Mô phỏng mô hình gây giảm bạch cầu thực nghiệm bằng Carboplatin trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 26 MÔ PHỎNG MÔ HÌNH GÂY GIẢM BẠCH CẦU THỰC NGHIỆM BẰNG CARBOPLATIN TRÊN CHUỘT NHẮT Trần Mạnh Hùng*, Trương Đình Phước*, Trần Văn Mười*, Huỳnh Thị Ngọc Hạnh* TÓM TẮT Mục tiêu: “Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng Carboplatin trên chuột nhắt” để làm công cụ sàng lọc và đánh giá khả năng khôi phục bạch cầu của các thuốc thử nghiệm, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Phương pháp: Suy giảm bạch cầu được tiến hành bằng cách tiêm phúc mạc Carboplatin ở các liều lượng khác nhau. Sử dụng buồng đếm Neubauer và xét nghiệm công thức máu để xác định mô hình phù hợp. Kết quả: Carboplatin với liều duy nhất 100 mg/kg, tiêm phúc mô gây giảm bạch cầu mạnh nhất ở thời điểm 5 ngày sau đó. Tác động làm giảm số lượng các loại bạch cầu cũng thể hiện rõ rệt, nhất là trên bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu lympho. Tổng lượng bạch cầu có thể phục hồi tự nhiên trở về bình thường sau một đợt khảo sát (14 ngày sau khi tiêm carboplatin). Vì thế, mô hình chỉ có giá trị áp dụng vào ngày thứ 5. Kết luận: Mô hình này có thể được áp dụng làm công cụ sàng lọc các thuốc có tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu do thuốc hóa trị ung thư gây ra. Từ khóa: Carboplatin, Suy giảm bạch cầu, Mô hình thực nghiệm ABSTRACT DEVELOPMENT OF A MOUSE MODEL FOR CARBOPLATIN-INDUCED NEUTROPENIA Tran Manh Hung, Truong Dinh Phuoc, Tran Van Muoi, Huynh Thi Ngoc Hanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 26 - 31 Objective: A mouse model for Carboplatin-induced neutropenia was developed to provide a tool for screening agents that exert protective effect on anticancer drug-induced neutropenia. Methods: Neutropenia was induced by intraperitoneal injections of Carboplatin at different doses. Neubauer cell counter and white blood cell count were applied to determine grade of neutropenia. Results: Carboplatin at a dose of 100 mg/kg, ip, induced significant neutropenia after 5 days of injection. However, total white blood cell count returned to baseline 14 days thereafter, thus this model could be of value when evaluating at day 5. Conclusion: This mouse model can be applied for screening agents that exert protective effect on Carboplatin-induced neutropenia.. Key words: Carboplatin, Neutropenia, Mouse model ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các mầm bệnh từ bên ngoài như vi khuẩn, nấm, virus Giảm số lượng bạch cầu sẽ làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội, đây cũng là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho người bệnh. Thuốc điều trị thường là nguyên nhân chính gây giảm bạch cầu qua nhiều cơ chế khác nhau; trong đó các thuốc chống ung thư là một trong những nhóm thuốc có nguy cơ cao nhất gây mất bạch cầu. *Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 093.7746.596 Email: manhung1969@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 27 Carboplatin tên khoa học cis-diammine (cyclobutane-1,1-dicarboxylate-O,O') platinum (II), là một dẫn xuất của kim loại nặng platin. Carboplatin gắn vào ADN để tạo ra liên kết chéo bên trong và giữa hai chuỗi ADN, liên kết chéo này làm thay đổi cấu trúc và ức chế sự tổng hợp ADN. Carboplatin được chỉ định dùng đơn trị hoặc phối hợp các thuốc khác chống khối u tân sinh, điều trị loại u ác tính sau: ung thư biểu mô buồng trứng, ung thư vú tân sinh, ung thư phế quản (tế bào nhỏ hoặc không nhỏ), khối u ở đầu và cổ, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn. Trước đây, tình trạng giảm bạch cầu do thuốc chống ung thư gây ra buộc phải giảm hoặc ngừng liệu pháp hóa trị, hiện nay, khó khăn này đã được khắc phục nhờ việc sử dụng các yếu tố kích thích hệ tạo máu như G-CSF (Granulocyte - Colony Stimulating Factor: yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt), GM-CSF (Granulocyte macrophage – Conoly Stimulating Factor: yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt - đại thực bào. Một trong các biệt dược thông dụng là Neupogen với hoạt chất là filgrastim. Ngoài các yếu tố trên, hiện nay việc phát triển các thuốc kích thích hệ tạo máu bằng công nghệ sinh học, bằng các thuốc các thuốc có nguồn gốc dược liệu cũng đang được đẩy mạnh. Vì vậy việc xây dựng các mô hình dược lý phù hợp để phục vụ cho các nghiên cứu này là cần thiết. Với mục đích trên, chúng tôi đặt mục tiêu mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu trên chuột nhắt bằng một thuốc hóa trị ung thư như Carboplatin. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng ddY, khỏe mạnh, không dị tật, không có biểu hiện bất thường, do viện Vacin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp. Chuột thí nghiệm là chuột đực có trọng lượng khoảng 20 ± 2 gam lúc bắt đầu tiến hành thí nghiệm; hàng ngày chuột được cung cấp đủ thức ăn và nước uống. Chuột thí nghiệm được phân ra thành các lô thử nghiệm sau: Lô chứng Lô gây giảm bạch cầu bằng Carboplatin Lô sử dụng filgrastim để đánh giá đáp ứng của mô hình. Hóa chất và thuốc thử nghiệm: - Carboplatin 150 mg: do công ty Ebewe Pharma sản xuất, lô số: VN-4413-10 - Neupogen (filgrastim): do F. Hoffmann-La Roche sản xuất, số lô: VN-9562-10 Phương pháp thử nghiệm Thăm dò tác dụng gây giảm tổng lượng bạch cầu trên buồng đếm Neubauer: Carboplatin được pha trong glucose với liều 200 mg/kg, 150 mg/kg hay 100 mg/kg và được tiêm phúc mạc liều duy nhất với thể tích tiêm 0.1 ml/10 g thể trọng vào buổi sáng và được thực hiện trên 6 chuột. Chuột được lấy máu từ đuôi và xác định số lượng bạch cầu bằng buồng đếm Neubauer ở các thời điểm trước khi tiêm và liên tục 14 ngày sau khi tiêm. Xác định các chỉ số huyết học của mô hình trên máy xét nghiệm huyết học Các mẫu máu được lấy từ tim chuột sau khi gây mê bằng đá C02 và chứa trong các ống chứa mẫu có chất chống đông EDTA (do Bệnh viện ĐH Y Dược cơ sở 4 cung cấp). Mẫu máu được xét nghiệm trên máy EXCELL-2208, Bệnh viện ĐH Y Dược cơ sở 4). Các thông số về số lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu ưa bazơ, bạch cầu ưa acid, hồng cầu, tiểu cầu đều được ghi nhận và đưa vào kết quả thực nghiệm. Phân tích kết quả và thống kê: Các số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± Sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM). Việc thống kê các số liệu được áp dụng dựa trên phần mềm thống kê Minitab, sử dụng phép kiểm t-test để so sánh sự khác biệt giữa các Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 28 lô. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p<0.05, p<0.01 hay p<0.001. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát tác động làm giảm bạch cầu của Carboplatin: Carboplatin tiêm phúc mạc 200 mg/kg liều duy nhất Phương pháp khảo sát tiến hành trên 6 chuột, sau khi tiêm carboplatin với liều 200 mg/kg tất cả chuột đều suy yếu, ngày thứ 2 có 3 chuột bị tiêu chảy nặng, ngày thứ 3 có 4 chuột tử vong và ngày tiếp theo 2 chuột còn lại đã tử vong. Như vậy, liều 200 mg/kg carboplatin là quá độc, không thích hợp để khảo sát. Carboplatin tiêm phúc mạc 150 mg/kg liều duy nhất Tiến hành tương tự, khảo sát trên 6 chuột, sau khi tiêm phúc mô carboplatin 150 mg/kg liều duy nhất thì vào ngày thứ 3, cả 6 chuột đã bị tiêu chảy và rất yếu. Ngày hôm sau tất cả chuột đều tử vong. Carboplatin tiêm phúc mạc 100 mg/kg liều duy nhất Thí nghiệm được tiến hành trên một lô gồm 6 chuột, cân và lấy máu đuôi chuột vào ngày 0 (trước khi tiêm thuốc), sau đó tiêm phúc mô carboplatin 100 mg/kg liều duy nhất. Tiếp tục theo dõi thể trọng và tổng lượng bạch cầu trong 14 ngày sau đó (ngày 1 đến ngày 14). Kết quả được trình bày trong Hình 1. Hình 1. Tác động của carboplatin 100 mg/kg, ip trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu Trong quá trình thí nghiệm, thể trọng của chuột bắt đầu giảm vào ngày thứ 2 và giảm mạnh nhất vào ngày thứ 5. Từ ngày 6 trở đi, chuột bớt yếu và dần tăng cân trở lại. Đến ngày 9, thể trọng chuột về lại mức bình thường. Sau khi tiêm carboplatin 100 mg/kg thể trọng, tổng lượng bạch cầu bắt đầu giảm vào ngày thứ 1 và tiếp tục giảm thấp nhất vào ngày thứ 5. Từ ngày 6 tổng lượng bạch cầu bắt đầu tăng trở lại. Đến ngày 14, có sự phục hồi hoàn toàn tổng lượng bạch cầu. Đánh giá mô hình gây suy giảm bạch cầu của Carboplatin và đáp ứng của Filgrastim Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên các lô chuột thí nghiệm như sau: Lô chứng (glucose 5%, ip). Lô gây suy giảm bạch cầu bằng carboplatin (100 mg/kg, ip, liều duy nhất). Lô gây suy giảm bạch cầu bằng carboplatin và được điều trị bằng filgrastim (Neupogen) (50 μg/kg, ip liều duy nhất 24 giờ sau khi tiêm carboplatin). Lô gây suy giảm bạch cầu bằng carboplatin và được điều trị bằng filgrastim (20 μg/kg/ngày, ip từ ngày 1 đến ngày 5). Do dung môi sử dụng trong pha chế carboplatin, filgrastim và G-CSF là glucose 5% nên ở lô chứng chúng tôi sử dụng glucose 5%. Mặt khác để đánh giá sự đáp ứng của mô hình với các thuốc có khả năng phục hồi dòng bạch cầu, sau khi tiêm carboplatin, chuột được điều trị bằng filgrastim với liều 50 μg/kg, ip liều duy nhất, hoặc được điều trị bằng liều filgrastim liều 20 μg/kg, ip vào 5 ngày: 1, 2, 3, 4, 5. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 29 Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm: tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa bazơ. Ngoài ra các chỉ số huyết học khác như hồng cầu, hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct), và tiểu cầu , cũng được theo dõi. Dựa vào kết quả thống kê và biểu đồ thể hiện số lượng các loại bạch cầu giữa các lô thử nghiệm, chúng tôi thấy rằng sau khi tiêm liều duy nhất carboplatin (100 mg/kg, ip) tổng lượng bạch cầu giảm xuống rất thấp (giảm trên 70% so với chỉ số bình thường), trong đó bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân đều giảm mạnh. Hai loại bạch cầu quan trọng giúp cơ thể chống nhiễm trùng là bạch cầu trung tính và bạch cầu lympho cũng giảm trên 70% so với chỉ số bình thường. Đối với bạch cầu ưa acid, số lượng ở các lô thực nghiệm đều có giá trị là 0. Như vậy có thể cho rằng, carboplatin liều 100 mg/kg ip đã gây suy giảm bạch cầu đạt mức bệnh lý ở thời điểm 5 ngày sau khi tiêm liều duy nhất. Hình 2. Tác động của carboplatin và Filgrastim trên các loại bạch cầu Theo dõi đáp ứng của mô hình với các thuốc kích thích tạo dòng bạch cầu, chúng tôi nhận thấy việc sử dụng filgrastim (Neupogen) liều duy nhất 50 mcg/kg vào thời điểm 24 giờ sau khi tiêm carboplatin có tác dụng hồi phục một phần sự suy giảm bạch cầu. Cụ thể, filgrastim phục hồi một phần số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân đạt ý nghĩa thống kê so với lô gây suy giảm bạch cầu. Với chế độ liều 20 mcg/kg/ngày sử dụng trong 5 ngày, filgrastim cũng có khả năng phục hồi một phần tổng lượng bạch cầu, nhưng trên bạch cầu trung tính thì mức độ phục hồi gần như hoàn toàn. Tuy nhiên đối với bạch cầu lympho, tác dụng của filgrastim hầu như chưa được thể hiện. Đánh giá trên tiểu cầu, hồng cầu và các chỉ số liên quan Ngoài bạch cầu, chúng tôi cũng đánh giá mức độ tác động của carboplatin trên số lượng hồng cầu và các chỉ số liên quan như Haemoglobin (Hb), Hematocrit (Hct) và số lượng tiểu cầu. Kết quả được trình bày ở bảng 1: Bảng 1. Số lượng hồng cầu, các thông số liên quan và số lượng tiểu cầu Hồng cầu Hb Hct Tiểu cầu Glucose 5% (n = 10) 9,54 ± 0,38 152,70 ± 6,54 44,68 ± 1,93 931,60 ± 124,73 Carboplatin 100 mg/kg (n = 14) 7,71 ± 0,28** 123,21 ± 3,96** 36,49 ± 1,40** 601,14 ± 14,27** Carboplatin 100 mg/kg + Filgrastim 50 mcg/kg (n = 10) 8,65 ± 0,38# 134,00 ± 5,45 38,25 ± 1,67 536,50 ± 36,24 Carboplatin 100 mg/kg + Filgrastim 20 mcg/kg/ngày x 5 (n = 6) 8,32 ± 0,46 129,50 ± 5,38 37,38 ± 1,60 413,50 ± 47,31 **P < 0.01 so với lô chứng #P < 0.05 so với lô carboplatin Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 30 Vào ngày thứ 5 sau khi tiêm carboplatin, số lượng hồng cầu giảm có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng. Song song với sự giảm hồng cầu, hàm lượng Hb và Hct cũng giảm, mặc dù sự suy giảm này có thể chưa phản ánh rõ rệt tình trạng thiếu máu có ý nghĩa lâm sàng. Như vậy carboplatin cũng gây suy giảm sự tạo hồng cầu nhưng ở mức độ nhẹ hơn so với bạch cầu. Filgrastim ở liều duy nhất 50 mcg/kg và 20 mcg/kg/ngày x 5 ngày hầu như không có tác dụng rõ rệt trên chỉ số hồng cầu và các thông số liên quan, ngoại trừ số lượng hồng cầu có tăng trở lại ở lô sử dụng filgrastim 50 mcg/kg. Như vậy, yếu tố kích thích tạo bạch cầu chỉ thể hiện rõ trên dòng bạch cầu mà không có tác dụng kích thích rõ rệt trên hồng cầu. Tương tự, trên tiểu cầu, carboplatin làm giảm số lượng tiểu cầu khá mạnh vào ngày thứ 5. Tuy nhiên ở các lô sử dụng filgrastim số lượng tiểu cầu vẫn ở mức suy giảm như khi sử dụng carboplatin. Điều này chứng tỏ filgrastim không có khả năng phục hồi tiểu cầu. BÀN LUẬN Hiện nay ở Việt Nam tỉ lệ mắc ung thư ngày càng tăng, đặc biệt ung thư vú, ung thư phổi và ung thư buồng trứng. Hóa trị liệu pháp với các dẫn chất platin (cisplatin, carboplatin, oxaliplatin ) là một trong những điều trị căn bản, đôi khi là đòi hỏi bắt buộc trong những ca bệnh này. Vì thế, trong nghiên cứu này chúng tôi chọn carboplatin để nghiên cứu và xây dựng một mô hình gây suy giảm bạch cầu thích hợp và hướng đến áp dụng mô hình cho các thử nghiệm sàng lọc các thuốc có tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu. Trong nghiên cứu của Thomas và cộng sự (1995)(3), nhóm tác giả sử dụng liều duy nhất carboplatin 125 mg/kg, ip, trên chuột nhắt chủng Balb/c, kết quả cho thấy số lượng bạch cầu trung tính giảm mạnh vào khoảng ngày 5 đến ngày 8 sau khi tiêm carboplatin. Trong nghiên cứu này, carboplatin được sử dụng với liều thấp hơn (100 mg/kg tiêm phúc mô), trên chuột nhắt chủng Swiss albino, kết quả cho thấy sự suy giảm bạch cầu trung tính cũng giảm thấp nhất vào ngày 5. Ngoài ra, các loại bạch cầu khác cũng giảm rất mạnh, kèm theo sự giảm hồng cầu và tiểu cầu. Điều này chứng tỏ liều lượng carboplatin sử dụng như trên có thể phù hợp cho việc xây dựng mô hình gây suy tủy của thuốc hóa trị và áp dụng trong sàng lọc các thuốc có tác dụng bảo vệ hay phục hồi chức năng tạo máu. Filgrastim thường được sử dụng với chế độ liều 10 mcg/kg hay 30 mcg/kg trong các thực nghiệm dược lý(1,2). Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện khảo sát với hai liều là 50 mcg/kg tiêm phúc mô liều duy nhất và 20 mcg/kg/ngày tiêm phúc mô trong 5 ngày và kết quả cho thấy thuốc có đáp ứng một phần. Có thể do thời gian sử dụng và theo dõi quá ngắn (5 ngày) nên chưa thể theo dõi tác dụng phục hồi hoàn toàn của filgrastim. Chúng tôi chưa thử nghiệm filgrastim ở liều 5 mcg/kg, hay 10 mcg/kg (liều sử dụng thực tế trên lâm sàng). Tuy nhiên giữa thực nghiệm và lâm sàng có nhiều khác biệt, vì thế một chế độ liều thích hợp trên người còn tùy thuộc vào mức độ suy giảm bạch cầu và sự đáp ứng của bệnh nhân. Carboplatin gây suy giảm mạnh tiểu cầu và có ảnh hưởng nhẹ trên hồng cầu và các chỉ số liên quan. Như vậy ngoài các chỉ tiêu về các loại bạch cầu, mô hình này có thể áp dụng để đánh giá thêm về sự phục hồi số lượng tiểu cầu, một chỉ tiêu khá quan trọng khi đề cập đến các biến chứng trên quá trình đông máu. KẾT LUẬN - Carboplatin với liều duy nhất 100 mg/kg, tiêm phúc mô gây giảm bạch cầu mạnh nhất ở thời điểm 5 ngày sau đó. Tác động làm giảm số lượng các loại bạch cầu cũng thể hiện rõ rệt, nhất là trên bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu lympho. Sự suy giảm bạch cầu ưa acid, ưa bazơ cũng rất đáng chú ý và có thể chỉ mang tính tham khảo. Tuy nhiên sự suy giảm bạch cầu này chỉ mang tính tạm thời, tổng lượng bạch cầu có thể phục hồi tự nhiên trở về bình thường sau một đợt khảo sát (14 ngày sau khi tiêm carboplatin) vì thế, mô hình chỉ có giá trị áp dụng vào ngày thứ 5. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 31 - Ngoài ra, carboplatin còn có tác động gây giảm tiểu cầu một cách rõ rệt và giảm hồng cầu cũng như các chỉ số huyết học khác, đây cũng là những thông số rất có giá trị khi áp dụng mô hình để sàng lọc các thuốc hỗ trợ trong hóa trị ung thư. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Doanell C. et al. (1998), Systemic Effects of Pegylated Recombinant Human Megakaryocyte Growth and Developemant Factor in Combination with Recombinant Murine Granulocyte Colony-Stimulating Fsctor in a Murine Model of Myelosuppression, Toxicological Sciences, 45, 77-87. 2. Kabaya K., Obuchi M. (1995) “Experimental study on safety for granulopoiesis in simultaneous therapy with recombinant human granulocyte conoly – stimulating factor and chemotherapy”, Oncol Res, 7 (3-4) 165-71. 3. Thomas R.U., Juan D.C., Songmei Y., Susan S., Megakaryocyte Growth and Development Factor Ameliorates Carboplatin-Induced Thrombocytopenia in Mice, Blood, Vol 86 (August 1), pp 971-976 (1995).