NCBI) bằng phần mềm ClustalX như sau: Hình 3.3. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) KIF2A-GD và so sánh với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Linker Venus (1-173) Chương 3: Kết quả và thảo luận. 43 Dựa vào kết quả so sánh trên hình 3.3 và 3.4, chúng tôi kết luận trình tự gene KIF2A-GD thu được tương đồng hoàn toàn (99,9 %) với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Tại vị trí Nucleotide thứ 142 xuất hiện một đột biến A thành G, tuy nhiên đột biến này không làm thay đổi trình tự amino acid của protein KIF2A-GD vì cả hai codon GTA và GTG đều mã hóa cho Valine. Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự plasmid pVenus (155-238) KIF2A-GD và so sánh với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Linker Venus (155-238) Chương 3: Kết quả và thảo luận. 44 Như vậy, cDNA KIF2A-GD đã được gắn chèn đồng khung vào plasmid pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. Hình 3.5 và 3.6 là kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) và pVenus (155-238) tái tổ hợp có mang đoạn chèn β2-Adaptin-ear. Kết quả so sánh sắp gióng cột cho thấy cDNA của β2-Adaptin-ear chúng tôi thu nhận hoàn toàn tương đồng Linker Hình 3.5. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) β2Adaptin-ear và so sánh với trình tự M34175.1 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 45 (99,9 %) với trình tự mang mã số M34175.1 trên ngân hàng gene và đã được gắn chèn đồng khung. Khi so sánh trình tự linker (là trình tự nằm giữa gene mục tiêu của chúng tôi và gene mã hóa cho mảnh N-Venus) của plasmid pVenus (1-173) tái tổ hợp (hình 3.3 và hình 3.5) với trình tự linker của plAasmid pVenus (1-173) N1 [phụ lục], Hình 3.6. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (155-238) β2Adaptin-ear và so sánh với trình tự M34175.1trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Linker Chương 3: Kết quả và thảo luận. 46 chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi ở codon thứ 2 (CCG thành CCT). Vì hai codon CCG và CCT đều mã hóa cho acid amin Proline nên đột biến này không ảnh hưởng đến khung dịch mã của linker và mảnh N-Venus. Tóm lại, chúng tôi đã dòng hóa thành công lần lượt cDNA KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào hai vector biểu hiện pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238). Hai cDNA này được thu nhận chính xác và tạo dòng vào đúng vị mong muốn là gắn vào đầu 5’của trình tự mã hóa cho protein mảnh N-Venus và mảnh C-Venus thông qua một linker. 3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống Split Venus. COS-7 là dòng tế bào nguyên bào sợi thận khỉ xanh Châu Phi mang trình tự DNA của virus SV40, được sử dụng như là tế bào chủ trong quá trình chuyển gene vào tế bào động vật [43]. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gene tạm thời, plasmid sau khi được chuyển vào trong tế bào sẽ không sáp nhập vào bộ gene của tế bào chủ mà tồn tại ở dạng episome, có thể tự sao chép và biểu hiện độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của những gene này ngắn. Chúng tôi đồng chuyển các plasmid tái tổ hợp nói trên và plasmid pVenus (1-173); pVenus (155-238) mang gene mã hóa cho protein PIP5KA và PIP5KC661 vào tế bào COS-7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein dựa vào tín hiệu huỳnh quang. Sơ đồ đồng chuyển các plasmid được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2 (chương 2-Vật liệu và phương pháp). 3.2.1. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. Protein Venus có bước sóng kích thích tối ưu là 515 nm và bước sóng phát ra tương ứng là 528 nm [32]. Tuy nhiên do điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi chỉ có thể quan sát tín hiệu huỳnh quang của protein Venus ở bước sóng kích thích là 488 nm và phát ra ở bước sóng 507 nm. Hai bước sóng này vẫn nằm trong ngưỡng kích thích và phát ra của protein Venus. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 47 Các plasmid đồng chuyển pVenus (1-173) và pVenus (155-238) hoạt động theo nguyên tắc của hệ thống BIFC, nghĩa là tín hiệu huỳnh quang phát ra khi hai protein dung hợp vào mảnh N và mảnh C của protein Venus tương tác với nhau. Kết quả hình 3.7 cho thấy vùng hình cầu của protein KIF2A chỉ tương tác với protein PIP5KA mà không tương tác với protein PIP5KC661. Điều này phù hợp với kết quả trước đó của nhóm chúng tôi khi sử dụng lai kép hai hệ thống (two-hybrid system) trên hai protein này (Nakano và cs). Và tương tác này chỉ xảy ra trong môi trường có bổ sung huyết thanh (FBS 10 %) hoặc có sự hiện diện của protein ARF6 QL (hình 3.7 A1, A3, A4, B1, B3 và B4) [21][30]. Thành phần chính của huyết thanh là hormone, nhân tố tăng trưởng. Những nhân tố này đã được chứng minh tham gia vào quá trình hoạt hóa phân tử PIP5K, làm tăng mức độ PIP2 tại màng tế bào [24]. Protein ARF6 cũng là nhân tố trực tiếp hoạt hóa PIP5K [21]. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận KIF2A-GD chỉ gắn lên protein PIP5KA khi protein này được hoạt hóa. Tín hiệu huỳnh quang cũng được ghi nhận khi biểu hiện đồng thời vùng ear của tiểu phần β2-Adaptin và protein PIP5KC trong tế bào COS-7 (hình 3.8) nhưng không được ghi nhận trong trường hợp đồng biểu hiện KIF2A-GD và PIP5KC661; hay β2-Adaptin-ear và PIP5KA (hình 3.7 C và 3.8 C). Như đã nói trên, protein KIF2A chỉ tương tác với PIP5KA, tiểu phần β2 của AP-2 tương tác đặc hiệu với PIP5KC661. Vì vậy, kết quả hình 3.7 và 3.8 cho thấy hệ thống hai plasmid pVenus của chúng tôi hoạt động ổn định và 4 plasmid tái tổ hợp được tạo dòng ở trên được biểu hiện trong tế bào COS-7. Ngoài ra, kết quả hình 3.7 và 3.8 cho phép xác định vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661. PIP5KA chủ yếu tập trung ở nhân và khu vực quanh nhân, PIP5KC661 biểu hiện trong nhân và rải rác trong tế bào chất của COS-7. Trường hợp tế bào COS-7 được chuyển gene mã hóa cho protein ARF6 QL, chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661, hai protein này tập trung chủ yếu tại những khu vực gần màng tế bào. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 48 Hình 3.7. Kết quả tương tác của protein KIF2A-GD và protein PIP5KA trong tế bào COS-7 với các điều kiện khác nhau A1, A2, A3 và A4: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- KIF2A-GD-(155-238) C1- PIP5KA. B1, B2, B3 và B4: tế bào được đồng chuyển plasmid (155-238) N1- KIF2A-GD-(1-173) C1- PIP5KA. C: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- KIF2A-GD-(155-238) C1- PIP5KC661. A1, A3, B1, B3 và C: hai protein tương tác trong điều kiện có huyết thanh FBS 10 %. A2, A4, B2 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện không có huyết thanh FBS 10 %. A3, A4, B3 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện có protein ARF6 QL. Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm + ARF6 QL A1 A2 A3 B1 B2 B3 B4 C A4 Chương 3: Kết quả và thảo luận. 49 Hình 3.8. Kết quả tương tác của protein β2 AP2-ear và protein PIP5KC661 trong tế bào COS-7 với các điều kiện khác nhau A1, A2, A3 và A4: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- β2 AP2-ear -(155-238) C1- PIP5KC661. B1, B2, B3 và B4: tế bào được đồng chuyển plasmid (155-238) N1- β2 AP2-ear -(1-173) C1- PIP5K C661. C: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- β2 AP2-ear -(155-238) C1- PIP5KA. A1, A3, B1, B3 và C: hai protein tương tác trong điều kiện có huyết thanh FBS 10 %. A2, A4, B2 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện không có huyết thanh FBS 10 %. A3, A4, B3 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện có protein ARF6 QL. Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm. + ARF6 QL A1 A3 A4 A2 B1 B3 B2 B4 C Chương 3: Kết quả và thảo luận. 50 3.2.2. Kết quả xác định hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid Bên cạnh đó, chúng tôi xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang nhằm so sánh hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid. Đồ thị hình 3.9 cho thấy trong cùng một điều kiện (trong môi trường có 10 % FBS hoặc có sự hiện diện của ARF6 QL), trường hợp đồng chuyển plasmid pVenus (1-173) N1-KIF2A-GD và pVenus (155-238) C1-PIP5KA có số lượng tế bào phát huỳnh quang cao hơn trường hợp chuyển hai plasmid pVenus (155-238) N1-KIF2A-GD và pVenus (1- 173) C1-PIP5KA. Chúng tôi thu được kết quả tương tự (hình 3.10) đối với trường hợp biểu hiện đồng thời protein β2-Adaptin-ear và PIP5KC661 trong tế bào COS-7. Khi có sự hiện diện của protein ARF6 QL số lượng protein PIP5KA và PIP5KC661 được hoạt hóa nhiều hơn thể hiện qua phần trăm tế bào phát huỳnh quang. Hình 3.9. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển các plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KA và KIF2A-GD vào tế bào COS-7 ST: kí hiệu tế bào được nuôi trong môi trường D’MEM 0 % FBS Chương 3: Kết quả và thảo luận. 51 Dựa vào kết quả đồ thị 3.9 và 3.10, chúng tôi chọn cặp plasmid tương ứng sau để xác định PIP5KA và PIP5KC661 tương ứng được hoạt hóa ở tế bào HeLa clone 3: 3.3. Xác định sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trên dòng tế bào HeLa clone 3. Chúng tôi tiến hành xác định ảnh hưởng của nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF và protein ARF6 QL đối với sự hoạt hóa PIP5KA, PIP5KC661 cũng như những biến đổi kiểu hình tương ứng trên dòng tế bào HeLa clone 3. pVenus(1-173)N1-KIF2A-GD pVenus(155-238)C1-PIP5KA và pVenus(1-173)N1-β2-Adaptin-ear pVenus(155-238)C1-PIP5KC661 Hình 3.10. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển các plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KC661 và β2-Adaptin- ear vào tế bào COS-7 ST: kí hiệu tế bào được nuôi trong môi trường D’MEM 0 % FBS Chương 3: Kết quả và thảo luận. 52 3.3.1. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi được kích thích bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF. Nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng sinh và biệt hóa của tế bào. Khi nhân tố này gắn vào thụ thể tương ứng của nó (EGFR) trên màng tế bào sẽ khởi động các con đường truyền tín hiệu [7]. Ở tế bào HeLa khi được kích thích bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF, PIP5KB cùng với protein ARF6 tham gia vào quá trình tạo nếp gấp trên màng (membrane ruffle) [17]. Protein ARF6 là một protein G, thuộc họ protein ARF. Protein này được hoạt hóa khi gắn với GTP và bất hoạt khi gắn với GDP. Khi được hoạt hóa bởi nhân tố trao đổi guanine (GEF), ARF6-GTP trực tiếp hoạt hóa PIP5K, dẫn đến quá trình tạo protein PIP2, theo sau đó là những biến đổi trên màng tế bào và hoạt động của actin [21]. Sự di chuyển của tế bào (cell migration) có vai trò quan trọng trong việc tái tạo mô, đáp ứng viêm, ung thư và di căn. Quá trình này gồm nhiều bước, bắt đầu với việc hình thành cấu trúc lamellipodia, filopodia, tiếp đến là kết dính các chất bên trong tế bào và cuối cùng giải phóng các chất này. Khi quá trình di chuyển của tế bào bị hạn chế do lamellipodia không được tạo ra không hiệu quả, những nếp gấp trên màng sẽ được hình thành. Những nếp gấp này sau đó tham gia tái sắp xếp lại actin [4][22]. Để so sánh tác động của nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF đối với PIP5KA và PIP5KC661, chúng tôi tiến hành đồng chuyển các cặp plasmid trên vào dòng tế bào HeLa clone 3 kích thích tế bào bằng nhân tố này (100 ng/ml) trong thời gian 5 phút. Sự sắp xếp của F-actin trong tế bào được xác định bằng cách nhuộm tế bào với Alexa Fluor 568 (Invitrogen) Kết quả hình 3.11 cho thấy nếp gấp trên màng chỉ được hình thành ở tế bào biểu hiện PIP5KA mà không có ở tế bào biểu hiện PIP5KC661. Đồng thời PIP5KA cũng định vị tại những nếp gấp trên màng khi tế bào được kích thích bởi EGF (hình 3.11 – A2). Vị trí biểu hiện của PIP5KC661 và sự sắp xếp actin trong tế bào này không thay đổi trong trường hợp tế bào được kích thích bởi EGF (hình 3.11 – B2). Chương 3: Kết quả và thảo luận. 53 Theo công trình của Doughman và cs (2003), PIP5KA và Rac1 khi biểu hiện đồng thời cũng cảm ứng hình thành những nếp gấp trên màng tế bào trong nguyên bào sợi sarcoma xương ở người MG-63 khi có nhân tố tăng trưởng tiểu cầu (platelet- derived growth - PDGF) kích thích [11]. Trong điều kiện bình thường của tế bào, quá trình hoạt hóa và bất hoạt ARF6 xảy ra thuận nghịch. Khi tế bào HeLa clone 3 được kích thích bởi EGF, protein ARF6 nội bào được hoạt hóa, tác động đến hoạt động của PIP5KA, quá trình polymer hóa actin xảy ra và hình thành nếp gấp trên màng tế bào. Nhưng ARF6 cũng có thể bị bất hoạt bởi các protein thủy giải liên kết GTP-ARF6 bên trong tế bào. Vì vậy, membrane ruffle chỉ được hình thành trong thời gian ngắn [6][17]. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận hoạt động của PIP5KA liên quan đến sự hình thành nếp gấp trên màng khi tế bào nhận được các kích thích, trong khi đó, hoạt động của protein PIP5KC661 không bị ảnh hưởng. 3.3.2. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi protein ARF6 QL biểu hiện vượt mức. Protein ARF6 QL được sử dụng trong đề tài này là dạng đột biến của ARF6, đột biến này kháng lại quá trình thủy giải GTP thành GDP [20]. Tương tự kết quả trên dòng tế bào COS-7, PIP5KA và PIP5KC661 đều di chuyển đến vị trí gần màng tế bào chỉ khi có sự hiện diện của protein ARF6 đã được hoạt hóa (ARF6 QL). Kết quả nhuộm F-actin cũng cho thấy các sợi actin tập trung ngay tại vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661 (hình 3.12). Nghiên cứu của Brown và cộng sự (2001) cho thấy khi đồng chuyển gene mã hóa protein ARF6 QL và gene mã hóa protein PIP2 vào tế bào HeLa, protein PIP2 biểu hiện và tích lũy thành “cụm”, những “cụm” này được bao phủ bởi actin. Kết quả kiểu hình tương tự ở dòng tế bào COS sau 18 giờ chuyển gene mã hóa protein ARF6 QL, số lượng và kích thước của các “cụm” PIP2 tăng lên ở thời điểm 40 phút sau đó [6]. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 54 A2 PIP5KA F-actin PIP5KA F-actin A1 B1 B2 PIP5KC661 PIP5KC661 F-actin F-actin Hình 3.11. Kết quả sắp xếp của actin trong tế bào HeLa clone 3 khi kích thích bởi EGF và mẫu chứng “PIP5KA”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) KIF2A-GD và (155-238) PIP5KA. “PIP5KC661”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) β2-Adaptin-ear và (155-238) PIP5KC661. “F-actin”: kí hiệu kết quả nhuộm actin của tế bào bằng Alexa Fluor 568. A1 và B1: tế bào không bị kích thích bởi EGF; A2 và B2: tế bào bị kích thích bởi EGF trong 5 phút. Thanh tỉ lệ kích thước: 10 µm. “ “: vị trí membrane ruffle. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 55 3.3.2. Kết quả định lượng cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa clone 3. Để xác định ảnh hưởng của EGF và ARF6QL lên sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661, chúng tôi sử dụng phần mềm Image J (NIH) để tính toán cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa clone 3 khi có sự hiện diện của nhân tố tăng Hình 3.12. Kết quả sắp xếp actin trong tế bào HeLa clone 3 biểu hiện ARF6QL PIP5KA”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) KIF2A-GD và (155-238) PIP5KA. “PIP5KC661”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) β2- Adaptin-ear và (155-238) PIP5KC661. “F-actin”: kí hiệu kết quả nhuộm actin của tế bào bằng Alexa Fluor 568. Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm Merge PIP5KA F-actin F-actin PIP5KC661 Merge Chương 3: Kết quả và thảo luận. 56 trưởng biểu mô EGF, protein ARF6 QL. Kết quả được tính toán trên 20 tế bào và số liệu được xử lí thống kê bằng hàm T-test (Excel 2007). Hình 3.13. Kết quả cường độ huỳnh quang thể hiện tương tác giữa PIP5KA và KIF2A-GD trong điều kiện có hoặc không có EGF/ ARF6 QL ở tế bào HeLa clone 3 “*”: khác biệt về mặt thống kê bằng phương pháp T-test (p<0.05) * Hình 3.14. Kết quả cường độ huỳnh quang thể hiện tương tác giữa PIP5KC661 và β2-AP2-ear trong các điều kiện khác nhau ở tế bào HeLa clone 3 “*”: khác biệt về mặt thống kê bằng phương pháp T-test (p<0.05) * Chương 3: Kết quả và thảo luận. 57 Như đã chứng minh ở trên, tương tác giữa KIF2A-GD với PIP5KA và β2- Adaptin-ear với PIP5KC661 phụ thuộc vào sự hoạt hóa của hai protein PIP5K này. Vậy cường độ của tín hiệu huỳnh quang thu được sẽ phản ánh tương đối mức độ hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trong tế bào. Kết quả thống kê bằng phương pháp T-test cho thấy ở mẫu tế bào được kích thích bởi EGF, cường độ huỳnh quang không có sự khác biệt so với mẫu chứng. Chúng tôi có thể kết luận PIP5KA và PIP5KC đều không được hoạt hóa bởi EGF mặc dù membrane ruffle được hình thành khi có sự hiện diện của PIP5KA. Điều này cho thấy rằng quá trình hình thành membrane ruffle không phụ thuộc vào sự hoạt hóa của PIP5KA. Cường độ huỳnh quang ở mẫu tế bào có biểu hiện ARF6QL tăng lên và có sự khác biệt về mặt thống kê trong cả hai trường hợp protein PIP5KA và PIP5KC661. Như vậy có thể kết luận ARF6QL có khả năng hoạt hóa PIP5KA và PIP5KC661 in vitro. Hai protein này khi được hoạt hóa sẽ di chuyển đến gần màng tế bào và tác động đến quá trình sắp xếp của actin trong tế bào. Chương 4: Kết luận. 58 KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được, chúng tôi kết luận như sau: 1. Đã dòng hóa thành công cDNA mã hóa cho protein KIF2A-GD và β2- Adaptin-ear vào vector biểu hiện pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. 2. Hệ thống Split Venus được sử dụng để xác định tương tác giữa các protein cho kết quả: tương tác giữa protein KIF2A-GD và PIP5KA chỉ xảy ra khi PIP5KA được hoạt hóa. 3. Trong tế bào HeLa clone 3: - PIP5KA và PIP5KC661 khi được hoạt hóa bởi protein ARF6QL sẽ thay đổi vị trí biểu hiện và dẫn đến sự tái sắp xếp actin trong tế bào. - Nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF không có khả năng hoạt hóa PIP5KA và PIP5KC661. Nhưng nhân tố này cảm ứng hình thành nếp gấp trên màng khi tế bào biểu hiện protein PIP5KA. Protein PIP5KC661 không tham gia quá trình hình thành nếp gấp trên màng tế bào. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo. 59 [1]. Akiko N. K., Yamazaki M., Unoki T., Hongu T., Murata C., Taguchi R., Katada T., Frohman M. A., Yokozeki T., Kanaho Y., (2007). Role of activation of PIP5Kγ661 by AP-2 complex in synaptic vesicle endocytosis. The EMBO Journal 26, 1105–1116. [2]. Akiyama C., Narikawa N. S, Kitazawa T., Hamakubo T., Kodama T., Shibasaki Y., (2005) Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase γ is associated with cellecell junction in A431 epithelial cells. Cell Biology International 29 514-520. [3]. Bairstow S. F., Ling K., Su X., Firestone A. J., Carbonara C., Anderson R. A., (2006). Type Iγ661 phosphatidylinositol phosphate kinase directly interacts with AP2 and regulates endocytosis. The Journal of Biological Chemistry 281, no. 29, pp. 20632–20642. [4]. Borm B., Requardt R. P., Herzog V., Kirfel G., (2005). Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization. Experimental Cell Research 302, 83– 95. [5]. Bout I. v d., Divecha N., (2009). PIP5K-driven PtdIns (4, 5) P2 synthesis: regulation and cellular functions. Journal of Cell Science 122, 3837-3850. [6]. Brown F. D., Rozelle A. L., Yin H. L., Balla T, Donaldson J. G., (2001). Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Arf6-regulated membrane traffic. The Journal of Cell Biology 154, 1007–1017. [7]. Carpenter G., Cohen S., (1990). Epidermal growth factor. The Journal of Biological Chemistry 265 (14), 7709–7712. [8]. Cockcroft S., (2009). Phosphatidic acid regulation of phosphatidylinositol 4- phosphate 5-kinases. Biochimica et Biophysica Acta 1791, pp. 905–912. [9]. Coppolino M. G., Dierckman R., Loijens J., Collins R. F., Pouladi M., Bilen J. J., Schreiber A. D., Trimble W. S., Anderson R., Grinstein S., (2002). Inhibition of phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase Iα impairs localized Tài liệu tham khảo. 60 actin remodeling and suppresses phagocytosis. The Journal of Biological Chemistry 277 (46), 43849–43857. [10]. Current Protocol in Molecular Biology. Transfection of cultured eukaryotic cells using cationic lipid reagents, Unit 9.4. [11]. Doughman R. L., Firestone A. J., Wojtasiak M. L., Bunce M. W., Anderson R. A., (2003). Membrane ruffling requires coordination between type Iα Phosphatidylinositol phosphate kinase and Rac signaling. The Journal of Biological Chemistry 278 (25), 23036–23045. [12]. Fan J. Y., Cui Z. Q., Wei H. P., Zhang Z. P., Zhou Y. F., Wang Y. P., Zhang X. E., (2008). Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein–protein interactions in living cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 367. [13]. Ganem N. J., Compton D. A., (2004). The KinI kinesin Kif2a is required for bipolar spindle assembly through a functional relationship with MCAK. The Journal of Cell Biology 166(4), 473–478. [14]. Hirokawa N., (1998). Kinesin and Dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science 279 (519). [15]. Hirokawa N., Takemura R., (2004). Kinesin superfamily proteins and their various functions and dynamics. Experimental Cell Research 301, 50-59. [16]. Hirokawa N., Takemura R., (2005). Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience 1624. [17]. Honda A., Nogami M., Yokozeki T., Yamazaki M., Nakamura H., Watanabe H., Kawamoto K., Nakayama K., Morris A. J., Frohman M. A., Kanaho Y., (1999). Phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-Kinase α Is a Downstream Effector of the Small G Protein ARF6 in Membrane Ruffle Formation. Cell 99, 521-532. [18]. Invitrogen, Lipofectamine™ Reagent. Tài liệu tham khảo. 61 [19]. Jang C. Y., Coppinger J. A., Seki A., Yates J. R., Fang G., (2009). Plk1 and Aurora A regulate the depolymerase activity and the cellular localization of Kif2a. Journal of Cell Science 122, 1334-1341. [20]. Jaworski J., (2007). ARF6 in the nervous system. European Journal of Cell Biology 86, 513–524. [21]. Kanaho Y., Nakano A. K., Yokozeki T., (2007). The Phosphoinositide kinase PIP5K that produces the versatile signaling phospholipid PI4, 5P2. Biol. Pharm. Bull 30(9), 1605—1609. [22]. Lauffenburger D. A., Horwitz A. F., (1996). Cell migration: A physically integrated molecular process. Cell 84, 359-369. [23]. Ling K., Doughman R. L., Firestone A. J., Bunce M. W., Anderson R. A., (2002). Type Iγ phosphatidylinositol phosphate kinase targets and regulates focal adhesions. Nature 420. [24]. Mao Y. S., Yin H. L., (2007). Regulation of the actin cytoskeleton by phosphatidylinositol 4-phosphate 5 kinases. Pflugers Arch - Eur J Physiol 455:5–18. [25]. Mejillano M., Yamamoto M., Rozelle A. L., Sun H. Q., Wang X., Yin H. L., (2001). Regulation of apoptosis by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate inhibition of caspases, and caspase inactivation of phosphatidylinositol phosphate 5-kinases. Journal of Biological Chemistry 276 (3), 1865–1872. [26]. Nagai T., Ibata K., Park E. S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A., (2002). A variant of fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature biotechnology 20, 87-90. [27]. Narkis G., Ofir R., Landau D., Manor E., Volokita M., Hershkowitz R, Elbedour K., Birk O. S., (2007). Lethal contractural syndrome type 3 (LCCS3) is caused by a mutation in PIP5K1C, which encodes PIPKIγ of the phophatidylinsitol pathway. The American Journal of Human Genetics 81. [28]. Ohno H., Clathrin-associated adaptor protein complexes. Journal of Cell Science 119, 3719-3721. Tài liệu tham khảo. 62 [29]. Paolo G. D., Moskowitz H. S., Gipson K., Wenk M. R., Voronov S., Obayashi M., Flavell R., Fitzsimonds R. M., Ryan T.A., Camilli P. D., (2004). Impaired PtdIns (4,5) P2 synthesis innerve terminals produces defects in synaptic vesicle trafficking. Nature 431. [30]. Peter J. P., Hsu V. W., Ooi C. E., Finazzi D., Teal S. B., Oorschot V., Donaldson J. G., Klausner R. D. (1995). Overexpression of wild-type and mutant Arf1 and Arf6: Distinct perturbations of nonoverlapping membrane compartments. The Journal of Cell Biology 128, 1003-1017. [31]. QIAGEN® Plasmid Purification Handbook. [32]. Rekas A., Alattia J. R., Nagai T., Miyawaki A., Ikura M., (2002). Crystal structure of Venus, a yellow fluorescent protein with improved maturation and reduced environmental sensitivity. The Journal of Biological Chemistry 277 (52), 50573–50578. [33]. Rodemer C., Haucke V., (2008). Clathrin/AP-2-Dependent Endocytosis: a novel playground for the pharmacological toolbox? Handbook of Experimental Pharmacology 186, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg. [34]. Shibasaki Y., Ishihara H., Kizuki N., Asano T., Oka Y., Yazaki Y., (1997). Massive Actin Polymerization Induced by Phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-Kinase In Vivo. The Journal of Biological Chemistry 272, 7578–7581. [35]. Shyu Y. J., Liu H., Deng X., Hu C. D., (2006). Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. BioTechniques 40:61-66. [36]. Tsuboi S., Meerloo J., (2007). Wiskott-Aldrich Syndrome protein is a key regulator of the phagocytic cup formation in macrophages. The Journal of Biological Chemistry 282 (47), 34194–34203. [37]. Wang Y., Lian L., Golden J. A., Morrisey E. E., Abrams C. S., (2007). PIP5KIγ is required for cardiovascular and neuronal development. PNAS 104, 11748-11753. Tài liệu tham khảo. 63 [38]. Weernink P. A. O., Schmidt M., Jakobs K. H., (2004). Regulation and cellular roles of phosphoinositide 5-kinases. European Journal of Pharmacology 500, 87– 99. [39]. Wozniak M. A., Modzelewska K., Kwong L., Keely P. J., (2004). Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta 1692, 103– 119. [40]. Yamamoto M, Chen M. Z., Wang Y. J, Sun H. Q., Wei Y, Martinez M., Yin H. L., (2006). Hypertonic stress increases phosphatidylinositol 4, 5- bisphosphate levels by activating PIP5KIβ. The Journal of Biological Chemistry 281 (43), 32630–32638. Các trang web [41]. [42]. [43]. 2/Default.aspx?ATCCNum=CRL-1651&Template=cellBiology. [44]. [45]. [46]. [47]. PHỤ LỤC Phụ lục. 1.Sơ đồ plasmid pVenus (1-173) N1 Phụ lục. Phụ lục. 2.Sơ đồ plasmid pVenus (155-238) N1 Phụ lục. 3.Kết quả xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KA và KIF2A-GD vào tế bào COS-7 Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) 173kif2a-155pip5kA 10.4 6.1 9.5 173kif2a-155pip5kA-ARF6 22.5 15.6 21 173kif2a-155pip5kA-ST 0 0 0 173kif2a-155pip5kA-ARF6- ST 13.6 12 10.3 155Kif-173PIP5KA 4 5.3 7 155Kif-173PIP56KA-ARF6 5 6.1 7.1 155Kif-173PIP5KA-ST 0 0 0 155Kif-173PIP56KA-ARF6- ST 3.2 5.8 5 Phụ lục. Descriptives VAR00002 Test of Homogeneity of Variances VAR00002 Levene Statistic df1 df2 Sig. 3.919 7 16 .011 ANOVA VAR00002 Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 886.423 7 126.632 38.701 .000 Within Groups 52.353 16 3.272 Total 938.776 23 Homogeneous Subsets VAR00002 Duncan VAR000 01 N Subset for alpha = .05 1 2 3 4 5 N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimu m Maximu m Lower Bound Upper Bound 1.00 3 8.6667 2.26789 1.30937 3.0329 14.3004 6.10 10.40 2.00 3 19.7000 3.62905 2.09523 10.6849 28.7151 15.60 22.50 3.00 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 4.00 3 11.9667 1.65025 .95277 7.8672 16.0661 10.30 13.60 5.00 3 5.4333 1.50444 .86859 1.6961 9.1706 4.00 7.00 6.00 3 6.0667 1.05040 .60645 3.4573 8.6760 5.00 7.10 7.00 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 8.00 3 4.6667 1.33167 .76884 1.3586 7.9747 3.20 5.80 Tota l 24 7.0625 6.38877 1.30410 4.3648 9.7602 .00 22.50 Phụ lục. 3.00 3 .0000 7.00 3 .0000 8.00 3 4.6667 5.00 3 5.4333 5.4333 6.00 3 6.0667 6.0667 1.00 3 8.6667 4.00 3 11.9667 2.00 3 19.7000 Sig. 1.000 .383 .053 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 4.Kết quả xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KC661 và β2-Adaptin-ear vào tế bào COS-7 Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) 173b2Adaptin-155PIP5KC 9.5 11.2 12.3 173 b2Adaptin- 155PIP5KC+ARF6 QL 17.7 15 18.3 173 b2Adaptin-155 PIP5KC ST 6 8.1 5 173 b2Adaptin- 155PIP5KC+ARF6 QL ST 14 9.4 10.6 155 b2Adaptin-173PIP5KC 4.2 5 5 155b2Adaptin- 173PIP5KC+ARF6 QL 7 8 10 155 b2Adaptin-173PIP5KC-ST 0 0 0 155b2Adaptin- 173PIP5KC+ARF6 QL ST 4 6.7 5.4 Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimu m Maximu m Lower Bound Upper Bound 1.00 3 11.0000 1.41067 .81445 7.4957 14.5043 9.50 12.30 2.00 3 17.0000 1.75784 1.01489 12.6333 21.3667 15.00 18.30 3.00 3 6.3667 1.58219 .91348 2.4363 10.2971 5.00 8.10 Phụ lục. VAR00003 Test of Homogeneity of Variances VAR00003 Levene Statistic df1 df2 Sig. 2.147 7 16 .098 ANOVA VAR00003 Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 556.480 7 79.497 36.040 .000 Within Groups 35.293 16 2.206 Total 591.773 23 Homogeneous Subsets VAR00003 Duncan VAR000 01 N Subset for alpha = .05 1 2 3 4 5 7.00 3 .0000 5.00 3 4.7333 8.00 3 5.3667 3.00 3 6.3667 6.3667 6.00 3 8.3333 1.00 3 11.0000 4.00 3 11.3333 2.00 3 17.0000 4.00 3 11.3333 2.38607 1.37760 5.4060 17.2607 9.40 14.00 5.00 3 4.7333 .46188 .26667 3.5860 5.8807 4.20 5.00 6.00 3 8.3333 1.52753 .88192 4.5388 12.1279 7.00 10.00 7.00 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 8.00 3 5.3667 1.35031 .77960 2.0123 8.7210 4.00 6.70 Tota l 24 8.0167 5.07240 1.03540 5.8748 10.1586 .00 18.30 Phụ lục. Sig. 1.000 .220 .124 .787 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 5.Kết quả cường độ huỳnh quang tương tác giữa PIP5KA và KIF2A trong tế bào HeLa clone 3 KIF2A-PIP5KA KIF2A- PIP5KA-EGF KIF2A-PIP5KA- ARF6QL Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 1 75.729 55.150 98.692 57.353 135 73.2643 2 73.828 57.281 91.587 96.858 89.734 114.5097 3 74.426 89.614 67.751 79.585 141.86 117.1223 4 90.069 119.553 79.121 90.242 140.3604 115.816 5 105.607 67.096 86.779 85.625 67.3731 88.1758 6 107.190 59.934 76.249 73.514 133.2441 83.6177 7 85.820 128.580 94.112 73.681 131.2482 81.7872 8 69.943 72.000 70.949 96.101 112.9736 74.4935 9 33.696 80.852 66.942 109.583 97.9373 157.1252 10 65.291 85.564 63.597 106.491 115.0955 72.874 Trung Bình 78.160 81.562 79.578 86.903 116.483 97.879 Cường độ huỳnh quang trung bình 79.861 83.241 107.181 STDEV 2.406 5.180 13.155 p Value 0.541 0.002 Sử dụng phần mềm Image J, xác định cường độ huỳnh quang 20 tế bào của 2 lần lặp lại thí nghiệm. So sánh kết quả bằng phương pháp T-Test giữa cặp tế bào có và không có kích thích với EGF, giữa cặp tế bào có biểu hiện và không có biểu hiện ARF6 QL. 6. Kết quả cường độ huỳnh quang tương tác giữa PIP5KC661 và β2-Adaptin- ear trong tế bào HeLa clone 3. BETA-PIP5KC BETA-PIP5KC- EGF BETA-PIP5KC- ARF6QL lần 1 Lần 2 lần 1 Lần 2 lần 1 Lần 2 1 109.057 84.276 96.721 91.913 127.763 120.139 2 127.066 116.879 68.565 87.117 121.235 87.007 3 89.909 52.704 82.249 80.040 102.649 150.607 Phụ lục. 4 114.627 120.855 69.343 94.411 103.697 89.992 5 100.755 77.861 55.079 82.106 138.339 128.136 6 75.130 71.348 141.300 90.473 140.571 102.789 7 78.040 112.831 76.522 74.613 89.585 76.365 8 92.861 80.751 77.617 75.906 114.179 174.899 9 75.130 100.772 75.940 192.818 134.408 152.068 10 71.719 96.973 53.368 67.368 78.784 159.608 Trung Bình 93.430 91.525 79.670 93.676 115.121 124.161 Cường độ huỳnh quang trung bình 92.477 86.673 119.641 STDEV 1.347 9.904 6.392 p Value 0.489 0.006