Luận văn Xây dựng quy trình định lượng Cytomegalovirus (CMV) trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR

giữa hai oligonucleotide khác nhau). Trong phản ứng PCR, nếu cấu trúc bậc hai này càng bền vững bao nhiêu thì hiệu quả nhân bản càng giảm đi bấy nhiêu. Độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp được đo bằng chỉ số năng lượng tự do (∆G, kcal/mole), chỉ số này phải lớn hơn -9kcal (theo hãng IDT) vì ∆G càng lớn bao nhiêu thì cấu trúc càng kém bền bấy nhiêu, do đó sẽ không ảnh hưởng đến hoạt động của PCR. Kết quả khảo sát trên phần mềm trực tuyến IDT oligo analyzer cho thấy, tất cả cấu trúc thứ cấp của hệ primers – mẫu dò đều có ∆G > -9kcal, nằm trong khoảng cho phép chấp nhận được. Kết luận, về mặt lý thuyết hệ primers và TaqMan probe của chúng tôi có thể chấp nhận. 3.1.2. Kết quả hệ primers và TaqMan probe bằng thực nghiệm 3.1.2.1. Kiểm tra khả năng hoạt động của hệ primers–TaqMan probe bằng Real - Time PCR Chúng tôi chạy thử nghiệm hệ primers - TaqMan probe trên mẫu bệnh phẩm đã được khẳng định dương tính bằng Real-Time PCR từ kit CMV của Roche (Light Cycler® CMV Quant kit-04- 845-854-001 ở trung tâm Y khoa Medic (thông tin mẫu ở phần phụ lục có mã số 5089) với kit của chúng tôi thiết kế. Mẫu được tách chiết DNA-CMV trong huyết thanh. Quá trình này nhằm mục đích kiểm tra khả năng bắt cặp, khuếch đại và phát tín hiệu huỳnh quang của hệ primers – probe trên gene UL123 của CMV. Để kiểm tra hiện tượng ngoại nhiễm có thể xảy ra trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi bố trí thêm một mẫu chứng âm với những thành phần phản ứng không đổi nhưng thay nguồn DNA bằng nước cất vô trùng. Kết quả chạy thực nghiệm: (hình 3.7) Hình 3.7: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primers – TaqMan probe bằng thực nghiệm. Kết quả chạy Real-Time PCR cho thấy, hệ primers và TaqMan probe hoạt động tốt, mẫu dương tính ở chu kỳ ngưỡng 33,9, tương đương 3x103 copies virus/ml mẫu thử, phù hợp kết quả xét nghiệm của trung tâm y khoa Medic . Đường cong PCR lên đều và đẹp, không có hiện tượng nhiễu tín hiệu huỳnh quang. Chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ mọi hoạt động trong quy trình thử nghiệm đều tốt, không có hiện tượng ngoại nhiễm. Như vậy, hệ primers-TaqMan probe CMV được thiết kế hoạt động hiệu quả trong phản ứng Real-Time PCR. UL123_-CMV- mẫu 5089 Chứng âm 3.1.2.2. Kết quả khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của hệ primers và probe được thiết kế  Trên lý thuyết, bằng phần mềm Annhyb 4,942 và trình tự genome của các tác nhân HSV1, HSV2, VZV, EBV, HBV, HCV, HPV, vi khẩn lao từ Genbank, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng bắt cặp của hệ primers – TaqMan probe, kết quả khảo sát (bảng 3.3). Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primers – TaqMan probe thiết kế với một số loài virus khác Tên chủng HSV1 HSV2 VZV EBV HBV HCV HPV MTB Phần trăm (%) bắt cặp Primer xuôi 61,9 58,1 54,3 54,3 53,3 48,1 49,5 59,5 Primer ngược 50,5 56 61 52 42 51,5 45 61,5 Probe 39 39,7 47,7 41 31,7 38,7 37,7 44,3 Qua kết quả bảng 3.3, chúng tôi thấy phần trăm bắt cặp giữa hệ primers-TaqMan probe của CMV trên genome của các loài HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, HBV, HCV, HPV, vi khẩn lao đều không cao, đối với primer xuôi dao động trong khoảng 48,1% đến 61,9%, với primer ngược trong khoảng 42%-61,5%, còn với probe nằm trong khoảng 39%-44,3% khẳng định hệ primers-TaqMan probe được thiết kế là đặc hiệu cho CMV.  Trên thực nghiệm, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real-Time PCR , một bằng hệ primers-probe cho CMV và một bằng hệ primers-probe đã thiết kế cho từng mẫu chứa DNA của các loài HSV1, HSV2, EBV, HBV, HPV, MTB, HCV (hệ primers-probe cho mỗi tác nhân, xem phụ lục). Các mẫu chứa DNA của HBV, HPV, HCV, EBV, MTB được khẳng định dương tính bằng phản ứng Real-Time PCR của công ty cổ phần công nghệ Việt Á, còn DNA chứa HSV-1, HSV-2, được tách chiết từ mẫu huyết thanh có kết quả IgG dương tính của trung tâm y khoa Medic. Kết quả chạy phản ứng giữa các loài với hệ primers- TaqMan probe đặc hiệu cho từng loài thì dương tính còn đối với hệ primers- TaqMan probe của CMV thì âm tính (bảng 3.4). Bảng 3.4: Kết quả nhân bản các loài với hệ primers- TaqMan probe đặc hiệu loài Mẫu chứa virus Chu kỳ ngưỡng (Ct) Lần 1 Lần 2 Lần 3 EBV 32,5 29,4 29,3 MTB 29,7 28,6 28,7 HBV 22,1 21,1 21 HCV 28,7 27,7 27,9 HPV 26,9 25,9 25,8 CMV 34 32 31,8 HSV 26,4 25 25,2 3.1.2.3. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR (bảng 3.5) Chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm PCR nhận được với hệ primers-TaqMan probe đã thiết kế bằng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR. Primer sử dụng cho giải trình tự là primer đặc hiệu cho CMV đã thiết kế, chúng tôi chọn ngẫu nhiên từ một mẫu đã nhân bản (mẫu mã số 5089), gởi đi công ty Macrogenn Inc (Hàn quốc) để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm PCR khuếch đại (xem kết quả gốc ở phụ lục). Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự Trình tự Chiều dài CCNCNTATCCTCAGGTACAACGTAGTTCTNATACATGCT CTACATAGTATAGCCCAATACACTTNATCTCCTCGNAAG GCTCATNAAC 88bp Ghi chú: (N: nucleotide không xác định được) Một điều cần lưu ý trong kết quả giải trình tự là số lượng các N, nếu kết quả giải trình tự có nhiều ký tự N thì kết quả không sử dụng được. Ở đây, kết quả mà chúng tôi nhận được có 6N (6/88). Tỷ lệ N trong trình tự chiếm tỷ lệ thấp nên kết quả này có thể chấp nhận được. Với kết quả giải trình tự ở trên, chúng tôi nhận thấy kích thước của sản phẩm nhân bản được chỉ có 88bp, nhỏ hơn so với trên lý thuyết là 98bp. Nguyên nhân là do máy giải trình tự thường không giải được một số nucleotide đầu tiên và mặt khác, vì chúng tôi sử dụng chính các primer của chính phản ứng PCR để làm primer trong phản ứng giải trình tự, do đó trình tự các sản phẩm PCR giải ra bị mất một đoạn khoảng 11 nucleotide về phía đầu 5’, nơi primer xuôi bắt vào. Hình 3.8: Kết quả gióng cột sản phẩm khuếch đại theo lý thuyết (sp) và kết quả giải trình tự (CMV- ab1.2800) bằng phần mềm ClustalX Qua hình 3.8, chúng tôi nhận thấy vùng trình tự không tương đồng là 9/88 nucleotide=10,22%, vùng trình tự tương đồng giữa sản phẩm PCR thu được với các trình tự CMV đã công bố chiếm 89,78%. Tỉ lệ này cho phép kết luận sản phẩm PCR chúng tôi nhân bản là đặc hiệu cho CMV.  Kết quả kiểm tra sản phẩm giải trình tự trên Blast: Hình 3.9: kết quả khảo sát sản phẩm giải trình tự bằng Blast Qua hình 3.9 chúng tôi thấy sự tương đồng giữa sản phẩm PCR mà chúng tôi nhân bản được với các trình tự thuộc HCMV, vùng gen IE từ 89%-91%. Với giá trị E-value từ 4x10-55- 4x10- 60 thì sự tương đồng giữa các trình tự rất có ý nghĩa. KẾT LUẬN: hệ primerss – TaqMan probe của chúng tôi hoạt động tốt, đặc hiệu và chuyên biệt, có thể ứng dụng được vào quy trình. 3.1.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu hóa của phản ứng 3.1.3.1. Kêt quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu Từ nhiệt độ biến tính của primer xuôi và primer ngược được sử dụng, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng từ 550C đến 650C. Ngoại trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai còn các thành phần khác (DNA bản mẫu, primer,…) và các điều kiện khác (điều kiện về thiết bị, thời gian phản ứng,…) của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần (bảng 3.6) Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai Nhiệt độ lai (Ct) lần 1 (Ct) lần 2 (Ct) lần 3 (Ct) TB Chứng âm (550C) N/A N/A N/A N/A 55,00C 25,9 25,4 26,2 25,8 55,80C 27,6 25,8 25,4 26,3 57,10C 24,9 25 24,6 24,8 58,90C 25,4 25,5 25,5 25,5 61,40C 26,1 25,5 25 25,5 63,30C 25,8 25,9 25,5 25,7 64,50C 26,2 24,6 25,9 25,6 650C 26,2 25,2 28,8 26,7 Nhận xét: ở nhiệt độ 57,10C xuất hiện chu kỳ ngưỡng thấp nhất, và được chọn là nhiệt độ lai tối ưu cho phản ứng. Hình 3.10: Đường cong biểu diễn khảo sát nhiệt độ lai Kết luận: Primer hoạt động tốt ở nhiệt độ lai là 57,10C . 3.1.3.2. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ Khi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2, chúng tôi tiến hành các phản ứng ở cùng nhiệt độ lai 570C, thành phần các chất tham gia phản ứng là như nhau, chỉ khác biệt về nồng độ MgCl2, chúng tôi lặp lại thí nghiệm ba lần và kết quả thu được (bảng 3.7). Bảng 3.7: Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 MgCl2 (mM) (Ct) lần 1 (Ct) lần 2 (Ct) lần 3 (Ct) TB 1,5 (+) 26 / 26,3 / 2,0 26 26 26,3 26,1 2,5 25,7 25,7 26 25,8 3,0 26 26 26,2 26,1 3,5 25,3 25,3 25,6 25,4 4,0 25,8 25,8 26,1 25,9 4,5 27,4 26 27,8 27,1 5,0 25,4 27,4 25,5 26,1 1,5 (-) Âm tính Âm tính Âm tính Hình 3.11: đường cong biểu diễn khảo sát nồng độ Mg2+ Qua kết quả chúng tôi nhận thấy ở nồng độ MgCl2 = 3,5mM ở chu kỳ ngưỡng thấp nhất đã có tín hiệu huỳnh quang, do đó chúng tôi chọn nồng độ MgCl2=3,5mM là tối ưu cho phản ứng. 3.1.3.3. Kết quả khảo sát nồng độ primer và TaqMan probe * Kết quả khảo sát nồng độ TaqMan probe: Nồng độ TaqMan probe có ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng Real-Time PCR, nếu nồng độ này quá thấp thì tín hiệu yếu, còn quá cao sẽ lãng phí và có thể gây ảnh hưởng xấu đến phản ứng. Theo các nghiên cứu trước đây, nồng độ TaqMan probe trong phản ứng Real-Time PCR dao động trong khoảng 100nM đến 500nM. Vì vậy, chúng tôi chọn phổ nồng độ từ 100-500nM với đơn vị tăng là 100nM nhằm tìm ra nồng độ cho giá trị Ct nhỏ nhất, thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.8: Khảo sát nồng độ TaqMan probe Nồng độ probe Chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 100nM 24,8 24,8 24,3 24,6 200nM 24,6 23,8 23,6 24,0 300nM 23,7 23,7 23,7 23,7 400nM 24,7 24,5 24,4 24,5 500nM 24,7 24,5 24,9 24,7 Hình 3.12: Biểu diễn đường cong khảo sát nồng độ TaqMan probe Kết quả bảng (3.8) cho thấy nồng độ TaqMan probe CMV= 300nM cho giá trị Ct nhỏ nhất, nồng độ này được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. * Kết quả khảo sát nồng độ primer: Nếu nồng độ primer quá thấp thì primer sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ primer quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo nghiệm nồng độ primer từ 0,1 đến 0,5μM ba lần (bảng 3.9) để tìm giá trị Ct nhỏ nhất. Bảng 3.9: Kết quả khảo sát nồng độ primer Nồng độ Primer (μM) Chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 0,1 25,2 26,9 27,6 26,6 0,2 25,6 26,1 26 25,9 0,3 26 25,8 26,8 26,2 0,4 24,7 25,4 25,4 25,2 0,5 25,3 26 25,8 25,7 Qua kết quả bảng cho thấy ở nồng độ primer là 0,4μM cho giá trị Ct thấp nhất. Hình 3.13:Biểu diễn đường cong của nồng độ primer 3.1.4. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng  Độ nhạy là một yếu tố quyết định giá trị của phương pháp chẩn đoán. Độ nhạy cho biết giới hạn số lượng bản mẫu DNA nhỏ nhất mà một phương pháp có thể phát hiện. Chúng tôi khảo sát độ nhạy của phản ứng Real-Time PCR CMV với các nồng độ mẫu chuẩn từ 101 đến 106 bản sao phản ứng. Thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ nhạy Nồng độ mẫu chuẩn (bản sao/ ml) Chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 101 (-) (-) (-) (-) 102 34 34,2 33,8 34,0 103 29,6 29,6 29,4 29,5 104 26,8 26,3 26,6 26,6 105 23,1 22,2 22,9 22,7 106 19 19,4 18,7 19,0 Hình 3.14: Đường cong biểu diễn kết quả khảo sát độ nhạy  Qua kết quả chúng tôi nhận thấy giới hạn phát hiện DNA-CMV của phản ứng chúng tôi là 102 bản sao/phản ứng.  Xây dựng đường cong chuẩn Với các mẫu chuẩn có số lượng bản sao CMV đã biết 102, 104, 106 chúng tôi xây dựng đường chuẩn cho phản ứng định lượng CMV, từ đường chuẩn này có thể xác định được hàm lượng virus trong bệnh phẩm. Kết quả đường chuẩn qua ba lần thí nghiệm (hình 3.15). Lần 1 Hình 3.15: Đường chuẩn . Qua ba lần khảo sát, hệ số tuyến tính của đường chuẩn thể hiện ở bảng 3.11 Bảng 3.11: Hiệu quả phản ứng Real-Time PCR Lần 1 Lần 2 Lần 3 PCR eficiency (hiệu quả khuyếch đại) 96,2% 103,9% 101% Hệ số tuyến tính của đường chuẩn 1,0 1,0 1,0 Hệ số tuyến tính của đường chuẩn ba lần đều =1,0, trong qui định (R2>0,98), hiệu quả khuyếch đại từ 96,2% - 103,9% (qui định 90%-105%). Trên cơ sở đó cho thấy phản ứng Real- Time PCR của chúng tôi là hiệu quả và đạt mức độ tối ưu. Các trị số 2,3,4,5,6 trên trục X được biểu thị bằng cơ số logarit của cơ số 10 (log10) tức là tương ứng với các số lượng bản đích là 102, 103, 104, 105, 106 copies trong phản ứng. 3.1.5.Khảo sát tính lặp lại của phản ứng Real-Time PCR Độ tin cậy của thí nghiệm được thể hiện qua nhiều yếu tố trong đó tính lặp lại là một yếu tố quan trọng. Tính lặp lại của phản ứng Real-Time PCR được biểu hiện qua hai hệ số biến thiên (variability coefficient) gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng. Giá trị các hệ số Lần 2 Lần 3 biến thiên này càng thấp thì tính lặp lại càng cao. Biến thiên nội phản ứng là độ biến thiên giữa các phản ứng được thực hiện vào cùng một thời điểm. Biến thiên liên phản ứng là độ biến thiên giữa các lần lặp lại phản ứng vào các thời điểm khác nhau. Chu kỳ ngưỡng là yếu tố để đánh giá độ biến thiên này. Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng (HSBTNPƯ), và hệ số biến thiên liên phản ứng (HSBTLPƯ) trên mẫu chuẩn CMV với các nồng độ 102, 104, 106 bản sao/phản ứng và hai mẫu bệnh phẩm , thí nghiệm được lặp lại ba lần. 3.1.5.1. Hệ số biến thiên nội phản ứng (intraassay variability coefficicent) Hình 3.16: Đường cong biểu diễn nội phản ứng Standard Curve Graph for FAM-490 Hình 3.17: đồ thị giá trị Ct các lần lặp lại của nội phản ứng Bảng 3.12: Giá trị Ct các nồng độ của đường chuẩn trong nội phản ứng Nồng độ (bảnsao/phản ứng) Ct lần 1 Ct lần 2 Ct lần 3 Ct trung bình 102 31,25 32,56 33,85 32,55 104 28,10 27,58 27,60 27,76 106 20,20 19,48 19,05 19,58 Mẫu 1 26,75 27,04 25,76 26,52 Mẫu 2 35,63 34,97 34,59 35,06 Theo thống kê mô tả trong MS-Excel [5] (phụ lục), chúng tôi tiến hành tính toán hệ số biến thiên nội phản ứng của phản ứng Real-Time PCR (bảng 3.13) Bảng 3.13: hệ số biến thiên nội phản ứng (HSBTNPƯ) Nồng độ (bản sao/ phản ứng) Ct trung bình Độ lệch chuẩn HSBTNPƯ 102 32,55 1,30 3,99 104 27,76 0,29 1,06 106 19,58 0,58 2,97 Mẫu 1 26,52 0,67 2,53 Mẫu 2 35,06 0,53 1,5 3.1.5.2. Hệ số biến thiên liên phản ứng (inter-assay variability coefficient) Ngày 1: Unknows: mẫu thử Standards: mẫu chuẩn Ngày 2 Ngày 3 Hình 3.18: Đồ thị giá trị Ct lặp lại của liên phản ứng Bảng 3.14: Giá trị chu kỳ ngưỡng các nồng độ của đường chuẩn liên phản ứng Nồng độ (bản sao/ phản ứng) Ct lần 1 Ct lần 2 Ct lần 3 Ct trung bình 102 36,13 35,44 33,99 35,19 104 28,71 27,80 27,08 27,86 106 22,65 21,64 20,75 21,68 Mẫu 1 29,52 28,48 26,29 28,10 Mẫu 2 26,28 25,54 22,97 24,93 Dựa vào kết quả bàng 3.14, chúng tôi tiến hành tính toán theo thống kê mô tả trong MS- EXCEL [5] (phụ lục), kết quả bảng 3.15. Bảng 3.15: Hệ số biến thiên liên phản ứng (HSBTLPƯ) Nồng độ (bản sao/phản ứng) Ct trungbình Độ lệch chuẩn HSBTLPƯ 102 35,19 1,09 3,10 104 27,86 0,82 2,93 106 21,68 0,95 4,38 Mẫu 1 26,01 1,65 5,87 Mẫu 2 27,02 1,74 6,97 Độ lặp lại của phản ứng Real-Time PCR CMV thông qua các hệ số biến thiên nội phản ứng và liên phản ứng được tổng kết trong bảng 3.16. Bảng 3.16: HSBTNPƯ và HSBTLPƯ của Real-Time PCR CMV Hệ số Mẫu chuẩn (bản sao/phản ứng) Mẫu bệnh phẩm 102 104 106 Mẫu 1 Mẫu 2 BTNPƯ 3,99 1,06 2,97 2,53 1,50 BTLPƯ 3,1 2,93 4,38 5,87 6,97 Bảng 3.17: Kết quả so sánh độ lặp lại trong một số công trình Tác giả Độ lặp lại Độ nhạy HSBTNPƯ HSBTLPƯ Machida & cs (2000) [48] 0,89 – 1,43 1,51 – 4,46 102 Gault & cs (2001) [26] 0,6 – 2,5 12 - 21 101 Heli Piiparinen (2004) [33] 5,12 – 13,1 4,5 – 19,6 101 Thí nghiệm 1,06-3,99 2,93 - 6,97 102 So sánh với các kết quả công bố của một số tác giả (bảng 3.17) cho thấy kết quả phản ứng Real-Time PCR của chúng tôi phù hợp với các kết quả đã công bố, chứng tỏ quy trình chúng tôi xây dựng hoạt động tốt. 3.2. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CMV TRÊN MỘT SỐ BỆNH PHẨM Sau khi tối ưu hóa quy trình định lượng CMV bằng Real-Time PCR, chúng tôi tiến hành ứng dụng trên một số mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm CMV. Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành ứng dụng khảo sát hai đợt: Đợt 1: gồm 10 mẫu nước tiểu từ bệnh viện Từ Dũ (bảng 3.18) và 10 mẫu huyết thanh từ trung tâm xét nghiệm Y khoa Medic và bệnh viện Từ Dũ (bảng 3.19) Bảng 3.18: Kết quả khảo sát mẫu nước tiểu từ bệnh viện Từ Dũ bằng quy trình Real-Time PCR STT Mã số mẫu khảo sát IgG (AU/ml) IgM Ứng dụng quy trình 1 4212 71,7 (+) / - 2 7864 487,2 (+) 0,317 (-) - 3 7792 >250 (+) 0,128 (-) (+), Ct=37,3 4 4718 >750 (+) 0,6 (+) (+), Ct=31,78 5 3144 373,5 (+) 0,366 (-) (+), Ct=28,46 6 3162 719,2 (+) 0,226 (-) - 7 5000 217,2 (+) 0,167 (-) - 8 4502 482,1 (+) 0,274 (-) - 9 6996 132,6 (+) 0,133 (-) - 10 6604 750 (+) 0,141 (-) - Bảng 3.19: Kết quả khảo sát mẫu huyết thanh từ BV Từ Dũ và trung tâm y khoa Medic bằng quy trình Real-Time PCR STT Mã số mẫu khảo sát IgG (AU/ml) IgM Ứng dụng quy trình 1 6604 (Từ Dũ) 750 (+) 0,141 (-) (+), Ct=37,4 2 3544 (Từ Dũ) 321 (+) 0,231 (-) (+), Ct=37,2 3 7822 (Từ Dũ) / 0,538 (+) - 4 6514 (Từ Dũ) 376,8 (+) 0,436 (-) - 5 3162 (Từ Dũ) 719,2 (+) 0,226 (-) - 6 2056 (Medic) 1,1U/ml (+) 0,3 (-) - 7 7066 (Medic) 1,2 U/ml (+) 0,6 (-) - 8 7072 (Medic) 0,3 U/ml (-) 2,1 (+) (+), Ct=30,6 9 3207 (Medic) 2,0 U/ml (+) 1,5 ( +) - 10 5089 (Medic) (+), PƯ Real-Time PCR bằng kit ROCHE, 3820 copies. (+), Ct=33,9 Đợt 2, chúng tôi tiếp tục ứng dụng trên 12 mẫu nước tiểu và 12 mẫu máu thu được từ bệnh viện Từ Dũ có kết quả kháng thể CMV (bảng 3.20) Bảng 3.20: Thông tin mẫu bệnh phẩm đợt 2 TT Mẫu Máu Nước tiểu IgG IgM 1 6896 x x 306 (+) 0.106(-) 2 7786 x x 192.9(+) 0.198(-) 3 6746 x x ( Real-Time PCR có Ct=30) 297(+) / 4 6866 x / 98.7(+) 0.198(-) 5 7546 x x 697.2(+) 0.109(-) 6 7068 x x 738.3(+) 0.286(-) 7 7358 x x 171(+) 8 7032 x x 107.1(+) 9 7304 x x 227.7(+) 10 7194 x x 345(+) 0.136(-) 11 7672 x x 335.1(+) 0.193(-) 12 7630 x (Real-Time PCR có Ct=38) x 230.7(+) 0.126(-) Tóm lại,qua khảo sát trên 20 mẫu máu và 22 mẫu nước tiểu được xác định dương tính với kháng thể IgG-CMV, chúng tôi thu được 4 mẫu nước tiểu và 4 mẫu huyết thanh dương tính với phản ứng Real-Time PCR, hai mẫu máu được xác định dương tính với kháng thể IgM-CMV, có một mẫu dương tính với phản ứng Real- Time PCR, chứng tỏ quy trình chúng tôi xây dựng có thể sử dụng chung trên cả dịch máu, hoặc nước tiểu. Tuy nhiên, qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy không phải có kháng thể IgG-CMV hay IgM-CMV là có lượng virus trong máu cao đủ để định lượng CMV, giữa hàm lượng kháng thể IgG-CMV hoặc IgM-CMV và hàm lượng virus trong mẫu nhiễm cần nghiên cứu thêm để thấy được mối tương quan của chúng. CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 4.1.1. Chúng tôi đã xây dựng được quy trình xử lý nước tiểu và tách chiết được DNA-CMV trong nước tiểu để định lương virus trong mẫu thử giúp các bác sĩ chẩn đoán bệnh CMV nhanh và điều trị kịp thời. Mặt khác, định lượng DNA-CMV trong nước tiểu còn nhiều ưu điểm: - Thu mẫu đơn giản, đặc biệt hiệu quả đối với em bé mới sinh do việc trích máu rất khó khăn. - Không gây đau và tránh lây nhiễm các bệnh qua đường máu. 4.1.2. Chúng tôi xây dựng được quy trình định lượng CMV bằng Real-Time PCR - Bộ primers – TaqMan probe mẫu chuẩn hoạt động hiệu quả và đặc hiệu. - Nhiệt độ lai của phản ứng là 57,10C. - Nồng độ MgCl2 là 3,5mM. - Nồng độ TaqMan probe là 300nM. - Nồng độ primer là 0,4M. - Hệ số tuyến tính của đường chuẩn là 1,0. - Hệ số biến thiên nội phản ứng : 1,06 – 3,99 - Hệ số biến thiên liên phản ứng : 2,93 – 6,97 - Độ nhạy : 102 bản sao/ phản ứng. - Kết quả phù hợp với phản ứng Real-Time PCR chạy bằng kit của Roche - Ứng dụng quy trình trên bệnh phẩm cho kết quả tốt. Từ đây cho thấy quy trình định lượng CMV của chúng tôi có đủ khả năng ứng dụng để định lượng CMV trong các mẫu máu, hoặc nước tiểu. - Giá thành thấp hơn gấp ba lần so với kit Roche ở trung tâm Y khoa Medic. 4.2. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA QUY TRÌNH Hoặc 4.3. ĐỀ NGHỊ Qua phần ứng dụng quy trình chúng tôi đề xuất thêm một số hướng nghiên cứu tiếp tục: 4.3.1. Dùng quy trình định lượng vừa xây dựng thống kê mối tương quan giữa lượng virus trong mẫu thử với biểu hiện bệnh CMV trên bệnh nhân mang thai, sự tương quan giữa dị tật bẩm sinh với lượng virus trong máu, hoặc nước tiểu người mẹ mang thai và những bệnh nhân suy giảm miễn dịch như ghép tạng…. 4.3.2. Ứng dụng quy trình thống kê mối tương quan giữa lượng kháng thể với lượng virus trong máu hoặc nước tiểu liên quan bệnh CMV, so sánh đối chiếu với các phương pháp chẩn đoán khác. THIẾT LẬP VÀ CHẠY PHẢN ỨNG REAL-TIME PCR TÁCH CHIẾT DNA ĐỌC KẾT QUẢ, XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COPIES/ml MẪU THỬ THU MẪU HUYẾT THANH THU NƯỚC TIỂU VÀ XỬ LÝ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bio-Rad Laboratories. INC (2004), Hướng dẫn sử dụng real time PCR. 2. Cao Minh Nga (2008), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tài liệu tập huấn, Bộ Y Tế -Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh. 3. Trần Thị Thanh Nga & Cao Minh Nga (3/11/2000), “Vấn đề nhiễm virus trong ghép cơ quan (ghép thận)”, Hội thảo Việt-Pháp về bệnh lý thận và ghép thận ở trẻ em, Tổng hội y dược học TP Hồ Chí Minh, tr.104-111. 4. Đái Duy Ban (2003), Sinh học phân tử của ung thư vòm họng, NXB KHKT. 5. Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS-EXCEL, NXB Giáo dục. 6. Hoàng Ngọc bảo Mi (2005), Xây dựng quy trình phát hiện CMV bằng phương pháp PCR, luận văn tốt nghiệp đại học, trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. 7. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, tr 129-134. 8. Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, NXB KHKT, Hà Nội. 9. Lê Huy Chính, (2007), Vi sinh vật y học, NXB y học, chi nhánh TP Hồ Chí Minh. 10. Quyển Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng phân tích DNA, công nghệ sinh học tập 2, NXB KHTN và công nghệ, Hà Nội. 11. Tạp chí thông tin y dược (22-10-2009), “Cytomegalo virus trong ghép thận”. 12. Tạp chí y học thực hành (2006), “Tìm hiểu Cytomegalovirus”, BS.P.T.H.Q (Dịch), Phòng KHTH - BV Từ Dũ. 13. Tạp chí Y học thực hành (số 11/2007), “CMV não là bệnh thường gặp ở trẻ sơ sinh do nhiễm trùng bẩm sinh từ thời kỳ bào thai”. 14. Từ Thành Trí Dũng (2006), Nhiễm Cytomegalovirus ở bệnh nhân ghép tạng, NXB Y học, chi nhánh TP Hồ Chí Minh. 15. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập 4, NXB Giáo dục. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước ngoài 16. Angélica Lidia Distéfano, Alicia Alonso, Fabián Martin and Fabián Pardon (2004), “Human Cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina”, BMC Pediatrics, 4:11. 17. A. R. Bergmann et all (2002), “ Importance of Sample Preparation for Molecular Diagnosis of Lyme Borreliosis from Urine”, Journal Of Clinical Microbiology, (Vol. 40, No. 12), p. 4581–4584. 18. Angela M. Kearns et all (2002), “ Rapid detection and quantification of CMV DNA in urine using LightCycler™-based real-time PCR”, Journal of Clinical Virology (24), p 131–134. 19. Ayan K Chakrabarti, Lori Caruso (2009), “ Detection of HIV-1 RNA/DNA and CD4 mRNA in feces and urine”, from chronic HIV-1 infected subjects with and without anti-retroviral therapy 10.1186/ 1742-6405-6-20 (7). 20. Barbi M, Binda S, Primache V, Clerici D (1998), “Congenital cytomegalovirus infection in a northern Italian Region”, Eu J of Epidemiol,p955-960. 21. Bai X, Rogers BB, Harkins PC, Sommerauer J, Squires R, Rotondo K,Quan A, Dawson DB, Scheuermann RH (2000), “Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients”. J Mol Diagn (2):191–201. 22. Bing-Yuan Chen, Harry W. Janes (2002), “ Methods in Molecular Biology”, PCR Cloning Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ, vol. 192: pp. 3-16. 23. Boppana SB, Fowler KB, Pass RF, Rivera LB, Bradford RD, Lakeman FD et al (2005), “Congenital cytomegalovirus infection: association between virus burden in infancy and hearing los”s. J Pediatr (146), p817–823. 24. C. Gilbert and G. Boivin (2005), “Human Cytomegalovirus Resistance to Antiviral Drugs”, Antimicrobial agents and chemotherapy, Vol. 49, No. 3, p. 873–883 25. Gault, E., Y. Michel, A. Dehe´e, C. Belabani, J. C. Nicolas, and A. Garbarg-Chenon (2001), “Quantification of human cytomegalovirus DNA by real-time PCR”. J. Clin. Microbiol. (39):772–775. 26. Ghaffari h, Obeidi o, Dehghan m, Chahardouli b, Alimoghaddam k, Gharebaghian a, Shamshiri ar, Ghavamzadeh a. (2006). “Development and evaluation of a real-time taqman- pcr for the detection of human cytomegalovirus dna in bone marrow transplant recipients” , shiraz e-medical journal ,vol 7-. 27. Gouarin S, Gault E, Vabret A, Cointe D, Rozenberg F, Grangeot-Keros L et al (2002). “Realtime PCR quantification of human cytomegalovirus DNA in amniotic fluid samples from mothers with primary infection”. J Clin Microbiol (40):1767–1772. 28. Grefte A. van der Giessen M, Van Son W, ey all (1993). “Circulating cytomegalovirus- infected endothelial cell in patients with an active CMV infection”. J Infect Dis (167), p270- 277. 29. Griscelli, F., M. Barrois, S. Chauvin, S. Lastere, D. Bellet, and J. H. Bourhis (2001), “Quantification of human cytomegalovirus DNA in bone marrow transplant recipients by real-time PCR”. J. Clin. Microbiol (39):4362–4369. 30. Griffiths PD, Baboonian C, Rutter D, Peckham C (1991): “Congenital and maternal cytomegalovirus infections in a London population”. Br J Obstet Gynaecol, 98(2):135-140. 31. Goegebuer .T, B. Van Meensel, K. Beuselinck, V. Cossey, M. Van Ranst, M. Hanssens, and K. Lagrou (Mar. 2009), “Clinical Predictive Value of Real-Time PCR Quantification of Human Cytomegalovirus DNA in Amniotic Fluid Samples”, Journal Of Clinical Microbiology, Vol. 47, No. 3, p. 660–665. 32. Heli Piiparinen (2004), Academicdissertation: Quantitative PCR in the diagnosis and monitoring of Human Cytomegalovirus infection in organ transplant patients. 33. Hidehiro Nishihara a, Masahiro Ito (1994), “ Detection of human cytomegalovirus DNA in immunocompromised children by polymerase chain reaction”, (3), p73-81. 34. Holland, P. M., R. D. Abramson, R. Watson, and D. H. Gelfand (1991). “Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’-3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (88):7276–7280. 35. Hudson, J. B., M. A. Bedell, D. J. McCance, and L. A. Laiminis (1990),“Immortalization and altered differentiation of human keratinocytes in vitro by the E6 and E7 open reading frames of human papillomavirus type 18”. J. Virol. (64):519–526. 36. Huma Siddiqui, Alexander J. Nederbragt, Kjetill S. Jakobsen (2009) “ A solid-phase method for preparing human DNA from urine for diagnostic purposes”, Clinical Biochemistry (42) , p1128–1135. 37. Isidore Rigoutsos, Jiri Novotny (2003), ”In silico pattern-based analysis of the Human Cytomegalovirus genome”, Journal of virology (84), p17-28. 38. Iwamoto GK, Monick MM, clark BD, et all (1990), “Modulation of interleukin I beta gene expression by the immediate early genes oh human cytomegalovirus”. J Clin Invest (85):p1853-1857. 39. Iwasawa, Akihiko Md; Hiltunen-Back, Eija Md, Reunala, Timo Md; Nieminen, Pekka Md; Paavonen, Jorma Md, (1996), “ Human Papillomavirus DNA in Urine Specimens of Men With Condyloma Acuminatum”. 40. Jayne C.Fox, et al (1995), “Longitudinal analysis of cytomegalovirusload in renal transplant recipients using a quantitative polymerase chain reaction correlation with disease”, Journal of General virology (76):p309-319. 41. Jiska Jebbink, Xin Bai, Beverly Barton Rogers, et all (February 2003), “Development of Real-Time PCR Assays for the Quantitative Detection of Epstein-Barr Virus and Cytomegalovirus, Comparison of TaqMan Probes, and Molecular Beacons”, Journal of Molecular Diagnostics, Vol. (5), No. 1, p15-20. 42. Joeli A. Brinkman a, Meliha Z. Rahmanib, W. Elizabeth Jones b (2004) “Optimization of PCR based detection of human papillomavirus DNA from urine specimens”. Journal of Clinical Virology (29), p 230–240. 43. Joeli A. Brinkman, W. Elizabeth Jones, Ann M. Gaffga, Jonathan A. Sanders, et al (Sept. 2002), “Detection of Human Papillomavirus DNA in Urine Specimens from Human Immunodeficiency Virus-Positive Women”, Journal Of Clinical Microbiology, Vol. 40, No. 9, p. 3155–3161. 44. Kirklin JK, Pillay D, et all (1994) . “Cytomegalovirus after heart transplantation. Riks factors for infection and death : a multi-institutional study”. J Heart Lung Transplant (13):p394-404. 45. Kyeong Man Hong, Hazim Najjar (2004), “Quantitative Real-Time PCR with Automated Sample Preparation for Diagnosis and Monitoring of Cytomegalovirus Infection in Bone Marrow Transplant Patients”, Molecular Diagnostics and Genetics, 846–856. 46. Lo CY, Ho KN, Yuen KY, et all (1997), “Diagnosing cytomegalovirus disease in CMV seropositive renal allograft recipients a comparition between the CMV pp65 assay”. Clin Transplant (11): p286-293. 47. Machida, U., M. Kami, T. Fukui et all (2000), “Real-time automated PCR for early diagnosisand monitoring of cytomegalovirus infection after bone marrow transplantation”. J. Clin. Microbiol. (38): p2536–2542. 48. Marianne Leruez-Ville et all (2003), “Monitoring Cytomegalovirus Infection in Adult and Pediatric Bone Marrow Transplant Recipients by a Real-Time PCR Assay Performed with Blood Plasma”, Journal Of Clinical Microbiology, p. 2040–2046. 49. Mark R Schleiss, MD (18-11-2009), Cytomegalovirus Infection, University of Minnesota Medical School. 50. Matthias J. Reddehase (2009), Cytomegaloviruses, Publisher: Caister Academic Press. 51. Murph JR, Souza IE, Dawson JD, Benson P, Petheram SJ, Pfab D, Gregg A, O'Neill ME, Zimmerman B, Bale JF (1998), “Epidemiology of congenital cytomegalovirus infection: maternal risk factors and molecular analysis of cytomegalovirus strains”, Am J Epidemiol, 147(10):940-947. 52. Michael Boeckh,MeeiLi Huang ( Mar. 2004), “Optimization of Quantitative Detection of Cytomegalovirus DNA in Plasma by Real-Time PCR” , Journal Of Clinical Microbiology, Vol. 42, No. 3, p. 1142–1148. 53. Mori, T., S. Okamoto, et all (2000), “Risk-adapted preemptive therapy for cytomegalovirus disease in patients undergoing allogeneic boNe marrow transplantation”, Bone Marrow Transplant. 25:765–769. 54. Munger, K., and P. M. Howley (2002), “Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res”. (89):213–228. 55. Nada Madi, Widad Al-Nakib, et all (2007), “Detection and Monitoring of Cytomegalovirus Infection in Renal Transplant Patients by Quantitative Real-Time PCR”, Med Princ Pract(16): p268–273. 56. Newton, C.R., Graham, A (1994), PCR, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, pp 1– 28. 57. Nitsche, A, N. Steuer, C. A. Schmidt, O. Landt, and W. Siegert (1999). “Different real-time PCR formats compared for the quantitative detection of human cytomegalovirus DNA”. Clin. Chem. (45):p1932–1937. 58. Nitsche, A., N. Steuer, C. A. Schmidt, O. Landt, H. Ellerbrok, G. Pauli, and W. Siegert (2000). “Detection of human cytomegalovirus DNA by real-time quantitative PCR”. J. Clin. Microbiol (38): p2734–2737. 59. Offermanns S, Rosenthal W (2008), “Encyclopedia of Molecular Pharmacology (2nd ed,)”, Springer: 437-438. 60. P. Stanier,et all (1992), “Detection of human cytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples using PCR”, Molecular and Cellular Probes (6), 51-58. 61. Paya Cv, Holley KE, Wiesner, et all (1990), “Early diagnosis of cytomegalovirus hepatitis in liver transplant recipient: role of immunostaining, DNA hybridization and culture of hepatic tissue”. Hepatology (10) :1198-1205. 62. Phan Quận, (2008); Clinical Infectious Diseases (46):1455–7. 63. Ralph Raphley (2000), The Nucleic Acid Protocol,s Handbook, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 337 – 340. 64. Ratnamohan VM, Chapman J, Howse H, et al. (1998) . Cytomegalovirus and human herpesvirus 6 both cause viral disease afte renal transplantation, Transplantation; 66:877- 882. 65. Ravit Arav-Boger, and Robert Pass (2007), Viral Load in Congenital Cytomegalovirus Infection. 66. Razonable, R. R., R. A. Brown (2001), “Comparative quantification of cytomegalovirus (CMV) DNA in solid-organ transplant recipients with CMV infection by using two high- throughput automated systems”. J. Clin. Microbiol (39):4472–4476. 67. Sambrook Joseph, David W.Russell (2001), “Molecular Cloning–A Laboratory Manual, 3rd ed”, Cold Spring Harbor Laboratory press, New York, vol. 2pp., 8.107-8.108. 68. Schaade, L., P. Kockelkorn, K. Ritter, and M. Kleines (2000). “Detection of cytomegalovirus DNA in human specimens by lightcycler PCR”. J. Clin. Microbiol. 38:4006–4009. 69. Tanaka, N., H. Kimura, K. Iida, Y. Saito, I. Tsuge, A. Yoshimi, T. Matsuyama, and T. Morishima (2000). “Quantitative analysis of cytomegalovirus load using a real-time PCR assay”. J. Med. Virol. 60:455–462. 70. Tay;or GH (2003). “Cytomegalovirus. Am Fam Physician”; (67):519-(24),526. 71. Todd S Wills, MD (28-04-2009), Cytomegalovirus, University of South Florida College of Medicine. 72. Yun, Z., I. Lewensohn-Fuchs, P. Ljungman, and A. Vahlne (2000). “Real-time monitoring of cytomegalovirus infections after stem cell transplantation using the TaqMan polymerase chain reaction assays”. Transplantation 69:1733–1736. 73. Nguồn internet: blogit.helsinki.fi/butcher/research1.htm www.abbottdiagnostics.com/science www.who.int/publications www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/c www.nature.com/.../n8/fig_tab/nm0800_863_F1.html www.abbottdiagnostics.co.uk/About_Us/UK/Xchan http:// www.abbottdiagnostics.com/science, bin/primer3/primer3 www.cgi . www.abbottdiagnostics.co.uk/About_Us/UK/Xchan... me/tim-hieu-cytomegalovirus/ virus-trong-ghep-than/54886.003046.html 74. Luận văn:  Kiều Thị Diễm Trang (2005), Thiết lập quy trình phát hiện Vibrio parahaemoliticus trong thực phẩm bằng phương pháp PCR và thử nghiệm ứng dụng, luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh.  Nguyễn Thị Ngọc Yến (2005), Xây dựng quy trình phát hiện Clostridium perrfringens trong thực phẩm bằng phương pháp PCR và thử nghiệm ứng dụng, luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh. 1. Kết quả Annhyb: 1.1. Của primer ngược: 1.2. Của Taqman probe 2. Kết quả Blast 2.1. Của primer xuôi Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident GQ466044.1 Human herpesvirus 5 strain 3301, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident GQ396663.1 Human herpesvirus 5 strain HAN20, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% GQ396662.1 Human herpesvirus 5 strain HAN38, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% GQ221974.1 Human herpesvirus 5 strain 3157, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% GQ221975.1 Human herpesvirus 5 strain JP, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% GQ221973.1 Human herpesvirus 5 strain HAN13, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% GQ244523.1 Human herpesvirus 5 strain Par 72 kDa immediate-early 1 protein (UL123) gene, complete cds 42.1 42.1 100% 0.018 100% GQ121041.1 Human herpesvirus 5 transgenic strain Towne substrain varL, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% BK000394.5 TPA: TPA_inf: Human herpesvirus 5 strain AD169 substrain varUK, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% FJ527563.1 Human herpesvirus 5 strain AD169 substrain varUC, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% AY446894.2 Human herpesvirus 5 strain Merlin, complete genome 42.1 42.1 100% 0.018 100% 2.2. Của primer ngược Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident GQ466044.1 Human herpesvirus 5 strain 3301, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ396663.1 Human herpesvirus 5 strain HAN20, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ396662.1 Human herpesvirus 5 strain HAN38, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ221974.1 Human herpesvirus 5 strain 3157, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ221975.1 Human herpesvirus 5 strain JP, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ221973.1 Human herpesvirus 5 strain HAN13, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ244523.1 Human herpesvirus 5 strain Par 72 kDa immediate-early 1 protein (UL123) gene, complete cds 40.1 40.1 100% 0.048 100% GQ121041.1 Human herpesvirus 5 transgenic strain Towne substrain varL, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% BK000394.5 TPA: TPA_inf: Human herpesvirus 5 strain AD169 substrain varUK, complete 40.1 40.1 100% 0.048 100% Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident genome FJ527563.1 Human herpesvirus 5 strain AD169 substrain varUC, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% AY446894.2 Human herpesvirus 5 strain Merlin, complete genome 40.1 40.1 100% 0.048 100% 2.3. Của Taqman probe Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident GQ466044.1 Human herpesvirus 5 strain 3301, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ396663.1 Human herpesvirus 5 strain HAN20, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ396662.1 Human herpesvirus 5 strain HAN38, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ221974.1 Human herpesvirus 5 strain 3157, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ221975.1 Human herpesvirus 5 strain JP, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ221973.1 Human herpesvirus 5 strain HAN13, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ244523.1 Human herpesvirus 5 strain Par 72 kDa immediate-early 1 protein (UL123) gene, complete cds 60.0 60.0 100% 3e-07 100% GQ121041.1 Human herpesvirus 5 transgenic strain Towne substrain varL, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% BK000394.5 TPA: TPA_inf: Human herpesvirus 5 strain AD169 substrain varUK, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% FJ527563.1 Human herpesvirus 5 strain AD169 substrain varUC, complete genome 60.0 60.0 100% 3e-07 100% AY446894.2 Human herpesvirus 5 strain Merlin, complete genom= 60.0 60.0 100% 3e-07 100% 3. Kết quả cấu trúc thứ cấp kiểm tra trên 3.1. KQ cấu trúc kẹp tóc của primer xuôi KQ SELF-DIMER của primer xuôi Delta G -3.61 kcal/mole Base Pairs 2 5' ATCCACATCTCCCGCTTATCC || 3' CCTATTCGCCCTCTACACCTA KQ HETRO DIMER của primer xuôi với TaqMan probe Delta G -4.74 kcal/mole ΔG 2.48 kcal.mole-1 TM -68.2 oC ΔH -5.5 kcal.mole-1 ΔS -26.8 cal.K-1mole-1 Base Pairs 3 5' ATCCACATCTCCCGCTTATCC : ||| : 3' AACCCGATTGATACGTCTCGTACATACTCT KQ HETERO DIMER của primer xuôi với primer ngược Delta G -4.74 kcal/mole Base Pairs 3 5' ATCCACATCTCCCGCTTATCC : ||| :: 3' AGGAGCTTTCCGAGTACTTG 3.2. KQ cấu trúc kẹp tóc của primer ngược ΔG -1.5 kcal.mole -1 TM 43.9 oC ΔH -25.2 kcal.mole -1 ΔS -79.5 cal.K -1mole-1 KQ cấu trúc SELF-DIMER của primer ngược Delta G -8.53 kcal/mole Base Pairs 6 5' GTTCATGAGCCTTTCGAGGA : |||||| : 3' AGGAGCTTTCCGAGTACTTG KQ HETERODIMER primer xuôi-primer ngược Delta G -4.74 kcal/mole Base Pairs 3 5' GTTCATGAGCCTTTCGAGGA :: ||| : 3' CCTATTCGCCCTCTACACCTA KQ HETERO DIMER primer ngược với Taqman probe Delta G -6.6 kcal/mole Base Pairs 5 5' GTTCATGAGCCTTTCGAGGA : ||||| 3' AACCCGATTGATACGTCTCGTACATACTCT 3.3. KQ kẹp tóc của Taqman probe KQ SELF DIMER của TaqMan Probe Delta G -7.05 kcal/mole Base Pairs 4 5' TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCCCAA : : :: |||| :: : : 3' AACCCGATTGATACGTCTCGTACATACTCT KQ HETERO DIMER của TaqMan probe với primer xuôi Delta G -4.74 kcal/mole Base Pairs 3 5' TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCCCAA : ||| : 3' CCTATTCGCCCTCTACACCTA KQ HETERO DIMER của Taqman probe với primer ngược Delta G -6.6 kcal/mole Base Pairs 5 5' TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCCCAA ||||| : ΔG -1.44 kcal.mole-1 TM 43.5 oC ΔH -24 kcal.mole-1 ΔS -75.8 cal.K-1mole-1 3' AGGAGCTTTCCGAGTACTTG 4. Kết quả Annhyb một số loài khác với hệ primer và Taqman probe thiết kế 4.1. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của primer xuôi với 8 loài khác 4.2. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của TaqMan probe với 8 loài khác 4.3. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của primer ngược với 8 loài khác 5.Kết quả chạy phản ứng kiểm tra độ đặc hiệu của loài PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 11-May-10 04:38 PM Data generated on: 11-May-10 at 1:11 PM. Optical data file name: DH 11-05-10.opd Plate Setup file used: DH 11-05-10.pts Protocol file used: CMV.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 57.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct Setpoint A03 EBV(-) N/A 65.0 A04 EBV(+) 29.3 65.0 E04 MTB(+) 28.7 60.1 E05 HBV(+) 21.0 60.1 E06 HCV(+) 27.9 60.1 E07 HBV(-) N/A 60.1 E09 MTB(-) N/A 60.1 E10 HCV(-) N/A 60.1 E12 HPV(+) 25.8 60.1 F09 HPV(-) N/A 58.7 F11 CMV(+) 31.8 58.7 F12 CMV(-) N/A 58.7 G08 HSV(+) 25.2 57.7 G09 HSV(-) N/A 57.7 6.Kết quả chạy liên phản ứng ngày 1: PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 03-Jun-10 10:55 AM Data generated on: 01-Jun-10 at 01:53 PM. Optical data file name: 01-06-10.opd Plate Setup file used: 01-06-10.pts Protocol file used: CMV.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 57.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Standard Curve Graph for FAM-490 Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct SQ Mean SD Mean E02 Standard 1 36.13 2.000 1.00E+02 1.00E+02 N/A 36.13 E03 Standard 2 28.71 4.000 1.00E+04 1.00E+04 N/A 28.71 E04 Standard 3 22.65 6.000 1.00E+06 1.00E+06 N/A 22.65 E09 mẫu1 4 29.52 3.893 7.82E+03 7.82E+03 N/A 29.52 E10 mẫu 2 5 26.28 4.856 7.18E+04 7.18E+04 N/A 26.28 7. Kết quả chạy liên phản ứng ngày 2: PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 03-Jun-10 01:01 PM Data generated on: 02-Jun-10 at 04:53 PM. Optical data file name: 02-06-10.lien2.opd Plate Setup file used: 02-06-10.lien2.pts Protocol file used: CMV.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 57.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Standard Curve Graph for FAM-490 Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD E02 Standard 1 35.44 2.000 1.00E+02 1.00E+02 N/A 35.44 N/A E03 Standard 2 27.80 4.000 1.00E+04 1.00E+04 N/A 27.80 N/A E04 Standard 3 21.64 6.000 1.00E+06 1.00E+06 N/A 21.64 N/A F02 Mẫu 2 4 25.54 4.797 6.97E+04 6.27E+04 N/A 25.54 N/A F03 Mẫu 1 5 28.48 3.945 8.00E+03 8.80E+03 N/A 28.48 N/A 8. Kết quả chạy liên phản ứng ngày 3: PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 03-Jun-10 04:44 PM Data generated on: 03-Jun-10 at 02:00 PM. Optical data file name: Lien 3.opd Plate Setup file used: Lien 3.pts Protocol file used: CMV.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 57.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Standard Curve Graph for FAM-490 Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD E02 Standard 1 33.99 2.000 1.00E+02 1.00E+02 N/A 33.99 N/A E03 Standard 2 27.08 4.000 1.00E+04 1.00E+04 N/A 27.08 N/A E04 Standard 3 20.75 6.000 1.00E+06 1.00E+06 N/A 20.75 N/A G02 mẫu2 4 22.97 5.299 9.01E+04 1.99E+05 N/A 22.97 N/A G06 mẫu 1 5 26.29 4.297 9.18E+03 1.98E+04 N/A 26.29 N/A 9. Kết quả chạy phản ứng đại diện mẫu 7792 và 3544 PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 21-Jun-10 09:11 AM Data generated on: 25-Apr-10 at 11:04 AM. Optical data file name: CMV- 24-04-2010.opd Plate Setup file used: CMV 24-04-2010.pts Protocol file used: CUC.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 57.0ºC for 01:00 Data collection enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Standard Curve Graph for FAM-490 PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 22-Jun-10 01:13 AM Data generated on: 08-Feb-10 at 07:20 PM. standard 7792 Optical data file name: CMV 08-02-10.opd Plate Setup file used: CMV 08-02-10.pts Protocol file used: cmv 57.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 15:00 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 60.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 10. Kết quả xử lý thống kê hệ số biến thiên nội phản ứng: 11. Kết quả xử lý thống kê hệ số biến thiên liên phản ứng: 3544 HSBTLPƯ 102 104 106 Mẫu 1 Mẫu 2 Giá trị trung bình (M) 35,18 27,86 21,68 28,097 24,93 Sai số chuẩn của giá trị trung bình 0,63 0,47 0,54 0,95 1,002 Giá trị trung vị 35,44 27,8 21,64 28,48 25,54 Độ lệch chuẩn (S) 1,09 0,81 0,95 1,64 1,73 Khoảng quan sát 2,14 1,63 1,9 3,23 3,31 Giá trị nhỏ nhất 33,99 27,08 20,75 26,29 22,97 Giá trị lớn nhất 36,13 28,71 22,65 29,52 26,28 Tổng 105,56 83,59 65,04 84,29 74,79 Số lần lặp lại 3 3 3 3 3 Giới hạn và khoảng tin cậy (95,0%) 2,71 2,02 2,36 4,09 4,31 HSBT (CV)=S/M x100 3,10 2,93 4,38 5,86 6,96 P (ĐỘ CHÍNH XÁC)=100-CV 96,89 97,06 95,61 94,13 93,03 12. Các thiết bị sử dụng Tiêu chuẩn (HSBTNPƯ) 102 104 106 Mẫu 1 Mẫu 2 Giá trị trung bình (M) 32,55 27,76 19,58 26,52 35,06 Sai số chuẩn của giá trị trung bình 0,75 0,17 0,34 0,39 0,30 Giá trị trung vị 32,56 27,6 19,48 26,75 34,97 Độ lệch chuẩn (S) 1,30 0,29 0,58 0,67 0,53 Khoảng quan sát 2,6 0,52 1,15 1,28 1,04 Giá trị nhỏ nhất 31,25 27,58 19,05 25,76 34,59 Giá trị lớn nhất 33,85 28,1 20,2 27,04 35,63 Tổng 97,66 83,28 58,73 79,55 105,19 Số lần lặp lại 3 3 3 3 3 Giới hạn và khoảng tin cậy (95,0%) 3,23 0,73 1,44 1,67 1,31 HSBT (CV)=S/M x100 3,99 1,06 2,97 2,53 1,50 P (ĐỘ CHÍNH XÁC)=100-CV 96,01 98,94 97,03 97,47 98,50 Tủ tách chiết DNA Máy chạy phản ứng Real-Time PCR Máy Bio-Rad, chạy phản ứng Real-Time PCR. Máy ly tâm Máy ủ khô Máy vorte x 13. Cấu trúc primers và probe đặc hiệu của 6 loài virus khảo sát độ đặc hiệu: 1. EBV - forward : 5’-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3’ - reverse : 5’-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3’ - probe: 5’-FAM-ACAAATTGCCAGTAGCCCACCAGGAGA-TAMRA-3’ 2. MTB 16s RNA - S97(F): 5’-GTGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’ - TBR: 5’- CCTACCAAGGCGACGACG-3’ - TB probe : 5’-FAM-CTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTGGTCCT-TAMRA- 3’ 3. HBV - HBVTAQ1 (F): 5’-GTG TCT GCG GCGTTT TAT CA-3’ - HBVTAQ2(R): 5’-GAC AAA CGG GCA ACA TAC CTT-3’ - HBVTAQPR: 5’ FAM-CCT CT(T/G) CAT CCT GCT GCT ATG CCT CAT C- TAMRA-3’ 4. HPV - fw: 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’ - re: 5’- CTTTTTATTGACATTTAGTATAAG-3’ - Probe: 5’- Fam- GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA-Tamra-3’ 5. HSV - F: 5’-GAG TGC GAA AAG ACG TTC-3’ - R: 5’-GTC TAC GAG GAC GGC C-3’ - P: 5’-FAM-TGC TCA TCA AGG GCG TGG ATC TGG-TAMRA-3’ 6. HCV - R: 5’-CGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCG-3’ - F: 5’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’ - Probe: 5’-FAM-GCGAGCCACCGGAATTGCCAGGACGACCGCTCGC-Tamra-3’ M?u QUY TRÌNH TÁCH CHI?T DNA/RNA Vào e ppe ndorf ch? a 90 0 µ l du ng d?ch 1 Ly tâm 13.00 0 v òng/ph út, 10 phút Hút 200 µ l µ lm?u (M?u b ?n hlao h út1 00 µ l) Vortex Tr?n d?u Thêm và o 200 µ l d ung d ?ch 2 Hút6 00 µ l du ng d?ch n? ivào eppe ndorf có s?n 6 00 µl du ng d?ch 3Làm l?nh 10 p hút Ly tâ m1 3.000 vòn g/phú t, 10 p hút Ð? yên 10 p hút Ð?d ung d?ch n ?i Thu c?n màu xan h Thêm và o 900 µ l d ung d?ch 4 Ly tâm 13 .0 00 v òng /p hút, 5 p hút Ð?d ung d ?ch n ?i thu c?n màu xan h Th?mv ào gi?y cho ráo S?y khô ? 60 oC Cho vào 50 µ l d ung d?ch TE 1X M?u lao c ho vào 1 00 µ l d ung d ?ch TE 1 X B?o q u?n l?nh -20 oC M?uRNA cho v ào 50 µ l du ng d?ch DEPC