Mô phỏng mô hình gây giảm bạch cầu thực nghiệm bằng Ribavirin và Interferon trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 38 MÔ PHỎNG MÔ HÌNH GÂY GIẢM BẠCH CẦU THỰC NGHIỆM BẰNG RIBAVIRIN VÀ INTERFERON TRÊN CHUỘT NHẮT Trần Mạnh Hùng*, Ngô Thị Kim Phúc* TÓM TẮT Mục tiêu: “Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng Ribavirin và Interferon trên chuột nhắt” để làm công cụ sàng lọc và đánh giá khả năng khôi phục bạch cầu của các thuốc thử nghiệm, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Phương pháp: Suy giảm bạch cầu được tiến hành bằng cách tiêm phúc mạc Interferon và cho uống Ribavirin ở các liều lượng khác nhau. Sử dụng buồng đếm Neubauer và xét nghiệm công thức máu để xác định mô hình phù hợp. Kết quả: Interferon alfa-2b liều 200.000 UI/kg tiêm phúc mạc 3 lần/tuần phối hợp với Ribavirin liều 300 mg/kg uống hàng ngày cho kết quả gây suy giảm bạch cầu rõ rệt, có ý nghĩa về mặt bệnh lý và thực nghiệm. Kết luận: Về mặt thực nghiệm, các thiết kế trên về chủng thú vật thí nghiệm, liều lượng, thời gian và đường sử dụng rất thích hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm để tiến hành nghiên cứu. Từ khóa: Interferon alfa-2b, Ribavirin, Suy giảm bạch cầu, Mô hình thực nghiệm ABSTRACT DEVELOPMENT OF A MOUSE MODEL FOR INTERFERON AND RIBAVIRIN INDUCED NEUTROPENIA Tran Manh Hung, Ngo Thi Kim Phuc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 38 - 44 Objective: A mouse model for Interferon and Ribavirin-induced neutropenia was developed to provide a tool for screening agents that exert protective effect on anticancer drug-induced neutropenia. Methods: Neutropenia was induced by intraperitoneal injections of Interferon and oral administration of Ribavirin at different doses. Neubauer cell counter and white blood cell count were applied to determine grade of neutropenia. Results: Interferon alfa-2b at a dose of 200.000 UI/kg, ip, 3 times/week combined with oral Ribavirin at a dose of 300 mg/kg/day x 14 days induced pathologically neutropenia. Conclusion: This mouse model can be applied for screening agents that exert protective effect on Carboplatin-induced neutropenia.. Key words: Interferon alfa-2b, Ribavirin, Neutropenia, Mouse model ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các mầm bệnh từ bên ngoài như vi khuẩn, nấm, virus Giảm số lượng bạch cầu sẽ làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội, đây cũng là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho người bệnh. Thuốc điều trị thường là nguyên nhân chính gây giảm bạch cầu qua nhiều cơ chế khác nhau; trong đó các thuốc kháng ung thư, kháng virus là một trong những nhóm thuốc có nguy cơ cao nhất gây mất bạch cầu. Ribavirin là chất tổng hợp có cấu trúc tương *Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 093.7746.596 Email: manhung1969@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 39 tự nucleosid guanosin, ức chế sự phiên bản của virus. Ribavirin được chỉ định phối hợp với interferon alfa-2b tái tổ hợp trong điều trị viêm gan C mạn tính ở những bệnh nhân từ 3 tuổi trở lên mà trước đó chưa được điều trị với interferon alfa hoặc ở những bệnh nhân 18 tuổi trở lên bị tái phát sau điều trị bằng interferon alfa. Ribavirin còn được chỉ định điều trị nhiễm virus herpes, cúm A, cúm B và các bệnh nhiễm virus khác: sởi, quai bị, thủy đậu, virus hợp bào đường hô hấp(1,2). Interferon alfa-2b có đặc tính chống ung thư, chống tăng sản, điều hòa miễn dịch và chống siêu vi. Interferon alfa gắn vào receptor bề mặt tế bào và khởi tạo những những thay đổi phức tạp bên trong tế bào, bao gồm: sự giảm tổng hợp một số enzym, kiềm hãm sự tăng sản tế bào, hoạt động điều hòa miễn dịch như làm tăng hoạt tính thực bào của đại thực bào và tăng tính gây độc tế bào đặc thù của lympho bào đối với các tế bào đích, ức chế sự sao chép virus trong các tế bào nhiễm siêu vi(3). Trước đây, tình trạng giảm bạch cầu do thuốc kháng virus gây ra buộc phải giảm hoặc ngừng liệu pháp trị liệu, hiện nay, khó khăn này đã được khắc phục nhờ việc sử dụng các yếu tố kích thích hệ tạo máu như G-CSF (Granulocyte - Colony Stimulating Factor: yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt), GM-CSF (Granulocyte macrophage – Conoly Stimulating Factor: yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt - đại thực bào. Ngoài các yếu tố trên, hiện nay việc phát triển các thuốc kích thích hệ tạo máu bằng công nghệ sinh học, bằng các thuốc các thuốc có nguồn gốc dược liệu cũng đang được đẩy mạnh. Vì vậy việc xây dựng các mô hình dược lý phù hợp để phục vụ cho các nghiên cứu này là cần thiết. Với mục đích trên, chúng tôi đặt mục tiêu mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu trên chuột nhắt bằng thuốc kháng virus ribavirin và interferon. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng chủng ddY, khỏe mạnh, không dị tật, không có biểu hiện bất thường, do viện Vắcxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp. Chuột thí nghiệm là chuột đực có trọng lượng khoảng 20 ± 2 gam lúc bắt đầu tiến hành thí nghiệm; hàng ngày chuột được cung cấp đủ thức ăn và nước uống. Chuột thí nghiệm được phân ra thành các lô thử nghiệm sau: - Lô chứng - Lô gây giảm bạch cầu bằng interferon alfa-2b - Lô gây giảm bạch cầu bằng interferon alfa- 2b và ribavirin. Hóa chất và thuốc thử nghiệm: - Uniferon (interferon alfa-2b 5MIU): do công ty Getz Pharma sản xuất, số ĐK: QLSP- 0267-09, hạn sử dụng: 03/2011, dạng bào chế: thuốc bột pha tiêm. - Ribazole (Ribavirin 500 mg): do công ty Getz Pharma sản xuất, số ĐK: VN-1841-06, hạn sử dụng: 05/2012, dạng bào chế: viên nén. Phương pháp thử nghiệm Thăm dò tác dụng gây giảm tổng lượng bạch cầu trên buồng đếm Neubauer: Thí nghiệm này nhằm dò tìm liều lượng thích hợp các thuốc thử nghiệm (interferon, ribavirin) và thời gian gây giảm bạch cầu, để từ đó có thể chọn các thông số cho thí nghiệm xác định nhằm xây dựng mô hình gây giảm bạch cầu. Trong thí nghiệm này, số lượng chuột sử dụng hạn chế (từ 4-6 con cho mỗi thí nghiệm). Xác định các chỉ số huyết học của mô hình trên máy xét nghiệm huyết học Các mẫu máu được lấy từ tim chuột sau khi gây mê bằng đá C02 và chứa trong các ống chứa mẫu có chất chống đông EDTA (do Bệnh viện ĐH Y Dược cơ sở 4 cung cấp). Mẫu máu được xét nghiệm trên máy EXCELL-2208, Bệnh viện ĐH Y Dược cơ sở 4): Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 40 Các thông số về số lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu ưa bazơ, bạch cầu ưa acid, hồng cầu, tiểu cầu đều được ghi nhận và đưa vào kết quả thực nghiệm. Phân tích kết quả và thống kê: Các số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± Sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM). Việc thống kê các số liệu được áp dụng dựa trên phần mềm thống kê Minitab, sử dụng phép kiểm t-test để so sánh sự khác biệt giữa 2 lô. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p<0.05, p<0.01 hay p<0.001. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chọn liều lượng thử nghiệm interferon alfa-2b và ribavirin Interferon alfa-2b: được pha trong dung dịch NaCl 0,9% pha tiêm với liều 100.000 UI/kg, 200.000 UI/kg, 400.000 UI/kg, 600.000 UI/kg, 1.000.000 UI/kg, 1.500.000 UI/kg, 2.000.000 UI/kg và được tiêm phúc mô 3 lần/tuần với thể tích tiêm 0,1 ml/10 g thể trọng. Ribavirin: được pha trong nước cất với các liều: 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg được cho uống hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng. Chuột thí nghiệm được tiến hành theo các lô thử nghiệm sau: Interferon 1.500.000 UI/kg IP 3 lần/tuần (14 ngày). Interferon 2.000.000 UI/kg IP 3 lần/tuần (14 ngày). Interferon 100.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 200 mg/kg uống hàng ngày (14 ngày). Interferon 200.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 400 mg/kg uống hàng ngày (14 ngày). Interferon 200.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 200 mg/kg uống hàng ngày (21 ngày). Interferon 400.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 200 mg/kg uống hàng ngày (14 ngày) Interferon 600.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 200 mg/kg uống hàng ngày (18 ngày). Interferon 1.000.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 200 mg/kg uống hàng ngày (18 ngày). Interferon 200.000 UI/kg IP 3 lần/tuần + ribavirin 300 mg/kg uống hàng ngày (14 ngày). Kết quả khảo sát các liều thử nghiệm được trình bày trong Hình 1. Sau khi tiêm interferon alfa-2b liều 1.500.000 UI/kg (Hình 1A) hay 2.000.000 UI/kg (Hình 1B), tổng lượng bạch cầu hầu như không thay đổi vì thế thí nghiệm được tiếp tục bằng cách kết hợp Ribavirin và Interferon. Sự kết hợp Ribavirin và Interferon gây giảm bạch cầu lệ thuộc vào liều lượng sử dụng. Với liều ribavirin > 300 mg/kg, tỷ lệ chuột tử vong cao, trong khi đó sự gia tăng liều lượng interferon không làm tăng thêm mức độ suy giảm bạch cầu (Hình 1 C, D, E, F, G, H). Ở liều lượng kết hợp ribavirin 300 mg/kg với interferon 200.000 UI/kg (Hình 1I), tổng lượng bạch cầu giảm khá rõ và duy trì trong suốt thời gian theo dõi. Bên cạnh đó, thể trọng của chuột thí nghiệm cũng giảm rõ rệt (Hình 1 K). Vì thế, chúng tôi quyết định chọn liều lượng phối hợp này để xây dựng mô hình. Đánh giá mô hình gây suy giảm bạch cầu của Ribavirin và Interferon Để đánh giá mô hình, chuột thí nghiệm được chia ra làm các lô như sau: Lô đối chứng (NaCl 0,9% ip 3 lần/tuần, nước cất uống hàng ngày) Lô gây suy giảm bạch cầu bằng interferon alfa-2b 200.000 UI/kg ip 3 lần/tuần và ribavirin 300 mg/kg uống hàng ngày Chuột thí nghiệm được lấy máu để tiến hành xét nghiệm công thức máu vào các ngày 7 và 14. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm: tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu mono, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa bazơ, hồng cầu và tiểu cầu. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 41 Hình 1. Tác động của Interferon alfa-2b và Ribavirin trên tổng lượng bạch cầu Tổng lượng bạch cầu Hình 2. Tác động của Interferon alfa-2b 200.000 UI/kg, ip + Ribavirin 300 mg/kg, po trên tổng lượng bạch cầu Dựa vào kết quả thống kê và biểu đồ thể hiện tổng lượng bạch cầu giữa các lô, chúng tôi nhận thấy rằng: Sự thay đổi về tổng lượng bạch cầu của các lô đối chứng (NaCl 0,9%) giữa các thời điểm 7 và 14 ngày so với chỉ số trước thực nghiệm (ngày 0) dao động không đáng kể. Như vậy trong suốt quá trình thử nghiệm yếu tố môi trường và điều kiện nuôi dưỡng không ảnh hưởng đến tổng lượng bạch cầu. Vào ngày 7, tổng lượng bạch cầu ở lô tiêm interferon alfa-2b và uống ribavirin giảm nhiều và so với lô đối chứng, sự suy giảm bạch cầu này có khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,01. Vào ngày 14, tổng lượng bạch cầu ở lô tiêm interferon alfa-2b và uống ribavirin giảm tương tự như ở ngày 7 và giảm nhiều so với lô đối chứng, sự suy giảm bạch cầu này khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,01. Như vậy sau khi tiêm interferon alfa-2b liều 200.000 UI/kg và ribavirin liều 300 mg/kg uống hàng ngày, tổng lượng bạch cầu giảm vào ngày thứ 7 và duy trì cho đến ngày theo dõi thứ 14. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 42 Đánh giá trên các loại bạch cầu Trong quá trình thực nghiệm, chỉ số các loại bạch cầu trước thực nghiệm (ngày 0) và của lô chứng ở các thời điểm ngày 7 và 14 dao động không đáng kể, ngoại trừ trường hợp bạch cầu đơn nhân (lô chứng ngày thứ 14 có số lượng tăng cao) (Hình 3). Như vậy sự thay đổi về tổng lượng bạch cầu ở lô gây suy giảm bạch cầu bằng interferon alfa-2b và ribavirin có thể gán cho tác động của thuốc. Vào ngày 7, các loại bạch cầu đều giảm so với lô chứng, trong đó số lượng bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân và bạch cầu ưa bazơ giảm rất mạnh, có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p<0,01) (Hình 3). Đối với bạch cầu ưa acid, số lượng hầu như không có biến đổi rõ rệt. Kết quả về sự suy giảm bạch cầu do interferon và ribavirin gây ra ở ngày thứ 14 cũng xảy ra tương tự như ngày 7. Hình 3. Tác động của Interferon alfa-2b 200.000 UI/kg, ip + Ribavirin 300 mg/kg, po trên từng loại bạch cầu Ngoài bạch cầu, chúng tôi cũng đánh giá mức độ tác động của Interferon và Ribavirin trên số lượng hồng cầu và các chỉ số liên quan như Haemoglobin (Hb), Hematocrit (Hct) và số lượng tiểu cầu. Kết quả được trình bày ở Hình 4. Vào ngày thứ 7 và 14 sau khi tiêm interferon alfa-2b và uống ribavirin, số lượng hồng cầu không thay đổi so với lô đối chứng. Tương tự, hàm lượng Hb và Hct cũng không bị suy giảm ở lô sử dụng interferon và ribavirin, ngoại trừ ở ngày thứ 14, chỉ số hematocrit có giảm so với lô chứng. Như vậy interferon alfa-2b và ribavirin chưa gây suy giảm sự tạo hồng cầu có ý nghĩa phản ánh sự thiếu máu lâm sàng. Interferon alfa-2b và ribavirin làm giảm mạnh số lượng tiểu cầu vào ngày thứ 7 và 14 của thực nghiệm. Như vậy hai thuốc này không những ảnh hưởng lên số lượng bạch cầu, mà còn ảnh hưởng lên số lượng tiểu cầu. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 43 Hình 4. Tác động của Interferon alfa-2b 200.000 UI/kg, ip + Ribavirin 300 mg/kg, po trên hồng cầu và tiểu cầu BÀN LUẬN Tác động gây suy giảm bạch cầu xảy ra khá nhiều với các thuốc hóa trị như cyclophosphamid, methotrexat, 5-FU, cytosin arabinosid, etoposid, vincristin, adriamycin,, các thuốc kháng virus như ribavirin, interferon alfa-2b, lamivudin, zidovudin Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn ribavirin và interferon alfa-2b để xây dựng mô hình, do hiện nay tần suất sử dụng của các thuốc này trong điều trị viêm gan siêu vi B, C là khá phổ biến. Bên cạnh đó, chúng tôi chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu thực nghiệm nào sử dụng 2 thuốc này để xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu. Qua quá trình khảo sát sơ bộ về liều lượng sử dụng của các thuốc để có thể xây dựng mô hình có thể áp dụng được, chúng tôi nhận thấy: Interferon alfa-2b sử dụng với liều cao (2.000.000 UI/kg tiêm phúc mạc 3 lần/tuần) không gây suy giảm bạch cầu một cách rõ rệt. Điều này chứng tỏ nếu chỉ sử dụng riêng biệt interferon thì rất khó áp dụng để xây dựng được mô hình. Khi phối hợp interferon alfa-2b với ribavirin, tác động gây suy giảm bạch cầu của 2 thuốc này đã thể hiện trong thời gian theo dõi 14 ngày. Tuy nhiên, ribavirin gây tiêu chảy và làm cho chuột tử vong khi sử dụng liều cao. Sau khi khảo sát một số liều, chúng tôi đã chọn ra được sự phối hợp interferon alfa-2b liều 200.000 UI/kg tiêm phúc mô 3 lần/tuần và ribavirin 300 mg/kg uống hàng ngày. Ở tỷ lệ phối hợp này, chuột có biểu hiện suy giảm bạch cầu rõ rệt và tỷ lệ chuột tử vong thấp, vì thế có thể áp dụng được trong thực tế thực nghiệm. Với việc xác định công thức máu sau khi gây suy giảm bạch cầu bằng interferon alfa-2b và ribavirin, chúng tôi nhận thấy tất cả những loại bạch cầu quan trọng như bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân đều giảm mạnh. Mặc dù thuốc chưa tác động trên hồng cầu, nhưng độc tính của thuốc cũng đã thể hiện rõ trên tiểu cầu. Vì vậy đây có thể là một mô hình thích hợp khi áp dụng trên chuột nhắt. KẾT LUẬN - Interferon alfa-2b liều 200.000 UI/kg tiêm phúc mạc 3 lần/tuần phối hợp với ribavirin liều 300 mg/kg uống hàng ngày cho kết quả gây suy giảm bạch cầu rõ rệt, có ý nghĩa về mặt bệnh lý và thực nghiệm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 44 - Thời điểm giảm bạch cầu thể hiện rõ ở ngày thứ 7 và duy trì cho đến khi kết thúc thực nghiệm ở ngày thứ 14. Các loại bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu ưa bazơ đều giảm rõ rệt, trong đó bạch cầu lympho giảm rõ nhất. Số lượng bạch cầu ưa acid hầu như không bị ảnh hưởng. - Mô hình này cũng gây suy giảm số lượng tiểu cầu khá rõ rệt. Điều này cũng cung cấp thêm cho mô hình một thông số đánh giá có ý nghĩa khi áp dụng mô hình để sàng lọc các thuốc có tác dụng phòng ngừa suy tủy. - Về mặt thực nghiệm, các thiết kế trên về chủng thú vật thí nghiệm, liều lượng, thời gian và đường sử dụng rất thích hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm để tiến hành nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Drug Information Handbook International, pages 821-825. 2. Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basic of Therapeutic, pages 1190-1194. 3. Merck (1997), Davis’s Drug Guide, Pages 806-887.