Mô phỏng mô hình gây viêm khớp cấp và mạn tính bằng Carrageenan trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 446 MÔ PHỎNG MÔ HÌNH GÂY VIÊM KHỚP CẤP VÀ MẠN TÍNH BẰNG CARRAGEENAN TRÊN CHUỘT NHẮT Trần Như Quỳnh*, Đỗ Thị Hồng Tươi*, Trần Mạnh Hùng* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Với tỷ lệ mắc bệnh về cơ xương khớp ngày càng trở nên phổ biến ở Việt Nam, việc phát triển mô hình sàng lọc thuốc có nguồn gốc tự nhiên để hỗ trợ điều trị, giảm tần suất sử dụng và hạn chế tác dụng phụ của thuốc loại NSAID là rất cần thiết. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trên chuột nhắt trắng chủng Swiss albino với tác nhân gây viêm là carrageenan; mô hình mô phỏng là mô hình viêm khớp gối cấp và mạn tính. Kết quả: Mô hình gây viêm khớp cấp: tiêm vào khớp gối ở chân phải sau liều duy nhất 5 µL hỗn dịch carrageenan 2% gây viêm khớp cấp ở thời điểm 3 giờ sau khi tiêm, tăng cao nhất vào thời điểm 27 giờ và duy trì trong 75 giờ. Mô hình này đáp ứng với thuốc đối chứng ketoprofen. Mô hình gây viêm khớp mạn: tiêm vào khớp gối ở chân phải sau 5 µL hỗn dịch carrageenan 2% cách mỗi 3 ngày, 7 liều (từ ngày 1 đến ngày 19) gây viêm khớp gối kéo dài và duy trì trên 1 tuần. Mô hình này đáp ứng với thuốc đối chứng là ketoprofen trong giai đoạn điều trị (từ ngày 21-27). Kết luận: Mô hình gây viêm khớp gối cấp và mạn tính có thể được ứng dụng để sàng lọc thuốc. Từ khóa: Carrageenan, Viêm khớp, Mô hình chuột nhắt ABTRACT DEVELOPING MOUSE MODELS OF ACUTE AND CHRONIC ARTHRITIS Tran Nhu Quynh, Do Thi Hong Tuoi, Tran Manh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 446 - 451 Introduction: With the increasing incidence of arthritis in Vietnamese population, available animal models for screening anti-arthritis agents are needed. Materials and Methods: This study was done in Swiss albino mouse with carrageenan as an inflammatory-inducing agent to imitate mouse models of acute and chronic arthritis. Results: Mouse model of acute arthritis: intra-articular injection of 5 µL of carrageenan 2% suspension induced acute arthritis. Inflammation was manifested rapidly after injection of carrageenan and this response reached maximum effect after 27 hours. Ketoprofen showed positive response when applied locally to inflammatory area. Mouse model of chronic arthritis: intra-articular injection of 5 µL of carrageenan 2% suspension every 3 days, 7 times (from day 1 to day 19) induced chronic arthritis and lasted for more than 7 days (from day 21 to day 27). Ketoprofen showed positive response during treatment period (from day 21 to day 27) when applied locally to inflammatory area. Conclusions: These mouse models of acute and chronic arthritis could be applied for screening anti- inflammatory agents. Key words: Carrageenan, Arthritis, Mouse model * Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 Email: tranmanhhung@uphcm.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 447 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay các bệnh về cơ xương khớp nhất là thấp khớp, viêm khớp cấp, mạn, thoái hóa khớp, gai cột sống, viêm đa khớp ngày càng trở nên phổ biến ở các nước khí hậu nhiệt đới như Việt Nam. Triệu chứng toàn phát thường là khớp bị viêm sưng, đau, đặc biệt đau nhiều về đêm, cứng khớp buổi sáng dẫn đến hạn chế vận động. Việc dùng thuốc hóa dược để điều trị những bệnh này tồn tại một số nhược điểm nhất định về vấn đề chi phí cũng như các tác dụng phụ của thuốc trên dạ dày, ruột Chính vì thế, hiện nay người ta có xu hướng dùng lại các phương pháp thời xưa, gần gũi với thiên nhiên để hỗ trợ điều trị, giảm số lượng sử dụng, hạn chế tác dụng phụ của thuốc hóa dược, đặc biệt như các thuốc kháng viêm nhóm NSAID. Để có thể chứng minh hiệu quả của các thuốc có nguồn gốc tự nhiên trên thực nghiệm, điều cần thiết là phải mô phỏng được những mô hình gây viêm khớp có khả năng ứng dụng. Từ những lý do nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Mô phỏng mô hình viêm khớp cấp tính và mạn tính bằng carrageenan trên chuột nhắt’’ nhằm cung cấp các công cụ thực nghiệm cho mục đích sàng lọc dược lý các thuốc có tiềm năng điều trị, hỗ trợ điều trị viêm khớp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, giống đực, khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường, có trọng lượng khoảng 24 ± 2 gam, do Viện Vắc- xin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang cung cấp. Hàng ngày chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn và nước uống. Hóa chất và thuốc thử nghiệm: Carrageenan được cung cấp bởi Sigma Aldrich và pha thành hỗn dịch carrageenan 2%. Thuốc đối chiếu là gel ketoprofen thoa da (Profenid gel 2,5%, Sanofi Aventis), một NSAID có tác động kháng viêm, giảm đau, sốt. Phương pháp thử nghiệm Mô phỏng mô hình gây viêm khớp cấp tính bằng carrageenan trên chuột nhắt(1) Chuột được gây viêm khớp cấp bằng cách tiêm vào khớp gối chân phải sau liều duy nhất 5 µL hỗn dịch carrageenan 2%. Chu vi khớp gối được đo trước khi tiêm và ở các thời điểm 3-27- 51-75 giờ sau khi tiêm carrageenan. Lô chứng được tiêm dung dịch NaCl 0,9% và lô thử đáp ứng của mô hình được thoa gel ketoprofen 2,5% (10 mg, 2 lần/ngày), lên khớp gối chân. Theo dõi và đánh giá mức độ gây viêm khớp của carrageenan và đáp ứng của ketoproten dựa vào mức độ sưng viêm ở khớp gối, mức độ đau và hình ảnh vi thể. Mô phỏng mô hình gây viêm khớp mạn tính(3) Chuột được gây viêm khớp mạn tính bằng cách tiêm vào khớp gối chân phải sau 5 µL hỗn dịch carrageenan 2%, 7 liều cách mỗi 3 ngày trong 19 ngày. Đánh giá mức độ gây viêm của carrageenan (từ ngày 1 đến ngày 19) và mức độ duy trì phản ứng viêm (từ ngày 20 đến ngày 27) dựa trên sự sưng viêm, mức độ đau và hình ảnh vi thể. Mô hình được thử đáp ứng bằng thuốc đối chứng ketoprofen (đánh giá từ ngày 20 đến ngày 27 với liều thoa tại chổ 10 mg lên khớp gối, mỗi ngày 2 lần cách nhau 6 giờ vào thời điểm nhất định trong ngày). Đánh giá mức độ đau(2) Chuột được đặt trong bocal thủy tinh trong suốt đường kính 20 cm, cao 30 cm. Đặt máy quay phim phía dưới bocal sao cho bao quát hết đáy bocal. Tiến hành quay phim trong 5 phút khi chuột hoạt động nhiều nhất. Đánh giá độ đau của khớp theo thang điểm như sau: 0 = lực đặt chân bình thường, trọng lượng đặt trên 2 chân như nhau. 1 = lực đặt lên chân nhẹ, bàn chân đặt hoàn toàn trên sàn nhưng các ngón chân không trải đều. 2 = lực đặt lên chân trung bình, bàn chân cong với một phần chân chạm nhẹ lên đáy bocal. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 448 3 = đau nặng, chân hoàn toàn đưa lên khỏi đáy bocal. Điểm 0,5-1,5- 2,5 cho biểu hiện ở giữa các mức đã mô tả. Phân tích mô học Chuột được gây mê bằng đá CO2, cắt lấy phần khớp gối (dài 2 cm), rửa sạch bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9% lạnh. Thấm khô và cố định trong dung dịch formaldehyd 10% để phân tích mô học bằng phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin tại Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi Đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh. Mỗi một lô được tiến hành làm vi phẩu trên 4 mẫu. Các mẫu mô tả trong bài báo là các mẫu đại diện của mỗi lô trong mô hình mạn tính. Phân tích kết quả và thống kê Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM) và được đánh giá ý nghĩa thống kê bằng phép kiểm Mann-Whitney. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Mô phỏng mô hình gây viêm khớp cấp bằng carrageenan Chuột thí nghiệm được chia thành 3 lô sau: - Lô chứng: tiêm vào khớp gối chân phải sau liều duy nhất 5 µL dung dịch NaCl 0,9% - Lô gây viêm khớp: tiêm vào khớp gối chân phải sau liều duy nhất 5 µL hỗn dịch Carrageenan 2%. - Lô ketoprofen: chuột được tiêm vào khớp gối chân phải sau liều duy nhất 5 µL hỗn dịch carrageenan 2% + thoa 10 mg ketoprofen 2,5% dạng gel lên khớp gối chân (2 lần/ngày). Sự thay đổi chu vi khớp gối chân chuột ở lô chứng, lô bệnh và lô đối chứng tại các thời điểm 3 giờ, 27 giờ, 51 giờ, 75 giờ sau khi tiêm carrageenan hoặc nước muối được thể hiện ở hình 1. Hình 1. Sự thay đổi chu vi khớp gối trước (0 giờ) và sau khi gây viêm (3-75 giờ) ở các lô thử nghiệm Sau khi gây viêm chúng tôi nhận thấy chu vi khớp gối chân chuột ở lô gây viêm bằng carrageenan bắt đầu tăng vào thời điểm 3 giờ sau khi tiêm, tăng tối đa ở thời điểm 27 giờ, sau đó có xu hướng giảm xuống, tuy nhiên vẫn duy trì được mức độ sưng viêm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P<0,05). Ở lô được thoa gel ketoprofen, chu vi khớp gối chân chuột thể hiện xu hướng giảm ngay sau khi tiêm carrageenan 3 giờ và trở về mức bình thường sau 27 giờ. Tác động làm giảm sưng viêm của ketoprofen khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô gây viêm. Ở lô chứng, không có sự khác biệt đáng kể về chu vi khớp gối trước và sau khi tiêm NaCl 0,9%, vì thế có thể cho rằng kỹ thuật tiêm không Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 449 gây ảnh hưởng đến kết quả gây viêm bằng carrageenan. Mô phỏng mô hình gây viêm khớp mạn tính bằng carrageenan Thí nghiệm được tiến hành trên các lô thử nghiệm sau: - Lô chứng: tiêm vào khớp gối chân phải sau 5 µL dung dịch NaCl 0,9% cách mỗi 3 ngày, với tổng số lần tiêm là 7 lần (từ ngày 1 đến ngày 19). - Lô gây viêm khớp mạn tính: tiêm vào khớp gối ở chân phải sau 5 µL hỗn dịch carrageenan 2%, cách mỗi 3 ngày, với tổng số lần tiêm là 7 lần (từ ngày 1 đến ngày 19). - Lô ketoprofen: tiêm vào khớp gối ở chân phải sau 5 µL hỗn dịch carrageenan 2%, cách mỗi 3 ngày trong 19 ngày; từ ngày 20 đến ngày 27, thoa 10 mg ketoprofen 2,5% dạng gel lên khớp gối chân, mỗi ngày 2 lần cách nhau 6 giờ vào thời điểm nhất định trong ngày. Sau khi chuột được gây viêm khớp trong 19 ngày, mức độ duy trì viêm khớp và đáp ứng kháng viêm của ketoprofen được đánh giá trong 7 ngày (từ ngày 20 đến ngày thứ 27). Độ giảm chu vi khớp gối ở lô chứng, lô gây viêm và lô đối chứng trong thời gian điều trị 7 ngày so với trước khi điều trị được thể hiện ở hình 2. Hình 2. Mức độ giảm chu vi khớp gối tính từ ngày 20 đến ngày 27 sau khi gây viêm ở các lô thử nghiệm Ở lô gây viêm bằng carrageenan 2%, mức độ sưng viêm khớp gối thể hiện rõ trong suốt giai đoạn gây viêm (từ ngày 1 đến ngày 19). Sau khi ngưng tiêm tác nhân gây viêm, mức độ sưng viêm khớp gối tiếp tục được duy trì trong suốt khoảng thời nghiên cứu (từ ngày 20 đến ngày 27). Ở lô chứng, mặc dù cũng được tiêm liên tục NaCl 0,9%, tuy nhiên không có sự biểu hiện của sưng viêm khớp gối. Khi điều trị bằng ketoprofen (từ ngày 20 đến ngày 27), mức độ sưng viêm khớp gối giảm rõ rệt so với lô gây viêm. Như vậy, ketoprofen cũng thể hiện rõ đáp ứng trên mô hình này. Khảo sát tác động giảm đau của ketoprofen trên mô hình viêm khớp cấp và mạn tính Thí nghiệm được tiến hành trên các lô thử nghiệm đã được mô tả ở trên. Thang điểm đau được đánh giá thông qua thang điểm đánh giá hành vi đau ở khớp chuột với các mức độ từ 0-4 với 0 là không đau (lực đặt bàn chân lên bocal bình thường) và 4 là đau nặng (phải nhất chân khỏi đáy bocal). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 1 và bảng 2. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 450 Bảng 1. Điểm đau của lô chứng, lô bệnh và lô đối chứng tại các thời điểm sau gây viêm khớp cấp Lô Điểm đau khớp gối Sau 3 giờ Sau 27 giờ Sau 51 giờ Sau 75 giờ Chứng (n=6) 0,6 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Carrageenan (n=6) 1,8 ± 0,2 1,9 ± 0,1 1,7 ± 0,2 1,6 ± 0,2 Ketoprofen (n=6) 1,7 ± 0,4 1,4 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,1 ± 0,19 Bảng 2. Điểm đau của các lô thử nghiệm trong 7 ngày điều trị (ngày 21-27) ở mô hình viêm khớp mạn Lô chuột Điểm đau khớp gối Ngày 19 Ngày 20 Ngày 21 Ngày 22 Ngày 23 Ngày 24 Ngày 25 Ngày 26 Chứng (n=8) 0,4 ± 0,2 0,3 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 Carrageenan (n=8) 1,8 ± 0,2 1,8 ± 0,2 1,6 ± 0,2 1,6 ± 0,2 1,4 ± 0,2 1,4 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,2 Ketoprofen (n=8) 1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,2 1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,2 1,5 ± 0,2 1,1 ± 0,2 1,1 ± 0,2 0,9 ± 0,2 Ở mô hình gây viêm khớp cấp: điểm đau khớp gối chân chuột ở lô chứng cao nhất là 0,6 sau khi tiêm sau đó giảm về mức 0. Điểm đau khớp gối chân chuột ở lô gây viêm (carrageenan) cao nhất là 1,9 ± 0,2. Điểm đau này chỉ giảm nhẹ trong quá trình thử nghiệm và đến thời điểm 75 giờ sau khi tiêm là 1,6 ± 0,2. Mức độ giảm là 0,3 điểm. Ở lô điều trị bằng ketopfofen mức độ đau cao nhất là 1,7 ± 0,4. Điểm đau này giảm trong quá trình thử nghiệm. Đến thời điểm 75 giờ sau khi tiêm, điểm đau là 1,1 ± 0,2. Mức độ giảm là 0,6 điểm. Mặc dù không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô đối chiếu so với lô bệnh nhưng có thể nhận thấy điểm đau của lô đối chiếu giảm nhanh hơn so với lô bệnh, bắt đầu từ thời điểm 27 giờ cho đến kết thúc thử nghiệm. Ở mô hình gây viêm khớp mạn: điểm đau khớp gối chân chuột ở lô chứng cao nhất là 0,4 sau khi tiêm sau đó giảm về mức 0. Trong khi đó ở lô gây viêm điểm đau trước khi điều trị là 1,8 ± 0,2. Điểm đau này giảm rất ít và đến ngày 26 điểm đau của lô này là 1,3 ± 0,2. Mức giảm về độ đau có chuyển biến nhưng không đáng kể. Ở lô ketoprofen điểm đau ngày trước khi điều trị là 1,6 ± 0,2 và có xu hướng giảm xuống, đến cuối đợt điều trị điểm đau là 0,9 ± 0,2. Mức độ giảm là 0,7 điểm. Phân tích vi thể Ở lô chứng, sau khi tiêm NaCl 0,9%, vi thể khớp và mô quanh khớp hầu như không có sự thay đổi nào. Ở lô gây viêm bằng carrageenan, có sự tăng sinh tế bào niêm mạc hoạt dịch với sự xâm nhập của những tế bào viêm (hình 3, phải-trên) và cả sự xâm nhập tế bào viêm vào trong mô mỡ (hình 3, phải-dưới). Ở lô điều trị bằng ketoprofen khu vực viêm khu trú hơn so với lô gây viêm và có sự hình thành các tế bào sợi (hình 4). Hình 3. Hoạt dịch và mô mỡ ở khớp chân chuột nhóm chứng (NaCl 0,9%) và khớp chân chuột gây viêm (carrageenan 2%) với sự tăng sinh và hiện diện của tế bào viêm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 451 Hình 4. Tăng sinh tế bào lớp hoạt dịch và thấu nhập tế bào viêm ở lô gây viêm (carrageenan); Sự hình thành tế bào sợi và ít có tế bào viêm hơn khi được điều trị bằng ketoprofen. KẾT LUẬN Qua thực nghiệm mô phỏng mô hình gây viêm khớp cấp và mạn tính trên chuột nhắt, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: - Trên mô hình gây viêm khớp cấp tính: hỗn dịch carrageenan 2% làm sưng viêm khớp gối, làm thay đổi hình ảnh vi thể khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Mặc dù điểm đau có gia tăng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê. Ketoprofen 2,5% có tác dụng làm giảm mức độ sưng viêm và cải thiện tình trạng viêm trên vi thể. - Trên mô hình gây viêm khớp mạn tính: tiêm cách quãng hỗn dịch carrageenan 2% mỗi 3 ngày trong 19 ngày gây sưng viêm khớp gối kéo dài. Sau khi ngưng tiêm tác nhân gây viêm, tình trạng viêm khớp tiếp tục được duy trì trên 7 ngày. Ketoprofen sử dụng trong giai đoạn điều trị (từ ngày 20-27) có tác dụng cải thiện tình trạng sưng viêm, cấu trúc vi thể và mức độ đau trên mô hình này. - Với mức độ đáp ứng của cả 2 mô hình khi điều trị bằng ketoprofen, chúng tôi cho rằng cả 2 mô hình này đều có thể được ứng dụng trong sàng lọc các thuốc có khả năng điều trị, hỗ trợ điều trị viêm khớp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Carara C (2004), ‘’Anti-inflammatory effect of mud-bath applications on adjuvant arthritis in rats’’, Clinical and Experimental Rheumatology, 22, 763-766. 2. Hansra P, et al (2000), ‘’Carrageenan-induced arthritis in the rat’’, Inflammation, 24 (2), 141-155. 3. Hwang HJ, Lee HJ, Kim CJ, Shim I, Hahm DH. (2008), ‘’Inhibitory Effect of Amygdalin on Lipopolysaccharide- Inducible TNF-α and IL-1β mRNA Expression and Carrageenan-Induced Rat Arthritis’’, Journal of Microbiology and Biotechnology, 18 (10), 1641-1647. Ngày nhận bài báo : 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo : 21.12.2012 Ngày bài báo được đăng : 10.03.2014