Luận văn Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm Ganoderma lucidum

àm giảm bớt, dùng Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 11 nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư. [2, 3] Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.[7, 8] Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Các nhà khoa học ở Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm Linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong Đông Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt. Ung thư tiền liệt tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000 người được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới. Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị Co mp an y C on fid en ti l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 12 tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001) ü Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1 ü Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1 ü Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma). Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [2, 22] Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985). Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng. [2] Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong cơ chế chống não hóa, chống ung thư. Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ. Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại năng như: Chì, Germanium. 2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng Hải báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần, điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140). Co mp an y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 13 Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin Trung thảo dược 1973,1:31). Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1). Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242). Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428). Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ 43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22). Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương. Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực. Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với cam thảo, gừng, táo. Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ Tất Lợi có ghi: Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày Co mp ny C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 14 giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp làm món ăn cao cấp. 2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI 2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16] Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng polysaccharid gồm 2 loại chính: GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) M= 23.000 Da GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan. b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt (Kishida & al., 1988). . Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm. Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh chi chất mucopolysaccharid dùng chống ung thư. 2.5.2 Ganoderic Acid Co mp a y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 15 Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19] Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11] Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan. 2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19] Hoạt chất Hoạt tính Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Ganodermaldiol Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol Co mp an y C on fid e tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 16 Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine: ü Giảm độ nhớt máu ü Ức chế kết dính tiểu cầu ü Ngăn chặn hình thành cục nghẽn ü Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin ü Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não ü Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 2.5.4 Alcaloid [10, 11] Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alcaloid. ü Tác dụng lên hệ thần kinh ü Tác dụng lên huyết áp ü Tác dụng trị ung thư 2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23] Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 17 ü Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean. ü Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như: ü Trị long đờm, chữa ho ü Là chất phụ gia trong một số vắc xin ü Tác dụng thông tiểu ü Tác dụng kháng viêm, chống khối u 2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19] Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium: ü Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư ü Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ ü Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ Co mp an y C on fid en ti l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 18 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thực phẩm, Khoa Sinh học Ứng dụng - Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí Minh 3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm khoa sinh học ứng dụng, Trường Cao Đẳng Kinh Tế - Công Nghệ Tp.HCM. 3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thiết bị Cân phân tích Kính hiển vi Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng Nồi hấp thanh trùng Tủ sấy 3.3.2 Hóa chất Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar. 3.3.3 Môi trường sử dụng 3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 19 3.3.3.2 Môi trường nhân giống Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với cám bắp. 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum 3.4.1.1 Hình thái quả thể 3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9] ü Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính ü Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn ü Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút ü Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95% ü Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu ü Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17] ü Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử ü Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính ü Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô ü Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100 3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng Cách tiến hành: Các môi trường đều được pha với nồng độ khác nhau. và được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy giống. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy ở nhiệt độ 500C và tiến hành cân trọng lượng khô. Tổng số chai cấy: 52 chai Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 20 3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PG + 1 g/l MgSO4 2 PG + 2 g/l MgSO4 3 PG + 3 g/l MgSO4 4 PG + 4 g/l MgSO4 3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PG + 0,5 g/l KH2PO4 2 PG + 1g /l KH2PO4 3 PG + 1,5 g/l KH2PO4 4 PG + 2 g/l KH2PO4 3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 P + 10 g/l Glucose 2 P + 15 g/l Glucose 3 P + 20 g/l Glucose Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 21 4 P + 25 g/l Glucose 5 P + 30 g/l Glucose 3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy pH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Ở các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau. Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm. Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai. Vậy tổng số chai cấy là 14 chai 3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 21. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai. Tổng số chai cấy là 10 chai. 3.5. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 3.5.1. Mục đích Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp quy hoạch thực Co mp an C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 22 nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm. 3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu Phương trình hồi quy được xây dựng từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào. Ảnh hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của chúng. Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 < p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05. Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong phương trình hồi qui cuối cùng. Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ lại trong phương trình. Phương trình hồi quy Yi = b0 +b1 1x + b2 2x + b3 3x + b12 1 2x x + b13 1 3x x + b23 2 3x x + b123 1 2 3x x x Trong đó ü Yi: Sinh khối nấm thu được (g/20ml) ü ix (i= 1 – k): là các yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố có hai mức là hai giới hạn biên của nó. ü bo, bi, bj, bij: là các hệ số trong phương trình hồi quy Để đơn giản trong tính toán, chuyển từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ nguyên (hệ mã hoá). Xét yếu tố được kí hiệu là Zi Zio = ( Zi max + Zimin)/2 Với: + Zimax: mức cao + Zimin: mức thấp + Zio: mức cơ sở ü Điểm có tọa độ (Z1o, Z2o, Z3o,…Zko) gọi là tâm của phương án Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 23 ü Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu làm gốc tọa độ. ü Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối. Phương trình hồi quy Y = b0 +b1 1x + b2 2x + b3 3x + b1b2 1 2x x + b1b3 1 3x x + b2b3 2 3x x + b1b2b3 1 2 3x x x Với + Y: sinh khối (g/20ml) + b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 : các hệ số trong phương trình hồi quy + 1x : nồng độ MgSO4 (g/l) + 2x : nồng độ KH2PO4 (g/l) + 3x : nồng độ Glucose (g/l) Bảng 3.1: Các yếu tố thí nghiệm Các yếu tố (g/l) Các mức 1x 2x 3x Mức cơ sở Khoảng biến thiên Mức trên Mức dưới Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm Số TN 1x 2x 3x y1 y2 y3 Ytb 1 + + + 2 - + + 3 + - + 4 - - + 5 + + - 6 - + - Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 24 7 + - - 8 - - - 3.6 XÁC ĐỊNH DƯỢC CHẤT CÓ TRONG NÂM LINH CHI 3.6.1 Phương pháp định tính alcaloid [11] 3.6.1.1 Chuẩn bị dịch thử Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau: - Phần 1: Bột nấm Linh chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 3.6.1.2 Thuốc thử định tính alcaloid - Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử. - Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần. Co mp an y C on fid e tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 25 Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. 3.6.2 Phương pháp xác định hợp chất saponin [11] Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính. 3.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả: Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++ 3.6.1.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13) Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm. ü Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoid. ü Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 26 3.6.3 Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard) Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether. Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid 3.6.4 Định tính acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ. 3.7 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE (GLPs) [15, 16] Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 27 Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001) Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc) đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi. Sinh khối nấm Linh Chi Nghiền Hổn hợp chiết rút lần 1 Bã chiết lần 1 Hỗn hợp chiết rút lần 2 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 3 Dịch chiết lần 1 Dịch chiết lần 2 -Ngâm nước 70oC trong 3 giờ -Ngâm trong nước 70oC trong 3 giờ -Ngâm trong cồn 80% ở 70oC trong 2 giờ Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 28 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẨU CỦA NẤM LINH CHI (GANODRMA LUCIDUM) 4.1.1 Hình thái quả thể nấm Linh chi Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm, Khoa sinh học ứng dụng trước đó, có hình dạng như sau : Hình 4.1: Hình thái nấm Linh chi Nhận xét: Quả thể của nấm Linh chi thu hái được có cuống ngắn, đính bên, cuống nấm to (đường kính 2- 3 cm), lớp vỏ cuống láng, đỏ nâu. Mũ nấm hình quạt, đôi khi có hình dị dạng, mặt mũ nấm láng, đỏ nâu, có vân gợn đồng tâm. Khi còn non, tai nấm có màu vàng chanh – vàng cam cho đến đỏ tươi, càng về già thì màu càng sẫm lại. Kích thước từ 3 – 12 cm, dày từ 1 – 3,5 cm. Phần đính cuống gồ lên hoặc lõm xuống. Mặt dưới thể quả thường màu trắng kem – hơi vàng, có nhiều lỗ nhỏ. Đây là lớp bào tầng sinh sản của nấm, chính những lỗ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. Mật độ lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn. Khi chúng tôi bổ đôi quả thể ra thì thấy đây là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm. Khi bào tử đảm chín thì nó được phóng thích dọc theo ống này và thoát ra ngoài qua miệng lỗ ống. Còn phần thịt nấm ở trên thì có màu vàng nâu đến nâu đỏ. Phân cách giữa phần trên và phần dưới (tầng sinh sản) là khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần dưới thì là ống thẳng hướng xuống. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 29 4.1.2 Hệ sợi nấm Ganoderma lucidum Hình 4.2: Hình thái sợi nấm Linh chi (vật kính dầu x100) 4.1.3 Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum Bào tử đảm có dạng hình trứng, chúng ta có thể thấy rõ trên cả 2 hình đều có đầu chóp tròn - nhọn, phồng căng. Bào tử nấm Linh chi có cấu trúc vỏ kép, có kiến tạo lỗ thủng (porus, lacunae) và có kích thước bào tử khoảng 8 – 11 x 6 – 8 µm Hình 4.3: Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum 4.2 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng 4.2.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng Mg2+ là khoáng chất cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, giúp quá trình sinh tổng hợp các chất tham gia xây dựng tế bào được xảy ra nhanh hơn. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng MgSO4 ở các hàm lượng khác nhau. Từ đó, chúng tôi có thể xác định được hàm lượng MgSO4 cần thiết để quá trình tạo sinh khối xảy ra nhanh nhất. Co mp an y C on fid e tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 30 Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.1: ảnh hưởng của MgSO4 lên môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy Khối lượng (g/20ml) NT1 PG + 1 g/l MgSO4 0,178 NT2 PG + 2 g/l MgSO4 0,346 NT3 PG + 3 g/l MgSO4 0,466 NT4 PG + 4 g/l MgSO4 0,379 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 NT1 NT2 NT3 NT4 Nghiệm thức kh ối lư ợn g si nh k hố i ( g/ 20 m l) Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ 4.1, chúng tôi nhận thấy khi sử dụng MgSO4 ở mức 1g/l thì sinh khối phát triển chậm nhất và khi tăng dần hàm lượng MgSO4 lên 3g/l thì lượng sinh khối thu được cao nhất 0,466 g/20ml và khi tăng hàm lượng MgSO4 lên 4g/l thì lượng sinh khối giảm đáng kể chỉ còn 0,379 g/20ml Điều này có thể khi tăng Mg2+ vượt quá mức chịu đựng của tế bào, sẽ ức chế sự hoạt một số enzyme cần thiết trong quá trình tổng hợp tế bào cũng như sẽ giảm các phản ứng tổng hợp trong tế bào sợi nấm. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 31 Kết luận: Chúng tôi chọn hàm lượng MgSO4 là 3 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo. 4.2.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng KH2PO4 là nguồn cung cấp kali và photphat cho nấm. Nguồn kali đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym hoạt động. Đồng thời, Kali đóng vai trò cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong và ngoài tế bào. Nguồn phosphate tham gia tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lượng KH2PO4 thích hợp cho môi trường nuôi cấy tơ nấm Linh chi Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.2: ảnh hưởng của KH2PO4 đến tốc độ tăng trưởng Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy Khối lượng (g/20ml) NT1 PG + 0,5g/l KH2PO4 0,322 NT2 PG + 1g/l KH2PO4 0,475 NT3 PG + 1,5g/l KH2PO4 0,449 NT4 PG + 2g/l KH2PO4 0,364 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 NT1 NT2 NT3 NT4 Nghiệm thức kh ối lư ợ ng s in h kh ối (g /2 0m l) Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 32 Nhận xét: Dựa và biểu đồ 4.2, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần thì lượng sinh khối tăng. Mặt khác, khi hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt quá mức chịu đựng của tế bào nấm Linh chi thì lượng sinh khối thu được giảm. Lượng sinh khối thu được cao nhất là 0,475 g/20ml khi hàm lượng KH2PO4 là 2 g/l. Khi lượng KH2PO4 là 1 g/l thì lượng sinh khối thu được thấp nhất 0,322 g/20ml Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng KH2PO4 là 1 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo. 4.2.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Nguồn cacbon dùng để tổng hợp nên các chất: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau. Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát hàm lượng Glucose ảnh hưởng tới tốc độ tạo sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng ở các mức thay đổi khác nhau. Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.3: Ảnh hưởng của Glucose đến tốc độ tăng trưởng Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy Khối lượng (g/20ml) NT1 P + 10 g/l Glucose 0,389 NT2 P + 15 g/l Glucose 0,414 NT3 P + 20 g/l Glucose 0,435 NT4 P + 25 g/l Glucose 0,247 NT5 P + 30 g/l Glucose 0,215 Co mp an y C nfi de nti al SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 33 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Kh ối lư ợn g si nh k hố i ( g/ 20 m l) Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ 4.3, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng Glucose tăng lên dần thì sinh khối sở nấm tăng. Khi hàm lượng Glucose càng tăng thì lượng sinh khối thu được càng giảm. Hàm lượng Glucose đạt mức 20g/l thì lượng sinh khối thu được là cao nhất 0,435 g/20ml. Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng glucose là 20 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo. 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA pH LÊN MÔI TRƯỜNG CẤY Hầu hết môi trường nuôi cấy đều có pH tối thích cho quá trình phát triển của từng giống. Sự tăng hoặc giảm pH (chính là sự tăng hoặc giảm H+) trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Linh chi. Chúng tôi tiến hành cấy giống trong chai thuỷ tinh 100ml, chứa một lượng môi trường là 20ml. Trước khi hấp thanh trùng, ta chỉnh pH môi trường trong các mẫu về các giá trị : pH =3,5 ; pH =4; pH =4,5; pH =5; pH =5,5; pH =6,8; pH =7. Sau đó tiến hành cấy giống bằng cách gắp một hạt lúa cho vào chai. Co mp a y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 34 Bảng 4.4: Ảnh hưởng pH lên tốc độ tạo sinh khối của Linh Chi pH Khối lượng (g/20ml) 3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7 TN 1 0,193 0,225 0,348 0,333 0,344 0,346 0,278 TN 2 0,111 0,241 0,290 0,366 0,386 0,336 0,270 Trung bình 0,152 0,233 0,319 0,349 0,365 0,341 0,274 Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh khối của Ganoderma lucidum Nhận xét Dựa vào biểu đồ trên chúng tôi nhận thấy sinh khối tơ nấm Linh chi có khả năng tăng trưởng tốt trong khoảng pH = 4,5 đến pH = 7,0. Khi nuôi cấy trong mô trường có pH = 3,5 thì khối lượng sinh khối thấp nhất 0,152 g/20ml. Sinh khối nấm tăng dần theo giá trị của pH, nhưng khi tăng giá trị pH 6,8 thì sinh khối giảm 0,341 g/20ml và giảm dần cho đến pH = 7,0 trong cùng một điều kiện nuôi cấy. 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7 pH Kh ối lư ợn g si nh k hố i ( g/ 20 m l) Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 35 Kết luận Như vậy chúng tôi chọn được giá trị pH = 5,5 là giá trị pH tối thích cho sự phát triển của tơ nấm với lượng sinh khối cao nhất đạt 0,365 g/20ml. 4.4 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM LINH CHI Quá trình sinh trưởng của tơ nấm phải trải qua 4 giai đoạn: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn cân bằng và giai đoạn già cỗi. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nuôi cấy sinh khối trong trong những chai nhỏ 100ml, chứa 20ml môi trường PG + MgSO4 + KH2PO4. Điều chỉnh về pH 5,5 rồi sau đó đem đi hấp thanh trùng. Mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa cho vào chai. Khoảng thời gian lấy mẫu là cách nhau 3 ngày. Mẫu được sấy khô ở 500C - 600C sau đó đi cân và ghi nhận số liệu. Bảng 4.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi thay đổi theo thời gian khi nuôi cấy trong môi trường lỏng Thời gian (ngày) TN 3 NGÀY 6 NGÀY 9 NGÀY 12 NGÀY 15 NGÀY 18 NGÀY 21 NGÀY LẦN 1 0,114 0,251 0,451 0,699 0,773 0,781 0,790 LẦN 2 0,144 0,265 0,461 0,685 0,787 0,819 0,820 TB 0.129 0.258 0.456 0.692 0.78 0.8 0.805 Co mp an y C on fid e tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 36 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 3 6 9 12 15 18 21 Ngày K hố i l ư ợ ng s in h kh ối (g /2 0m l) Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum Nhận xét Đường cong sinh trưởng là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy sinh khối sợi nấm Linh chi. Dựa vào đồ thị ta biết chính xác được khoảng thời gian nào sinh khối phát triển mạnh nhất, lúc nào sinh khối ổn định và lúc sinh khối bắt đầu già đi. Từ đường cong sinh trưởng chúng tôi nhận thấy: · Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít · Đến ngày thứ 12, sinh khối phát triển nhưng không nhanh, tơ nấm dần dần chuyển sang màu vàng · Từ ngày 12 đến ngày 15, sinh khối phát triển vượt bậc · Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng rất chậm, tơ nấm từ vàng nhạt chuyển sang màu vàng đậm 15 ngày Hình 4.4: Sinh khối sợi nấm Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 37 4.5 TỐI ƯA HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LỎNG NUÔI CẤY HỆ SỢI GANODERMA LUCIDUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM Chúng tôi xác định điền kiện tối ưu để thu được sinh khối cực đại, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm và tiến hành như sau: Xét k=3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm (Glucose, KH2PO4, MgSO4) và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Hàm mục tiêu Y là sinh khối Ganoderma lucidum Bảng 4.6 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng Các yếu tố (g/l) Các mức 1x 2x 3x Mức cơ sở 3,0 1,0 20 Khoảng biến thiên 0,5 0,2 2 Mức trên 3,5 1,2 22 Mức dưới 2,5 0,8 18 Trong đó x1 : Hàm lượng MgSO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) x2 : Hàm lượng KH2PO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) x3 : Hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) y1 : Khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 1 (g/20ml) y2 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 2 (g/20ml) y3 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 3 (g/20ml) Ytb : là khối lượng trung bình của sinh khối Ganoderma lucidum trong 3 lần lặp lại Bảng 4.7 : kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm Số TN 1x 2x 3x y1 Y2 Y3 Ytb 1 3,5 1,2 22 0,495 0,501 0,516 0,504 2 2,5 1,2 22 0,51 0,513 0,519 0,514 Co mp a y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 38 3 3,5 0,8 22 0,534 0,522 0,528 0,528 4 2,5 0,8 22 0,537 0,534 0,534 0,535 5 3,5 1,2 18 0,534 0,537 0,543 0,538 6 2,5 1,2 18 0,573 0,51 0,537 0,54 7 3,5 0,8 18 0,528 0,576 0,57 0,558 8 2,5 0,8 18 0,474 0,54 0,543 0,519 Kiểm tra sự đồng nhất của các phương sai 2iS theo tiêu chuẩn Cochran: (trung bình cộng của ba lần thí nghiệm) với k là số lần lặp lại thí nghiệm, k=3 Tra bảng với các thông số f = k – 1 = 2 N = 8 Thu được 0,5157tbG = Vậy 0,4471 0,5157tt tbG G= < = . Nên các phương sai đồng nhất, thí nghiệm lặp lại có nghĩa. 1 2 3 3 y y yy + += 2 2 2 2 1 2 3( ) ( ) ( ) 1i y y y y y yS k - + - + - = - 2 0,000378 iS =å 2 max 2 0,4471tt i SG S = = å Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 39 0.47 0.48 0.49 0.5 0.51 0.52 0.53 0.54 0.55 0.56 0.57 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 Nghiệm thức Kh ối lư ợn g si nh k hố i ( g/ 20 m l) Biểu đồ 4.5: Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm Sau khi tiến hành thí nghiệm tối ưu theo qui hoạch thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy nghiệm thức số 7 có các thành phần như sau: MgSO4 (3,5 g/l); KH2PO4 (0,8 g/l) và Glucose (18 g/l) thì sinh khối nấm Linh chi khô là cao nhất đạt 0,558 g/20ml. Để tiến hành thu sinh khối sợi nấm Linh chi phục vụ cho thử nghiệm sản xuất trà túi lọc và phân tích các hoạt chất có trong hệ sợi. Chúng tôi, tiến hành pha môi trường trường PG có bổ sung các thành phần các hoạt chất như trên và nuôi cấy tĩnh hệ sợi nấm Linh chi. Kết quả cho thấy, lượng sinh khối nấm Linh chi sau 15 ngày đạt năng suất 17 g/l. 4.6 XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.6.1 Định tính alkaloid · Thử nghiệm 1 Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc thử Mayer và thuốc thử Dragendoff ống 1 : dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Dragendoff ống 2: dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Mayer 1 2 Co mp an y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 40 Hình 4.5: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff Kết quả Dựa và kết quả thử nghiệm trên ta thấy Ống 1: Khi dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendoff thì dung dịch chuyển sang màu nâu nhưng không có kết tủa Ống 2: Dịch chiết có màu vàng nhạt, xuất hiện kết tủa trắng · Thử nghiệm 2 1 2 Hình 4.6: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff Kết quả Ống 1: xuất hiện màu vàng nhưng không có kết tủa Ống 2: màu hơi đục xuất hiện kết tủa nhưng với hàm lượng rất ít Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 41 Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử nghiệm thì kết quả là âm tính: Bột dược liệu trích với nước – acid: có thể trích hết tấc cả các alcaloid ở dạng baz tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+ -> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích luôn những hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp chất tuy không phải là alcaloid nhưng có thể cho kết quả dương tính với thuốc thử. Bột dược liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích được những alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích tốt các alcaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các alcaloid có cấu trúc đặc thù –C=C –N – . Kết luận: hoạt chất alcaloid có trong tơ nấm Linh chi đỏ với hàm lượng rất thấp nên những phương pháp định tính không thấy đươc sư hiện diện của chúng 4.6.2 Định tính saponin 4.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt Hình 4.7: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi Kết quả: Độ bền của bọt Kết quả Sau 15 phút + Sau 30 phút ++ Sau 60 phút +++ Co mp an y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 42 Độ bền của bọt đều bền vững sau 60 phút. Như vậy dược liệu từ sinh khối có chứa hoạt chất saponin 4.6.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Ống 1: dịch chiết sau khi cho acid vào Ống 2: dịch chiết sau khi cho bazo vào 1 2 Hình 4.8: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel Kết quả Bọt trong 2 ống nghiêm đều bền hơn 15 phút, bọt trong ống nghiệm 2 cao hơn gấp 3 lần cột bọt trong ống nghiệm 1 Như vậy, trong môi trường kiềm bọt bền hơn trong môi trường acid. Sơ bộ kết luận là có saponin steroid. 4.6.3 Định tính triterpenoid 1 2 Hình 4.9: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard Co mp an y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 43 Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ). Ống 1(đối chứng): nước cất + acid Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc 4.6.4 Định tính acid hữu cơ Hình 4.10 : Định tính acid hữu cơ có trong quả thể Linh chi. Sau khi cho dịch chiết nước bột tơ và quả thể nấm Linh chi đỏ tác dụng với tinh thể Na2CO3 và hơ nóng thì nhận thấy có bọt khí xuất hiện rất ít và bay ra. Như vậy, dịch chiết nước từ tơ nấm Linh chi đỏ có chứa hàm lượng rất ít thành phần acid hữu cơ. 4.6.5 Định lượng polysaccharide từ sinh khối nấm Linh chi Tiến hành ly trích polysaccharides từ 10 gam nấm Linh chi đã sấy khô theo qui trình thí nghiệm. Sau quá trình lọc và sấy khô thu nhận được 0.3144 gam polysaccharide thô. Như vậy hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đỏ chỉ đạt khoảng 0.31%. Hình 4.11: hình ảnh polysaccharide kết tủa sau khi lọc Co mp a y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 44 Phần 5: KẾT LUẬN 5.1. KẾT LUẬN Qua thí quá trình nghiên cứu, chúng tôi đạt được một số kết quả sau: - Xác định đường cong sinh trưởng của sợi nấm Linh chi trên môi trường PG. - Xác định điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của sợi nấm Linh chi + pH môi trường nuôi cấy: pH = 5,5 - Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm. Kết quả về thành phần môi trường tốt nhất như sau » Ø Glucose : 18g/l Ø KH2PO4 : 0,8g/l Ø MgSO4 : 3,5g/l Ø Khoai tây : 200g/l Lượng sinh khối thu được sau 15 ngày là 17g/l. - Sinh khối hệ sợi (Ganoderma lucidum) có chứa các thành phần hóa học: Saponine, saponin triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thô ly trích được trong sinh khối nấm Linh chi là khoảng 0,31% 5.2 ĐỀ NGHỊ Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa thể nghiên cứu đầy đủ về nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), đề nghị nghiên cứu thêm về: ü Khảo sát sâu hơn tác dụng của một số khoáng chất khác và thành phần hóa học, tác dụng dược lý, lâm sàng. Nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy trong môi trường lỏng và có thể ứng dụng trong ngành dược và ngành sản xuất trà thảo dược. ü Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tơ nấm Linh chi, nhằm đa dạng hóa sản phẩm các sản phầm từ hệ sợi nấm. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 45 Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Đoàn Sáng, 2003 Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay. Nhà xuất bản Y học, Hà nội, Việt nam. 2. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam. 3. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi - dược liệu quí ở việt nam. Nhà xuất bản mủi cà mau. 4. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 5. Nguyễn Lân Dũng, 2001. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 6. Nguyễn Hữu Đống, 2003. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 7. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000. Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà nội. 8. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico, 2002. Cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nuyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM. 10. Nguyễn Phước Nhuận, 2001. Giáo trình sinh hoá học, phần 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM. 11. Trần Hùng, 2004. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược TP.HCM. 12. Trần Văn Mão, 2004. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. Co mp an y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 46 Tài liệu tiếng anh 13. Steyaert R.L, 1972. Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle. 14. Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New Zealand. 15. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001. Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland. 16. Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00- 00. 17. Zhaoji – Ding, 1980. The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart. Tài liệu internet 18. Lingzhi.htm 19. .activeCompoundsReishi.html 20. Biomed~1.htm 21. 22. Mushroom Information Gano HIV.mht 23. đnh5 Co mp an y C on fid en tia l