Miễn dịch học ứng dụng

n gốc, các chỉ số sinh học, các quy trình nhân giống và bảo quản. Mỗi giống gốc cần được kiểm tra sự đồng nhất, an toàn và hiệu lực.  Cần chú ý rằng việc sử dụng một giống gốc và số lần cấy chuyển giới hạn sẽ giúp duy trì sự đồng nhất và tính ổn định của sản phẩm vacxin. 3.3.2. Nhân giống sản xuất (working seed)  Giống sản xuất là giống dùng để tạo ra sản phẩm vacxin.  Tùy quy mô sản xuất mà phải nhân giống sản xuất tới một số lượng nào đó cho phù hợp.  Giống sản xuất được tạo ra từ giống gốc bằng cách cấy chuyển tiếp nhưng không qúa 5 – 10 lần.  Số lần cấy chuyển tiếp có thể được xác định qua dữ liệu và được thiết lập cho phù hợp trong từng trường hợp cũng nhằm duy trì sự đồng nhất và tính ổn định của vacxin. 3.4. Yêu cầu về nguyên liệu và môi trƣờng nuôi cấy  Nguyên vật liệu, hóa chất  Chi tiết và nguồn gốc của tất cả các thành phần trong sản phẩm như hóa chất, nguyên vật liệu được sử dụng trong quá trình sản xuất vacxin phải đảm bảo yêu cầu kỹ thuật và phải được phê chuẩn của cơ quan cấp giấy chứng nhận có thẩm quyền quốc gia. Tất cả các thành phần có nguồn gốc động vật như máu, huyết thanh mà không được tiệt trùng đều phải có kiểm tra để đảm bảo không có vi khuẩn, nấm, mycoplasma và virus ngoại lai. Nguyên vật liệu cấn có nguồn gốc và các thông số kỹ thuật rõ ràng. Để tránh nhiễm khuẩn từ ngoài vào trong suốt quá trình sản xuất nên khuyến khích việc sử dụng các kỹ thuật tiệt trùng nghiêm ngặt để đảm bảo độ thuần khiết. Hạn chế sử dụng các chất bảo quản, đặc biệt là kháng sinh. Không nên bổ sung bất kỳ loại kháng sinh nào trong quá trình sản xuất nhất là dịch nuôi cấy tế bào, các môi trường, dịch tiêm trứng. Trong trường hợp cần thiết có thể sử dụng không quá 3 loại kháng sinh cùng một loại sản phẩm. Một số tiêu chuẩn còn cấm dùng Penicillin và Streptomycin trong những vacxin sử dụng theo đường khí dung và đường tiêu hóa. Những kháng sinh sử dụng trong sản xuất phải không gây ảnh hưởng cho loài vật sử dụng vacxin và không gây ô nhiễm thực phẩm có nguồn gốc từ các loài động vật sử dụng vacxin.  Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy - Nếu là vacxin virus: Môi trường nuôi cấy thường là: * Phôi trứng  Phôi trứng được sử dụng phổ biến để sản xuất các loại vacxin virus, đặc biệt là vacxin dùng cho gia cầm.  Để nhân và giữ giống gốc người ta thường dùng trứng của các đàn gà “siêu sạch” SPF (Specific Pathogenic Free) có chứng chỉ kiểm dịch sạch 18 loại virus và các vi khuẩn như Salmonella, Mycoplasma và Mycobacterium. Trứng dùng cho sản xuất vacxin thành phẩm có thể dùng các đàn gà sạch nuôi trong các trại gà tập trung có theo dõi dịch bệnh và phải được kiểm tra sạch với một số mầm bệnh đặc biệt là H5N1, Newcastle, Mycoplasma, Salmonella và không được tiêm vacxin. Đường tiêm trứng cũng như loại chất thu hoạch tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật đã được cấy chuyển. Tế bào  Với các vacxin được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào cần chuẩn bị một nguồn tế bào MCS (Master Cell Stock) phù hợp và ổn định.  Mỗi nguồn tế bào cần đảm bảo tính đồng nhất về đặc tính di truyền trong giới hạn số lần cấy chuyển đồng thời phải tinh khiết, không được lẫn vi khuẩn, nấm, mycoplasma và virus ngoại lai.  Môi trường tế bào được sử dụng trong sản xuất vacxin thường là các tế bào nguyên thủy (primary cell) có nguồn gốc từ những mô thông thường. Tế bào dòng (cell line) cũng được dùng phổ biến.  Các vacxin sử dụng cho gia cầm thường được sản xuất từ nguồn nuôi tế bào xơ phôi gà sạch bệnh.  Một số loại vacxin được sản xuất từ nguồn nuôi tế bào nguyên thủy có nguồn gốc từ các phôi thông thường của động vật khỏe mạnh. Mỗi loại tế bào đều có một quy trình chi tiết chỉ dẫn kỹ thuật nuôi cấy cho đến bước cuối cùng là thu hoạch vacxin. + Vacxin vi khuẩn Cần chuẩn bị các môi trường thích hợp để nhân giống sản xuất và sản xuất vacxin. Tùy theo quy mô mà chuẩn bị lượng môi trường, nhiều ít khác nhau. Dù là vacxin vi khuẩn nhược độc hay vô hoạt, bước đầu người ta đều cấy giống sản xuất vào môi trường sản xuất vacxin và nuôi ở 370C trong các bình nuôi cấy hoặc các thiết bị lên men sục khí. Ví dụ: Môi trường sản xuất thường dùng với vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt: - Hottinger 50% - Nước dạ dày lợn 50% - Pepton bột 10% - Glucoza 0,2% - NaCl 0,9% 3.5. Vệ sinh khu vực sản xuất  Mục đích  Đảm bảo yêu cầu vô trùng về nhà xưởng, trang thiết bị trong khu vực sản xuất trước và sau khi sản xuất, đặc biệt là phòng vô trùng, nơi thực hiện những thao tác kỹ thuật chính trong nuôi cấy, san, chia môi trường và chế phẩm. Thực hiện  Trƣớc khi làm việc 1 ngày cần tiến hành:  Lau hốt bằng gạc vô trùng có tẩm cồn 700  Hút bụi, lau sàn nhà 2 lần, lần 1 bằng nước cất, lần 2 bằng dung dịch sát trùng thích hợp (ví dụ Extran 3%).  Bật máy hút ẩm.  Bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi vào phòng làm việc.  Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp đặt đĩa thạch. Sau khi làm việc Lau hốt bằng gạc vô trùng có tẩm cồn 700 Lau các dụng thường dùng (dao, kéo, pank, kẹp...) và bàn làm việc bằng gạc tẩm cồn 700 Hút bụi sàn nhà, lau sàn 2 lần. Hút ẩm Bật đèn tử ngoại Một tuần tổng vệ sinh toàn bộ nhà xưởng như hút bụi, lau sàn, dụng cô thường dùng và bàn làm việc, cửa kính... Xông phòng hàng quý hoặc trước khi vào đợt sản xuất mới.  Sau khi tổng vệ sinh toàn bộ khu vực sản xuất, dùng formol 40% để khử trùng.  Liều lượng: 35ml formol +17,5g KMnO4/m 3 k.khí, thời gian xông 48 giờ.  Trung hòa bằng Amonhydroxyt 0,5 ml/m3 không khí.  Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp đặt đĩa thạch. MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN Sản xuất vaccine phòng PRRS Phƣơng pháp phân lập virus PRRS Kết quả phân lập virus PRRS sử dụng tế bào Marc-145 Negative control 48h postinfection 60h postinfection Multiplicity of infection (MOI) = 0.1; 0.25; 0.75, and 1 were used for cell infection.  The result showed that MOI = 1 was ideal and resulted in 100% cells destroyed after 60h postinfection Fig. 2. Result of PRRSV isolation using cell line of Marc-145 Quy trình chế vacxin vô hoạt Chủng virus lựa chọn Nuôi cấy tăng sinh trên TB Bất hoạt virus Tinh sạch virus Kiểm tra độ vô trùng của sản phẩm Bổ sung chất bổ trợ Vacxin Vacxin virus chế trên môi trƣờng tế bào nguyên thủy  Ví dụ: Quy trình sản xuất vacxin bại liệt uống  Vacxin bại liệt sống giảm độc được sản xuất từ chủng poliovirus được gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát (primary cell)  Chuẩn bị tế bào:  Khỉ dùng cho sản xuất là giống khỉ Maccaca muldatta  Cân nặng 2 – 3 kg, tuổi 2 – 2,5  Không có tác nhân ngoại lai: simian virus 40 (SV40), swine- origin influenza virus (SIV)  Không có kháng thể kháng poliovirus  Cách ly kiểm dịch 6 tuần. Mổ lấy thận (vô trùng):  Gây mê sâu bằng ketamin liều 10 –20mg/kg  Cắt động mạch cổ  Tắm bằng xà phòng và Cloramin  Lột da bụng, mổ bộc lộ thận, bóc tách thận, đảm bảo không gây tổn thương nhu mô thận.  Tripsin hóa  Dùng Trypsine-EDTA 1x để tách tế bào thận khỉ  Nuôi cấy tế bào trong môi trường thích hợp  Gây nhiễm virus  Thu hoạch virus và xác định nồng độ virus TCID50 Quy trình sản xuất vacxin cho vi khuẩn Kiểm tra thuần khiết Giống gốc vi khuẩn Môi trường thích hợp 370C/8h Tập trung giống sản xuất Kiểm tra thuần khiết Cấy giống vacxin Kiểm tra thuần khiết 370C/sau 8h Đếm số (10 tỷ vi khuẩn/1ml) Lên men sục khí 370C/24h tiệt trùng bằng formol 0,8%) Lắc vô hoạt vi khuẩn ở 370C/7 ngày Kiểm tra vô hoạt Pha loãng tới nồng độ 10 tỷ vi khuẩn/ml Bổ sung nước phèn 10% Kiểm tra vô trùng Kiểm tra bán thành phẩm Lọ nước thịt 50ml Ra chai  dán nhãn  bảo quản 2 -100C/18 tháng Kiểm tra thành phẩm Vật lý, an toàn, vô trùng, hiệu lực 10 lít VACXIN VIRUS NHƢỢC ĐỘC CHẾ TRÊN PHÔI TRỨNG Giống gốc Ra chai  dán nhãn  bảo quản 2 -100C/2 nămKiểm nghiệm vacxin Gây nhiễm phôi trứng Ra chai  Đông khô  dán nhãn  bảoquản Pha với nước sinh lý nồng độ 10-x hoặc xELD50) Gây giống sản xuất Kiểm tra vô trùng Ấp tiếp ở 370C/x giờ Thu trứng, để lạnh 40C/12h Mổ trứng Thu chất chứa virus Bán thành phẩmKiểm tra vô trùng chuẩn độ hiệu giá Quy trình cơ bản sản xuất vacxin virus trên môi trƣờng tế bào fibroblast phôi gà: a. Tách tế bào fibroblast phôi gà bằng Tripsin  Dùng phôi gà 10 - 12 ngày tuổi khoẻ mạnh.  Sát trùng vỏ trứng bằng cồn iot 5%. Mổ trứng, lấy phôi cho vào hộp lồng (đĩa Petri). Mổ phôi: bỏ đầu,chân,phủ tạng. Phần mô còn lại cắt thành các mẩu nhỏ 3 x 4 mm.  Rửa 3 lần bằng dung dịch Hanks.  Cho các mẩu mô vào bình cầu có khía trong đó có thanh sắt bọc nhựa và cho Tripsin (Tripsin đã pha loãng, nếu 5 – 10 phôi cho 20 ml, 11- 20 phôi 30ml).  Đặt bình cầu lên máy khuấy từ, quay tốc độ trung bình trong 1h.  Đổ lớp nước Tripsin chứa tế bào vào 1 cốc qua 3 lần vải gạc ( cốc đặt trong đá lạnh để tripsin ngừng h/đ).  Cho tiếp Tripsin mới vào, tiếp tục quay như lần đầu đến khi tế bào được tách rời hoàn toàn.  Ly tâm 2000 vòng/phút/ 3phút.Bỏ lớp Tripsin, lấy cặn tế bào. Rửa sạch tế bào bằng dung dịch Hanks (2lần)  Hoà tế bào với môi trường nuôi dưỡng. ( LH: Lactoalbumin hydrolysat; Parker; Eagle )  Đếm số lượng tế bào và nuôi cấy tế bào Ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo 1 líp Ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo treo TÕ bµo BHK TÕ bµo BHK 21 nu«i sau 48h • Kiểm nghiệm là thực hiện các kiểm tra tổng thể chất lượng của loại vacxin: - Vacxin hoàn thành theo quy trình sản xuất - Vacxin phải tinh khiết, an toàn, có hiệu lực. • Các bước kiểm nghiệm phải tiến hành tại cơ sở sản xuất (theo tiêu chuẩn cơ sở) và kiểm nghiệm tại cơ quan pháp chế quốc gia – ở Việt Nam là Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và vacxin thú y – Cục Thú y. • Sau khi có đầy đủ hồ sơ pháp chế, vacxin mới được xuất xưởng, lưu hành. I. Tiêu chuẩn của một phòng kiểm nghiệm vacxin Thú Y • Phòng kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn, virus và pha chế môi trường phải tách rời nhau. • Thiết bị và máy móc phục vụ cho các khâu kiểm nghiệm phải đầy đủ và đạt tiêu chuẩn quy định. • Thiết kế phù hợp, dễ vệ sinh, sàn và tường không thấm nước và chịu được hóa chất. • Các buồng an toàn về VSV bảo vệ được sản phẩm và người thao tác. • Có hệ thống thông gió tốt và an toàn. • Trang thiết bị bảo hộ tốt. • Phải có khu nhà nuôi động vật thí nghiệm: – Nhà nuôi gia cầm; – Nhà nuôi gia súc nhỏ; – Nhà nuôi gia súc lớn. • Mỗi nhà nuôi có 2 khu tách biệt dành cho kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn và virus. • Kết cấu của nhà nuôi phải đảm bảo an toàn sinh học (nghĩa là khi tiến hành công cường độc, các VSV cường độc không được gây ô nhiễm ra môi trường bên ngoài)  Với yêu cầu nhƣ vậy phải có: • Phương tiện đốt xác động vật, hệ thống vệ sinh tiêu độc triệt để. • Hệ thống thông gió ra vào phòng phải qua một hệ thống lọc hiệu quả. • Có đầy đủ các phương tiện cách ly. • Hệ thống nước thải phải được xử lý an toàn sinh học trước khi thải ra ngoài khu vực. II. Các chỉ tiêu vacxin cần kiểm nghiệm và phƣơng pháp kiểm nghiệm 2.1. Các chỉ tiêu kiểm nghiệm • Độ thuần khiết • An toàn • Hiệu lực 2.2. Phƣơng pháp kiểm nghiệm Lấy mẫu và bảo quản mẫu  Mẫu phải có tính đại diện  Lấy ngẫu nhiên theo tỷ lệ quy định và được bảo quản trong điều kiện phù hợp và an toàn  Khi đến phòng kiểm nghiệm phải được tiến hành ngay các thủ tục kiểm nghiệm trong thời gian ngắn nhất.  Mẫu lấy theo lô vacxin • Lô vacxin là toàn bộ các sản phẩm được chia vào các vật chứa cuối cùng từ cùng một khối lượng vacxin đồng nhất, trong cùng một ca sản xuất. • mẫu được lấy ngẫu nhiên Tỷ lệ mẫu • 10% sản phẩm (it nhất là 5) với lô dưới 100 sản phẩm. • 10% với lô sản phẩm có từ 100 đến dưới 500 SP. • 2% SP với lô từ 500 SP trở lên (nhiều nhất là 20 SP). • Mẫu lấy xong phải được dán nhãn ,bao gói và bảo quản ở điều kiện bảo quản của vacxin.  Các phƣơng pháp kiểm nghiệm • Mỗi loại vacxin có một quy trình kiểm nghiệm được chấp nhận bởi cơ quan có thẩm quyền quốc gia. • Nội dung kiểm nghiệm chung bao gồm: a. Kiểm tra độ thuần khiết  Độ thuần khiết của vacxin được xác định bằng các kiểm tra việc nhiễm tạp khuẩn.  Xét nghiệm được tiến hành với giống gốc, giống sản xuất, môi trường tế bào, các thành phần có nguồn gốc động vật như huyết thanh bê và mỗi lô sản phẩm vacxin trước khi mang ra sử dụng.  Các phương pháp sử dụng để đảm bảo độ tinh sạch của sản phẩm thay đổi tùy theo bản chất của sản phẩm, được mô tả chi tiết trong quy trình kiểm nghiệm hoặc trong quy trình sản xuất của từng loại vacxin (tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở).  Để xác định VSV ngoại lai VK, Mycoplasma, nấm Cấy mẫu vào các môi trường nuôi cấy thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ tối ưu trong vòng 14 ngày rồi đọc kết quả. Môi trƣờng sử dụng Môi trường phát hiện vi khuẩn gồm: • Môi trường nước thịt pepton • Môi trường nước thịt gan yếm khí • Môi trường thạch máu • Môi trường thạch thường • Môi trường đặc biệt (tùy yêu cầu). Tiến hành Mẫu thử Loại môi trường Số lượng môi trường Số lượng mẫu cấy Nhiệt độ nuôi Thời gian theo dõi (ngày) Huyết thanh Nước thịt Thạch máu Nước thịt gan yếm khí SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 37 0 C 37 0 C 37 0 C 20–250C 14 ngày Giống gốc (virus) Nước thịt Thạch máu Nước thịt gan yếm khí SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 37 0 C 37 0 C 37 0 C 20–250C 14 ngày Hỗn dịch tế bào Nước thịt Thạch máu Nước thịt gan yếm khí SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 37 0 C 37 0 C 37 0 C 20–250C 14 ngày Vacxin bán thành phẩm Nước thịt Thạch máu Nước thịt gan yếm khí SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 37 0 C 37 0 C 37 0 C 20–250C 14 ngày Vacxin thành phẩm Nước thịt Thạch máu Nước thịt gan yếm khí SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 37 0 C 37 0 C 37 0 C 20–250C 14 ngày  Đánh giá kết quả  Kết quả là âm tính • Tất cả các ống thử đều trong suốt, mầu sắc môi trường không đổi • Nếu có một trong các ống thử có biểu hiện nhiễm khuẩn thì phải tiến hành nhuộm và soi kính để xác định loại vi khuẩn • Kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. • Nếu lần 2 âm tính thì mẫu được coi là âm tính.  Kết quả là dƣơng tính  Trong các ống thử có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành nhuộm và soi kính để xác định loại vi khuẩn.  Nếu lần 2 cũng dương tính và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu đó được coi là dương tính.  Vacxin hay lô có mẫu kiểm tra phải loại bỏ. • Nếu lần 2 dương tính nhưng với loại tạp khuẩn khác thì phải tiến hành thêm lần 3 với cách thức như trên.  Xác định virus ngoại lai: • Tùy theo yêu cầu kiểm tra loại virus ngoại lai, dựa vào đặc tính của virus mà lựa chọn những phương pháp thích hợp. • Ví dụ: – Virus cúm, Newcastle gây ngưng kết hồng cầu nên kiểm tra bằng phản ứng HA b. Kiểm tra độ an toàn của vacxin • Là chỉ tiêu quan trọng của 1 loại vacxin. • 1 vacxin khi sử dụng phải đạt được chỉ tiêu này. • Độ an toàn của một vacxin phải được chứng minh sớm trong giai đoạn bán sản phẩm và sau khi sản xuất. • Xác định chỉ tiêu an toàn phải được tiến hành qua nhiều bước: - Thử trong phòng thí nghiệm - Thử trên thực địa, ở quy mô nhỏ và đại trà.  Kiểm tra khả năng tăng độc lực Yêu cầu này thực hiện với các loại vacxin sống. • Tất cả các loại vacxin nhược độc phải được kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm truyền qua bản động vật • VSV trong vacxin được:  Gây nhiễm cho một nhóm động vật cảm thụ với giống gốc  Luôn dùng đường mắc bệnh tự nhiên với loài động vật đó. • Sau đó dùng mô bào hay chất bài tiết của động vật đã gây nhiễm trên để gây nhiễm cho nhóm động vật khác.  Sau không ít hơn 5 lần cấy chuyển như vậy, chủng VSV được phân lập lại và được kiểm tra đầy đủ các đặc tính sinh học và độc lực như phương pháp kiểm tra giống gốc.  VSV vacxin phải có độc lực giảm và ổn định có thể chấp nhận được sau khi cấy chuyển theo cách này.  Kiểm tra nguy cơ với môi trƣờng • Vacxin sống có thể bài thải, làm lây lan cho ĐV mẫn cảm hoặc không mẫn cảm và gây hại cho môi trường. • Cần tiến hành kiểm tra nguy cơ ô nhiễm VSV vacxin (nếu có) để khi sử dụng vacxin cần có những biện pháp khống chế  Kiểm tra tính an toàn của vacxin trƣớc khi sử dụng cho động vật • Các kiểm tra an toàn với một lô sản phẩm vacxin thường được tiến hành bằng cách tiêm cho động vật thí nghiệm (chuột nhắt, chuột lang, mèo, chó, lợn, gia cầm) hoặc cho bản động vật tùy theo quy trình chỉ dẫn. • Việc kiểm tra này được thực hiện theo các bước:  Trong phòng thí nghiệm: • Nguyên tắc chung, tất cả các loại vacxin đều yêu cầu các thử nghiệm sử dụng quá liều: - Gấp 10 lần đối với vacxin sống - Gấp 2 lần với vacxin vô hoạt. • Kiểm tra hiệu lực, độ an toàn có thể được xác định dựa vào các quan sát hàng ngày động vật sau khi được tiêm vacxin trong suốt giai đoạn trước khi công cường độc.  Nội dung tiến hành: • Pha vacxin với liều đã hướng dẫn trong quy trình kiểm nghiệm • Tiêm cho động vật thí nghiệm với các lô đã được bố trí theo các liều thử khác nhau • Sau đó theo dõi một thời gian đã được quy định.  Nội dung theo dõi gồm: – Phản ứng toàn thân: sốt, kém ăn, bỏ ăn, sốc vacxin tức thì, các phản ứng phụ khác... – Phản ứng cục bộ: viêm, sưng. – Tính tỷ lệ phản ứng của mỗi nội dung theo dõi, ghi chép đánh giá kết quả.  Vacxin được coi là an toàn khi không có hoặc có ít các phản ứng sau sử dụng. Các phản ứng này ở trong mức độ cho phép. c. Kiểm tra hiệu lực của vacxin  Là khả năng bảo hộ của động vật sau khi được sử dụng vacxin  Động vật có được miễn dịch bảo hộ phòng bệnh  Thường 1 vacxin được coi là có hiệu lực khi vacxin tạo được miễn dịch phòng bệnh >80% trong quần thể. • Kiểm tra hiệu lực của vacxin là yêu cầu cần thiết đối với mỗi lô sản xuất. • Có nhiều phương pháp kiểm tra, nhưng hiệu lực của vacxin dùng trong thú y nên được chứng minh bằng phƣơng pháp công cƣờng độc trên bản động vật. • Trong trường hợp có các phương pháp thử khác thay thế có giá trị tin tưởng, ngƣời ta sẽ hạn chế sử dụng phƣơng pháp công cƣờng độc. • Vì vậy, việc áp dụng các nguyên lý thay thế, giảm hoặc chọn lọc các kiểm tra trên động vật (nguyên lý 3R - Replace, Reduce và Refine animal test) được khuyến khích sử dụng nếu có thể được. 1. Ph-¬ng ph¸p c«ng c-êng ®éc • ĐÓ thùc hiÖn ph-¬ng ph¸p nµy, ng-êi ta cÇn ph¶i cã gièng vi sinh vËt c-êng ®éc tiªu chuÈn cã c¸c chØ sè sinh häc æn ®Þnh, ®Æc biÖt lµ chØ sè LD50 víi b¶n ®éng vËt vµ ®éng vËt thÝ nghiÖm thay thÕ. • TiÕn hµnh g©y miÔn dÞch cho nhãm ®éng vËt thÝ nghiÖm b»ng liÒu vacxin sö dông, khi cã miÔn dÞch ch¾c ch¾n (kho¶ng 2 - 3 tuÇn) tiÕn hµnh g©y nhiÔm gièng c-êng ®éc tiªu chuÈn víi liÒu chÝ tö (th-êng lµ 100 LD50 - 1.000 LD50), cã bè trÝ l« ®éng vËt ®èi chøng kh«ng ®-îc tiªm vacxin. • Tiªu chuÈn cña ®éng vËt thÝ nghiÖm trong thö th¸ch c-êng ®éc lµ khoÎ m¹nh, cã ph¶n øng huyÕt thanh ©m tÝnh víi lo¹i vi sinh vËt cã trong vacxin ®em thö. • Theo dõi những biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết của cả 2 lô thí nghiệm và đối chứng. • Thí nghiệm đạt được khi ở lô đối chứng động vật mang thử chết 100% với triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh. • Tỷ lệ phần trăm sống sót ở lô thí nghiệm, tỷ lệ này phải đạt ít nhất 80% thì lô vacxin mới đạt được chỉ tiêu hiệu lực. Dĩ nhiên, tỷ lệ này càng cao càng tốt. • Cũng có thể tiến hành thí nghiệm trên thực địa bằng cách tiêm vacxin với liều sử dụng cho một quần thể động vật ngoài thực địa, sau một thời gian khi miễn dịch được thành lập chắc chắn, bắt ngẫu nhiên một lượng cá thể đủ lớn rồi tiến hành thử thách cường độc, xác định tỷ lệ bảo hộ. 2. C¸c ph-¬ng ph¸p thö hiÖu lùc thay thÕ 2.1. Ph-¬ng ph¸p thö hiÖu lùc l©m sµng • Ph-¬ng ph¸p nµy cã thÓ sö dông ®Ó thiÕt lËp hiÖu lùc khi c¸c nghiªn cøu c«ng c-êng ®éc kh«ng thÓ thùc hiÖn ®-îc. • Ng-êi ta sö dông vacxin cho mét quÇn thÓ ®éng vËt trªn thùc ®Þa, ®an xen víi c¸c quÇn thÓ ®éng vËt kh¸c kh«ng ®-îc sö dông vacxin vµ trong vïng ®Þa lý ®ang cã dÞch l-u hµnh. Theo dâi kh¶ năng miÔn dÞch ë quÇn thÓ ®· sö dông vacxin.  Tuy nhiên, khó có thể nhận được các thông số rõ ràng để chứng minh hiệu lực vacxin trong trường hợp này bởi các ảnh hưởng phụ không mong muốn như khả năng chống chịu của các cá thể khác nhau rất lớn 2.2. Phƣơng pháp định lƣợng kháng nguyên • Với một số loại vacxin, việc đánh giá hiệu lực có thể được thực hiện bằng phương pháp định lượng kháng nguyên. • Với vacxin vi khuẩn, tiến hành đếm số lượng vi khuẩn. VÝ dô: – Trong vacxin tô huyÕt trïng lîn v« ho¹t, 1ml vacxin cã chøa Ýt nhÊt 1010 tÕ bµo vi khuÈn. – Vacxin phã th-¬ng hµn lîn v« ho¹t cã 10 tû vi khuÈn/ml. – Vacxin phã th-¬ng hµn lîn nh-îc ®éc cã 2 - 2,5 tû vi khuÈn/ 1 liÒu dïng. – Vacxin nh-îc ®éc nha bµo nhiÖt th¸n cã 30 triÖu nha bµo/ml... • Với vacxin virus VÝ dô: – Víi c¸c virus nh-îc ®éc cã kh¶ năng ng-ng kÕt hång cÇu, ng-êi ta x¸c ®Þnh ®Ëm ®é virus trong vacxin th«ng qua hiÖu gi¸ cña ph¶n øng HA. – Vacxin Newcastle hÖ II chñng lasota, hiÖu gi¸ HA tèi thiÓu ph¶i ®¹t 1/64 (5log2), cßn vacxin hÖ I, hiÖu gi¸ nµy lµ 1/32 (4log2). 2.3. ĐÞnh l-îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh • Tiªm vacxin cho ®éng vËt thÝ nghiÖm, t¹i thêi ®iÓm cã miÔn dÞch ch¾c ch¾n, tiÕn hµnh lÊy mÉu huyÕt thanh ®Ó ®Þnh l-îng kh¸ng thÓ. • Th«ng qua chØ sè trung hoµ hoÆc hiÖu gi¸ cña ph¶n øng HI (víi virus g©y ng-ng kÕt hång cÇu) ®Ó ®¸nh gi¸ hiÖu lùc cña vacxin. Vacxin tụ huyết trùng lợn vô hoạt • TIÊU CHUẨN NGÀNH : 10 TCN 891-2006 (Ban hành kèm theo Quyết định số 18/QĐ-BNN-KHCN ngày 12 tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ NN và PTNT) • Phạm vi áp dụng Qui trình này áp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin vô hoạt được chế tạo từ các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida suiseptica. Vacxin có chất bổ trợ, dạng lỏng. 1. Mẫu • Theo 10 TCN 160 – 92 “Vacxin thú y - Qui trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm”. Quy trình kiểm nghiệm 2. KiÓm tra v« trïng Theo 10 TCN 161-92. Vacxin thó y - Qui trình kiÓm tra thuÇn khiÕt. 3. KiÓm tra an toµn 3.1. Ph-¬ng ph¸p träng tµi: Tiªm d-íi da cho 2 lîn khoÎ, thÓ träng 20 - 30kg, mçi con 2 liÒu vacxin ghi trªn nh·n. Sau 10 ngµy theo dâi, toµn bé ®éng vËt ph¶i sèng khoÎ. 3.2. Ph-¬ng ph¸p thay thÕ: Tiªm vacxin vµo d-íi da cho ®éng vËt thÝ nghiÖm nh- sau: – 2 thá, thÓ träng 1,5 - 2kg/con, mçi con 1 liÒu vacxin; – 2 chuét lang, thÓ träng 300 - 400g/con, mçi con 1 liÒu vacxin; – 5 chuét nh¾t tr¾ng, thÓ träng 18 - 20g/con, mçi con 0,5ml vacxin. – Toµn bé ®éng vËt ph¶i ph¶i sèng khoÎ sau 10 ngµy theo dâi. 4. KiÓm tra hiÖu lùc: 4.1. Ph-¬ng ph¸p träng tµi (dïng lîn): • Tiªm miÔn dÞch cho 5 lîn khoÎ m¹nh (20 - 30kg /con), mçi con mét liÒu vacxin ghi trªn nh·n (1 liÒu chøa Ýt nhÊt 7 x 109CFU). Sau 14 - 21 ngµy, c¸c lîn ®· ®-îc g©y miÔn dÞch cïng víi 3 lîn ®çi chøng ®-îc thö th¸ch víi mét chñng c-êng ®éc P.multocida t-¬ng øng mçi con 1 MLD (minimum lethal dose) cña lîn vµo d-íi da. Theo dâi 7 ngµy, l« vacxin ®-îc coi lµ ®¹t tiªu chuÈn nÕu: • Lîn ®èi chøng chÕt hÕt, lîn miÔn dÞch sèng Ýt nhÊt 3 con hoÆc • Lîn ®èi chøng chÕt 2 con, lîn miÔn dÞch sèng c¶ 5 con. 4.2. Ph-¬ng ph¸p thay thÕ: Dïng mét trong c¸c ph-¬ng ph¸p sau:  Bèn thá khoÎ, thÓ träng 1,5 - 2kg/con, mçi con ®-îc tiªm 1/2 liÒu vacxin vµo d-íi da. Mòi thø hai ®-îc tiªm sau mòi mét 7 ngµy víi cïng 1 liÒu l-îng vµ ®-êng tiªm.  Sau lÇn miÔn dÞch thø hai 14 ngµy, 4 thá miÔn dÞch cïng 2 thá ®èi chøng cïng träng l-îng ®-îc thö th¸ch víi mét chñng c-êng ®éc P.multocida t-¬ng øng liÒu 10 - 20LD50 cña chuét nh¾t tr¾ng. Đéng vËt ®-îc theo dâi 7 ngµy. L« vacxin ®-îc coi lµ ®¹t nÕu thá miÔn dÞch sèng Ýt nhÊt 50% vµ thá ®èi chøng chÕt 100%. Phƣơng pháp tính liều LD50 trên chuột Dùng 100 chuột nhắt trắng thể trọng 18 – 20g/con, được chia làm 2 lô, mỗi lô 50 con. Tiêm xoang phúc mạc chuột 0,1ml canh trùng cường độc P.multocida tương ứng pha loãng từ 10-1 đến 10-10. Theo dõi trong 7 ngày, ghi chép số động vật chết. Tính giá trị LD50 của từng lô theo phương pháp Reed – Muench.  Phô lôc • Ph-¬ng ph¸p tÝnh LD50 theo pp của Reed-Muench • Ph-¬ng ph¸p tÝnh liÒu b¶o hé: lgPD50 = L - d (s – 0,5) Trong ®ã: L: logarit cña ®é pha lo·ng ®Ëm nhÊt ®· thö d: HÖ sè pha lo·ng s: Tæng c¸c tØ lÖ sèng (thËp ph©n) ChØ sè b¶o hé: 1/PD50 mÉu Rp= 1/PD50 chuÈn KT. BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG • TÝnh gi¸ trÞ LD50 theo c«ng thøc Reed - Muench a - 50 LgLD50= lgA + -------------- x d a - b Trong ®ã: A: LiÒu giíi h¹n s¸t trªn 50% B: LiÒu giíi h¹n s¸t d-íi 50% a: TØ lÖ chÕt (%) ë liÒu A b: tØ lÖ chÕt (%) ë liÒu B d: HÖ sè pha lo·ng • иnh gi¸ hiÖu lùc b»ng chØ sè lgLD50 miÔn dÞch lgPD50= ---------------------------- ≥ 4 lgLD50 ®èi chøng • Tùy theo loại vacxin được sản xuất, một số kiểm tra nhất định cần được thực hiện. • Các kiểm tra này có thể bao gồm: • Độ ẩm trong vacxin đông khô. • Độ pH. • Mức độ chất bảo quản và lượng kháng sinh tối đa cho phép. • Độ ổn định về tính chất vật lý của chất bổ trợ. • Mức chân không trong vacxin đông khô.  Bao gói và nhãn của vacxin: • Vacxin trước khi xuất xưởng phải được bao gói hoặc đóng trong hộp carton. • Các loại vacxin được dán nhãn rõ ràng. Tất cả chỉ dẫn và khẳng định trên nhãn phải được xác nhận của cơ quan quốc gia có thẩm quyền. • Các nhãn vacxin thú y không thấm nước và chứa đựng đủ các thông tin cần thiết, dù cho vacxin được chứa trong các ampoul nhỏ. • Trên hộp carton hoặc bao gói bên ngoài sản phẩm vacxin cũng phải có nhãn ghi vắn tắt các thông tin nổi bật. Yêu cầu nhãn vacxin 1. Tên chính xác của vacxin, phải viết rõ và cùng font chữ 2. Tên và địa chỉ của nhà sản xuất (ghi cả nhà nhập khẩu cho vacxin nhập khẩu). 3. Nhiệt độ bảo quản. 4. Dòng khuyến cáo “chỉ dùng cho thú y (hoặc động vật)”. 5. Hướng dẫn cách sử dụng đầy đủ bao gồm tất cả các cảnh báo cần thiết. 6. Với những động vật cung cấp thực phẩm, cần có cảnh báo thời gian không dùng vacxin trước khi giết mổ ( điều này tùy thuộc vào loại vacxin) 7. Thời hạn sử dụng. 8. Số lô sản xuất. 9. Số chứng nhận (cấp phép) của sản phẩm, một số quốc gia thay vào đó là số giấy phép hay số đăng ký của nhà sản xuất. 10. Số liều. 11. Khuyến cáo nên dùng toàn bộ sau khi đã mở lọ vacxin hoặc thời gian bảo quản vacxin sau khi mở thích ứng với từng loại, phương pháp xử lý thích hợp với phần vacxin thừa. 12. Cảnh báo an toàn phù hợp cho người sử dụng. Ví dụ: Vô tình tiêm vào tay thì phải làm gì 13. Khi bổ sung kháng sinh trong quá trình sản xuất, cần khuyến cáo “có sử dụng kháng sinh (tên cụ thể) để bảo quản”. 14. Nhãn sản phẩm cũng phải bao gồm các khuyến cáo chính xác khác. Nhất là những lưu ý đặc biệt (nếu có) trong việc sử dụng và bảo quản vacxin. 15. Những thông tin tương tự cũng nên ghi vào tờ rơi giới thiệu, sản phẩm được gửi kèm theo gói sản phẩm. Tờ giới thiệu này có thể ghi chi tiết hơn về cách sử dụng và các phản ứng phụ gây hại của vacxin. • Khi đưa vacxin vào cơ thể động vật, với sự kích thích của yếu tố KN có trong vacxin, hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, tạo ra một đáp ứng MD dịch thể và tế bào. • Đáp ứng này sản sinh KT đặc hiệu để chống lại KN • Các yếu tố này lưu thông trong máu và dịch thể của cơ thể động vật, gây ra trạng thái MD tiếp thu chủ động nhân tạo. I. Nguyên lý sử dụng vacxin Quá trình phát sinh và lây truyền của bệnh truyền nhiễm Chuét Ng-êi Ong Ruåi Lîn bÞ bÖnh Gµ bÞ bÖnh VÞt bÞ bÖnh bß bÖnh Sµn lîn ®µn tr©u bß §µn VÞt §µn gµ II. Quy luật hình thành KT dịch thể đặc hiệu sau khi sử dụng vacxin ở động vật • Khi đưa vacxin vào cơ thể, KT chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào KN chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần đầu hay lần 2, 3... • Sau đó KT mới được sinh ra, lượng KT tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2 – 3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm. • Sử dụng vacxin lần đầu, đáp ứng MD gọi là sơ hay tiền phát. • Sử dụng vacxin lần hai, đáp ứng MD dịch gọi là thứ cấp hay thứ phát. • Trong đáp ứng MD thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng KT sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện KT sớm. Đƣờng biểu diễn quy luật hình thành KT khi dùng vacxin ở động vật Hàm lượng kháng thể Thời điểm tác động 7 ngày 21 ngày Thời gian miễn dịch Ngưỡng bảo hộ III. Tiêm vacxin nhắc lại • Sự khác biệt của đáp ứng MD sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các tế bào nhớ MD. • Trong đáp ứng MD thứ cấp, các tế bào này phát triển nhanh và mạnh, tạo ra một lớp tế bào sản xuất KT nhanh và nhiều hơn nên KT xuất hiện sớm, hàm lượng nhiều hơn rõ rệt. • Nếu tiêm cách lần dùng vacxin lần đầu 3 – 4 tuần, sử dụng tiếp lần thứ hai thì đáp ứng MD sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian MD dài hơn. Đƣờng biểu diễn phản ứng miễn dịch khi tiêm vacxin nhắc lại Hàm lượng kháng thể Thời điểm tác động Sơ chủng Nhắc lại Thời gian miễn dịch Ngưỡng bảo hộ IV. NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG VACXIN  Để có được hiệu quả như mong muốn sau khi tiêm phòng vacxin thì việc sử dụng vacxin đúng nguyên tắc luôn là điều kiện tiên quyết.  Sử dụng vacxin sai nguyên tắc không những không mang lại được hiệu quả phòng bệnh mà còn dẫn đến nhiều nguy cơ khác nhƣ làm giảm khả năng đề kháng của vật nuôi, thậm chí gây ra những tai biến đáng tiếc. Vì vậy trong quá trình sử dụng vacxin cần tuân thủ các nguyên tắc sau đây:  Tiêm phòng vacxin trên phạm vi hợp lý, đạt tỷ lệ cao • Cần xác định chính xác và hợp lý phạm vi tiêm phòng của vacxin • Cần phải tiêm phòng các ổ dịch cũ, những vùng hàng năm có dịch đe dọa, những vùng hai bên đường giao thông trọng yếu, quanh các chợ, xí nghiệp chế biến thú sản, vùng biên giới • Khi có dịch xảy ra phải tiêm chống dịch trong ổ dịch và các vùng xung quanh (vùng bị dịch uy hiếp). • Ngoài khu vực bị uy hiếp là vùng an toàn, mầm bệnh khó có thể lây lan trong thời gian trước mắt. • Để đáp ứng được yêu cầu phòng bệnh thì tiêm phòng cần đạt tỷ lệ càng cao càng tốt, nói chung phải đạt tỷ lệ 80%, các vụng bị uy hiếp phải đạt tỷ lệ 90-95%.  Tiêm phòng vacxin đúng đối tƣợng • Vacxin là thuốc phòng bệnh cho động vật khỏe, chưa mắc bệnh. • Nếu trong cơ thể động vật đã mang sẵn mầm bệnh nhưng chưa phát ra thì sau khi được tiêm kháng nguyên cùng loại với mầm bệnh có trong cơ thể thì bệnh phát ra sớm hơn, nặng hơn. • Trường hợp ngoại lệ có thể dùng vacxin mà động vật đã nhiễm mầm bệnh. Ví dụ: Sử dụng vacxin nhược độc dịch tả vịt khi vịt bị nhiễm bệnh  Bình thường không dùng vacxin cho động vật quá non và thận trọng với động vật có thai • Ở động vật non, các cơ quan miễn dịch chưa hoàn chỉnh nên đáp ứng miễn dịch với vacxin còn yếu, động vật non còn có một lượng kháng thể thụ động , những kháng thể đó có thể ngăn cản vacxin phát huy tác dụng. • Nếu không có dịch đe dọa thì chỉ nên dùng vacxin cho súc vật từ 2-7 tuần tuổi, dùng vacxin càng muộn càng tốt. Khi có dịch đe dọa buộc phải tiêm phòng sớm cho động vật non nhưng sau đó cần tiêm nhắc lại. Miễn dịch thụ động ở động vật non Thời gian miễn dịch Hiệu giá kháng thể Ng-ìng b¶o hé Đáp ứng miễn dịch ở động vật non khi tác động liều vacxin đầu tiên Thời gian miễn dịch Hiệu giá kháng thể Thời điểm tác động vacxin lần đầu ở động vật non 1 ngày tuổi MD thụ động MD chủ động  Sử dụng vacxin nhƣ thế nào ở động vật mang thai? • Ở động vật mang thai, do trạng thái sinh lý có những thay đổi nên dùng vacxin dễ gây những phản ứng mạnh và làm sảy thai. • Mặt khác, do hiện tượng dung nạp MD ở động vật non nên không nên dùng vacxin sống cho động vật trong thời gian mang thai, đặc biệt là các loại vacxin virus nhược độc có thể xâm nhập vào bào thai . Tiêm phòng đúng thời gian, đúng quy cách Tiêm đúng thời gian • Phần lớn các bệnh truyền nhiễm thường xảy ra hoặc phát triển rầm rộ vào một thời gian nhất định trong năm . • Vì vậy để phòng một bệnh truyền nhiễm nào đó cần tiêm phòng vacxin trước mùa bệnh xảy ra một khoảng thời gian đủ cho cơ thể tạo được miễn dịch phòng vệ chắc chắn (thường là 2-3 tuần). • Vì vậy mùa tiêm phòng của nước ta thường là tháng 3, tháng 4 và tháng 9, tháng 10 hàng năm. Tiêm đúng liều và đúng đường • Tiêm đúng liều: phải tiêm đủ liều vacxin cho động vật theo khuyến cáo của nhà sản xuất ghi trên nhãn mác hoặc trong bản hướng dẫn kèm theo vacxin. • Nếu tiêm quá liều sẽ tạo ức chế đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể, hiệu giá kháng thể đặc hiệu tạo ra sẽ thấp, hoạt động của miễn dịch tế bào sẽ hạn chế, lãng phí vacxin, chi phí tiêm phòng tăng. • Ngược lại nếu tiêm liều thấp hơn liều quy định, sẽ không đủ lượng kháng nguyên kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch, Đưa vacxin đúng đường quy định • Các đường đưa vacxin phổ biến hiện nay là tiêm bắp, tiêm dưới da, nhỏ mắt, mũi, khí dung... • Khả năng đáp ứng miễn dịch của các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể đối với vacxin đưa vào cơ thể bằng các đường khác nhau cũng khác nhau. • Vì vậy trong quá trình nghiên cứu chế tạo vacxin các nhà nghiên cứu đã chú ý lựa chọn đường đưa tối ưu vào cơ thể cho từng loại vacxin.  Kỹ thuật sử dụng vacxin • Khả năng tạo miễn dịch của vacxin phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng vacxin có đúng kĩ thuật hay không. Kỹ thuật sử dụng vacxin bao gồm kỹ thuật bảo quản vacxin và đƣờng đƣa vacxin. • Điều kiện bảo quản vacxin phải đảm bảo, vacxin phải để nơi râm mát tránh ánh sáng trực tiếp. • Nhiệt độ thích hợp cho việc bảo quản vacxin là 2 - 40C. Đặc biệt vacxin nhược độc chế từ virus phải được bảo quản ở -150C • Trước khi sử dụng phải kiểm tra thật kỹ, nếu thấy vacxin chuyển màu quá hạn sử dụng phải huỷ bỏ. • Nơi tiêm phải sát trùng, dụng cụ tiêm phải tiêu độc, liều lượng tiêm phải đảm bảo. • Khi dùng vacxin nhược độc nhất là loại có nha bào thì không làm vương vãi vacxin. • Súc vật được tiêm là những con khoẻ mạnh, không tiêm vacxin cho những con đang ốm, những con quá gầy yếu, quá non, con mới đẻ, những con mới phẫu thuật chưa lành, những con có nhiều ký sinh trùng, sau khi tiêm cần nuôi dưỡng, chăm sóc tốt  Phối hợp các loại vacxin • Mỗi loại vacxin chỉ mang một mầm bệnh và do đó nó chỉ có tác dụng phòng một bệnh duy nhất, đó chính là vacxin đơn giá. • Nếu phối hợp nhiều loại kháng nguyên trong cùng một chế phẩm vacxin để phòng bệnh được gọi bằng tên chung là vacxin đa giá. • Việc sử dụng vacxin đa giá sẽ làm tăng khả năng phòng bệnh của vacxin. • Dùng vacxin đa giá cho phép giảm số lần tiêm chủng, như vậy giảm được giá thành cũng như giảm được stress cho con vật.  Một số điều chú ý khi sử dụng và bảo quản vacxin – Bảo quản vacxin trong điều kiện quy định – Để trong phòng lạnh hoặc tủ lạnh 40C - 100C – Không để vacxin ở chỗ nóng, có ánh sáng mặt trời – Không giữ vacxin ở nhiệt độ âm (trừ vacxin virus dạng tươi) Khi sử dụng: Kiểm tra lọ vacxin trƣớc khi sử dụng: Trạng thái vật lý Màu sắc Độ trong, đục Kiểm tra nhãn lọ vacxin: Tên vacxin: có đúng với nhu cầu không Số lô, số liều, liều lƣợng sử dụng Ngày sản xuất, số kiểm nghiệm xuất xƣởng Thời hạn sử dụng, quy cách bảo quản Không dùng: Lọ vacxin đã có thay đổi về trạng thái vật lý Nút lỏng, đã có thay đổi về trạng thái vật lý Lọ nứt Thao tác sử dụng – Khi pha vacxin: dụng cụ và nước cất phải được tiệt trùng, để nguội – Dụng cụ tiêm vacxin, tay người pha vacxin, vị trí tiêm cũng phải được tiệt trùng – Với vacxin sống: dụng cụ pha thuốc phải được tiệt trùng và để nguội, không được rửa bằng thuốc sát trùng – Khi dùng xong, dụng cụ phải được tiệt trùng trở lại, tránh để dây vacxin ra ngoài – Khi dùng vacxin phải đưa thuốc đúng đường quy định. V. QUY ĐỊNH VỀ VIỆC TIÊM PHÒNG BẮT BUỘC VACXIN CHO GIA SÚC VÀ GIA CẦM Ở VIỆT NAM 5.1. Phạm vi, đối tƣợng áp dụng 1. Quy định này được áp dụng đối với gia súc, gia cầm trong diện phải tiêm phòng tại các hộ gia đình, cá nhân, cơ sở chăn nuôi động vật tập trung. 2. Tổ chức, cá nhân trong nước, nước ngoài có hoạt động chăn nuôi gia súc, gia cầm trên lãnh thổ Việt Nam phải tuân theo qui định này. 2. Giải thích thuật ngữ 1. Gia súc, gia cầm thuộc diện tiêm phòng là gia súc, gia cầm trong vùng quy định phải tiêm phòng và có đủ điều kiện để tiêm phòng (không tính gia súc đang mắc bệnh, có chửa kỳ cuối, gia súc mới sinh). 2. Tiêm phòng định kỳ là tiêm phòng vào thời gian nhất định được quy định trong năm tùy theo từng bệnh. 3. Tiêm phòng bổ sung là tiêm phòng ngoài thời gian tiêm định kỳ đối với gia súc mới sinh đến độ tuổi tiêm phòng, gia súc mới nhập đàn, gia súc chưa được tiêm trong lần tiêm định kỳ. 4. Tiêm phòng khẩn cấp là tiêm phòng khi xảy ra dịch bệnh.  Các bệnh phải tiêm phòng, tỷ lệ tiêm phòng 1. Các bệnh phải tiêm phòng bắt buộc, bao gồm: – Bệnh Lở mồm long móng – Bệnh Dịch tả lợn – Bệnh Nhiệt thán – Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò, lợn – Bệnh Dại – Bệnh Newcastle – Bệnh Dịch tả vịt • Khi tiêm phòng những bệnh trên đây, tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100% cho gia súc, gia cầm trong diện tiêm. 2. Những bệnh khác: tiêm phòng để khống chế, thanh toán dịch bệnh theo đề nghị của Cục Thú y. Các phản ứng không mong muốn khi tiêm phòng vacxin và cách khắc phục • Khi tiêm phòng vacxin, những phản ứng không mong muốn có thể xẩy ra là các tác dụng phụ của vacxin hay những tai biến do việc sử dụng vacxin gây ra. Nguyên nhân • Phụ thuộc thuộc tính của vacxin. • Bảo quản vacxin không tốt (để nhiễm khuẩn, để đông băng với vacxin không được đông băng) • Sai quy chế sử dụng (sai chỉ định, quá liều) và đặc biệt do đánh giá chất lượng, cấp phép xuất xưởng, không được thực hiện chu đáo, không đúng quy trình kỹ thuật.  Phản ứng cục bộ tại nơi tiêm • Thường là sưng đỏ, phù nề, ngứa chỗ tiêm, có khi dẫn đến đau khớp, có khi gây ra những nốt loét thậm chí tạo một cục cứng ngay tại nơi tiêm, một số ít trường hợp còn thấy xuất hiện hiện tượng viêm hạch tại nơi tiêm. • Trường hợp nhẹ có thể không cần can thiệp, sau 24h phản ứng sẽ mất. • Trường hợp nơi tiêm sưng to và có thủy thũng dùng dầu nóng xoa bóp nơi sưng 2-3 lần/ngày cho con vật nghỉ ngơi ăn uống tốt, sau 2-3 ngày các triệu chứng sẽ khỏi  Một số phản ứng toàn thân • Ở dạng nhẹ có thể gặp là sốt nhẹ từ 0.5 – 1oC có khi lên tới 1.5oC, con vật cảm thấy mệt mỏi, giảm ăn hoặc bỏ ăn nhiều khi có phản ứng nôn ọe, trên bề mặt da thấy nổi mề đay hay nổi các ban đỏ với nhiều kích thước và hình dạng khác nhau. • Triệu chứng nặng hơn có thể gặp là co thắt phế quản, ngất, hạ huyết áp, bệnh thần kinh, loạn thị, liệt... • Nếu các phản ứng ở thể nhẹ chỉ cần để vật nuôi nghỉ ngơi nơi thoáng mát, cho ăn thức ăn loãng, giàu đạm, tiêm các loại vitamin và thuốc trợ sức (cafein natri benzoat 25%). • Khi con vật sốt cao, các triệu chứng toàn thân nặng có thể dùng kháng sinh kết hợp với các loại vitamin (B1, C) để tiêm bắp, chăm sóc nuôi dưỡng tốt đến khi vật nuôi hết triệu chứng, nếu con vật sốt quá cao phải dùng thuốc hạ sốt  Những tai biến khi sử dụng vacxin • Vacxin có thể gây ra những tai biến ngoài ý muốn. Nguyên nhân là do: + Có các thành phần thừa trong chế phẩm vacxin (không phải là thành phần kháng nguyên mang tính quyết định) gây ra. + Do việc tiêm phòng vacxin trong lúc cơ thể vật nuôi đang mắc một bệnh cấp tính hay một số bệnh mạn tính nặng, gia súc đang sốt hay tiêu chảy, gia súc bị suy dinh dưỡng... + Một số loại vacxin không sử dụng cho gia súc mang thai, một số loại chỉ sử dụng cho vật nuôi ở một lứa tuổi nhất định...  Trong thú y, khi sử dụng vacxin thường gặp những tai biến do + Quá liều lượng quy định + Tiêm vacxin khi cơ thể đang mang chính mầm bệnh của kháng nguyên được đưa vào, vì vậy sau khi tiêm vacxin có những bệnh sẽ nhanh bùng phát hơn và nặng hơn so với khi không tiêm. + Lợi dụng đặc điểm này mà người ta có thể tiêm vacxin cho vật nuôi để chẩn đoán sớm xem vật nuôi có đang mang mầm bệnh nào đó không. Những tai biến gồm có:  Nhiễm bệnh • Nguyên nhân do các thành phần kháng nguyên là vi sinh vật bị giảm độc lực có thể hồi phục trở lại. • Nguy cơ này ở vacxin ngừa bại liệt ở trẻ nhỏ là là 10-7, nghĩa là cứ 10 triệu trẻ em uống vacxin Sabin thì có một em tai nạn loại này. Điều này không ngăn cản được việc sử dụng vacxin này bởi lẽ tỉ lệ đó được xem là chấp nhận được. • Nguy cơ trên cũng có thể xảy ra do chế phẩm vacxin nhiễm các tác nhân gây bệnh khác vào. Điều này có thể hạn chế bằng các quy trình sản xuất, bảo quản và sử dụng chặt chẽ  Bệnh miễn dịch • Thử nghiệm vacxin phòng bệnh dại trên cừu cho thấy có xác suất bệnh tự miễn trên hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/10.000. Lý do có thể là do vacxin chiết xuất từ não chó đã mang theo cả những mẩu protein của tế bào thần kinh, khi tạo miễn dịch cơ thể (được tiêm) đã tạo ra cả kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh của mình. • Vacxin phòng ho gà có thể gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10-4 – 10-6. Việc tinh lọc vacxin này sẽ làm tăng mức an toàn khi sử dụng nhưng đồng nghĩa với việc làm giảm hiệu quả của nó.  Sốc quá mẫn • Thường xảy ra ngay sau khi tiêm vacxin do vacxin chứa lượng độc tố cao chưa được vô hoạt triệt để. • Biểu hiện của quá trình này thường là con vật khó thở, niêm mạc mắt, mũi đỏ ửng, các cơ đặc biệt là các cơ vân rung mạnh, các triệu chứng thần kinh kèm theo như dãy dụa, kêu rống. • Nặng hơn còn có thể gặp là hiện tượng ỉa đái lung tung, sùi bọt mép, niêm mạc tím tái... • Khi động vật sốc quá mẫn phải can thiệp khẩn trương, kịp thời bằng cách + Đưa ngay động vật vào nơi thoáng mát yên tĩnh ở tư thế đầu cao hơn đuôi cho động vật dễ thở. + Xoa bóp vùng ngực để tăng cường hô hấp và nhịp tim. + Dùng các loại thuốc kháng Histamin như: Dimedron, Ephedrin, Phenegan, Adrenalin..., kết hợp truyền dung dịch sinh lý mặn hoặc sinh lý ngọt có trộn thêm vitamin B1 hoặc vitamin C. • Ở người, đã có một số thảm họa vacxin xảy ra trên thế giới mà lịch sử phát triển vacxin đã phải ghi nhận: Thảm họa Mulkowal Xảy ra vào tháng 10 năm 1902 ở Mulkowal, Ấn Độ, 19 người chết vì uốn ván sau khi tiêm vacxin dịch hạch bất hoạt toàn tế bào, đó là do vacxin này bị nhiễm khuẩn trong quá trình sản xuất tại cơ sở Haffkine ở Bombay Ấn Độ. TIÊM PHÒNG ĐỐI VỚI TỪNG BỆNH Theo hƣớng dẫn của Cục Thú Y Bệnh Dịch tả lợn 1. Đối tượng tiêm phòng: tất cả các loại lợn trong diện tiêm phòng 2. Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia đình trong phạm vi cả nước. 3. Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần vào tháng 3 - 4 và 9 - 10 hàng năm. 4. Tiêm phòng bổ sung đối với lợn mới sinh, mới nhập về chưa được tiêm trong thời gian tiêm định kỳ. 5. Tiêm phòng khẩn cấp: khi có dịch xảy ra, tiêm thẳng vào ổ dịch trong phạm vi xã có dịch. 6. Liều lượng, đường tiêm, lợn trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất vacxin. Danh mục các bệnh phải công bố dịch 1. Bệnh thuộc danh mục bảng A của Luật Thú y thế giới 1.1. Bệnh Lở mồm long móng 1.2. Bệnh Cúm gia cầm chủng độc lực cao (HPAI) 1.3. Bệnh Dịch tả lợn 1.4. Bệnh Dịch tả trâu bò 1.5. Bệnh Lưỡi xanh 1.6. Bệnh newcastle 1.7. Bệnh Đậu cừu, Đậu dê 2. Bệnh thuộc danh mục bảng B của Luật Thú y thế giới 2.1. Bệnh Nhiệt thán 2.2. Bệnh Dại 2.3. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 2.4. Bệnh Bò điên Danh mục các bệnh nguy hiểm của động vật 1. Bệnh Lở mồm long móng 2. Bệnh Cúm gia cầm chủng độc lực cao (HPAI) 3. Bệnh Dịch tả lợn 4. Bệnh Dịch tả trâu bò 5. Bệnh Lưỡi xanh 6. Bệnh newcastle 7. Bệnh Gumboro 8. Bệnh Đậu cừu, Đậu dê 9. Bệnh Nhiệt thán 10. Bệnh Dại 11. Bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò, lợn 12. Bệnh Lep tô (Xoắn khuẩn) 13. Bệnh Tiên mao trùng; 14. Bệnh Biên trùng; 15. Bệnh Lê dạng trùng; 16. Bệnh giả dại; 17. Bệnh Ung khí thán; 18. Bệnh Giun bao; 19. Bệnh Suyễn Lợn; 20. Bệnh Rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn; 21. Bệnh Bò điên; 22. Bệnh Dịch tả vịt; 23. Bệnh Viêm gan vịt; 24. Bệnh Xuất huyết ở thỏ; LỊCH DUNG VACXIN CHO ĐÀN GÀ THƢƠNG PHẨM Ngày tuổi Vacxin sử dụng 1 Gumboro 1 7 Chủng đậu Nhỏ Lasota lần 1 10 Gumboro 2 20 Gumboro 3 25 Lasota lần 2 40 Tiêm Newcastle Hệ I Phần II MIỄN DỊCH HỌC ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU I. Khái niệm  KT đặc hiệu là chất được cơ quan, tế bào miễn dịch sản xuất ra khi có sự kích thích của KN Chúng sẽ tương tác với KN theo nhiều cách khác nhau Mục đích cuối cùng là vô hiệu hoá và loại trừ KN ra khỏi cơ thể KT đặc hiệu gồm có: KT dịch thể đặc hiệu KT tế bào II. Ứng dụng của kháng thể đặc hiệu  Trong chẩn đoán bệnh  Trong điều trị bệnh  Trong phòng bệnh A). Ứng dụng trong chẩn đoán  Trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm  Các phản ứng huyết thanh học  Chẩn đoán kháng nguyên  Chẩn đoán kháng thể Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính HT KN Nước sinh lý - + Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc Phản ứng ELISA Kết quả phản ứng ELISA Phản ứng huỳnh quang Kết quả phản ứng huỳnh quang  Chẩn đoán bệnh ung thư Chẩn đoán Invitro  Dùng KT đặc hiệu để xác định kháng nguyên ung thư trên bề mặt tế bào ung thư (hóa mô miến dịch). Dùng KT đơn dòng để chẩn đoán sớm tế bào ung thư thông qua các dấu ấn đặc biệt có trên bề mặt tế bào ung thư ở các giai đoạn phát triển khác nhau.  Dùng kháng kháng thể đánh dấu huỳnh quang để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh bệnh nhân ung thư vòm họng (ung thư do nhiễm virus Epstein – Barr) Chẩn đoán Invivo  Xác định mô ung thư  Dùng KT đặc hiệu với KN ung thư đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ để tiêm vào cơ thể.  KT này sẽ tập trung tại nơi có KN ung thư.  Theo dõi vị trí tập trung phóng xạ có thể xác định mô ung thư.  Xác định một số KN ung thư với số lượng rất ít trên tế bào  Dùng KT đơn dòng đã đánh dấu  Rồi tiêm vào cơ thể để phát hiện một số ít tế bào di căn hoặc còn sót sau phẫu thuật hoặc sau lý trị liệu. B. Trong phòng bệnh Trong phòng bệnh truyền nhiễm  Dùng kháng huyết thanh Ví dụ: Kháng độc tố uốn ván  Những con vật bị thương đột ngột hoặc trước phẫu thuật có thể tiêm kháng độc tố uốn ván vào dưới da với liều.  Kháng huyết thanh cần dùng sớm mới có hiệu quả, không để quá 12 giờ sau khi bị thương. C). Trong điều trị bệnh Trong điều trị bệnh truyền nhiễm  Dùng kháng huyết thanh Nguyên lý:  Khi mắc bệnh cấp tính, cơ thể động vật chưa có miễn dịch  Có thể đưa kháng huyết thanh vào cơ thể để tạo miễn dịch bị động, giúp con vật thoát khỏi cơn nguy kịch  kháng huyết thanh có các loại sau: Kháng huyết thanh dị loài  KHT s¶n xuÊt tõ ®éng vËt kh¸c loµi.  Tr-íc ®©y sö dông ë d¹ng HT, nay th-êng ®-îc dïng ë d¹ng Immuno globulin (IgG) tinh sạch.  KHT dÞ loµi khi sö dông dÔ g©y sèc ph¶n vÖ hay bÖnh huyÕt thanh, nguy hiÓm cho ng-êi sö dông KHT cïng loµi: Tr¸nh ®-îc sèc ph¶n vÖ hay bÖnh huyÕt thanh  Dùng kháng thể lòng đỏ trứng gà  Kháng thể lòng đỏ kháng virus Gumboro  Kháng thể lòng đỏ kháng virus Newcastle  Kháng thể lòng đỏ kháng virus IB Trong điều trị ung thư Dùng kháng thể đơn dòng III. Sản xuất kháng thể dịch thể đặc hiệu  Những yếu tố đầu tiên cho việc sản xuất KT đạt hiệu quả là:  Có những quy trình thao tác chung viết bằng văn bản.  Có hướng dẫn về sản xuất rõ ràng cho từng loại KT được sản xuất.  Sự tôn trọng triệt để các hướng dẫn trên trong quá trình sản xuất. Các bước sản xuất kháng thể 3.1. Lập kế hoạch Mỗi loại KT được sản xuất trong một cơ sở phải có kế hoạch sản xuất chi tiết mô tả các bước của quy trình, số lượng sản phẩm cần sản xuất, thời gian tiến hành...  Kế hoạch được lập là tài liệu trong quy trình sản xuất chuẩn được chi tiết hóa. 3.2. Tài liệu của quy trình sản xuất  Quy trình kỹ thuật chi tiết là tài liệu sản xuất cho mỗi loại KT.  Tài liệu phải nêu rõ nguyên lý sản xuất, các công đoạn sản xuất và phương pháp kiểm tra sản phẩm sau mỗi công đoạn.  Tài liệu nêu rõ  Nguồn gốc của kháng nguyên để gây miễn dịch.  Động vật và tiêu chuẩn của động vật dùng sản xuất KT.  Trình tự sản xuất.  Kiểm nghiệm sản phẩm Mỗi công đoạn đều phải mô tả chi tiết các thao tác kỹ thuật, phương pháp đánh giá sản phẩm của từng công đoạn. 3.3. Quá trình sản xuất KT đặc hiệu 3.3.1. Nguyên lý chung của quá trình tạo miễn dịch cao cho động vật  Để có hàm lượng KT cao phải gây tối MD cho động vật theo nguyên lý chung: - Dùng vacxin gây miễn dịch cơ sở - Gây tối miễn dịch bằng cách Tiêm nhắc lại vài lần bằng vacxin hoạc Công cường độc với liều tăng dần 3.3.2. Yêu cầu về nguyên liệu, động vật Nguyên vật liệu, hóa chất Nguyên vật liệu, hóa chất được sử dụng trong quá trình sản xuất KT phải đảm bảo yêu cầu kỹ thuật và phải được phê chuẩn của cơ quan cấp giấy chứng nhận có thẩm quyền quốc gia. Động vật dùng trong sản xuất và kiểm nghiệm Động vật phải đạt tiêu chuẩn về các yêu cầu ký thuật QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH Sơ đồ tóm tắt qui trình sản xuất kháng thể trên thỏ  Bước 1: Gây miễn dịch cho thỏ  Gây MD cơ sở: dùng KN là virus (VK) vô hoạt  Gây tăng MD: dùng vacxin nhắc lại.  Bước 2: Thu hoặch huyết thanh Khi HT thỏ có nồng độ KT cao thì thu Ví dụ: Trong sản xuất KHT tụ huyết trùng hiệu giá phản ứng IHA đạt >1/160 Immunisation protocol an example of a typical immunisation schedule for rabbit  Bước 3: Chiết tách IgG Phương pháp Caprylic axit - Amonium sulphat (NH4)2SO4 (Attached PDF file)  Bước 4: Kiểm tra độ tinh khiết và hiệu giá KT Kiểm tra độ tinh khiết của IgG bằng phương pháp chạy điện di trên gen Polyacrylamide gel (PAGE). Kiểm tra hiệu giá của IgG bằng các phương pháp huyết thanh học. MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ  Kháng thể lòng đỏ là trong lòng đỏ của trứng gia cầm có KT dịch thể đặc hiệu  Kháng thể được tạo ra bằng phương pháp gây MD cao cho động vật, nên KT đặc hiệu chính là lớp IgG.  Gà được sử dụng phổ biến để chế KT lòng đỏ  Ví dụ:  KT lòng đỏ kháng virus Gumboro  KT lòng đỏ kháng virus viêm gan vịt  KT lòng đỏ kháng Mycoplasma galisepticum Quy trình sản xuất KT lòng đỏ kháng virus viêm gan vịt G©y MD cao cho gµ ®Î víi virus viªm gan vÞt Thu trøng Mæ trøng thu lßng ®á Pha lo·ng lßng ®á víi dung m«i KiÓm tra v« trïng KiÓm tra an toµn KiÓm tra hiÖu lùc Đãng chai B¶o qu¶n -200c