Luận văn Xây dựng qui trình phát hiện escherichia coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

ån maøu. + Thöû nghieäm Voges Proskauer: cho 0,2ml thuoác thöû –napthol 5% vaøo canh khuaån MR–VP, laéc maïnh; boå sung theâm 0,2 – 0,3 ml KOH 40%, laéc maïnh, quan saùt 10 – 30 phuùt. Phaûn öùng VP laø döông tính khi canh khuaån chuyeån sang maøu ñoû, phaûn öùng laø aâm tính khi canh khuaån khoâng chuyeån maøu. - Thöû nghieäm Simon citrate: trong moâi tröôøng Simon citrate, phaûn öùng laø döông tính khi moâi tröôøng coù xuaát hieän sinh khoái vi khuaån vaø maøu moâi tröôøng chuyeån sang xanh da trôøi, phaûn öùng laø aâm tính khi moâi tröôøng khoâng coù sinh khoái vaø khoâng chuyeån maøu. Qui trình phaân laäp, ñònh danh E. coli baèng phöông phaùp nuoâi caáy vaø thöû nghieäm sinh hoùa ñöôïc toùm taét treân H ình 5. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Laáy 1g (1ml) maãu vaøo 10ml moâi tröôøng BGBL UÛ ôû 44C  0,5C trong 24 – 48 giôø Choïn caùc oáng coù sinh hôi caáy sang EMB agar. Maãu khoâng sinh hôi ñöôïc xem laø aâm tính E. coli UÛ ôû 37  0,5C trong 24 giôø Choïn khuaån laïc deït, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính khoaûng 1mm ñeå caáy sang TSA UÛ ôû 37C  0,5C qua ñeâm Thöû nghieäm IMViC E. coli coù bieåu hieän sinh hoaù: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrat (-). Moät trong soá caùc phaûn öùng treân sai laø khoâng phaûi E. coli Keát luaän: coù hay khoâng coù E. coli/g thöïc phaåm H ình 5. Quy trình phaân l aäp, ñònh danh E. coli baèng phöông p haùp nuoâi caáy v aø thö û nghieäm sinh hoaù Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2.6. Thu vaø xöû lyù khuoân DNA ch o ph aûn öùng PCR Huùt 1ml dòch taêng sinh cho vaøo eppdorrf saïch. Ly taâm 800 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Chuyeån phaàn dòch beân treân sang moät eppendorf khaùc. Ly taâm 10.000 voøng/phuùt trong 10 phuùt ñeå thu nhaän sinh khoái. Röûa sinh khoái teá baøo trong 1ml nöôùc caát voâ truøng. Thu nhaän sinh khoái sau khi röûa baèng caùch ly taâm 10000 voøng/ phuùt trong 5 phuùt. Huyeàn phuø hoaù sinh khoái trong 0,2ml TE. Ñun soâi caùch thuûy dòch huyeàn phuø teá baøo trong 10 phuùt, ly taâm 10.000 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Dòch noåi phía treân ñöôïc söû duïng laøm khuoân DNA cho phaûn öùng PCR. 2.7. Ñieàu kieän cuûa phaûn öùng PCR phaùt hieän E. coli Phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän trong theå tích 25l vôùi caùc thaønh phaàn nhö sau: - d H2O 13l - Ñeäm PCR 10X 2,5l - dNTP 10X 2,5l - MgCl2 25 mM 2,5l - Moài EC1 6 pM 1,0l - DNA 3,0l - Taq DNA polymerase 1UI/l 0,5l Chöông trình cuûa phaûn öùng PCR ñöôïc thieát laäp nhö sau: hoãn hôïp phaûn öùng ñöôïc giöõ ôû 95C trong 10 phuùt ñeå bieán tính hoaøn toaøn caùc sôïi DNA, ñoàng thôøi hoaït hoùa Taq DNA polymerase. Phaûn öùng chính ñöôïc thöïc hieän trong 35 chu kyø, moãi chu kyø goàm: 95C trong 1 phuùt, 55C trong 45 giaây, 72C trong 1 phuùt. Sau khi keát thuùc phaûn öùng chính maãu ñöôïc giöõ ôû 72C trong 10 phuùt. Maãu ñöôïc giöõ oån ñònh ôû 4C trong 30 phuùt tröôùc khi phaân tích. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2 .8. Phaân tíc h saûn p haåm PCR baèng ñieän di tr eân g el agar ose - Chuaån bò gel agarose 1,5%: caân 0,75g agarose vaøo bình tam giaùc 100ml, theâm vaøo 50ml ñeäm TAE, ñun baèng loø vi ba trong khoaûng 2 - 3 phuùt cho ñeán khi agarose tan hoaøn toaøn, laéc ñeàu. Ñeå nguoäi khoaûng 60C. Ñoå hoãn hôïp gel vaøo khay ñoå gel ñaõ chuaån bò saün cuøng vôùi caùc löôïc taïo gieáng. Ñeå yeân trong khoaûng 30 phuùt cho gel ñoâng ñaëc hoaøn toaøn. Beà daøy cuûa gel sau ñoâng ñaëc khoaûng 0,7 - 0,8cm. - Nheï nhaøng laáy löôïc ra khoûi gel, ñaët khuoân gel vaøo boàn ñieän di. Cho dung dòch ñieän di vaøo boàn cho ñeán khi ngaäp gel. - Cho vaøo moãi oáng PCR chöùa saûn phaåm khueách ñaïi 2,5l dung dòch naïp maãu. Troän ñeàu, duøng micropipette huùt 10l moãi maãu cho vaøo trong caùc gieáng treân gel ñieän di ñaõ chuaån bò. Trong quaù trình phaân tích luoân daønh 1 gieáng cho thang DNA chuaån (DNA ladder) hay maãu ñoái chöùng döông. Thöïc hieän quaù trình ñieän di ôû hieäu ñieän theá 100V, trong 45 - 50 phuùt. Sau khi keát thuùc ñieän di, gel ñöôïc ngaâm trong dung dòch ethidium bromide1l/ml trong 10 phuùt, sau ñoù röûa baèng nöôùc trong 5 phuùt. - Phaùt hieän caùc saûn phaåm khueách ñaïi döôùi hoäp ñeøn soi UV 312nm. ÔÛ caùc maãu ñoái chöùng aâm, phaûi khoâng coù vaïch cuûa saûn phaåm khueách ñaïi. Caùc maãu döông tính laø nhöõng maãu coù vaïch khueách ñaïi truøng vôùi vaïch khueách ñaïi cuûa maãu ñoái chöùng döông hay coù kích thöôùc khoaûng 299bp. Caùc maãu khoâng coù saûn phaåm khueách ñaïi hay coù vaïch saûn phaåm khueách ñaïi khoâng truøng vôùi vaïch khueách ñaïi cuûa maãu ñoái chöùng döông hay khoâng töông öùng vôùi kích thöôùc ñaõ bieát treân thang DNA chuaån laø nhöõng maãu aâm tính. 2.9. Kieåm c höùng maãu aâm tính Caùc maãu aâm tính ñöôïc söû duïng trong caùc thí nghieäm gaây nhieãm E. coli ñeå xaùc ñònh ñoä nhaïy, thoâng soá kyõ thuaät vaø phaïm vi aùp duïng cuûa phöông phaùp PCR. Maãu naøy caàn ñöôïc kieåm chöùng khoâng coù söï hieän dieän cuûa E. coli (aâm tính) baèng caùch laëp laïi 3 laàn phaân tích ôû caùc phaàn khaùc nhau cuûa khoái maãu baèng phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn thoáng treân cuøng moät maãu. Neáu caû ba laàn ñeàu cho keát quaû aâm tính thì keát luaän maãu thöïc phaåm ñoù khoâng chöùa E. coli. 2.10. Xaùc ñònh ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Pha dòch vi khuaån E. coli baèng dung dòch NaCl 0,85% voâ truøng ôû caùc noàng ñoä pha loaõng baäc 10–1 ñeán 10–9 vaø xaùc ñònh maät ñoä teá baøo E. coli ôû moãi ñoä pha loaõng. Phöông phaùp xaùc ñònh maät ñoä nhö sau: huùt 100l dòch pha loaõng cho vaøo ñóa petri voâ truøng, ñoã vaøo moãi ñóa 10 – 15ml moâi tröôøng PCA ñaõ ñöôïc ñun chaûy vaø laøm nguoäi ôû 45C. Troän ñeàu dòch maãu vaø moâi tröôøng baèng caùch xoay ñóa xuoâi vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà 3 – 5 laàn. Ñaët ñóa treân maët phaúng naèm ngang khoaûng 30 phuùt cho agar ñoâng laïi, uû 37C trong 24 giôø. Ñeám soá khuaån laïc xuaát hieän treân ñóa. Huùt 500l dòch pha loaõng ñaõ ñöôïc xaùc ñònh maät ñoä vaøo eppendorf voâ truøng, xöû lí teá baøo ñeå ly trích khuoân DNA vaø thöïc hieän phaûn öùng PCR laàn löôït treân caùc maãu coù maät ñoä teá baøo 9 x 101 – 9 x 105 CFU/ml. 2.11. Kieåm chöùng tính chu yeân bieät c uûa c aëp moài EC Tính chuyeân bieät cuûa caëp moài ñaõ ñöôïc thieát laäp cho vi sinh vaätmuïc tieâu ñöôïc khaûo saùt baèng caùch söû duïng khuoân DNA töø caùc chuûng E. coli vaø caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhö Salmonella typhimurinum, Shigella sonnei, Clostridium botulinum, C. perfringgens, Vibrio cholerae...Caëp moài laø chuyeân bieät khi cho keát quaû (+) vôùi E. coli vaø cho keát quaû (-) vôùi caùc loaøi khaùc. 2.12. Kieåm chöùng ñieàu kieän toái ö u cuûa ph aûn öùng PCR Phaûn öùng PCR chòu aûnh höôûng cuûa nhieàu yeáu toá nhö nhòeât ñoä baét caëp giöõa moài vaø khuoân, noàng ñoä moài , noàng ñoä Mg2+ vaø noàng ñoä Taq… - Nhieät ñoä: ñöôïc kieåm chöùng trong daõy nhieät ñoä töø 50 - 67C. - Mg2+: ñeå xaùc ñònh noàng ñoä Mg2+ toái öu cho phaûn öùng PCR, phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän ôû nhieät ñoä baét caëp toái öu vôùi caùc noàng ñoä Mg2+ laø 2, 2,5, 3 , 3,5 vaø 4mM. - Noàng ñoä moài: ñöôïc kieåm chöùng laø 5,5; 6 vaø 6,5pM/phaûn öùng. 2.13. Khaûo saùt thôøi g ian taêng sinh toái thieåu phaùt h ieän E. coli treân maãu th öïc phaåm Tieán haønh khaûo saùt thôøi gian taêng sinh toái thieåu cho giai ñoaïn taêng sinh E. coli trong caùc maãu thöïc phaåm vaø aûnh höôûng cuûa chaát neàn thöïc phaåm leân phaûn öùng PCR. Ba loaïi maãu aâm tính ñoái vôùi E. coli ñöôïc choïn laø caù, pate vaø söõa. Gaây nhieãm E. coli vaøo 10g maãu, ñoàng nhaát vôùi 90ml Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn dung dòch pepton vaø uû ôû 37C. Thöïc hieän phaûn öùng PCR treân dòch taêng sinh sau moãi 2 giôø vaø xaùc ñònh thôøi gian taêng sinh toái thieåu taïi thôøi ñieåm keát quaû PCR baét ñaàu döông tính. 2.14. Xaùc ñònh gi ôùi haïn phaùt h ieän Gaây nhieãm E. coli laàn löôït vaøo caùc maãu thöïc phaåm aâm tính ñeå xaùc ñònh giôùi haïn phaùt hieän cuûa phöông phaùp PCR. Khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän ñöôïc thöïc hieän treân 5 maãu thöïc phaåm ñaïi dieän cho caùc nhoùm thòt, rau, söõa, boät vaø tröùng. Maãu ñöôïc gaây nhieãm E. coli ôû 4 maät ñoä trong caùc khoaûng 1 –5, 5 – 10, 10 – 20, 20 – 50 CFU/g. Moãi ñoái töôïng maãu ñöôïc laëp laïi 3 laàn. Qui trình xaùc ñònh giôùi haïn phaùt hieän ñöôïc tieán haønh theo H ình 6. Hình 6. Sô ñoà khaûo saùt g iôùi haïn phaùt hieän E. coli tr ong maãu thö ïc ph aåm g aây nhieãm theo phöông ph aùp tr uyeàn thoáng vaø PCR 2. 15. K ieåm chöùng ñoä laëp laïi Thöïc hieän phaân tích laäp laïi 10 laàn baèng phöông phaùp PCR treân cuøng moät dòch maãu ñaõ xöû lyù, taïi cuøng moät thôøi ñieåm, treân cuøng moät ñieàu kieän vôùi moïi thaønh phaàn cuûa phaûn öùng ñeàu khoâng thay ñoåi. Vieäc khaûo saùt ñöôïc thöïc hieän treân moät dòch maãu aâm tính vaø moät dòch maãu döông tính. 10 g maãu + 90 g SPW Ñoàng nhaát maãu Huùt 10 ml + 90 ml TSB Gaây nhieãm E. coli ôû 4 maät ñoä. UÛ ôû 370C trong 24 giôø Phaùt hieän E. coli baèng phöông phaùp truyeàn thoáng Phaùt hieän E. coli baèng phöôngphaùp PCR Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2.16. Xaùc ñònh c aùc giôùi h aïn oån ñònh cuûa phöô ng p haùp PCR - Khaûo saùt nhieät ñoä baét caëp cuûa moài: tieán haønh khaûo saùt caùc phaûn öùng PCR ôû nhöõng ñieàu kieän nhieät ñoä baét caëp khaùc nhau trong khi vaãn giöõ nguyeân caùc thaønh phaàn phaûn öùng. Caùc nhieät ñoä ñöôïc choïn ñeå khaûo saùt laø 50C , 52C, 55C, 58C, 60C vaø 62C. - Khaûo saùt noàng ñoä Mg2+ trong khoaûng giaù trò 1,0mM, 1,5mM, 2,0mM, 2,5mM, 3,0mM, 3,5mM vaø 4mM. - Khaûo saùt giôùi haïn noàng ñoä moài cho pheùp: trong qui trình ñaõ ñöôïc thieát laäp, noàng ñoä moãi moài trong moät phaûn öùng laø 6pM. Giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä cho pheùp ñöôïc khaûo saùt vôùi caùc noàng ñoä:1,25pM, 2,5pM, 3,75 M, 5pM, 6,25pM, 7,5p vaø 8,75pM trong moät phaûn öùng (25 l). Toång theå tích vaø caùc thaønh phaàn khaùc cuûa phaûn öùng khoâng thay ñoåi. - Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä Taq DNA polymerase cho pheùp: trong qui trình ñaõ ñöôïc thieát laäp, löôïng Taq DNA polymerase ñöôïc söû duïng trong phaûn öùng laø 0,5U/25µl. Do söû duïng vôùi theå tích nhoû neân ñeå deã daøng thao taùc chuùng toâi tieán haønh pha loaõng noàng ñoä Taq polymerase 5 laàn trong ñeäm pha loaõng daønh rieâng cho Taq DNA polymerase. Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä Taq cho pheùp ñöôïc tieán haønh vôùi caùc giaù trò 0,5, 1, 1,5 vaø 2µl/phaûn öùng. 2.17. Xaùc ñònh caùc thoâng soá kyõ thuaät cuûa phöông phaùp PCR so vôùi nuoâi caáy Choïn khoaûng 30 maãu ñaïi dieän cho caùc nhoùm thöïc phaåm khaùc nhau goàm thòt, gia caàm, rau quaû, nguõ coác, söõa, boät... ôû caùc daïng nguyeân lieäu hay ñaõ qua cheá bieán. Kieåm chöùng maãu aâm tính vôùi E. coli. Gaây nhieãm E. coli vôùi maät ñoä töông ñöông giôùi haïn phaùt hieän vaøo 1g maãu aâm tính. Tieán haønh phaân tích ñoàng thôøi baèng hai phöông phaùp nuoâi caáy vaø PCR. Keát quaû phaùt hieän cuûa moãi phöông phaùp seõ ñöôïc toùm taét treân Baûn g 2 ñeå tính toaùn caùc thoâng soá kyõ thuaät cuûa phöông phaùp thay theá. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Baûng 2. Baûng g iaù trò g iaû ñònh söï töông ñoàng keát quaû ph aùt hieän E. coli baèng phöông phaùp nuoâi ca áy vaø PCR Phöông phaùp tham chieáu Phöông phaùp löïa choïn Maãu döông tính Maãu aâm tính Toång keát quaû Maãu döông tính N11 N12 C Maãu aâm tính N21 N22 D Toång keát quaû A B A+ B hay C+D = N Caùc thoâng soá kyõ thuaät töông ñoái cuûa phöông phaùp PCR so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy ñöôïc tính nhö sau: Ñoä chính xaùc töông ñoái: RA% = ( N11 + N22) x 100/ C + D hoaëc A + B Giaù trò döông tính giaû töông ñoái: FP% = N21 x 100/ D Giaù trò aâm tính giaû töông ñoái: FN% = N12 x100/ C Ñoä nhaïy töông ñoái: RS - P(%) = N11 x100/ C Ñoä ñaëc hieäu töông ñoái: RS - N(%) = N22 x100/ D Ñoä khaùc bieät coù yù nghóa cuûa 2 phöông phaùp:  2 = (( { N12 - N21 }) - 1) 2  ( N12 + N21), vôùi baäc töï do df = 1. 2.18. ÖÙng duïng qui trình phaùt h ieän E. coli trong caùc maãu thö ïc ph aåm tr eân thò tröôøng Choïn khoaûng 70 maãu thuoäc nhieàu chuûng loaïi thöïc phaåm khaùc nhau. Moãi maãu laáy ñaïi dieän 10g, ñoàng nhaát vôùi 90g TSB, uû ôû 37oC trong 24 giôø. Canh khuaån sau khi uû ñöôïc tieán haønh phaùt hieän E. coli baèng caû hai phöông phaùp nuoâi caáy vaø phöông phaùp PCR. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn PHAÀN III KEÁT QUAÛ VAØ BIEÄN LUAÄN 1. PHAÂN LAÄP CHUÛNG E. COLI TÖØ MAÃU TH ÖÏC PHAÅM: Ñeå coù nguoàn chuûng E. coli phuïc vuï vieäc xaây döïng qui trình phaùt hieän E. coli vaø ñaùnh giaù hieäu löïc qui trình, beân caïnh hai chuûng E. coli chuaån ñöôïc cung caáp töø Ñaïi hoïc RMIT (UÙc) vaø vieän Pasteur TP. HCM, chuùng toâi ñaõ tieán haønh phaân laäp E. coli töø khoaûng 67 maãu thöïc phaåm khaùc nhau nhö thòt, caù, tröùng, söõa, rau quaû, gia vò vaø saûn phaåm khoâ... theo phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn thoáng. Maãu ñöôïc taêng sinh choïn loïc trong caùc oáng moâi tröôøng BGBL chöùa oáng Durham ôû 440C trong 24 giôø. Caùc oáng moâi tröôøng coù leân men vaø sinh hôi (ñuïc, coù boït khí trong oáng Durham) (Hình 7) ñöôïc duøng ñeå caáy leân caùc ñóa petri chöùa moâi tröôøng EMB nhaèm muïc ñích taùch vaø phaân laäp khuaån laïc ñaëc tröng cuûa E. Coli. Sau 24 giôø uû ôû nhieät ñoä 370C ôû ñóa petri töø caùc maãu chöùa E. coli ñaõ xuaát hieän caùc khuaån laïc maøu ñoû tía, coù aùnh kim, bôø troøn ñeàu vaø ñöôøng kính khoaûng 0,5mm (Hình 8). H ình 7. E. coli tre ân moâi tröôøng BGBL co ù oáng Dur ham 1: Moâi tröôøng ñoái chöùng , 2: Moâi tröôøng sau khi caáy E. coli Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Hình 8. Khuaån laïc E. Coli treân moâi tröôøng EMB 1: Moâi tröôøng ñaái chöùng; 2: Moâi tröôøng coù chöùa khuaån laïc E. Coli Choïn ôû moãi ñóa moät khuaån laïc ñaëc tröng ñeå tieán haønh thöû nghieäm IMViC nhö sau : - Thöû nghieäm Indol döông tính vì xuaát hieän voøng ñoû treân neàn moâi tröôøng canh trypton (Hình 9.1) - Thöû nghieäm Methyl Red döông tính vì maøu canh khuaån trôû neân ñoû(H ình 9.2) - Thöû nghieäm Vosges Proskauer aâm tính vì moâi tröôøng thöû nghieäm maøu vaøng khoâng thay ñoåi ( Hì nh 9.3) - Thöû nghieäm Citrate aâm tính vì moâi tröôøng khoâng chuyeån sang maøu xanh döông (Hình 9. 4). Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Hình 9. Keát quaû thö û nghieäm IMViC cuûa caùc chuûng E.Coli ph aân laäp 1 : Thöû nhghieäm Indol (+) ; 2 : Thöû nghieäm Methyl Red (+) ; 3 : Thöû nghieäm Voges Prokaeur (-) ; 4 : Thöû nghieäm Citrate (-) Taát caû 40 chuûng E. coli ñaõ ñöôïc phaân laäp ñeàu ñöôïc khaúng ñònh laø E. coli baèng phaûn öùng sinh hoaù vaø ñöôïc kieåm tra laïi baèng phaûn öùng PCR. Keát quaû phaân laäp ñöôïc trình baøy ôû Baûng 3. Baûng 3 K eát quaû phaân laäp chuûng E. coli tö ø maãu th öïc ph aåm : STT Teân maãu - Nguoàn goác Phöông phaùp truyeàn thoáng Phöông phaùp PCR Kyù hieäu 1 Chaû caù Chôï Taân Phuù + + E. coli 1 2 Gan heo + + E. coli 2 3 Thòt gaø + + E. coli 3 4 Caù côm Chôï Thuû Ñöùc + + E. coli 4 5 Caù roâ + + E. coli 5 6 Caù treâ + + E. coli 6 7 Chaû luïa + + E. coli 7 8 Caù loøng tong + + E. coli 8 9 Soø luïa + + E.coli 9 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 10 Baïch tuoäc Chôï Baøo Sen + + E. coli 10 11 Soø loâng + + E. coli 11 12 Caù soøng + + E. coli 12 13 Caù nuïc + + E. coli 13 14 Teùp + + E. coli 14 15 Môõ heo + + E. coli 15 16 Caù höôøng + + E. coli 16 17 Caù thu Chôï Taân Phuù + + E. coli 17 18 OÁc böôu Traïm 2 Caàu Vöôït + + E. coli 18 19 Caù chieâm + + E. coli 19 20 Caù lìm kìm + + E .coli 20 21 Caù baïc maù + + E. coli 21 22 Caù ñieâu hoàng + + E. coli 22 23 Thòt heo Sieâu thò Ñaàm Sen + + E. coli 23 24 Thòt gaø + + E. coli 24 25 Thòt boø + + E. coli 25 26 Pate Chôï Thuû Ñöùc + + E. coli 26 27 Döa leo + + E. coli 27 28 Caø roát + + E. coli 28 29 Chaø boâng + + E.coli 29 30 Baùnh mì + + E. coli 30 31 Ñaäu huû + + E. coli 31 32 Ñaäu que + + E. coli 32 33 Khoùm + + E. coli 33 34 Chuoái + + E. coli 34 35 Sapo + + E. coli 35 36 Khoai cao + + E .coli 36 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 37 Mì + + E. coli 37 38 Khoâ möïc Chôï Nancy + + E. coli 38 39 Khoâ boø + + E. coli 39 40 Nho Traïm 2 Caàu Vöôït + + E. coli 40 Trong quaù trình phaân laäp chuùng toâi nhaän thaáy E. coli hieän dieän nhieàu trong caùc maãu thöïc phaåm töôi soáng vaø caùc maãu chöa qua khöû truøng ñoùng goùi, phaàn ngoaøi cuûa khoái maãu thöôøng chöùa nhieàu E. coli hôn phaàn trong caùc maãu ñaõ khöû truøng, gia nhieät thì ít bò nhieãm E. coli . 2. THIEÁT LAÄP QUI TRÌNH PCR PHAÙT HIEÄN E. COLI BAÈNG CHUÛNG CHUAÅN 2.1. Thô øi gian xöû l yù nhieät trích khuoân DNA Caùc khaûo saùt tröôùc ñaây cho thaáy coù theå ñun caùch thuûy ñeå phaù teá baøo giaûi phoùng DNA duøng laøm khuoân cho phaûn öùng PCR. Ñeå xaùc ñònh thôøi gian xöû lyù toát nhaát chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt xöû lyù baèng nhieät ôû caùc thôøi gian khaùc nhau trong khoaûng 10 – 40 phuùt. Dòch sau khi xöû lyù ñöôïc duøng laøm khuoân ñeå thöïc hieän phaûn öùng PCR. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû Hình10. Hình 10. Keát quaû khaûo saùt th ôøi gian ñun caùch th uûy ñeå phaù vôõ teá baøo giaûi p hoùng DNA boä gen vi khuaån 1: Vaïch 299bp chuaån; 2: 10 phuùt ;3: 20phuùt; 4: 30 phuùt; 5: 40 phuùt 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Keát quaû ñieän di cho thaáy töø gieáng 2 ñeán gieáng 6, phaûn öùng PCR cho saûn phaåm khueách ñaïi coù ñoä daøi baèng vôùi saûn phaåm chuaån ôû taát caû caùc tröôøng hôïp xöû lyù dòch teá baøo baèng nhieät phaùp xöû lyù baèng nhieät. ÔÛ caùc khoaûng thôøi gian xöû lyù nhieät khaùc nhau ñeàu cho tín hieäu ñaïi roõ neùt do vaäy ñeå tieát kieäm thôøi gian chuùng toâi choïn thôøi gian xöû lyù ñeå phaù vôõ teá baøo giaûi phoùng khuoân DNA laø 10 phuùt. 2.2. Khaû naêng khueác h ñaïi cuûa caëp moài EC Khi thöïc hieän phaûn öùng khueách ñaïi vôùi caëp moài EC cho 6 chuûng E. coli coù nguoàn goác khaùc nhau, keát quaû ñieän di cho thaáy caùc gieáng coù caùc vaïch vôùi kích thöôùc 299bp. Nhö vaäy caëp moài EC coù khaû naêng khueách ñaïi ñoaïn DNA ñuùng kích thöôùc 299pb (Hình 11). H ình 11. K haû naêng khueác h ñaïi cuûa ca ëp moài EC 1: Thang 100pb chuaån ; 2, 3, 4, 5, 6, 7 caùc chuûng E. coli khaùc nhau 2.3. Khaûo saùt tính ch uyeân bieät c uûa caëp moài EC Tính chuyeân bieät cuûa phöông phaùp PCR trong phaùt hieän E. coli chính laø tính chuyeân bieät cuûa caëp moài EC ñaõ ñöôïc thieát laäp. Ñeå khaûo saùt tính chuyeân bieät cuûa caëp moài EC, chuùng toâi tieán Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn haønh thí nghieäm treân 6 chuûng E. coli coù nguoàn goác khaùc nhau vaø 9 chuûng vi sinh vaät khaùc. Caùc chuûng vi sinh vaät naøy ñöôïc nhaän töø Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Sinh hoïc phaân töû, Tröôøng ÑH Khoa hoïc töï nhieân, Ñaïi hoïc Quoác gia Tp Hoà Chí Minh, Ñaïi hoïc RMIT (UÙc) vaø Vieän Pasteur Tp Hoà Chí Minh. Keát quaû ñöôïc trình baøy treân Baûng 4 vaø Hình 12. Hì nh 12. K eát quaû khaûo saùt tính chuyeân bieät cuûa ca ëp moài EC 1: Thang 100bp; 2, 3, 4, 5, 6, 7 chuûng E. coli; 8: Salmonella typhimurinum; 9: Listeria monocytogenes; 10: Virio cholerae; 11: Virio parahaemotylicus; 12: Bacielus cereus; 13: Staphylococus aureus; 14: Shigella sonnei; 15: Clostridium botulinum; 16: Clostridium perfringens. Baûng 4. Keát quaû khaûo sa ùt chuyeân bieät cuûa phö ông phaùp PCR phaùt hieän E. Coli STT Teân chuûng Nguoàn goác Soá chuûng Soá keát quaû döông tính 1 Escherichi coli RMIT, UÙc 2 2 2 Escherichia coli Vieän Pasteur TP HCM 1 1 3 Escherichia coli Phaân laäp töø thöïc phaåm 3 3 4 Salmonella typhimurinum TTKHCNSH 1 0 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 5 Listeria monocytogenes TTKHCNSH 1 0 6 Vibrio cholerae TTKHCNSH 1 0 7 Vibrio parahaemolyticus TTKHCNSH 1 0 8 Bacilus cereus TTKHCNSH 1 0 9 Staphylococus aureus TTKHCNSH 1 0 10 Shigella sonnei TTKHCNSH 1 0 11 Clostridium botulinum TTKHCNSH 1 0 12 Clostridium perfringens TTKHCNSH 1 0 Keát quaû khaûo saùt cho thaáy phaûn öùng PCR vôùi caëp moài EC chæ cho saûn phaåm khueách ñaïi coù ñoä daøi 299 bp treân caùc chuûng E. coli; caùc vi sinh vaät khaùc ñeàu cho keát quaû aâm tính vôùi caëp moài naøy. Nhö vaäy coù theå keát luaän caëp moài EC laø ñaëc tröng cho E. coli chæ cho saûn phaåm khueách ñaïi 299 bp vôùi caùc chuûng E. coli. 2.4. Caùc ñieàu kieän toái öu c uûa p haûn ö ùng PCR - Nhieät ñoä baét caëp giöõa moài vaø khuoân: nhieät ñoä baét caëp giöõa moài vaø khuoân laø yeáu toá quan troïng quyeát ñònh keát quaû PCR. Keát quaû khaûo saùt cho thaáy tröø tröôøng hôïp nhieät ñoä 67oC, caùc tröôøng hôïp 50 -62C phaûn öùng ñeàu cho saûn phaåm khueách ñaïi 299pb nhöng keát quaû 58C cho keát quaû toát nhaát (gieáng 5). Nhö vaäy 58C ñöôïc xem laø nhieät ñoä toái öu cho moài baét caëp vaø khuoân (Hình 13). Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn H ình 13. Nhieät ñoä baét c aëp giöõa moài vaø khuoân toái öu cuûa phaûn öùng PCR 1: Vaïch chuaån; 2: 500C; 3: 53C; 4: 55C; 5: 58C ,6: 62C; 7: 67C - Noàng ñoä moài: khaûo saùt noàng ñoä moài nhaèm muïc ñích toái öu hoaù haøm löôïng moài EC trong phaûn öùng PCR. Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt ôû caùc noàng ñoä moài khaùc nhau laø 5,5; 6 vaø 6,5pM/phaûn öùng cho moãi moài. Keát quaû ñöôïc theå hieän treân Hình 14. H ình 14. Khaûo saùt noàng ñoä moài toái öu c uûa ph aûn öùng PCR 1: Vaïch chuaån; 2: 5,5pM; 3: 3: 6pM; 4: 6,5pM Keát quaû treân cho thaáy noàng ñoä moài töø 5,5 – 6,5 ñeàu cho tín hieäu khueách ñaïi. Tuy nhieân tính hieäu khueách ñaïi roõ nhaát ôû vaïch 6pM (gieáng 3). Do ñoù chuùng toâi choïn noàng ñoä moài 6pM/phaûn öùng laø noàng ñoä moài thích hôïp nhaát cho phaûn öùng PCR. 299bp 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Noàng ñoä Mg2+: ion Mg2+ coù taùc duïng taêng cöôøng aùi löïc giöõa moài vaø khuoân DNA ñoàng thôøi giuùp cho Taq DNA polymerase gaén dNTP vaøo moài trong giai ñoaïn keùo daøi. Vì vaäy neáu haøm löôïng Mg2+ trong phaûn öùng quaù cao seõ khoâng cho saûn phaåm khueách ñaïi hay saûn phaåm khueách ñaïi khoâng ñaëc hieäu. Ngöôïc laïi, neáu haøm löôïng ion naøy quaù thaáp seõ khoâng cho hay cho quaù ít saûn phaåm khueách ñaïi, khoâng theå phaùt hieän ñöôïc khi ñieän di. Trong khaûo saùt naøy, chuùng toâi tieán haønh thay ñoåi haøm löôïng ion Mg2+ dao ñoäng trong khoaûng 2 - 4mM trong moät phaûn öùng. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän treân Hình 15. Hình 15. Noàng ñoä Mg 2+ toái öu c uûa phaûn öùng PCR 1: Vaïch chuaån; 2: 2mM; 3: 2,5mM; 4: 3mM; 5: 3,5mM; 6: 4mM Keát quaû treân Hình 15 cho thaáy ôû taát caû caùc phaûn öùng PCR ñeàu cho saûn phaåm khueách ñaïi. Tuy nhieân saûn phaåm khueách ñaïi toát nhaát khi thöïc hieän vôùi noàng ñoä Mg2+ laø 3mM/phaûn öùng. Ñaây ñöôïc xem laø noàng ñoä toái öu cho phaûn öùng PCR. Tuy nhieân ñeå ñoàng nhaát vôùi caùc qui trình phaùt hieän vi sinh vaät trong thöïc phaåm baèng PCR chuùng toâi choïn noàng ñoä Mg2+ laø 2,5mM ñeå thieát laäp qui trình phaùt hieän E. coli. Töø caùc keát quaû khaûo saùt caùc ñieàu kieän toái öu cuûa phaûn öùng PCR neâu treân chuùng toâi choïn ñieàu kieän toái öu cuûa phaûn öùng PCR nhö sau: Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Chöông trình cuûa phaûn öùng khueách ñaïi ñöôïc thieát laäp vôùi 35 chu kyø goàm 95C trong 1 phuùt, 58C trong 45 giaây, 72C trong 1 phuùt. - Noàng ñoä moãi moài EC laø 6pmol - Noàng ñoä Mg2+ thích hôïp laø 2,5mM - Noàng ñoä Taq thích hôïp laø 0,5l 2.5. Thô øi gian taêng sinh c aàn thieát ñeå ph aùt hieän E. coli tr ong th öïc ph aåm Ñeå thieát laäp qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm, chuùng toâi thöïc hieän phaûn öùng PCR treân caùc maãu thöïc phaåm caù, pate vaø söõa ñöôïc gaây nhieãm E. coli vôùi maät ñoä khoaûng 10CFU/10g. Nuoâi taêng sinh trong tuû aám ôû 37C trong 24 giôø. Sau moãi 2 giôø laáy 1ml dòch nuoâi caáy ly taâm thu sinh khoái vaø huyeàn phuø hoùa trong TE, xöû lyù nhieät vaø thöïc hieän phaûn öùng PCR. Caùc thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 3 laàn. Keát quaû ôû Baûng 5 cho thaáy ôû maãu söõa sau 12 giôø taêng sinh ñaõ coù theå phaùt hieän E. coli baèng PCR. Tröôøng hôïp maãu pate thì caàn 16 giôø taêng sinh. Tröôøng hôïp caù gaây nhieãm E.coli caàn ñeán 20 giôø môùi phaùt hieän ñöôïc E.coli. Do vaäy, chuùng toâi choïn thôøi gian taêng sinh toái thieåu treân moâi tröôøng TSB laø 20 giôø. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Baûng 5. Thôøi gian taêng sinh toái thieåu ñeå p haùt hieän E. coli tr ong caùc maãu th öïc phaåm bò g aây nhieãm. Thôøi gian taêng sinh (giôø) Keát quaû phaûn öùng PCR Caù Pate Söõa 4 - - - 6 - - - 8 - - - 10 - - - 12 - - + 14 - - + 16 - + + 18 - + + 20 + + + 24 + + + Kyù hieäu : +, phaûn öùng PCR döông tính -, phaûn öùng PCR aâm tính 2.6. Xaùc ñònh ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR Ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR ôû ñaây ñöôïc xaùc ñònh baèng soá teá baøo E. coli toái thieåu coù trong moät phaûn öùng maø phöông phaùp PCR coù theå phaùt hieän ñöôïc. Trong khaûo saùt naøy, chuùng toâi tieán haønh pha loaõng baäc 10 dòch teá baøo E. coli ñöôïc taêng sinh trong moâi tröôøng TSB qua ñeâm baèng dung dòch NaCl 0,85% sao cho coù maät ñoä töø 9 x 101 – 9 x 105 CFU/ml. Dòch teá baøo naøy ñöôïc duøng ñeå xöû lyù nhieät, ñeå thu DNA duøng cho phaûn öùng PCR. Ba ûng 6 vaø Hình 16 trình baøy keát quaû xaùc ñònh ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR. Baûng 6. K eát quaû phaùt h ieän E. coli baèng phöông phaùp PCR ôû c aùc maät ñoä khaùc nhau Maät ñoä Ñoä pha loaõng Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 10 -1 10-2 10-3 10-4 10-5 CFU /ml 9. 105 9. 104 9.103 9.102 9.101 CFU / phaûn öùng 3. 102 3. 101 3. 100 3. 10-1 3. 10-2 Keát quaû PCR + + + _ _ H ình 16. Ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng PCR 1: Thang DNA ; 2: Vaïch chuaån 299bp; 3: 9 x 105 CFU/ml; 4: 9 x 104 CFU/ml; 5: 9 x103 CFU/ml; 6: 9 x 102 CFU/ml; 7: 9 x 101CFU/ml 2.7. Quy trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm baèng phöông phaùp PCR Caên cöù vaøo keát quaû cuûa caùc thí nghieäm treân, chuùng toâi ñeà nghò qui trình PCR ñeå phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm nhö sau: - Chuaån bò maãu: Caân 10 g thöïc phaåm vaøo bao PE voâ truøng, boå sung 90g Buffered Pepton Water, ñoàng nhaát vaø uû trong tuû aám ôû 370C trong 20 giôø. Huùt 1ml dung dòch sau khi taêng sinh vaøo eppendorf, ly taâm vôùi toác ñoä 10.000 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Loaïi dòch trong beân treân, röûa caën teá baøo baèng 1ml nöôùc caát voâ truøng. Ly taâm ñeå loaïi boû phaàn nöôùc. Huyeàn phuø hoùa sinh khoái teá baøo trong 299bp Baûng 6 vaø Hình 16 cho thaáy phaûn öùng PCR cho pheùp phaùt hieän E. coli ôû maät ñoä 9 x 103 CFU/ml hay 3CFU/ phaûn öùng PCR. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn eppendorf vôùi 0,2ml TE, ñun soâi caùch thuûy trong 10 phuùt. Ly taâm vôùi toác ñoä 10000 voøng/phuùt trong 5 phuùt ñeå loaïi boû caùc maõnh vôõ teá baøo. Phaàn dòch beân treân ñöôïc duøng laøm khuoân DNA cho phaûn öùng PCR. - Thaønh phaàn cuûa 25l phaûn öùng PCR : Ñeäm duøng cho phaûn öùng PCR ( 10X) 2,5µl dNTP 100µl 2,5µl MgCl2 (25mM) 2,5µl Moài EC 1 (6pM) 1,0 µl Moài EC 2 (6pM) 1,0 µl Taq polymerase 1U 0,5µl DNA khuoân 3,0µl Nöôùc caát 12,0µl - Chöông trình cuûa phaûn öùng khueách ñaïi: bieán tính DNA ôû 95C trong 5 phuùt; phaûn öùng PCR goàm 35 chu kyø, moãi chu kyø goàm 3 böôùc bieán tính ôû 95C trong 1 phuùt, baét caëp cuûa moài vôùi DNA khuoân ôû 58C trong 45 giaây, keùo daøi ôû 72C trong 1 phuùt. Sau phaûn öùng maãu ñöôïc giöõ ôû 72C trong 10 phuùt ñeå cho caùc ñoaïn DNA chöa toång hôïp hoaøn chænh seõ tieáp tuïc ñöôïc toång hôïp ñeå hoaøn taát chieàu daøi cuûa chuùng. Maãu ñöôïc giöõ oån ñònh ôû 4C trong 30 phuùt tröôùc khi keát thuùc. - Phaân tích saûn phaåm khueách ñaïi: saûn phaåm sau khueách ñaïi ñöôïc ñieän di treân gel agarose 1,5% ôû ñieän theá 100V trong 45 phuùt. Sau ñieän di gel ñöôïc nhuoäm trong dung dòch ethidium bromide trong 10 phuùt, röûa laïi baèng nöôùc roài quan saùt saûn phaåm khueách ñaïi treân hoäp ñeøn soi UV coù böôùc soùng 312nm. - Dieãn giaûi keát quaû: + Neáu xuaát hieän vaïch töông ñöông vôùi 299bp thì keát luaän laø döông tính (+) + Neáu khoâng xuaát hieän vaïch hoaëc vaïch coù kích thöôùc khoâng phaûi 299bp keát luaän laø aâm tính (-). Thôøi gian cho toaøn boä qui trình khoaûng 24 giôø (bao goàm khoaûng 20 giôø taêng sinh vaø 4 giôø thöïc hieän phaûn öùng PCR) tính töø luùc nhaän maãu cho ñeán luùc traû lôøi keát quaû. Caùc böôùc cuûa qui trình phaùt hieän E. coli döôïc toùm taét treân Hì nh 17 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Ñoàng nhaát UÛ ôû 370C trong 20 giôø Laáy 1ml cho vaøo eppendorf, li taâm 10.000 voøng/phuùt Loaïi boû phaàn nöôùc. Röûa sinh khoái teá baøo vôùi 1ml nöôùc caát voâ truøng Li taâm 10.000 voøng/phuùt , thu nhaän sinh khoái Huyeàn phuø hoùa sinh khoái vaøo 0,2 ml TE. Ñun soâi caùch thuûy trong 10 phuùt Li taâm 10000 voøng/phuùt, thu laáy phaàn dòch phía treân Phaûn öùng PCR trong 35 chu kyø vôùi caùc böôùc 95C trong 1 phuùt, 55C trong 45 giaây, 72C trong 1phuùt Phaân tích keát quaû treân gel agarose 1,5% Dieãn giaûi keát quaû Hình 17. Toùm taét qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm baèng PCR Maãu thöïc phaåm 10 g + 90g BPW Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 3. XAÙC NH AÄN H IEÄU LÖÏC PHÖÔNG PHAÙP 3.1. Giôùi h aïn pha ùt hieän Giôùi haïn phaùt hieän laø maät ñoä teá baøo thaáp nhaát cuûa vi sinh vaät muïc tieâu maø phöông phaùp coù khaû naêng phaùt hieän ñöôïc trong maãu so vôùi phöông phaùp chuaån. Giôùi haïn phaùt hieän laø thoâng soá quan troïng quyeát ñònh phöông phaùp ñöôïc thieát laäp coù ñaùp öùng ñöôïc yeâu caàu thöïc teá hay khoâng. Trong luaän vaên naøy giôùi haïn phaùt hieän cuûa qui trình phaùt hieän E. coli trong thöïc phaåm ñöôïc khaûo saùt treân 4 chuûng E. coli coù nguoàn goác khaùc nhau, moãi chuûng ñöôïc thöïc hieän treân 5 maãu ñaïi dieän cho 5 nhoùm thöïc phaåm. Moãi loaïi maãu ñöôïc gaây nhieãm vôùi caùc maät ñoä E. coli 3CFU, 8CFU, 15CFU vaø 36CFU/g maãu vaø laëp laïi 2 laàn. Tieán haønh phaân tích caùc maãu ñaõ gaây nhieãm baèng 2 phöông phaùp PCR vaø nuoâi caáy. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû Baûng 7 vaø H ình 18 Baûng 7. K eát quaû khaûo saùt giô ùi haïn phaùt hieän c uûa q uy tr ình PCR xeùt nghieäm E. coli trong thöïc phaåm Laàn Maät ñoä gaây nhieãm (CFU/g) Phöông phaùp Maãu gaây nhieãm Thòt Caù Baùnh Söõa töôi Caø chua 1 0 Nuoâi caáy _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ 3 Nuoâi caáy + + - + + PCR + + - + + 8 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 15 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 36 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 0 Nuoâi caáy _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ 3 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 8 Nuoâi caáy + + + + + Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 2 PCR + + + + + 15 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + 36 Nuoâi caáy + + + + + PCR + + + + + ÔÛ maät ñoä gaây nhieãm 3CFU/g maãu thì caû hai phöông phaùp ñeàu cho keát quaû döông tính ôû 4 loaïi maãu. Maãu baùnh boâng lan gaây nhieãm laàn 1 cho keát quaû aâm tính ôû caû hai phöông phaùp nhöng laàn 2 cho keát quaû döông tính, coù leõ do laàn 1 vieäc gaây nhieãm khoâng thaønh coâng. Nhö vaäy giôùi haïn phaùt hieän naøy laø 3CFU/g maãu thöïc phaåm sau khi qua böôùc taêng sinh trong moâi tröôøng TSB ôû 37C trong 20 giôø. Tuy giôùi haïn phaùt hieän cuûa 2 phöông phaùp laø töông ñöông nhau nhöng roõ raøng phöông phaùp PCR coù hieäu quaû hôn so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy vì coù thôøi gian phaùt hieän ngaén hôn, chæ sau khoaûng 24 giôø keå töø khi phaân tích. Trong khi ñoù phöông phaùp nuoâi caáy cho keát quaû sau ít nhaát 3 ngaøy. Hình 18. Keát quaû ñieän di khaûo saùt g iôùi haïn pha ùt hieän c uûa quy tr ình PCR xeùt nghieäm E. coli tr ong th öïc phaåm 1: Thang 100bp; 2, 3, 4 ,5, 6: maãu thòt, caù, baùnh, söõa vaø caø chua gaây nhieãm ôû maät ñoä 3CFU/g; 7, 8, 9,10, 11: maãu thòt, caù, baùnh, söõa vaø caø chua gaây nhieãm ôû maät ñoä 8CF/g 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 3.2. Xaùc ñònh ca ùc thoâng soá kó thuaät tö ông ñoái cuûa p höông phaùp PCR so v ôùi phöô ng phaùp nuoâi ca áy Ñeå ñaùnh giaù caùc thoâng soá kó thuaät cuûa phöông phaùp PCR so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy chuùng toâi tieán haønh choïn caùc maãu ñaïi dieän cho caùc nhoùm thöïc phaåm khaùc nhau. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh treân 66 maãu, trong ñoù coù 33 maãu ñöôïc gaây nhieãm E. coli vôùi maät ñoä 3 CFU/g maãu (caùc maãu naøy tröôùc khi gaây nhieãm ñaõ ñöôïc khaúng ñònh laø aâm tính vôùi E. coli). Taát caû caùc maãu treân ñöôïc phaân tích ñoàng thôøi baèng 2 phöông phaùp nuoâi caáy vaø PCR. Keát quaû phaân tích ñöôïc trình baøy treân Baûng 8. Baûng 8. Keát quaû phaân tích E. coli treân caùc loaïi maãu thöïc phaåm coù vaø khoâng gaây nhieãm E. coli baèng phöông phaùp truyeàn thoáng vaø phöông phaùp PCR STT Teân maãu Maãu gaây nhieãm Maãu khoâng gaây nhieãm PCR Nuoâi caáy PCR Nuoâi caáy 1 Xuùc xích toâm + + _ _ 2 Xuùc xích heo + + _ _ 3 Xuùc xích boø + + _ _ 4 Heo 2 laùt + + _ _ 5 Thòt boø hoäp + + _ _ 6 Thòt gaø haàm + + _ _ 7 Caù vieân + + _ _ 8 Khoâ möïc + + _ _ 9 Caù basa + + _ _ 10 Caù trích soát caø + + _ _ 11 Chaû luïa + + _ _ 12 Caù ngöø soát caø + + _ _ 13 Naám rôm + + _ _ 14 Xaø laùch son + + _ _ 15 Caûi ngoït + + _ _ 16 Ñaäu que + + _ _ Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 17 Rau deàn + + _ _ 18 Chuoái + + _ _ 19 Ñaäu huû + + _ _ 20 Söõa töôi + + _ _ 21 Söõa ñaëc + + _ _ 22 Söõa chua + + _ _ 23 Bô + + _ _ 24 Caø pheâ söõa + + _ _ 25 Phomai + + _ _ 26 Baùnh boâng lan + + _ _ 27 Baùnh AFC + + _ _ 28 Nöôùc cam + + _ _ 29 Nho + + _ _ 30 Tröùng gaø + + _ _ 31 Tröùng vòt + + _ _ 32 Tröùng cuùt + + _ _ 33 Caø chua + + _ _ Töø keát quaû treân Baûng 8 coù theå toùm taét söï töông quan giöõa caùc keát quaû phaân tích baèng phöông phaùp PCR vaø phöông phaùp nuoâi caáy nhö Baûng 9. Baûng 9. Söï töông qua giöõa caùc keát quaû phaân tích baèng phöông phaùp nuoâi caáy vaø PCR Phöông phaùp nuoâi caáy Phöông phaùp PCR Maãu döông tính Maãu aâm tính Toång Maãu döông tính N11 = 33 N12 = 0 C = N11 + N12 = 33 Maãu aâm tính N21 = 0 N22 = 33 D = N21 +N22 =33 Toång keát quaû A = N11 + N21 = 33 B = N12 + N22 = 33 N = 66 Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Töø caùc döõ kieän treân Baûng 9, caùc thoâng soá kó thuaät töông ñoái giöõa phöông phaùp PCR vaø phöông phaùp nuoâi caáy coù theå ñöôïc tính nhö sau: - Ñoä chính xaùc töông ñoái: RA (%) = ( N11 + N22) x 100 / N = ( 33 + 33) x 100 / 66 = 100% - Tæ leä döông tính giaû: FP (%) = N21 x 100 / D = 0 x 100 / 33 = 0% - Tæ leä aâm tính giaû: FN (%) = N12 x 100 / D = 0 x 100 / 33 = 0% - Ñoä nhaïy töông ñoái : RS-P (%) = N11 x 100 / C = 33 x 100 / 33 = 100% - Ñoä ñaëc hieäu töông ñoái: RS-N (%) = N22 x 100 / D = 33 x 100 / 33 = 100% - Ñoä khaùc bieät coù yù nghóa cuûa 2 phöông phaùp :  2 = ((N12 - N21) - 1) 2/ ( N12 + N21) vôùi baäc töï do df = 1  2 = (( 0 - 0 ) - 1 )2 / ( 0 - 0 ) =  Caùc thoâng soá treân cho thaáy phöông phaùp PCR ñeå phaùt hieän E. coli coù keát quaû ñaùng tin caäy vôùi ñoä nhaïy töông ñoái laø RS = 100% thoõa maõn giôùi haïn chaáp nhaän cuûa tieâu chuaån AOAC vaø Nordl ( RS  95%). Khoâng coù tröôøng hôïp aâm tính giaû vaø döông tính giaû ñoái vôùi 33 maãu gaây nhieãm. Giaù trò cuûa caùc thoâng soá khaùc nhö ñoä ñaëc hieäu töông ñoái, ñoä chính xaùc töông ñoái ñeàu ñaït 100% vaø giaù trò  2 =  > 3,84 cho thaáy khoâng coù söï khaùc bieät khi phaân tích E. coli trong thöïc phaåm baèng phöông phaùp PCR hay nuoâi caáy. Noùi caùch khaùc keát quaû phaân tích E. coli baèng phöông phaùp nuoâi caáy vaø phöông phaùp PCR laø töông ñöông nhau. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 3.3. Ñaùnh giaù ñoä laëp laïi Muïc ñích cuûa khaûo saùt naøy ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä oån ñònh cuûa phöông phaùp trong thao taùc thöïc hieän qui trình phaân tích. Thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 10 laàn treân moät dòch maãu ñaõ xöû lyù vôùi cuøng moät ñieàu kieän, thaønh phaàn phaûn öùng, taïi cuøng moät thôøi ñieåm. Keát quaû ñöôïc theå hieän ôû Hì nh 19. Hình 19. Keát q uaû ñieän di khaûo saùt ñoä laëp laïi cuûa phaûn öùng PCR 1: Thang 100bp, 2: Vaïch chuaån 299bp; 3-12: saûn phaåm khueách ñaïi E. coli trong 10 laàn laëp laïi. Keát quaû treân cho thaáy taát caû caùc laàn laëp laïi ñeàu cho keát quaû döông tính. Nhö vaäy coù theå keát luaän raèng phöông phaùp PCR coù tính oån ñònh cao, deã daøng thao taùc. Keát quaû naøy seõ taïo thuaän lôïi cho vieäc trieån khai phöông phaùp PCR ñeán caùc phoøng thí nghieäm khaùc. 3.4. Ñaùnh giaù ñoä oån ñònh - Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng nhieät ñoä baét caëp cho pheùp: ñeå xaùc ñònh giôùi haïn dao ñoäng nhieät ñoä baét caëp cho phaûn öùng PCR, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt ôû caùc nhieät ñoä laø 50oC, 52oC, 55oC, 58oC, 60oC vaø 62oC. Keát quaû ñöôïc theå hieän treân Baûng 10 vaø Hình 20. 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Baûng 10. Gi ôùi haïn dao ñoäng cuûa nhieät ñoä baét caëp ch o ph eùp tr ong pha ûn öùng PCR Hình 20. Keát q uaû ñieän di khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng nhieät ñoä baét caëp cho pheùp cuûa phaûn öùng PCR 1: Vaïch 299bp chuaån; 2: 50, C; 3: 52C; 4: 55C; 5: 58C; 6: 60C ;7: 62C Keát quaû treân cho thaáy ôû nhieät ñoä 50C, 52C, 55, 58C, 60C vaø 62C ñeàu coùtín hieäu khueách ñaïi.Vì vaäy dao ñoäng nhieät ñoä baét caëp cho pheùp trong phaûn öùng PCR ñeå phaùt hieän E. coli laø 50 - 62C. Nhieät ñoä 500C 520C 550C 580C 600C 620C Keát quaû PCR + + + + + + 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn - Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä Mg2+ cho pheùp: chuùng toâi tieán haønh phaûn öùng PCR vôùi caùc noàng ñoä Mg2+ laø 1 – 4mM. Caùc thaønh phaàn khaùc cuûa phaûn öùng khoâng thay ñoåi. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc trình baøy ôû Baûng 11 vaø H ình 21. Baûng 11. Giôùi haïn dao ñoäng c ho p heùp c uûa noàng ñoä Mg 2+ tr ong phaûn öùng PCR Noàng ñoä Mg2+ (mM) 1 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4 Keát quaû PCR + + + + + + + Hình 21. Ke át quaû ñieän di khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng ch o ph eùp c uûa noàng ñoä Mg2+ tr ong phaûn öùng PCR 1:Vaïch 299 bp chuaån; 2: 1mM Mg2+; 3:1,5mM Mg2+; 4: 2,0mM Mg2+; 5: 2,5mM Mg2; 6: 3mM Mg2+; 7: 3,5mM Mg2+; 8: 4,0mMg2+ Keát quaû treân Hình 21 cho thaáy noàng ñoä Mg2+ töø 1mM ñeán 4mM ñeàu cho keát quaû khueách ñaïi döông tính. Nhö vaäy noàng ñoä Mg2+ dao ñoäng cho pheùp trong khoaûng töø 1- 4mM. - Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng noàng ñoä moài cho pheùp : Noàng ñoä moài trong moät phaûn öùng quyeát ñònh soá löôïng baûn sao cuûa DNA muïc tieâu trong quaù trình khueách ñaïi. Noàng ñoä moài quaù cao seõ cho saûn phaåm khueách ñaïi khoâng ñaëc hieäu, ngöôïc laïi noàng ñoä moài quaù thaáp seõ cho ít saûn phaåm khueách ñaïi, khoù phaùt hieän trong quaù trình ñieän di, deã gaây neân keát quaû aâm tính giaû. Trong khaûo saùt naøy chuùng toâi thay ñoåi noàng ñoä moài cho moät phaûn öùng trong khoaûng 1,25 -10 pmol. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc trình baøy treân Baûng 12 vaø Hình 22. Baûng 12. Giôùi haïn dao ñoäng cho pheùp cuûa noàng ñoä moài tr ong phaûn öùng PCR Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn VMoài/pö(pM) 0,2 0,41 0,63 0,83 1 1,5 1,7 Noàng ñoä moài 1,25pM 2,5pM 3,75pM 5pM 6,25pM 7,5pM 8,75pM KQ PCR - + + + + - - Keát quaû ôû Baûng 12 v aø Hình 22 cho thaáy noàng ñoä moài 1,25pM, 7,5pM vaø 8,75pM khoâng cho saûn phaåm khueách ñaïi. Caùc noàng ñoä töø 2,5 – 6,25 ñeàu cho saûn phaåm khueách ñaïi. Vaäy giôùi haïn dao ñoäng cho pheùp cuûa noàng ñoä moài laø 2,5pM – 6,25 ñeå phaùt hieän E. coli baèng phöông phaùp PCR. H ình 22. K eát quaû ñieän di khaûo saùt g iôùi haïn dao ñoäng c ho p heùp c uûa noàng ñoä moài tro ng p haûn öùng PCR 1:Vaïch 299 bp chuaån; 2: 1,25pM; 3: 2,5pM; 4: 3,75pM; 5: 5pM; 6: 6,25pm; 7: 7,5pM; 8: 8,75pM. - Khaûo saùt giôùi haïn dao ñoäng cho pheùp cuûa noàng ñoä Taq: Taq DNA polymerase laø thaønh phaàn khoâng theå thieáu cuûa phaûn öùng khueách ñaïi nhöng ñöôïc söû duïng vôùi haøm löôïng raát nhoû neân söï sai soá do duïng cuï kó naêng thao taùc laø khoù traùnh khoûi. Ñeå ñaùnh giaù giôùi haïn sai soá cho pheùp veà noàng ñoä enzym naøy trong phaûn öùng chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt caùc noàng ñoä dao ñoäng trong khoaûng 0,5 - 2,0l/ phaûn öùng. Keát quaû ñöôïc trình baøy trong Baûng 13 vaø Hình 23. Baûng 13. Giôùi haïn dao ñoäng cho pheùp cuûa noàng ñoä Taq trong phaûn öùng PCR Theå tích Taq DNA polymerase 1U ( l) 0,5 1,0 1,5 2,0 Keát quaû PCR + + + + 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Hình 23. Ke át quaû ñieän di khaûo saùt giô ùi haïn dao ñoäng ch o ph eùp c uûa noàng ñoä Taq DNA polymerase 1: Vaïch 299bp chuaån ; 2: 0,5U Taq; 3: 1,0U Taq; 4: 1,5U Taq; 5 : 2,0U Taq Keát quaû treân Baûng 12 vaø H ình 23 cho thaáy noàng ñoä enzym Taq polymerase trong moät phaûn öùng thay ñoåi 0,5 - 2,0l töông öùng vôùi 1 - 4U maø khoâng aûnh höôûng ñeán keát quaû khueách ñaïi. Caùc keát quaû phaân tích ñoä oån ñònh cuûa phaûn öùng PCR ñeå phaùt hieän E. coli baèng caëp moài EC theo quy trình ñaõ ñöôïc thieát laäp cho thaáy, quy trình vaø phaûn öùng naøy raát oån ñònh, cho pheùp caùc dao ñoäng khaù lôùn do thao taùc khi phoái troän caùc thaønh phaàn phaûn öùng. 4. ÖÙNG DUÏNG QUI TRÌNH PCR PHAÙT HIEÄN E. COLI TREÂN CAÙC MAÃU THÖÏC TEÁ Muïc ñích cuûa thí nghieäm naøy nhaèm so saùnh phöông phaùp PCR vaø phöông phaùp nuoâi caáy trong vieäc phaùt hieän E. coli trong caùc loaïi thöïc phaåm, sô boä ñaùnh giaù tæ leä nhieãm vi sinh vaät naøy trong caùc loaïi thöïc phaåm treân thò tröôøng. Thoâng qua söï so saùnh naøy seõ nhaän xeùt veà hieäu quaû cuûa 2 phöông phaùp khi aùp duïng vaøo thöïc teá kieåm nghieäm. Maãu thöïc phaåm ñöôïc khaûo saùt trong thí nghieäm naøy ñöôïc thu töø caùc chôï, sieâu thò vaø caùc cô sôû saûn xuaát kinh doanh thöïc phaåm treân ñòa baøn thaønh phoá Hoà Chí Minh. Soá löôïng maãu laø 70 maãu ñaïi dieän cho taát caû caùc loaïi thöïc phaåm. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc trình baøy treân Baûng 14. Baûng 14. Keát quaû p haân tíc h söï hi eän dieän cuûa E. coli treân moät soá loaïi maãu thöïc phaåm baèng phöông p haùp PCR vaø p höông ph aùp nuoâi c aáy 299bp Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn Nhoùm thöïc phaåm Soá löôïng maãu Soá maãu döông tính vôùi E. coli Phöông phaùp PCR ( tyû leä %) Phöông phaùp nuoâi caáy (tyû leä %) Thòt 14 7 8 Caù 27 22 23 Rau quaû 17 13 13 Söõa 9 1 1 Tröùng 3 0 0 Toång coäng 70 43 (61%) 45 (62%) Keát quaû ôû Baûng 14 cho thaáy söï hieän dieän cuûa E. coli treân moät soá loaïi maãu treân thò tröôøng laø raát cao khoaûng 62%. Haàu heát caùc maãu khoâng qua ñoùng goùi vaø khöû truøng ñeàu bò nhieãm E. coli. Coù söï khaùc bieät khoâng ñaùng keå giöõa tyû leä phaùt hieän E. coli trong caùc maãu thöïc phaåm giöõa 2 phöông phaùp PCR vaø phöông phaùp nuoâi caáy . Phöông phaùp PCR cho tæ leä phaùt hieän 61% , trong khi ñoù phöông phaùp nuoâi caáy coù tæ leä 62%. Keát quaû cuûa phaân tích treân 70 maãu naøy chöa ñuû ñeå khaúng ñònh tæ leä nhieãm E. coli treân thöïc teá. Ñaây chæ laø keát quaû böôùc ñaàu giuùp cho caùc nhaø quaûn lyù thöïc phaåm coù söï ñaùnh giaù sô boä veà tæ leä nhieãm vi sinh vaät naøy trong thöïc phaåm hieän nay. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn PHAÀN IV KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 1. KEÁT LUAÄN Töø keát quaû cuûa quaù trình thí nghieäm chuùng toâi ruùt ra moät soá keát luaän nhö sau: - Ñaõ thieát laäp ñöôïc quy trình PCR ñeå phaùt hieän E. coli baèng caëp moài EC töï thieát keá. Caëp moài EC naøy coù tính chuyeân bieät cao ñoái vôùi caùc chuûng E. coli. Ñoä nhaïy phaùt hieän cuûa phöông phaùp PCR ñoái vôùi maãu thöïc phaåm gaây nhieãm laø 1 – 5 CFU/g thöïc phaåm sau 20 giôø taêng sinh trong moâi tröôøng TSB. Keát quaû naøy töông ñöông vôùi phöông phaùp nuoâi caáy - Ñaõ tieán haønh ñaùnh giaù hieäu löïc sô boä qui trình ñeà xuaát. Caùc thoâng soá kó thuaät cuûa phöông phaùp PCR nhö ñoä chính xaùc, ñoä nhaïy, ñoä ñaëc hieäu, döông tính giaû, aâm tính giaû ñeàu ñaït tæ leä 100% so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy. Qui trình PCR coù ñoä laëp laïi cao, oån ñònh, deã thöïc hieän vaø cho keát quaû ñoàng nhaát. - Ñaõ thöû nghieäm öùng duïng qui trình PCR ñeå khaûo saùt tæ leä nhieãm E. coli treân 70 maãu thöïc phaåm khaùc nhau, phöông phaùp PCR ñaõ phaùt hieän 61% maãu bò nhieãm E. coli, khaù thoáng nhaát vôùi phöông phaùp truyeàn thoáng( 62%). 2. ÑEÀ NGHÒ Ñeå phöông phaùp PCR ñöôïc chaáp nhaän vaø öùng duïng roäng raõi, chuùng toâi ñeà nghò moät soá ñieåm sau: - Thöïc hieän böôùc xaùc nhaän hieäu löïc thöù caáp ñeå coù ñuû cô sôû trieån khai phöông phaùp PCR phaùt hieän E. coli vaøo thöïc teá. - Thöïc hieän khaûo saùt söï hieän dieän cuûa E. coli trong caùc loaïi thöïc phaåm treân dieän tích roäng vaø coù keá hoaïch ñeå khaúng ñònh chaéc chaén veà tæ leä nhieãm E. coli trong thöïc phaåm ñang löu haønh treân thò tröôøng. Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn TAØI LI EÄU THAM KHAÛO TIEÁNG VI EÄT 1. Ng uyeãn Thanh Baûo (1993), Escherichia coli, Vi khuaån hoïc, Boä moân vi sinh, Ñaïi Hoïc Y döôïc TP Hoà Chí Minh. 2. Ng uyeãn H öõu Ch í (2001), Caùc beänh ñöôøng tieâu hoùa thöôøng gaëp, Nxb Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. 3. Ng uyeãn Tieán Duõng (2002), Phaùt hieän phaân bieät Samonella spp vaø S. entericaI baèng PCR, Luaän vaên Thaïc só Ngaønh Sinh hoïc Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân Ñaïi hoïc Quoác gia TP Hoà Chí Minh. 4. Hoà H uyønh Thuøy Döô ng ( 2003), Sinh hoïc phaân töû, Nxb Giaùo Duïc. 5. Phaïm Th aønh H oå ( 2002), Di truyeàn hoïc, Nxb Giaùo Duïc. 6. Leâ Ñình H uøng (1997), Ñaïi cöông veà phöông phaùp kieåm tra vi sinh trong thöïc phaåm,Trung taâm ño löôøng chaát löôïng III. 7. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Pha ïm Minh Taâm (2000), Veä sinh an toaøn thöïc phaåm, Tröôøng Ñaïi hoïc Kó Thuaät TP Hoà Chí Minh. 8. Nguyeãn Vónh Phöôùc (1977), Vi sinh vaät thuù y taäp I, II, III, Nxb Ñaïi Hoïc vaø Trung Hoïc Chuyeân Nghieäp Haø Noäi. 9. Buøi Thò Thuaän, Nguyeãn Phuøng Tín, Buøi Minh Ñö ùc (1991), Kieåm tra chaát löôïng vaø thanh tra veä sinh an toaøn thöïc phaåm, Nxb Y hoïc. 10. Traàn Linh Th öôùc (2002), Phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät trong nöôùc, thöïc phaåm vaø myõ phaåm, Nxb Giaùo Duïc. 11. Traàn Linh Thöôùc (2001), Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc, Nxb Ñaïi Hoïc Quoác Gia Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. 12. Traàn Thanh Thuûy (2000), Höôùng daãn thöïc taäp vi sinh vaät hoïc, Nxb Giaùo Duïc. 13. Vaên phoøng coâng nhaän c haát löôïng Vieät Nam (2000). Yeâu caàu chung veà naêng löïc cuûa caùc phoøng thöû nghieäm vaø hieäu chuaån, ISO/IEC 17025. TIEÁNG ANH Luaän vaên toát nghieäp GVHD: PGS.TS. Traàn Linh Thöôùc Ñoaøn Thò Ngoïc Tuyeàn 14. AOAC I nternational Methods Co mmittee Guideline s for Val idation of Q ualitative Micr obiologic al Offici al Methods of Analysis (2000). 15. Bruce A White (1993), PCR protocol, Human Press, New Jersey. 16. Caeiro JP, Estr ada - Gar icia MT, Jiang ZD, Mathewson JJ, Adac hi J A, Steffer R, Dupon H L (1999), Improved detection of enterotoxigenic Escherichia coli among patients with traverlers' diarrhea by use of the polymerase chain reaction technique. J. infection Disease, 180 (6) - 2053 - 2055. 17. DBMD (2001) - Foodborne infections - General information . 18. Hug h G. Griffin, Annette M . Gr iffin (1994), PCR technology: Current innovation, CRC Press. USA. 19. Jame P. Nataro. J ames B. Kaper (1998), Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiology Reviews, 11(1): 142 – 201. 20. Sac – Single Jul (2002), Method validation of microbiological methods. 21. Wor ld H ealth Or ganization (WHO) (1997). Vol.50. No. 1/2. World Health statistics Quarterly. TAØI LI EÄU TREÂN INTERNET 22. http: // www. bham.ac.uk/ bcmught 6 / path /sero. html. 23. http: // www. bham.ac.uk/ bcm 4ght 6/ path tox. html. 24. http: // www. rva. nl / pdfdoc / t02ukexplanatory doconmicribiologyb. pdf 25. http:// www.cdc.gov/ ncidod/ diseaseinfo/ escherichia coli. Ghtm. 26. http:// www.bact.wise.edu/bact 330/lectureecoli.