Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real- Time PCR

khuếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân tích kết quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mồi tối ưu của cặp mồi pha trộn trong phản ứng 1, 2, 3 với nồng độ mồi thay đổi theo dãy nồng độ sau: 100; 200; 300; 400; 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mồi, chỉ có nồng độ mồi là thay đổi, nhiệt độ lai tối ưu là 660C, còn các thành phần phản ứng cũng không đổi và thêm nước cất cho đủ 25μl. 3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng 1 Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 1 được thể hiện trong hình 3.22 và bảng 3.8 dưới đây. Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 1 A - Mẫu không chứa đột biến; B - Mẫu amplicon đột biến rtA181V. Từ kết quả trong hình 3.22 và bảng 3.8, cho thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính ở tất cả các nồng độ mồi khảo sát; còn mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính (không vượt tín hiệu nền), duy chỉ có ở nồng độ mỗi mồi là 500nM cho kết quả dương tính. Nguyên nhân có thể là do nồng độ mồi quá cao dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu và gây hiện tượng dương tính giả, nên nồng độ mồi tối ưu sẽ nằm trong khoảng 100-400nM. Sau đó, chúng tôi tiến hành lặp lại phản ứng nhiều lần và kết quả khảo sát luôn ổn định, trong đó tại nồng mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính với tín hiệu mạnh, đường cong của đồ thị là cao A B 300nM nhất, nên chúng tôi chọn nồng độ 300nM là nồng độ mồi tối ưu của phản ứng 1 làm tiêu chí cho các lần khảo sát tiếp theo. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 1 Mẫu Nồng độ mỗi mồi (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-1 (-) 500 FAM 36,4 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA181 (+) 500 FAM 25,6 400 FAM 24,3 300 FAM 23,0 200 FAM 25,2 100 FAM 24,7 3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng 2 Ảnh hưởng nồng độ mồi lên phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.23 và bảng 3.9. Căn cứ vào kết quả trong hình 3.23 và bảng 3.9, mẫu amplicon mang đột biến rtA181T cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, còn mẫu chứng âm không chứa đột biến tại codon 181 đều cho kết quả âm tính. Chúng tôi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tôi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo. A B 300nM Hình 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 2 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu amplicon mang đột biến rtA181T. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 2 Mẫu Nồng độ mỗi mồi (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-2 (-) 500 FAM No Ct 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA181-2 (+) 500 FAM 24,3 400 FAM 23,6 300 FAM 24,2 200 FAM 24,8 100 FAM 24,6 3.4.3 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng 3 Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.24 và bảng 3.10. Hình 3.24: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 3 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu amplicon mang đột biến rtN236T. Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ mồi lên phản ứng 3 Mẫu Nồng độ mỗi mồi (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) 200nM A B Mẫu VA236 (-) 500 FAM No Ct 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA236 (+) 500 FAM 28,9 400 FAM 28,5 300 FAM 27,9 200 FAM 26,6 100 FAM 27,6 Dựa vào hình 3.24 và bảng 3.10, mẫu amplicon mang đột biến rtN236T cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, còn mẫu chứng âm không chứa đột biến rtN236T đều cho kết quả âm tính. Chúng tôi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 200nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tôi chọn nồng độ mỗi mồi là 200nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo. 3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò tối ưu Cũng như nồng độ mồi, nồng độ probe cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ probe theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ probe chỉ có nồng độ probe là thay đổi, còn các thành phần khác của phản ứng là như nhau và các chỉ tiêu nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi tối ưu được giữ nguyên. 3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1 Ảnh hưởng của nồng độ probe trong phản ứng 1 được thể hiện trong hình 3.25 và bảng 3.11. Hình 3.25: Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 1 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu A B 300nM amplicon mang đột biến rtA181V. Qua kết quả trong hình 3.25 và bảng 3.11, chúng tôi nhận thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính và mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính ở các nồng độ probe khảo sát. Sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, chúng tôi chọn nồng độ probe là 300nM làm nồng độ tối ưu vì tại nồng độ này phản ứng ổn định, đường cong đồ thị rõ nét và cao nhất. Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 1 Mẫu Nồng độ probe (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-1 (-) 500 FAM No Ct 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA181-1 (+) 500 FAM 25,1 400 FAM 23,8 300 FAM 24,3 200 FAM 22,8 100 FAM 24,3 3.5.2 Khảo sát nồng độ mẫu dò của phản ứng 2 Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.26 và bảng 3.12. Hình 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 2 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu amplicon chứa đột biến rtA181T. Từ kết quả phân tích trong hình 3.26 và bảng 3.12 ở trên, sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, mẫu chứng dương cho kết quả là những đường cong vượt tín hiệu nền, còn mẫu chứng âm cho kết quả là các đường cong không vượt qua tín hiệu nền. Qua phân tích kết quả, tại nồng probe 300nM kết quả luôn ổn định và cho đường cong đồ thị cao nhất. Do đó, chúng tôi chọn làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát kế tiếp. Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 2 Mẫu Nồng độ probe (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-2 (-) 500 FAM No Ct 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA181-2 (+) 500 FAM 25,7 400 FAM 23,8 300 FAM 24,3 200 FAM 22,7 100 FAM 25,6 3.5.3 Khảo sát nồng độ mẫu dò của phản ứng 3 300nM B A Ảnh hưởng của nồng độ probe trong phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.27 và bảng 3.13. Từ kết quả trong hình 3.27 và bảng 3.13, ở các nồng độ probe P236 khác nhau, mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính, còn mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ probe 300nM chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong cao nhất và rõ nét. Hình 3.27: Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 3 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu amplicon chứa đột biến rtN236T. Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ probe lên phản ứng 3 Mẫu Nồng độ probe (nM) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA236 (-) 500 FAM No Ct 400 FAM No Ct 300 FAM No Ct 200 FAM No Ct 100 FAM No Ct Mẫu VA236 (+) 500 FAM 25,5 400 FAM 24,2 300 FAM 22,9 200 FAM 22,6 100 FAM 25,4 Sau đó, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiều lần, tại nồng độ probe P236 là 300nM mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính mạnh nhất. Do vậy, chúng tôi chọn nồng độ P236 là 300nM làm tiêu A B 300nM chí cho các lần khảo sát tiếp theo. 3.6 Khảo sát nồng độ Mg2+ Ion Mg2+ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ Mg2+ tối ưu cho các phản ứng, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi còn các điều kiện phản ứng như nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, probe tối ưu vẫn được giữ nguyên. 3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg2+ của phản ứng 1 Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 1 thể hiện trong hình 3.28 và bảng 3.14. Hình 3.28: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 1 A – Mẫu không chứa đột biến; B – Mẫu amplicon chứa đột biến rtA181V. Dựa vào kết quả trong hình 3.28 và bảng 3.14, tại các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến đều cho kết quả âm tính, còn mẫu chứng amplicon mang đột biến rtA181V đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho kết quả mạnh nhất. Sau khi lặp lại thí nghiệm nhiều lần, chứng dương đều cho kết quả ổn định và mạnh nhất tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM. Do vậy, chúng tôi chọn nó làm nồng độ tối ưu. A B 3,0mM Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 1 Mẫu Nồng độ Mg2+ (mM) Chất phát huỳnh quang Ct (Threshold cycle) Mẫu VA181-1 (-) 1,5 FAM No Ct 2,0 FAM No Ct 2,5 FAM No Ct 3,0 FAM No Ct 3,5 FAM No Ct 4,0 FAM No Ct 4,5 FAM No Ct 5 FAM No Ct Mẫu VA181-1 (+) 1,5 FAM 25,5 2,0 FAM 25,4 2,5 FAM 24,6 3,0 FAM 25,4 3,5 FAM 24,6 4,0 FAM 25,1 4,5 FAM 26,6 5 FAM 23,9 3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg2+ của phản ứng 2 Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.29 và bảng 3.15. Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29 và bảng 3.15, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến rtA181T đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến rtA181T đều cho kết quả dương tính. A B 3,0mM Hình 3.29: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 2 A – Đối với chủng hoang dại; B – Đối với amplicon đột biến. Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 2 Mẫu Nồng độ Mg2+ (mM) Chất phát huỳnh quang Ct (Threshold cycle) Mẫu VA181-2 (-) 1,5 FAM No Ct 2,0 FAM No Ct 2,5 FAM No Ct 3,0 FAM No Ct 3,5 FAM No Ct 4,0 FAM No Ct 4,5 FAM No Ct 5 FAM No Ct Mẫu VA181-2 (+) 1,5 FAM 25,4 2,0 FAM 25,1 2,5 FAM 25,7 3,0 FAM 24,0 3,5 FAM 24,9 4,0 FAM 24,9 4,5 FAM 24,8 5 FAM 24,7 Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tôi chọn nó làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 2. 3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg2+ của phản ứng 3 Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.30 và bảng 3.16. Hình 3.30: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 3 A – Đối với chủng hoang dại; B – Đối với amplicon đột biến. Căn cứ vào kết quả từ hình 3.30 và bảng 3.16, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến rtN236T đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến rtN236T đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 2,5mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tôi chọn 2,5mM làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 2. Bảng 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 3 Mẫu Nồng độ Mg2+ (mM) Chất phát huỳnh quang Ct (Threshold cycle) Mẫu VA236 (-) 1,5 FAM No Ct 2,0 FAM No Ct 2,5 FAM No Ct 3,0 FAM No Ct 3,5 FAM No Ct 4,0 FAM No Ct 4,5 FAM No Ct 5 FAM No Ct Mẫu VA236 (+) 1,5 FAM 28,0 2,0 FAM 29,1 A B 2,5mM 2,5 FAM 25,7 3,0 FAM 26,1 3,5 FAM 27,3 4,0 FAM 26,7 4,5 FAM 26,8 5 FAM 27,7 3.7 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng Tính biến động của phản ứng real-time PCR là một yếu tố rất quan trọng, chính điều này có thể làm sai lệch kết quả. Trên cùng một mẫu bệnh phẩm, kết quả thu được có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm, cũng như giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người tiến hành, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng hoặc do sự khác biệt giữa các phương pháp chuẩn bị mẫu, cũng như phương pháp tách chiết HBV DNA… Để đánh giá độ lặp lại của phản ứng real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm khác nhau (inter-assay). Các phản ứng được thực hiện trên các điều kiện tối ưu đã được khảo sát. 3.7.1 Độ lặp lại trong một thí nghiệm Để đánh giá độ lặp lại trong một thí nghiệm, chúng tôi thực hiện phản ứng trên các mẫu amplicon đột biến tại rt181 và rt236 ở các nồng độ 104 và 103 bản sao/ml. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần trong cùng một lần thí nghiệm. 3.7.1.1 Phản ứng 1 phát hiện đột biến rtA181V Độ lặp lại trong một lần thí nghiệm của phản ứng 1 được trình bày trong hình 3.31 và bảng 3.17. Hình 3.31: Độ lặp lại trong một thí nghiệm của phản ứng 1 Bảng 3.17: Hệ số biến thiên trong một thí nghiệm của phản ứng 1 HBV DNA (bản sao/ml) Ct (Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 29,0 28,8 28,7 0,2944 0,0981 103 32,1 31,8 32,8 32,2 0,4203 0,1401 Kết quả từ hình 3.31 và bảng 3.17 cho thấy phản ứng 1 phát hiện đột biến rtA181V có tính lặp lại trong một lần thí nghiệm cao, giá trị biến thiên nội phản ứng thấp hơn 1%. 3.7.1.2 Phản ứng 2 phát hiện đột biến rtA181T Độ lặp lại trong một lần thí nghiệm của phản ứng 1 được trình bày trong hình 3.32 và bảng 3.18. Hình 3.32: Độ lặp lại trong một thí nghiệm của phản ứng 2 Bảng 3.18: Hệ số biến thiên trong một thí nghiệm của phản ứng 2 HBV DNA (bản sao/ml) Ct (Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 27,7 28,3 28,1 0,2828 0,0943 103 34,5 33,9 33,4 33,9 0,4509 0,1503 28,3 28,3 Kết quả từ hình 3.32 và bảng 3.18 cho thấy phản ứng 2 phát hiện đột biến rtA181T có tính lặp lại trong một lần thí nghiệm cao, giá trị biến thiên nội phản ứng thấp hơn 1%. 3.7.1.3 Phản ứng 3 phát hiện đột biến rtN236T Kết quả từ hình 3.33 và bảng 3.19 cho thấy phản ứng 3 phát hiện đột biến rtN236T có tính lặp lại trong một lần thí nghiệm cao, giá trị biến thiên nội phản ứng thấp hơn 1%. Hình 3.33: Độ lặp lại trong một thí nghiệm của phản ứng 3 Bảng 3.19: Hệ số biến thiên trong một thí nghiệm của phản ứng 3 HBV DNA (bản sao/ml) Ct (Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 25,9 26,0 26,2 0,3559 0,1186 103 31,9 32,0 31,4 31,7 0,2708 0,0902 3.7.2 Độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm Chúng tôi cũng sử dụng các nồng độ pha loãng như trên. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần trong 3 ngày khác nhau. Các điều kiện để thực hiện phản ứng chính là các điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở trên. 3.7.2.1 Phản ứng 1 phát hiện đột biến rtA181V 26,7 Kết quả trong hình 3.34 và bảng 3.20 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến rtA181V có hệ số biến thiên < 2%. Vì vậy, phản ứng phát hiện đột biến rtA181V có tính lặp lại giữa các lần thí nghiệm. Hình 3.34: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1 A – Ngày 1; B – Ngày 2; C – Ngày 3. Bảng 3.20: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1 HBV DNA (bản sao/ml) Ct (Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 28,5 28,6 28,6 0,0816 0,0272 103 33,7 33,6 32,5 33,3 0,5291 0,1763 3.7.2.2 Phản ứng 2 phát hiện đột biến rtA181T Độ lặp lại liên phản ứng của phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.35 và bảng 3.21. 28,7 A C B Hình 3.35: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 2 A – Ngày 1; B – Ngày 2; C – Ngày 3. Bảng 3.21: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 2 HBV DNA (bản sao/ml) Ct (Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 28,8 29,4 28,8 0,4899 0,1633 103 34,2 33,2 34,0 33,8 0,4320 0,1440 Kết quả trong hình 3.35 và bảng 3.21 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến rtA181V có hệ số biến thiên < 2%. Vì vậy, phản ứng phát hiện đột biến rtA181T có tính lặp lại giữa các lần thí nghiệm. 3.7.2.3 Phản ứng 3 phát hiện đột biến rtN236T Độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm của phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.36 và bảng 3.22. 28,2 A C B Hình 3.36: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3 A – Ngày 1; B – Ngày 2; C – Ngày 3. Bảng 3.22: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3 HBV DNA (bản sao/ml) Ct (Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 26,6 26,1 26,3 0,2160 0,7200 103 31,6 32,0 29,4 31,0 1,1430 0,3810 Kết quả trong hình 3.36 và bảng 3.22 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến rtA181V có hệ số biến thiên < 2%. Vì vậy, phản ứng phát hiện đột biến rtA181T có tính lặp lại giữa các lần thí nghiệm. 3.8 Khảo sát độ nhạy của phản ứng real-time PCR Độ nhạy của phản ứng real-time PCR là khả năng phát hiện đột biến trong quần thể. Dung dịch HBV DNA sau khi được pha loãng thành nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp được sử dụng để khảo sát độ nhạy. Độ nhạy của phản ứng tương ứng với nồng độ amplicon đột biến thấp nhất cho kết quả dương tính. 3.8.1 Khảo sát độ nhạy của phản ứng 1 26,2 A C B Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 1 được thể hiện trong hình 3.37 và bảng 3.23. Hình 3.37: Độ nhạy của phản ứng 1 Từ kết quả trong hình 3.37 và bảng 3.23, khi nồng độ amplicon là 2.101 bản sao/ml cho kết quả âm tính (không phát hiện được), từ nồng độ amplicon 2.102 bản sao/ml trở lên đều phát hiện được. Và với nồng độ virus hoang dại (âm tính với đột biến) cao nhất đều cho kết quả âm tính sau nhiều lần khảo sát. Do vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng 1 là 2.102 bản sao/ml. Bảng 3.23: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 1 Mẫu Nồng độ HBV DNA (copies/ml) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-1 (+) 2. 105 FAM 25,0 2. 104 FAM 27,2 2. 103 FAM 32,2 2. 102 FAM 36,6 2. 101 FAM No Ct Mẫu VA181-1 (-) (-) FAM No Ct 3.8.2 Khảo sát độ nhạy của phản ứng 2 Giới hạn phát hiện đột biến của phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.38 và bảng 3.24. Hình 3.38: Độ nhạy của phản ứng 2 Từ kết quả trong hình 3.38 và bảng 3.24 ở trên, khi nồng độ amplicon là 2.101 bản sao/ml cho kết quả âm tính (không phát hiện được), từ nồng độ amplicon 2.102 bản sao/ml trở lên đều phát hiện được. Và với nồng độ virus không mang đột biến cao nhất đều cho kết quả âm tính sau nhiều lần khảo sát. Vì vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng 2 là 2.102 bản sao/ml. Bảng 3.24: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2 Mẫu Nồng độ HBV DNA (copies/ml) Chất phát huỳnh quang Threshold cycle (Ct) Mẫu VA181-2 (+) 2. 105 FAM 24,4 2. 104 FAM 27,8 2. 103 FAM 32,0 2. 102 FAM 36,7 2. 101 FAM No Ct Mẫu VA181-2 (-) (-) FAM No Ct 3.8.3 Khảo sát độ nhạy của phản ứng 3 Giới hạn phát hiện đột biến của phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.39 và bảng 3.25. Hình 3.39: Độ nhạy của phản ứng 3 Bảng 3.25: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 3 Mẫu Nồng độ HBV DNA (copies/ml) Chất phát huỳnh quang Ct (Threshold cycle ) Mẫu VA236 (+) 2. 105 FAM 20,0 2. 104 FAM 26,1 2. 103 FAM 31,1 2. 102 FAM 35,2 2. 101 FAM No Ct Mẫu VA236 (+) (-) FAM No Ct Từ kết quả trong hình 3.39 và bảng 3.25 ở trên, khi nồng độ amplicon là 2.101 bản sao/ml cho kết quả âm tính (không phát hiện được), từ nồng độ amplicon 2.102 bản sao/ml trở lên đều phát hiện được. Và với nồng độ virus không mang đột biến cao nhất đều cho kết quả âm tính sau nhiều lần khảo sát. Vì vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng 3 định tính đột biến rtN236T kháng ADV của HBV là 2.102 bản sao/ml. 3.9 Khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi và mẫu dò Hình 3.40: Độ đặc hiệu của các hệ mồi và mẫu dò thiết kế Bảng 3.26: Độ đặc hiệu của các hệ mồi và mẫu dò thiết kế Mẫu Bộ kít thử Ct (Threshold cycle) Phản ứng 1 Phản ứng 2 Phản ứng 3 VA181-1(+) 20,4 VA181-1(-) No Ct VA181-2(+) 18,7 VA181-2(-) No Ct VA236 (+) 20,1 VA236 (-) No Ct CMV 27,9 No Ct No Ct No Ct EBV 26,5 No Ct No Ct No Ct HCV 17,1 No Ct No Ct No Ct HPV 25,8 No Ct No Ct No Ct MTB 32,6 No Ct No Ct No Ct Để đảm bảo các cặp mồi và probe được sử dụng trong các phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng ADV là đặc hiệu đối với HBV, các phản ứng real-time PCR giữa các cặp mồi và probe thiết HCV(+) VA181-2(+) VA181-1(+) VA236 (+) MTB(+) CMV(+) EBV(+) HPV(+) VA181-1(-) VA181-2(-) VA236(-) EBV(+) CMV(+) HCV(+) HPV(+) MTB(+) kế cùng với DNA tách chiết của một số đối tượng vi sinh vật khác (CMV, EBV, HCV, HPV, MTB) sẽ được thiết lập. Hệ primer, probe được xem là đặc hiệu đối với đột biến kháng ADV của HBV sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và cho kết quả âm tính với mẫu chứng âm và các chủng vi sinh vật khác. Qua kết quả trong hình 3.40 và bảng 3.26, các mẫu dương tính với đột biến kháng ADV của HVB đều cho kết quả dương tính, còn các mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ trong quá trình thao tác không bị nhiễm và các cặp mồi hoạt động tốt. Các mẫu dương tính với CMV, EBV, HCV, HPV và MTB cho kết quả dương tính với các bộ kít phát hiện CMV, EBV, HCV, HPV và MTB (do Công ty Công nghệ Việt Á cung cấp); đồng thời cho kết quả âm tính lần lượt với các cặp mồi đặc hiệu với các đột biến kháng ADV đã thiết kế. Điều này cho thấy, các cặp mồi và probe thiết kế hoàn toàn đặc hiệu với HBV. 3.10 Quy trình phát hiện đột biến kháng ADV của HBV Thành phần của các phản ứng được thể hiện trong bảng 3.27. Bảng 3.27: Thành phần của các phản ứng real-time PCR Thành phần Phản ứng 1 Phản ứng 2 Phản ứng 3 PCR master mix (μl) 12,5 12,5 12,5 Mồi xuôi (nM) 300 300 200 Mồi ngược (nM) 300 300 200 Mẫu dò (nM) 300 300 300 MgCl2 (mM) 3,0 3,0 2,5 Sau khi khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng real-time PCR, chúng tôi đã xác định được các điều kiện tối ưu của mỗi phản ứng cũng như giới hạn phát hiện các virus mang đột biến trong quần thể. Hỗn hợp của mỗi phản ứng với các thành phần trên sẽ được thêm nước cất vào cho đủ một thể tích phản ứng là 20μl. Quy trình phát hiện đột biến kháng ADV của HBV: Mỗi mẫu bệnh phẩm được tiến hành qua 3 phản ứng với tổng thể tích 25μl, trong đó có 5μl dung dịch HBV đã tách chiết được bảo quản trong TE 1X. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính được điều trị bằng ADV hoặc không. Tách chiết HBV DNA bằng phương pháp tủa, sau đó bảo quản trong TE 1X ở -200C. Đặt phản ứng real-time PCR với nhiệt độ lai là 660C, tối đa 40 chu kỳ. Đọc kết quả real-time PCR dựa vào đường cong đồ thị, nếu đường cong vượt tín hiệu nền thì kết quả dương tính, nếu không vượt quá tín hiệu nền sẽ cho kết quả âm tính. Hình 3.41: Quy trình phát hiện đột biến kháng ADV của HBV 3.11 Ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 3.11.1 Mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong đề tài là những mẫu huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính được thu thập từ một số phòng xét nghiệm thuộc các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và Tp. Hồ Chí Minh. 3.11.2 Ứng dụng quy trình trên 35 mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm sau khi được tách chiết HBV DNA được bảo quản trong TE 1X ở -200C. Sau khi định lượng, chúng tôi tiến hành áp dụng quy trình phát hiện các đột biến kháng ADV trên 35 mẫu bệnh phẩm. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.28. Bảng 3.28: Kết quả áp dụng quy trình trên 35 mẫu bệnh phẩm STT Ký hiệu mẫu Nồng độ HBV DNA (copies/ml) Threshold cycle (Ct) Đột biến kháng ADV của HBV rtA181V rtA181T rtN236T 1 VA0210104 1,01.105 No Ct - - - 2 VA0910709 1,69.105 30,3 - - + 3 VA0920709 5,2.106 28,8 - - + 4 VA4321303 2,82.108 No Ct - - - 5 VA4331303 1,80. 106 28,8 - + - 6 VA4411303 6,26. 104 No Ct - - - 7 VA5221501 1,78. 107 No Ct - - - 8 VA5271503 3,50. 106 29,9 - + - 9 VA5281503 5,90. 107 33,8 + - - 10 VA6221903 5,27. 105 34,6 - + - 11 VA6251903 9,87. 105 No Ct - - - 12 VA6512003 4,54. 105 34,6 + - - 13 VA7212203 1,86. 105 No Ct - - - 14 VA7282203 1,14. 107 32,6 - + - 15 VA7312203 6,86. 107 27,8 + - - 16 VA7632303 2,04. 106 No Ct - - - 17 VA8182403 7,56. 104 26,7 + - - 18 VA8192403 1,99. 104 No Ct - - - 19 VA8272403 5,39. 106 33,0 + - - 20 VA8462503 1,40. 105 No Ct - - - 21 VA8522503 2,98. 108 26,2 + - - STT Ký hiệu mẫu Nồng độ HBV DNA (copies/ml) Threshold cycle (Ct) Đột biến kháng ADV của HBV rtA181V rtA181T rtN236T 22 VA8532503 5,39. 108 30,5 + - - 23 VA8542503 1,60. 106 No Ct - - - 24 VA9332803 3,69. 107 No Ct - - - 25 VA9773003 2,04. 107 No Ct - - - 26 VA9783003 7,99. 107 No Ct - - - 27 VA9793003 5,18. 105 No Ct - - - 28 VA9813003 5,80. 105 No Ct - - - 29 VA9823003 4,93. 107 No Ct - - - 30 VA9833003 1,14. 107 27,6 + - - 31 VA9843003 5,59. 105 No Ct - - - 32 VA10103103 6,99. 108 No Ct - - 33 VA10123103 2,45. 108 No Ct - - - 34 VA10133103 2,10. 108 29,5 + - - 35 VA10163103 1,35. 108 29,1 + - - Qua kết quả thu nhận từ bảng 3.28 trên, chúng tôi tổng kết lại trong bảng 3.29. Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong đề tài được chúng tôi thu thập từ nhiều phòng xét nghiệm khác nhau. Đó là những mẫu huyết thanh dương tính với HBV có nồng độ biết trước được xác định bằng bộ kít định lượng HBV (Công ty cổ phần công nghệ Việt Á cung cấp). Trong 35 mẫu nghiên cứu, có 19 mẫu âm tính (chiếm 54,29%) và 16 mẫu xuất hiện đột biến kháng ADV (chiếm 45,11%). Trong 16 mẫu mang đột biến, có 10 mẫu dương tính với đột biến rtA181V (chiếm 28,57%), 4 mẫu dương tính với đột biến rtA181T (chiếm 11,43%), 2 mẫu dương tính với đột biến rtN236T (chiếm 5,71%) và không có mẫu nào chứa cùng lúc cả hai đột biến rtA181V và rtA181T, rtA181V và rtN236T, rtA181T và rtN236T. Bảng 3.29: Tổng kết kết quả real-time PCR trên 35 mẫu bệnh phẩm Đặc điểm Số lượng mẫu Tỷ lệ (%) rtA181V 10 28,57 rtA181T 4 11,43 rtN236T 2 5,71 rtA181V và rtA181T 0 0 rtA181V và rtN236T 0 0 rtA181T và rtN236T 0 0 Không chứa cả 3 đột biến trên 19 54,29 Tổng 35 100,00 Các trường hợp dương tính với đột biến kháng ADV, vì điều kiện không cho phép nên chúng tôi không có số liệu về việc bệnh nhân có sử dụng ADV trong điều trị hay không. Do vậy, việc xuất hiện các đột biến kháng ADV tại các vị trí rt181 và rt236 có thể là do bệnh nhân đó đã từng hoặc đang được điều trị bằng ADV, cũng có thể mang chủng đột biến trong máu do bị lây nhiễm từ người khác. Trước đây, khi quy trình phát hiện đột biến kháng ADV chưa được phát hiện và công bố, bệnh nhân nhiễm HBV được chỉ định điều trị bằng ADV mà không được làm xét nghiệm. ADV chỉ có tác dụng đối với những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính không mang các đột biến rtA181V/T và rtN236T, không hiệu quả đối với các bệnh nhân nhiễm HBV có các đột biến trên. Việc xét nghiệm chẩn đoán các đột biến kháng ADV trước khi chỉ định điều trị bằng ADV nhằm phát hiện sớm các đột biến để định hướng điều trị, giảm đáng kể chi phí và tác dụng nặng nề của thuốc đối với người bệnh. CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua các kết quả khảo sát trong thực nghiệm, chúng tôi có các kết luận sau:  Các cặp mồi và mẫu dò hoàn toàn đặc hiệu với HBV, đảm bảo các đặc tính cần thiết và có khả năng nhân bản tốt về mặt lý thuyết lẫn thực nghiệm.  Chúng tôi đã xác định được các điều kiện tối ưu của các phản ứng và đưa ra quy trình phát hiện đột biến kháng ADV của HBV bằng kỹ thuật real-time PCR với độ nhạy của quy trình là 102 bản sao/ml.  Áp dụng quy trình thành công trên 35 mẫu bệnh phẩm và thu được kết quả như sau: 19 mẫu âm tính (chiếm 54,29%) và 16 mẫu xuất hiện đột biến kháng ADV (chiếm 45,11%). Trong 16 mẫu mang đột biến, có 10 mẫu dương tính với đột biến rtA181V (chiếm 28,57%), 4 mẫu dương tính với đột biến rtA181T (chiếm 11,43%), 2 mẫu dương tính với đột biến rtN236T (chiếm 5,71%) và không có mẫu nào chứa cùng lúc cả hai đột biến rtA181V và rtA181T, rtA181V và rtN236T, rtA181T và rtN236T. 4.2 Kiến nghị Về cơ bản, chúng tôi đã khảo sát và xây dựng thành công quy trình phát hiện đột biến kháng ADV của HBV bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan. Để quy trình này được đưa vào chẩn đoán thường quy và sử dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm cũng như các cơ sở y tế, chúng tôi có một số kiến nghị sau:  Tiếp tục khảo sát trên số lượng bệnh phẩm lớn hơn nhằm khẳng định độ tin cậy, chuẩn xác của quy trình.  Tiến hành so sánh các kết quả thu được khi áp dụng quy trình này với kết quả của một số phương pháp khác như PCR RFLP, giải trình tự, lai mẫu dò…  Tiến đến việc xây dựng quy trình định lượng HBV kháng ADV bằng kỹ tuật real-time PCR. TÀI LIỆU THAM KHẢO A – Tài liệu tiếng Việt 1. Đông Thị Hoài An, Cao Minh Nga, Phạm Hoàng Phiệt, Kenji Abé (2003), “Kỹ thuật định típ gen siêu vi viêm gan B bằng multiplex PCR trên bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mãn tính”, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, tập 7, phụ bản của số 1. 2. Huỳnh Trường An, Lê Huyền Ái Thúy, Lê Thị Trúc Linh (2009), “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtN236T kháng thuốc Adefovir trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Việt Nam bằng kỹ thuật real-time PCR”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh. 3. Lê Huy Chính, Nguyễn Vũ Trung (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học. 4. Nguyễn Thị Chính, Ngô Tiến Hiển (2001), Virus học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Giáo Dục. 6. Bùi Đại (2002), Viêm gan vi rút B và D, Nhà xuất bản Y học. 7. Châu Hữu Hầu (2006), Viêm gan virus C, Nhà xuất bản Y học TP. Hồ Chí Minh. 8. Bùi Hữu Hoàng (2002), “Ý nghĩa của các dấu ấn huyết thanh trong chẩn đoán và điều trị viêm gan siêu vi B”, Chuyên đề nghiên cứu. 9. Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Phạm Hoàng Phiệt, Erwin Sablon (2003), “Kiểu gen của siêu vi viêm gan B ở bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát”, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, tập 7, phụ bản của số 1. 10. Nguyễn Thành Khôi, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2009), “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến điểm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao bằng phương pháp real-time allele-specific PCR”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc – khu vực phía Nam. 11. Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 12. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2005), Sinh học phân tử: Giới thiệu phương pháp và ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 13. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 14. Cao Minh Nga, Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy (2008), “Tài liệu tập huấn: Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh nhiễm ở người”, Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á. 15. Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 16. Tierney, Mc. Phee, Papadakis (2008), Chẩn đoán và điều trị y học hiện đại – tập 2, Nhà xuất bản Y học. 17. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA – tập 2, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội. 18. Trần Thiện Toàn, Lê Huyền Ái Thúy, Nguyễn Văn Hưng (2009), “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến kháng Adefovir của HBV bằng phương pháp PCR trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Tp. Hồ Chí Minh. 19. Nguyễn Sử Minh Tuyết, Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2010), “Phát hiện đột biến rtL180M và rtM204V/I kháng Lamivudine ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính bằng kỹ thuật real-time PCR”, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, tập 14, phụ bản của số 1. 20. Phạm Văn Ty (2007), Virus học, Nhà xuất bản Giáo dục. 21. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR – Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường áp dụng, Nhà xuất bản Y học TP. Hồ Chí Minh. 22. Nguyễn Chí Vinh (2006), “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến kháng Lamivudine 180rt – 204rt và đột biến Basal core promoter của virus viêm gan B (Hepatitis B virus) bằng kỹ thuật PCR- RFLP”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. Hồ Chí Minh. B – Tài liệu tiếng Anh 23. Adams abd M.O.Moss (2001), Food Microbiology, published by the Royal society of chemistry, 60-81. 24.Carla Osiowy, Jean-Pierre Villeneuve, E. Jenny Heathcote, Elizabeth Giles and Jamie Borlang (2006), “Detection of rtN236T and rtA181V/T mutations associated with resistance to Adefovir dipivoxil in samples from patients with chronic Hepatitis B virus infection by the INNO-LiPA DR line probe assay (version 2)”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 44, No. 6, p. 1994-1997. 25. Chen J.J., Ma S.W., Wang Z.H., Sun J., Hou J.L. (2008), “Kinetics of HBV mutants conferring adefovir resistance (rtn236t) and a method to detect them rapidly”, Article in Chinese, 16 (1): 33-7. 26. Dieter Glebe, PhD, Series Editor (2007) Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes, p. 14-15. 27. Hadziyannis, S. J., Tassopoulos, N. C., Heathcote, E. J., Chang, T. T., Kitis, G., Rizzetto, M., Marcellin, P., Lim, S. G., Goodman, Z., Ma, J., Arterburn, S., Xiong, S., Currie, G., Brosgart, C. L., (2005), “Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B”, The New England Journal of Medicine 352, 2673–2681. 28. Julien Lupo, Sylvie Larrat, Marie-Noёlle Hilleret, Raphaёle Germi, Véronique Boyer, Sandrine Nicod, Gérard Barguès, Vincent Leroy, Jean-Marie Seigneurin, Jean-Pierre Zarski, Patrice Morand (2009), “Assessment of selective real-time PCR for quantitation of lamivudine and adefovir Hepatitis B virus-resistant strains and comparision with direct sequencing and line probe assays”, Journal of Virological Methods 156, p. 52-58. 29. Lai, C.L., Ratziu, V., Yuen, M. F., Poynard, T. (2004), Viral hepatitis B, Lancet 362, 2089–2093. 30. Lok, A. S., Zoulim, F., Locarnini, S., Bartholomeusz, A., Ghany, M. G., Pawlotsky, J. M., Liaw, Y. F., Mizokami, M., Kuiken, C., (2007), “Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations formanagement”, Hepatology 46, 254–265. 31.Munira Hussain, Scott Fung, Evelien Libbrecht, Erwin Sablon, Carmela Cursaro, Pietro Andreone, and Anna S. F. Lok (2006), “Sensitive Line Probe Assay That Simultaneously Detects Mutations Conveying Resistance to Lamivudine and Adefovir”, Journal of Clinical Microbiology, p. 1094- 1097, Vol. 44, No. 3. 32. Osiowy C, Villeneuve JP, Heathcote EJ, Giles E, Borlang J. (2006), “Detection of rtN236T and rtA181V/T mutations associated with resistance to adefovir dipivoxil in samples from patients with chronic hepatitis B virus infection by the INNO-LiPA HBV DR line probe assay (version 2)”, J Clin Microbiol, 44: 1994-1997. 33. Pawlotsky, J. M., Dusheiko, G., Hatzakis, A., Lau, D., Lau, G., Liang, T. J., Locarnini, S., Martin, P., Richman, D. D., Zoulim, F., (2008), “Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and practice: recommendations for a standardized approach”, Gastroenterology 134, 405–415. 34. Perrillo, R. P. (2005), “Current treatment of chronic hepatitis B: benefits and limitations. Semin”, Liver Dis. 25 (Suppl. 1), 20–28. 35. Rajib Kishore Hazam, Premashis Kar (2007), “HBV Drug resistant: its elevance in clinical practice”, Hepatitis B Annual, Vol. 4, Issue 1, p. 24-39. 36. Stephanos J. Hadziyannis, George V. Papatheodoridis (2003), “Treatment of HBeAg negative chronic Hepatitis B: Treatment with new drugs (Adefovir and others)”, Journal of Hepatology, Vol. 39, Supplement 1, p. 172-176. 37. Tania M. Welzel, Wendell J. Miley, Thomas L. Parks, James J. Goedert, Denise Whitby, and Betty A. Ortiz-Conde (2006), “Real-time PCR assay for detection and quantification of Hepatitis B virus genotypes A to G”, Journal of Clinical Microbiology, p. 3325–3333. 38. Tim Shaw, Angeline Bartholomeusz, Stephen Locarnini (2006), “HBV drug resistance: Mechanisms, detection and interpretation”, Journal of Hepatology, p. 593-606. 39. Villet, S., Pichoud, C., Billioud, G., Barraud, L., Durantel, S., Trepo, C., Zoulim, F. (2008), “Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure”, Journal of Hepatology 48, p. 747–755. 40. Westland, C.E., Yang, H., Delaney,W.E.T., Gibbs, C.S., Miller, M.D.,Wulfsohn, M., Fry, J., Brosgart, C.L., Xiong, S. (2003), “Week 48 resistance surveillance in two phase 3 clinical studies of adefovir dipivoxil for chronic hepatitis B”, Hepatology 38, p. 96-103. 41. Yan J., Xie W., Wang L., Wang J.B., Feng X., Song S.J., Liu S.A., Wei H.S. (2006), “Application of nest PCR-RFLP in the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation in Hepatitis B virus”, Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 14 (7): 714-717. C – Các Webside 42. www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ 43. www.elsevier.com/locate/jviromet 44. www.ncbi.nlm.nih.gov 45. 46. PHỤ LỤC 1. Bảng các gen sử dụng STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi chú 1 AP011102 gi|251822209|dbj|AP011102.1| 3215 Genome 2 AP011108 gi|251822239|dbj|AP011108.1| 3215 Genome 3 DQ993686 gi|149211580|gb|DQ993686.1| 3215 Genome 4 DQ993688 gi|149211593|gb|DQ993688.1| 3215 Genome 5 DQ993689 gi|149211598|gb|DQ993689.1| 3215 Genome 6 DQ993691 gi|149211607|gb|DQ993691.1| 3215 Genome 7 DQ993692 gi|149211614|gb|DQ993692.1| 3215 Genome 8 DQ993693 gi|149211621|gb|DQ993693.1| 3215 Genome 9 DQ993697 gi|149211638|gb|DQ993697.1| 3215 Genome 10 DQ993703 gi|149211679|gb|DQ993703.1| 3215 Genome 11 DQ993704 gi|149211686|gb|DQ993704.1| 3215 Genome 12 DQ993705 gi|149211692|gb|DQ993705.1| 3215 Genome 13 DQ993706 gi|149211698|gb|DQ993706.1| 3215 Genome 14 DQ993707 gi|149211705|gb|DQ993707.1| 3215 Genome 15 DQ993708 gi|149211712|gb|DQ993708.1| 3215 Genome 16 DQ993709 gi|149211719|gb|DQ993709.1| 3215 Genome 17 DQ993710 gi|149211726|gb|DQ993710.1| 3215 Genome 18 DQ993711 gi|149211732|gb|DQ993711.1| 3215 Genome 19 FJ621619 gi|224809850|gb|FJ621619.1| 1032 Gen P 20 FJ621620 gi|224809852|gb|FJ621620.1| 1032 Gen P 21 FJ621623 gi|224809858|gb|FJ621623.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi chú 22 FJ621629 gi|224809870|gb|FJ621629.1| 1032 Gen P 23 FJ621659 gi|224809930|gb|FJ621659.1| 1032 Gen P 24 FJ621708 gi|224810028|gb|FJ621708.1| 1032 Gen P 25 FJ621720 gi|224810052|gb|FJ621720.1| 1032 Gen P 26 FJ621760 gi|224810132|gb|FJ621760.1| 1032 Gen P 27 FJ621779 gi|224810170|gb|FJ621779.1| 1032 Gen P 28 FJ621836 gi|224810284|gb|FJ621836.1| 1032 Gen P 29 FJ621866 gi|224810344|gb|FJ621866.1| 1032 Gen P 30 FJ621928 gi|224810468|gb|FJ621928.1| 1032 Gen P 31 FJ621929 gi|224810470|gb|FJ621929.1| 1032 Gen P 32 FJ621979 gi|224810570|gb|FJ621979.1| 1032 Gen P 33 FJ622026 gi|224810664|gb|FJ622026.1| 1032 Gen P 34 FJ622054 gi|224810720|gb|FJ622054.1| 1032 Gen P 35 FJ622069 gi|224810750|gb|FJ622069.1| 1032 Gen P 36 FJ622078 gi|224810768|gb|FJ622078.1| 1032 Gen P 37 FJ622095 gi|224810802|gb|FJ622095.1| 1032 Gen P 38 FJ622097 gi|224810806|gb|FJ622097.1| 1032 Gen P 39 FJ622120 gi|224810852|gb|FJ622120.1| 1032 Gen P 40 FJ622127 gi|224810866|gb|FJ622127.1| 1032 Gen P 41 FJ622158 gi|224810928|gb|FJ622158.1| 1032 Gen P 42 FJ622168 gi|224810948|gb|FJ622168.1| 1032 Gen P 43 FJ622179 gi|224810970|gb|FJ622179.1| 1032 Gen P 44 FJ622183 gi|224810978|gb|FJ622183.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi chú 45 FJ622029 gi|224811030|gb|FJ622029.1| 1032 Gen P 46 FJ622293 gi|224811198|gb|FJ622293.1| 1032 Gen P 47 FJ622321 gi|224811253|gb|FJ622321.1| 1032 Gen P 48 FJ622325 gi|224811261|gb|FJ622325.1| 1032 Gen P 49 FJ622331 gi|224811273|gb|FJ622331.1| 1044 Gen P 50 FJ622340 gi|224811291|gb|FJ622340.1| 1032 Gen P 51 FJ622356 gi|224811323|gb|FJ622356.1| 1032 Gen P 52 FJ622364 gi|224811339|gb|FJ622364.1| 1031 Gen P 53 FJ622367 gi|224811345|gb|FJ622367.1| 1032 Gen P 54 FJ622378 gi|224811367|gb|FJ622378.1| 1032 Gen P 55 FJ622382 gi|224811375|gb|FJ622382.1| 1032 Gen P 56 FJ622391 gi|224811393|gb|FJ622391.1| 1032 Gen P 57 FJ622393 gi|224811397|gb|FJ622393.1| 1032 Gen P 58 FJ622400 gi|224811411|gb|FJ622400.1| 1032 Gen P 59 FJ622405 gi|224811421|gb|FJ622405.1| 1032 Gen P 60 FJ622407 gi|224811425|gb|FJ622407.1| 1032 Gen P 61 FJ622420 gi|224811451|gb|FJ622420.1| 1032 Gen P 62 FJ622423 gi|224811457|gb|FJ622423.1| 1032 Gen P 63 FJ622428 gi|224811467|gb|FJ622428.1| 1032 Gen P 64 FJ622445 gi|224811501|gb|FJ622445.1| 1032 Gen P 65 FJ622481 gi|224811573|gb|FJ622481.1| 1032 Gen P 66 FJ622488 gi|224811587|gb|FJ622488.1| 1032 Gen P 67 FJ622515 gi|224811641|gb|FJ622515.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi chú 68 FJ622643 gi|224811897|gb|FJ622643.1| 1032 Gen P 69 FJ622681 gi|224811973|gb|FJ622681.1| 1032 Gen P 70 FJ622699 gi|224812009|gb|FJ622699.1| 1032 Gen P 71 FJ622710 gi|224812031|gb|FJ622710.1| 1032 Gen P 72 FJ622742 gi|224812095|gb|FJ622742.1| 1032 Gen P 73 FJ622763 gi|224812137|gb|FJ622763.1| 1032 Gen P 74 FJ622764 gi|224812139|gb|FJ622764.1| 1032 Gen P 75 FJ622772 gi|224812155|gb|FJ622772.1| 1032 Gen P 76 FJ622805 gi|224812221|gb|FJ622805.1| 1032 Gen P 77 FJ622809 gi|224812229|gb|FJ622809.1| 1032 Gen P 78 FJ622819 gi|224812249|gb|FJ622819.1| 1032 Gen P 79 FJ622830 gi|224812271|gb|FJ622830.1| 1032 Gen P 80 FJ622840 gi|224812291|gb|FJ622840.1| 1032 Gen P 81 FJ751281 gi|224978596|gb|FJ751281.1| 1032 Gen P 82 FJ751285 gi|224978604|gb|FJ751285.1| 1028 Gen P 83 FJ751286 gi|224978606|gb|FJ751286.1| 1024 Gen P 84 FJ751289 gi|224978612|gb|FJ751289.1| 1032 Gen P 85 FJ751292 gi|224978618|gb|FJ751292.1| 1024 Gen P 86 FJ751315 gi|224978663|gb|FJ751315.1| 1028 Gen P 87 FJ751564 gi|224979145|gb|FJ751564.1| 1028 Gen P 88 FJ751362 gi|224978751|gb|FJ751362.1| 1030 Gen P 89 FJ751364 gi|224978755|gb|FJ751364.1| 1022 Gen P 90 FJ751385 gi|224978797|gb|FJ751385.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi chú 91 FJ751421 gi|224978868|gb|FJ751421.1| 1031 Gen P 92 FJ751423 gi|224978872|gb|FJ751423.1| 1028 Gen P 93 FJ751429 gi|224978883|gb|FJ751429.1| 1024 Gen P 94 FJ751432 gi|224978888|gb|FJ751432.1| 1028 Gen P 95 FJ751434 gi|224978892|gb|FJ751434.1| 1032 Gen P 96 FJ751437 gi|224978898|gb|FJ751437.1| 1032 Gen P 97 FJ751439 gi|224978902|gb|FJ751439.1| 1032 Gen P 98 FJ751440 gi|224978904|gb|FJ751440.1| 1032 Gen P 99 FJ751446 gi|224978915|gb|FJ751446.1| 1024 Gen P 100 FJ751452 gi|224978927|gb|FJ751452.1| 1018 Gen P 101 FJ751460 gi|224978943|gb|FJ751460.1| 1021 Gen P 102 FJ751461 gi|224978945|gb|FJ751461.1| 1021 Gen P 103 FJ751463 gi|224978949|gb|FJ751463.1| 1023 Gen P 104 FJ751470 gi|224978963|gb|FJ751470.1| 1022 Gen P 105 FJ751478 gi|224978979|gb|FJ751478.1| 1022 Gen P 106 FJ751481 gi|224978985|gb|FJ751481.1| 1026 Gen P 107 FJ751492 gi|224979004|gb|FJ751492.1| 1032 Gen P 108 FJ751495 gi|224979009|gb|FJ751495.1| 1027 Gen P 109 FJ751498 gi|224979015|gb|FJ751498.1| 1031 Gen P 110 FJ751500 gi|224979019|gb|FJ751500.1| 1028 Gen P 111 FJ751502 gi|224979023|gb|FJ751502.1| 1032 Gen P 112 FJ751503 gi|224979025|gb|FJ751503.1| 1028 Gen P 113 FJ751508 gi|224979035|gb|FJ751508.1| 1024 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi chú 114 FJ751517 gi|224979053|gb|FJ751517.1| 1023 Gen P 115 FJ751523 gi|224979065|gb|FJ751523.1| 1020 Gen P 116 FJ751547 gi|224979112|gb|FJ751547.1| 1021 Gen P 117 FJ751560 gi|224979137|gb|FJ751560.1| 1024 Gen P 118 FJ751577 gi|224979168|gb|FJ751577.1| 1028 Gen P 119 FJ751579 gi|224979172|gb|FJ751579.1| 1028 Gen P 120 FJ751590 gi|224979193|gb|FJ751590.1| 1028 Gen P 121 FJ751591 gi|224979195|gb|FJ751591.1| 1028 Gen P 122 FJ751599 gi|224979209|gb|FJ751599.1| 1032 Gen P 123 FJ751601 gi|224979212|gb|FJ751601.1| 1032 Gen P 124 FJ751602 gi|224979214|gb|FJ751602.1| 1028 Gen P 2. Kết quả real-time PCR trên 35 mẫu bệnh phẩm 2.1 Lô 1 – Chạy trên 14 mẫu bệnh phẩm PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 12-Aug-10 09:59 AM Data generated on: 27-Mar-10 at 12:57 PM. Optical data file name: CHAY 14 MAU BENH PHAM 26-03-2010.opd Plate Setup file used: HBV Khang Aderfovir 26-03-2010.pts Protocol file used: Taqman.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 66.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Data Analysis Parameters Calculated threshold using the maximum curvature approach is 46.8. Per-well baseline cycles have been determined automatically. Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle. Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off. PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct Setpoint B02 181-1 (+) 29.9 B03 181-1 (-) N/A B04 181-1-622 N/A B05 181-1-625 N/A B06 181-1-651 34.6 B07 181-1-721 N/A B08 181-1-728 32.6 B09 181-1-731 27.8 B10 181-1-763 N/A B11 181-1-818 26.7 C02 181-1-819 N/A C03 181-1-827 33 C04 181-1-846 N/A C05 181-1-852 26.2 C06 181-1-853 30.5 C07 181-1-854 N/A C08 181-2 (+) 26.9 C09 181-2 (-) N/A C10 181-2-622 34.6 C11 181-2-625 N/A D02 181-2-651 N/A D03 181-2-721 N/A D04 181-2-728 32.6 D05 181-2-731 N/A D06 181-2-763 N/A D07 181-2-818 N/A D08 181-2-819 N/A D09 181-2-827 N/A D10 181-2-846 N/A D11 181-2-852 N/A E02 181-2-853 N/A E03 181-2-854 N/A E04 236(+) 31.6 E05 236(-) N/A E06 236-622 N/A E07 236-625 N/A E08 236-651 N/A E09 236-721 N/A E10 236-728 N/A E11 236-731 N/A F02 236-763 N/A F03 236-818 N/A F04 236-819 N/A F05 236-827 N/A F06 236-846 N/A F07 236-852 N/A F08 236-853 N/A F09 236-854 N/A Wells Excluded from Analysis No wells have been excluded from analysis. 2.2 Lô 2 – Chạy trên 9 mẫu bệnh phẩm PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 12-Aug-10 09:59 AM Data generated on: 27-Mar-10 at 12:57 PM. Optical data file name: CHAY 9 MAU BENH PHAM 28-03-2010.opd Plate Setup file used: HBV Khang Aderfovir 28-03-2010.pts Protocol file used: Taqman.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 13:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 66.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Data Analysis Parameters Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 63.9. Per-well baseline cycles have been determined automatically. Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle. Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off. PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct Setpoint B02 181-1 (+) 28.5 B03 181-1 (-) N/A B04 181-1-021 N/A B05 181-1-091 N/A B06 181-1-092 N/A B07 181-1-432 N/A B08 181-1-433 N/A B09 181-1-441 N/A B10 181-1-522 N/A B11 181-1-527 N/A B12 181-1-528 33.8 C02 181-2 (+) 29.4 C03 181-2 (-) N/A C04 181-2-021 N/A C05 181-2-091 N/A C06 181-2-092 N/A C07 181-2-432 N/A C08 181-2-433 28.8 C09 181-2-441 N/A C10 181-2-522 N/A C11 181-2-527 29.9 C12 181-2-528 N/A D02 236 (+) 29.0 D03 236 (-) N/A D04 236-021 N/A D05 236-091 30.3 D06 236-092 28.8 D07 236-432 N/A D08 236-433 N/A D09 236-441 N/A D10 236-522 N/A D11 236-527 N/A D12 236-528 N/A Wells Excluded from Analysis No wells have been excluded from analysis. Modified Well Contents No wells have been modifed. 2.3 Lô 3 – Chạy trên 12 mẫu bệnh phẩm PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 12-Aug-10 09:59 AM Data generated on: 27-Mar-10 at 12:57 PM. Optical data file name: CHAY 12 MAU BENH PHAM 02-04-2010.opd Plate Setup file used: HBV Khang Aderfovir 02-04-2010.pts Protocol file used: Taqman.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC for 03:30 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC for 00:15 Step 2: 55.0ºC for 01:00 Data collection and real-time analysis enabled. Step 3: 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Data Analysis Parameters Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 75.8. Per-well baseline cycles have been determined automatically. Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle. Weighted Mean digital filtering has been applied. Global filtering is off. PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct Setpoint B02 181-1 (+) 25.0 B03 181-1 (-) N/A B04 181-1-933 N/A B05 181-1-977 N/A B06 181-1-978 N/A B07 181-1-979 N/A B08 181-1-981 N/A B09 181-1-982 N/A B10 181-1-983 27,6 C02 181-1-984 N/A C03 181-1-1010 N/A C04 181-1-1012 N/A C05 181-1-1013 29.5 C06 181-1-1016 29.1 D02 181-2 (+) 26.0 D03 181-2 (-) N/A D04 181-2-933 N/A D05 181-2-977 N/A D06 181-2-978 N/A D07 181-2-979 N/A D08 181-2-981 N/A D09 181-2-982 N/A D10 181-2-983 N/A E02 181-2-984 N/A E03 181-2-1010 N/A E04 181-2-1012 N/A E05 181-2-1013 N/A E06 181-2-1016 N/A F02 236 (+) 27.8 F03 236 (-) N/A F04 236-933 N/A F05 236-977 N/A F06 236-978 N/A F07 236-979 N/A F08 236-981 N/A F09 236-982 N/A F10 236-983 N/A G02 236-984 N/A G03 236-1010 N/A G04 236-1012 N/A G05 236-1013 N/A G06 236-1016 N/A Wells Excluded from Analysis No wells have been excluded from analysis. Modified Well Contents No wells have been modifed.