Mô phỏng mô hình thử tác động ức chế HMG-CoA reductase từ nguồn enzym ở gan chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 340 MÔ PHỎNG MÔ HÌNH THỬ T[C ĐỘNG ỨC CHẾ HMG-CoA REDUCTASE TỪ NGUỒN ENZYM Ở GAN CHUỘT NHẮT Trương Đ nh Phước*, Trần Thị Thiên Thanh*, Huỳnh Ngọc Trinh*, Trần Mạnh Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể enzym HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt để áp dụng trong sàng lọc thuốc ức chế HMG-CoA reductase in vitro. Đối tượng v| phương ph{p nghiên cứu: Gan của chuột nhắt chủng Swiss albino, 8-10 tuần tuổi, giống đực, được chọn để tạo dịch đồng thể chứa HMG-CoA reductase. Định lượng protein trong dịch đồng thể enzym bằng phương ph{p pyrogallol-molybdat. X{c định hoạt tính HMG-CoA reductase trong dịch đồng thể enzym bằng phương ph{p đo động học sự giảm độ hấp thu của NADPH ở bước sóng 340 nm . Kết quả: Đã xây dựng được quy trình tạo dịch đồng thể enzym chứa HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt và x{c định được c{c điều kiện tối ưu của phản ứng khảo sát tác dụng ức chế HMG- CoA reductase in vitro, gồm: nồng độ cơ chất HMG- CoA ban đầu 60M, nồng độ co-factor NADPH 0,02 mM, dithiothreitol 1 mM, nhiệt độ phản ứng 37oC, lượng protein enzym 1 mg, pH 7,5 (đệm Tris- HCl) và thời gian tiến hành phản ứng trong 5 phút. Atorvastatin cho hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase thu được từ gan chuột nhắt với IC50 ước lượng là 14,89 ng/ml. Từ khóa: HMG-CoA reductase, gan, chuột nhắt, dịch đồng thể ABSTRACT DEVELOPING A PROCEDURE TO DETERMINE INHIBITION OF HMG-CoA REDUCTASE FROM MOUSE LIVER ENZYMES Truong Dinh Phuoc, Tran Thi Thien Thanh, Huynh Ngoc Trinh, Tran Manh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 340 - 347 Aim of study: This study aimed to develop a procedure to evaluate the inhibitory effect of new drug candidates on HMG-CoA reductase from mouse liver. Material and Method: Homogenate containing HMG-CoA reductase was prepared from 8-10 week old, male, Swiss albino mouse liver. Protein concentration in homogenate was determined by pyrogallol-molybdate method. HMG-CoA reductase activity in homogenate was assayed by kinetic method via measuring the reduction of absorption of NADPH at 340 nm. Results: This study had succeeded in establishing a procedure to prepare homogenate containing HMG-CoA reductase from mouse live and determining optimal conditions for reaction to evaluate the inhibitory effect of testing substances on HMG-CoA reductase in vitro, including: HMG-CoA 60M, co-factor NADPH 0.02 mM, dithiothreitol 1 mM, reaction temperature 37oC, protein enzyme 1 mg, pH 7.5 (Tris-HCl buffer) and reaction time 5 minutes. Atorvastatin showed IC50 of 14.89 ng/ml on HMG-CoA reductase from mouse liver. Key words: HMG-CoA reductase, liver, mouse, homogenate ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid huyết là một trong những nguyên nhân chính gây các biến chứng nhƣ xơ vữa động mạch, nhồi m{u cơ tim, tai biến mạch máu não... Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối quan hệ trực tiếp giữa nồng độ cholesterol huyết với * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 Email: manhhung1969@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 341 nguy cơ mắc bệnh tim mạch(11). Hiện nay việc điều trị rối loạn lipid huyết bao gồm điều trị không sử dụng thuốc v| điều trị sử dụng thuốc. Điều trị không dùng thuốc chủ yếu điều chỉnh lối sống của ngƣời bệnh. Có nhiều nhóm thuốc đƣợc sử dụng để điều trị bệnh, trong đó phổ biến nhất là các thuốc ức chế -hydroxyl-- methylglutaryl Coenzym A (HMG - CoA reductase) (nhóm statin), niacin, ezetimid, nhựa gắn acid mật, nhóm fibrat(6). Enzym HMG - CoA reductase (một enzym gắn kết màng ở lƣới nội chất trơn) có khả năng xúc tác phản ứng khử HMG - CoA thành acid mevalonic, đóng vai trò then chốt trong chu trình tổng hợp cholesterol, l| đối tƣợng nghiên cứu chủ yếu trong lĩnh vực điều trị rối loạn lipid huyết(2). Do đó ức chế HMG - CoA reductase là một cơ chế quan trọng trong việc nghiên cứu tìm ra các thuốc mới có t{c động ngăn sự tiến triển của bệnh cũng nhƣ cải thiện các triệu chứng lâm sàng ở ngƣời bệnh. Xuất phát từ những quan điểm trên, đề tài “Mô phỏng mô hình thử t{c động ức chế HMG CoA reductase từ nguồn enzyme ở gan chuột nhắt” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình chiết tách HMG - CoA reductase từ gan chuột nhắt. - Khảo s{t c{c điều kiện tối ƣu của phản ứng enzym để áp dụng trong việc thử nghiệm hoạt tính ức chế HMG - CoA reductase in vitro của các thuốc. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PH[P NGHIÊN CỨU Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, 8-10 tuần tuổi, nặng khoảng 30-35 gam, giống đực, khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thƣờng do Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh cung cấp. Chuột đƣợc nuôi khoảng 1 tuần để ổn định trƣớc khi thí nghiệm. Hóa chất - D,L- Dithiothreitol, độ tinh khiết ≥ 98% (TLC), Sigma Aldrich, số lô SLBK4951V - HMG-CoA, độ tinh khiết ≥ 95%, Santa Cruz Biotechnology, số lô 103476-21-7 - NADPH, độ tinh khiết ≥ 95%, Santa Cruz, số lô C0315 - Tris base, độ tinh khiết ≥ 99%, Merck, số lô TD600719-519 - Ethylendinitrilo tetraacetic acid, độ tinh khiết ≥ 99%, Merck, số lô 205-358-3 Qui trình thu dịch đồng thể enzym từ gan chuột nhắt Qui trình đƣợc mô phỏng dựa trên mô tả của Hirangi và cộng sự (2011)(3): Chuẩn bị các dung dịch bảo quản gồm đệm TRIS HCl 0,1 M pH 7,4, dung dịch sucrose 0,25 M lạnh (0-4oC), dithiothreitol 1mM; dung dịch rửa gan NaCl 0,9%. Chuột đƣợc nuôi ổn định và cho nhịn đói 8 giờ, sau đó g}y mê bằng đ{ CO2, cố định trên bàn mổ, bơm rửa làm sạch máu và dịch trong gan bằng dung dịch NaCl 0,9% trong khoảng 2 phút. Gan đƣợc tách nhanh, cho vào dung dịch sucrose 0,25 M đang đƣợc làm lạnh trong nƣớc đ{, rửa sạch. Làm nhuyễn sơ bộ mô gan bằng kéo, cho mô gan vào ống falcon 15 ml, bổ sung dung dịch sucrose 0,25 M lạnh tƣơng ứng 4 ml dung dịch/1 g mô. Tiến h|nh đồng thể hóa mẫu mô bằng máy nghiền đồng thể tế b|o cơ học ở nhiệt độ 0-4oC. Tiến h|nh đồng thể tế bào trong khoảng 20 giây, sau đó ngƣng 10 gi}y để tránh enzym bị mất hoạt tính bởi nhiệt. Tiếp tục nhƣ vậy 3 lần (tổng thời gian đồng thể mô khoảng 1 phút) cho đến khi thu đƣợc dịch mô đồng nhất (tạo thành dung dịch có cảm quan sánh, màu trắng đục). Ly tâm lần 1 ở 0oC trong 15 phút với tốc độ 5000 x g. Loại bỏ mỡ trên bề mặt dịch và trên thành falcon. Bỏ cắn, thu dịch. Bổ sung 0,1 ml dung dịch CaCl2 88 mM trên mỗi 1 ml dịch nổi, thỉnh thoảng lắc đều, để ổn định trong 5 phút trong đ{ b|o. Ly t}m lần 2 ở 0oC trong 35 phút với tốc độ 13500 x g, bỏ dịch thu cắn. Sau đó loại bỏ các vết mỡ trong cắn, rửa cắn thu đƣợc bằng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 342 cách hòa tan cắn trong dung dịch bảo quản enzym ở nhiệt độ 0- 4oC, vortex nhẹ. Cắn đƣợc đồng thể hoá trở lại bằng máy nghiền đồng thể tế b|o cơ học, tiến hành trong 20 gi}y, thu đƣợc dịch mô đồng nhất, duy trì nhiệt độ bảo quản 0- 4oC. Chia mẫu enzym thu đƣợc thành nhiều phần nhỏ, mỗi phần gồm khoảng 1 ml và bảo quản -70oC. Trƣớc khi sử dụng enzym, tiến h|nh rã đông chậm trên đ{ bào. Trong quá trình sử dụng, dịch đồng thể enzym luôn giữ lạnh trên đ{ b|o, không thực hiện qu{ trình đông – rã đông nhiều lần, tránh hƣ hỏng enzym. Định lƣợng protein trong dịch đồng thể enzym bằng phƣơng ph{p pyrogallol-molybdat Xây dựng đƣờng tuyến tính thể hiện sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ protein: pha các giai mẫu từ dung dịch mẹ protein chuẩn nồng độ 10 mg/ml (Bovine serum albmin – BSA) trong dung dịch bảo quản enzym (sucrose nồng độ 0,25 M, đệm TRIS HCl 0,1 M pH 7,4) nhƣ sau: Nồng độ BSA (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 6 Dung dịch mẹ BSA 10 mg/ml (µl) 0 10 20 30 40 50 60 Dung dịch bảo quản enzym (µl) 100 900 800 700 600 500 400 Hút chính xác 5 µl mỗi giai mẫu vào ống nghiệm, thêm 1 ml thuốc thử đỏ pyrogallol, ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, hút 300 µl hỗn hợp phản ứng vào giếng đo quang, v| đo độ hấp thu (OD) ở bƣớc sóng 595 nm. Dựa v|o đƣờng tuyến tính, tính toán hàm lƣợng protein trong mẫu enzym dựa vào kết quả OD thu đƣợc. Nếu OD nằm ngoài khoảng tuyến tính, tiến hành pha loãng mẫu enzym đến khi OD nằm trong khoảng tuyến tính. Các thí nghiệm x{c định hoạt tính enzym Tiến hành phản ứng khử HMG-CoA thành acid mevalonic nhờ hoạt tính xúc tác của HMG- CoA reductase. Hoạt tính đƣợc đ{nh giá bằng sự giảm đi của lƣợng co-factor NADPH trong quá trình xảy ra phản ứng. Lƣợng co-factor NADPH đƣợc x{c định dựa v|o phƣơng ph{p định lƣợng UV-Vis (đo động học) ở bƣớc sóng 340 nm. Phản ứng đƣợc thục hiện trong ống nghiệm với tổng thể tích 1ml bao gồm các tác nhân: Cơ chất HMG- CoA: khảo sát nồng độ tối ƣu (30 M, 60 M, 120 M) cho phản ứng. Co-factor NADPH: khảo s{t lƣợng NAPDH tối ƣu (0,01µmol; 0,02µmol; 0,05µmol; 0,1µmol) cho phản ứng. Dịch đồng thể enzym: khảo s{t lƣợng protein-enzym tƣơng ứng 0,2 mg-0,5mg-1mg-2 mg. Dung dịch đệm: sử dụng dung dịch đệm Tris- HCl 0,1 M để khảo sát pH tối ƣu cho phản ứng (pH 6; pH 7,5; pH 9). Dithiothreitol: chất chống oxi hóa, đƣợc sử dụng với nồng độ 1 mM trong phản ứng. Nhiệt độ phản ứng: 37oC. Tiến h|nh đo UV- Vis (phƣơng ph{p động học) để x{c định mật độ quang còn lại của NADPH mỗi 30 giây, trong 5 phút. Thực hiện song song mẫu trắng không có cơ chất HMG- CoA, các thành phần kh{c tƣơng tự nhƣ ống nghiệm phản ứng. Công thức đ{nh gi{ hoạt tính enzym (Sigma Aldrich): Đơn vị hoạt tính/mgP = Trong đó: 12,44 = εmM - hệ số hấp thu phân tử của NADPH ở 340nm là 6.22 mM–1cm–1. 12,44 thể hiện có 2 NADPH tham gia phản ứng. TV = tổng thể tích phản ứng (1 ml) V = thể tích dịch đồng thể enzym (ml) C = Nồng độ protein enzym mg/ml LP = Bề dày cốc đo (1cm) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 343 1 ĐVHT enzym chuyển 1 µmol NADPH thành NADP+ trong 1 phút ở 37 °C. ĐV: µmol/phút/mgP Khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG - CoA reductase của atorvastatin Phản ứng đ{nh gi{ t{c động ức chế HMG- CoA reductase của atorvastatin đƣợc thực hiện trong c{c điều kiện sau: nồng độ cơ chất HMG - CoA ban đầu: 60M, nồng độ đồng yếu tố NADPH: 0,02 mM, dithiothreitol 1 mM, nhiệt độ phản ứng 370C, lƣợng protein enzym: 1 mg và pH 7,5. Atorvastatin đƣợc thử nghiệm với các nồng độ: 0; 0,1; 1; 5; 10; 15; 20; 30; 50; 100; 1000 ng/ml, để x{c định IC50. KẾT QUẢ X{c định h|m lƣợng protein trong mẫu dịch đồng thể enzym thu đƣợc Thực hiện quy trình tạo dịch đồng thể enzym trên 8 lô chuột (6 chuột/lô), kết quả thu đƣợc 12 ml dịch đồng thể enzym/lô. Tiến hành x{c định h|m lƣợng protein của mỗi mẫu dịch đồng thể enzym (thực hiện 3 lần). Kết quả trình bày ở Biểu đồ 1. Biểu đồ 1: Đường tuyến tính và kết quả định lượng protein trong các lô thí nghiệm Khoảng tuyến tính của phƣơng ph{p ƣớc lƣợng trong khoảng nồng độ BSA từ 1-6 mg/ml. Phƣơng trình hồi quy là: y = 0,0676x + 0,0149, hệ số tƣơng quan R2 = 0,9935. Nồng độ protein (Cprotein) = 2,43 mg/ml – 3,86 mg/ml. Thí nghiệm thăm dò hoạt tính HMG-CoA reductase trong mẫu protein thu đƣợc Bảng 1: Kết quả thí nghiệm thăm dò sơ bộ hoạt tính HMG-CoA từ dịch đồng thể enzym Lượng protein enzym (mg) OD0-300 giây Hoạt t nh enzym (đơn vị/ mgP) 0,2 0,312 50,22 0,5 0,313 50,35 1 0,335 53,89 2 0,237 38,13 Hoạt tính HMG-CoA reductase đƣợc thăm dò qua phản ứng ở c{c điều kiện sau: nồng độ cơ chất HMG-CoA ban đầu 60 M, nồng độ co- factor NADPH 0,02 mM, pH 7,4 (đệm TRIS- HCl), dithiothreitol 1 mM và nhiệt độ phản ứng 37oC. Lƣợng protein enzym đƣợc khảo sát ở 4 mức 0,2 mg-0,5 mg-1 mg v| 2 mg để tìm ra lƣợng protein enzym cho hoạt tính cao nhất. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 1. Kết quả cho thấy mật độ quang giảm trong quá trình xảy ra phản ứng, chứng tỏ rằng quy trình tạo dịch đồng thể đã thu đƣợc enzym cùng với co-factor NADPH có khả năng xúc t{c sự chuyển hóa HMG-CoA. Khi sử dụng lƣợng protein enzym từ 0,2 mg-1 mg phản ứng xảy ra với hoạt tính enzym gần nhƣ nhau, trong đó tại lƣợng protein enzym là 1 mg thì có hoạt tính enzym cao nhất. Tuy nhiên, khi sử dụng lƣợng protein enzym là 2 mg thì hoạt tính enzym lại giảm xuống. Vì vậy thông số protein enzym 1 mg đƣợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo khoảng thời gian thực hiện phản ứng Thời gian thực hiện phản ứng đƣợc khảo Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 344 sát ở các thời điểm khác nhau nhằm tìm ra thời điểm thể hiện hoạt tính enzym cao nhất. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 3 lô dịch đồng thể (lô 1-3) với điều kiện phản ứng nhƣ sau: HMG-CoA 60 M, NADPH 0,02 mM, pH 7,4, dithiothreitol 1 mM, protein enzym 1 mg và nhiệt độ phản ứng 37oC. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong biểu đồ 2. Biểu đồ 2: Sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzym theo khoảng thời gian phản ứng Kết quả cho thấy hoạt tính enzym cao nhất trong 5 phút đầu tiên của phản ứng, sau đó hoạt tính enzym giảm dần. Do đó, các thí nghiệm tiếp theo đƣợc tiến h|nh đo mật độ quang của phản ứng mỗi 30 giây trong 5 phút đầu của phản ứng. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym HMG- CoA reductase theo pH phản ứng Bảng 2: Sự thay đổi hoạt tính enzym HMG- CoA reductase theo pH phản ứng pH OD0-300 giây Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 6,0 (n = 3) 0,063 ± 0,016 10,11 ± 2,54 7,5 (n = 3) 0,337 ± 0,011 54,14 ± 1,79 9,0 (n = 3) 0,052 ± 0,023 8,34 ± 3,73 HMG-CoA reductase trong gan chuột nhắt có hoạt tính cao nhất khi thực hiện phản ứng ở pH 7,5; hoạt tính của enzym giảm nhanh khi pH = 9 hoặc pH = 6. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong môi trƣờng đệm Tris-HCl ở 3 pH khác nhau nhằm chọn pH thích hợp cho phản ứng. Sử dụng dịch đồng thể enzym của lô 1 để tiến hành. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 2. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ HMG-CoA Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ cơ chất HMG-CoA HMG-CoA (M) OD0-300 giây Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 30 (n = 3) 0,324 ± 0,020 52,11 ± 3,20 60 (n = 3) 0,350 ± 0,018 56,23 ± 2,89 120 (n = 3) 0,348 ± 0,019 55,98 ± 3,11 Nồng độ cơ chất HMG-CoA đƣợc khảo sát ở 3 nồng độ 30-60 và 120 M. Hoạt tính enzym HMG-CoA reductase hầu nhƣ không bị ảnh hƣởng bởi nồng độ cơ chất HMG- CoA trong điều kiện khảo sát (bảng 3). Tuy nhiên, dựa vào một số nghiên cứu, chúng tôi sử dụng thông số nồng độ HMG-CoA là 60 M. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ NADPH Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ co-factor NADPH Nồng độ co- factor NADPH (mM) OD0-300 giây Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 0,01 (n=3) 0,285±0,013 45,87 ± 2.11 0,02 (n=3) 0,343±0,019 55,11 ± 3,09 0,05 (n=3) 0,325±0,030 52,23 ± 4,76 0,1 (n=3) 0,338±0,023 54,35 ± 3,76 Đồng yếu tố NADPH đƣợc khảo sát ở 4 nồng độ 0,01-0,02-0,05 và 0,1 mM. Hoạt tính Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 345 enzym HMG-CoA reductase cao nhất khi nồng độ NADPH là 0,02 mM, hoạt tính giảm khi giảm nồng độ co-factor NADPH, hoạt tính enzym không thay đổi nhiều khi tăng nồng độ NADPH lên 0,05 mM hoặc 0,1 mM. Khảo s{t độ ổn định của enzym HMG-CoA reductase Tiến hành phản ứng với các mẫu enzym thu đƣợc trong các khoảng thời gian sau: ngay sau khi tạo dịch đồng thể enzym, sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần, 12 tuần bảo quản ở -70oC. Kết quả thí nghiệm (biểu đồ 3) cho thấy hoạt độ enzym HMG-CoA giảm khi bảo quản (ở -70oC) v| đến 12 tuần hầu nhƣ enzym không còn khả năng xúc tác. Biểu đồ 3: Sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzym theo thời gian bảo quản Khảo s{t t{c động của atorvastatin lên khả năng ức chế HMG-CoA reductase từ dịch đồng thể enzym Bảng 5: T{c động ức chế HMG-CoA reductase trong dịch đồng thể của atorvastatin Nồng độ atorvastatin (ng/ml) OD0-300 giây Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 0 (mẫu chứng) (n=3) 0,330±0,015 53,11 ± 2,36 0,1 (n=3) 0,320±0,019 51,43 ± 3,12 1 (n=3) 0,300±0,09 48,23 ± 2,98 5 (n=3) 0,281±0,035 45,23 ± 5,63 10 (n=3) 0,205±0,013 32,89 ± 2,09 15 (n=3) 0,120±0,006 19,23 ±1,10 20 (n=3) 0,066±0,020 10,66 ± 3,21 30 (n=3) 0,029±0,011 4,65 ± 1,76 50 (n=3) 0,003±0,019 0,56 ± 3,03 100 (n=3) -0,017±0,031 -2,78 ± 5,04 1000 (n=3) 0,006±0,016 0,98 ± 2,65 Để có thể sử dụng dịch đồng thể enzym nhƣ một công cụ sàng lọc khả năng ức chế HMG- CoA reductase của các thuốc khảo sát, atorvastatin đƣợc sử dụng làm chất đối chứng dƣơng v| x{c định IC50 của thuốc này. Atorvastatin bắt đầu ức chế HMG-CoA reductase ở nồng độ 5 ng/ml, ở nồng độ ≥ 50 ng/ml atorvastatin có tác dụng ức chế enzym gần nhƣ ho|n to|n. Khoảng tuyến tính ƣớc lƣợng đƣợc ở khoảng nồng độ 5-50 ng/ml, phƣơng trình hồi quy là y = -49,98x + 77,66 với R2= 0,959 và IC50 của atorvastatin là 14,89 ng/ml. Kết quả này khẳng định thêm, enzym thu đƣợc trong dịch đồng thể có khả năng xúc t{c sự chuyển hóa của HMG-CoA. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 346 Biểu đồ 4: Tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro của atorvastatin; (A): đường cong hoạt tính enzym-log nồng độ, (B): khoảng tuyến tính ức chế enzym BÀN LUẬN Kết quả thăm dò sơ bộ hoạt tính enzym cùng với kết quả t{c động ức chế HMG-CoA reductase in vitro của atorvastatin cho thấy mẫu protein thu đƣợc có chứa enzym có khả năng xúc t{c sự chuyển hóa -hydroxyl-- methylglutaryl Coenzym A (HMG- CoA). Ở tế bào gan chuột nhắt có hai loại enzym có khả năng n|y l| HMG-CoA lyase (chuyển HMG- CoA thành acetoacetat và acetyl-CoA) và HMG-CoA reductase (chuyển HMG- CoA thành acid mevalonic)(3). Trong tế bào, HMG- CoA lyase phân bố ở ty thể. Theo quy trình tạo dịch đồng thể enzym, sau khi đồng nhất mẫu mô, dịch đồng thể sẽ đƣợc ly tâm lần 1 với tốc độ 5000 x g, thu dịch bỏ cắn. Với tốc độ này phần dịch sẽ không có ph}n đoạn nhân và ty thể do tỉ trọng lớn nên hiện diện chủ yếu ở phần cắn. Do đó có thể nhận định dịch đồng thể thu đƣợc chứa HMG-CoA lyase không đ{ng kể, sự chuyển hóa HMG-CoA là do HMG-CoA reductase (enzym nằm trong microsom tế bào gan chuột nhắt) xúc tác. Tốc độ phản ứng xúc tác của HMG-CoA reductase trong dịch đồng thể xảy ra nhanh nhất trong 5 phút đầu tiên, tốc độ giảm từ sau phút thứ 5 phút đến 30 phút. Phản ứng chậm lại từ sau 30 phút. Kết quả n|y tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Hulcher và cộng sự khi khảo sát hoạt tính của HMG-CoA reductase in vitro thu từ gan chuột cống: thời gian đo mật độ quang là mỗi 15-30 giây trong 5 phút đầu tiên của phản ứng(4). HMG-CoA reductase trong gan chuột nhắt cho hoạt tính xúc tác tối ƣu khi ở môi trƣờng trung tính (pH 7,5), hoạt tính giảm nhanh khi ở môi trƣờng acid (pH 6) hoặc quá kiềm (pH 9). Một số nghiên cứu chỉ ra rằng HMG-CoA reductase phân lớp 1 (phân bố chủ yếu ở động vật có vú) cũng hoạt động tối ƣu ở pH trung tính(5). Tuy nhiên ở Pseudomonas, HMG-CoA reductase lại hoạt động tối ƣu tại pH 9, xúc tác phản ứng theo chiều ngƣợc lại: từ acid mevalonic chuyển thành HMG-CoA(8). Nồng độ cơ chất HMG-CoA không ảnh hƣởng đ{ng kể đến hoạt tính của enzym. Ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng HMG-CoA với nồng độ 60 µM vƣợt quá giá trị Km của phản ứng (khoảng 4,2 µM ở chuột nhắt)(9). Vì vậy khi gấp đôi (120 µM) hay giảm một nửa (30 µM) nồng độ cơ chất HMG-CoA thì không ảnh hƣởng đến hoạt tính của HMG-CoA reductase. Tuy nhiên việc x{c định giá trị Km của phản ứng thƣờng khó khăn, đặc biệt với những mẫu protein thô(8). Do đó, chúng tôi sử dụng nồng độ HMG-CoA là 60 µM cho các thí nghiệm, để đảm bảo sự phù hợp của điều kiện phản ứng. Nồng độ đồng yếu tố NADPH từ 0,02 mM trở lên sẽ ít gây ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, Km của NADPH vào khoảng 26 µM (gan chuột)(8,10). Mặt khác NADPH còn đồng xúc tác cho các phản ứng khác tại mô gan thu đƣợc. Vì vậy để hạn chế sai Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 347 số chúng tôi sử dụng thông số nồng độ cofactor NADPH là 0,02 mM. Atorvastatin là chất ức chế HMG-CoA reductase với Ki rất thấp (cỡ v|i nM). Điều này phù hợp với kết quả của chúng tôi với IC50 ƣớc lƣợng khoảng 14,89 ng/ml. Kết quả n|y cao hơn so với t{c động ức chế HMG-CoA reductase tinh khiết từ ngƣời của atorvastatin là 4,58 ng/ml(7). Tuy vậy, kết quả này một lần nữa xác nhận mẫu enzym thu đƣợc chứa HMG-CoA reductase có khả năng xúc t{c phản ứng HMG-CoA thành acid mevalonic. KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề t|i “Mô phỏng quy trình x{c định hoạt tính enzym HMG- CoA reductase”, chúng tôi thu đƣợc những kết quả sau: - Xây dựng đƣợc quy trình tạo dịch đồng thể chứa HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt, dùng để sàng lọc các thuốc có t{c động ức chế enzym này, với thuốc đối chứng là atorvastatin có IC50 ƣớc lƣợng là 14,898 ng/ml. X{c định đƣợc c{c điều kiện tối ƣu của phản ứng sử dụng trong thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế HMG-CoA reductase từ dịch đồng thể, bao gồm: nồng độ cơ chất HMG- CoA ban đầu 60M, nồng độ co-factor NADPH 0,02 mM, dithiothreitol 1 mM, nhiệt độ phản ứng 37oC, lƣợng protein enzym 1 mg, pH 7,5 (đệm Tris- HCl) và thời gian tiến hành phản ứng trong 5 phút. Lời cám ơn: Chúng tôi chân thành cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tp. HCM đã cấp kinh phí nghiên cứu để thực hiện đề tài này (theo hợp đồng nghiên cứu số: 69/2017/HĐ- SKHCN ngày 19/5/2017). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ashmarina LI và cộng sự (1999), "3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A lyase: targeting and processing in peroxisomes and mitochondria", J Lipid Res. 40 (1): 70-75. 2. Brown DS, Dietschy JM, Siperstein MD (1973), "3-Hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A reductase. Solubilization and purification of a cold-sensitive microsomal enzyme.", J Biol Chem. 248: 4731-4738. 3. Hirangi D Patel GBS, Vandit T (2011), "Investigation of HMG- CoA Reductase inhibitory Activity of Antihyperlipidemic Herbal Drugs Study", Asian J. Exp. Biol. Sci. 2 (1): 63-68. 4. Hulcher FH et al. (1973), "Simplified spectrophotometric assay for microsomal 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase by measurement of coenzyme A", J Lipid Res. 14 (6): 625-631. 5. Kleinsek DA, Ranganathan S and Porter J W (1977) "Purification of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from rat liver”, Proc Natl Acad Sci USA; 74(4): 1431– 1435. 6. Mai Phƣơng Mai, Trần Mạnh Hùng (2014), Dược lý học tập 2, NXB Y Học, Bộ Y tế, tr. 289-297. 7. McTaggart F, Buckett L, Davidson R, Holdgate G, McCormick A, Schneck D, Smith G, Warwick M (2001) Preclinical and clinical pharmacology of rosuvastatin, a new 3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor. Am J Cardiol 2001;87(suppl):28B–32B 8. Rodwell VW and Brown WE (1980), "Hydroxymethylglutaryl- CoA reductase". Experientia Suppl. 36: 232-272. 9. Shapiro DJ et al. (1974), "Micro assay for 3-hydroxy-3- methylglutaryl-CoA reductase in rat liver and in L-cell fibroblasts", Biochim Biophys Acta. 370 (2): 369-377. 10. Shechter JR (1983), "Regulation of Rat Liver 3-Hydroxy-3- methylglutarylC oenzyme A Reductase", J Biol Chem. 259 (2): 870-877. 11. Wong ND (2014), "Epidemiological studies of CHD and the evolution of preventive cardiology", Nat Rev Cardiol. 11 (5): 276-289. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018