Môn kĩ thuật di truyền - Kĩ thuật chuyển gen

tiên, hai mảnh ADN đầu lệch do có những bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các bazơ nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết este giữa OH (3’) và P (5’) dưới tác dụng của enzyme ADN ligase. => Nhờ sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase, gen từ những loài khác nhau có thể được kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển. II. Đưa ADN vào tế bào nhân 1. Kỹ thuật Calcium phosphate (calcium phosphate technique) Nguyên tắc: khả ẩm bào của phức hợp ADN – calcium phosphate. Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) được phát triển đầu tiên để xác định sự lây nhiễm của ADN virus (Graham,1973). Hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của ADN virus cũng như ADN tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980). Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa ADN và calcium phosphate. Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter, 1982). Trong tế bào, các phân tử ADN ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do ẩm bào và lysosome nhưng rất ít ADN đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ. Hình: Phức hợp ADN-calcium phosphate. Kỹ thuật này vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Bên cạnh đó, biến nạp ADN tách chiết từ các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư. Ưu điểm: đơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Nhược điểm: hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp. 2. Chuyển gen qua liposome Nguyên tắc: sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-ADN. Hình 2.1: Cấu trúc tổng quát của Lipid cation. Hình 2.2: Cấu trúc tổng quát của DOPE (L-diolecyl phosphatidyllethanolamine). Hình 2.3: Phức hợp Liposome-ADN. Hình 2.4: Sơ đồ Hoạt động của vector liposome. Lipid cation được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine (DOPE). Phần cation của phân tử lipid kết hợp với ADN tích điện âm và kết quả là chứa đầy ADN trong phức hợp liposome-ADN. Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-ADN xảy ra dễ dàng. Ưu điểm: gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các ADN có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat không có hiệu quả. Nhược điểm: sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần của huyết thanh có thể xảy ra. 3. Phương pháp vi tiêm Sự thành công đầu tiên trong nghiên cứu tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm vào tiền nhân đã được công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980). Hình 3.1: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh. Cho đến nay, trong các kỹ thuật chuyển gen vào động vật thì phương pháp vi tiêm dung dịch ADN vào hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi. Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn. Nguyên tắc: một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi. - Dung dịch gen chuyển - Gen chuyển được xen vào trong một vector plasmid và tạo dòng trong E.coli. - Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được phát hiện trong môi trường nuôi cấy có thuốc kháng sinh do plasmid mang các gen kháng thuốc đặc hiệu. - Các vi khuẩn sống sót được sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển sẽ được sao chép mỗi khi tế bào vi khuẩn phân chia. - Sau đó, hàng triệu bản sao của plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển được tách chiết từ các tế bào vi khuẩn này và các đoạn gen chuyển được tách ra từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế. - Ðể tinh sạch, gen chuyển được điện di trên gel agarose. - Hoà tan gen chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE...) và tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế. - Nồng độ dung dịch ADN sử dụng cho vi tiêm thường là 1-5 µg/ml. - Trước khi chuyển vào phôi, gen chuyển được kiểm tra sự biểu hiện trong các tế bào nuôi cấy bằng sự chuyển nhiễm (transfection). - Các bước tiến hành - Nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào. - Lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra. - Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp theo. - Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng. - Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái nhận. Loài động vật Số lượng trứng được vi tiêm Số lượng con sinh ra từ trứng vi tiêm Số lượng con chuyển gen Thỏ 1907 218 (11,4%) 28 (1,5%) Cừu 1032 73 (7,1%) 1(0,1%) Lợn 2035 192 (9,4%) 20 (1%) Hình 3.4: Hiệu quả của vi tiêm ở một số loài động vật (Hammer và cộng sự, 1985). Ưu điểm: - Cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao. - Phương pháp chuyển gen có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi. - Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn. Nhược điểm: - Đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi thực hiện. - Sự xâm nhập của gen chuyển vào ADN tế bào vật chủ là một quá trình ngẫu nhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí ADN vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp. 4. Biến nạp (Transformation) Nguyên tắc: Muốn đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ được phải làm cho màng sinh chất tế bào nhận bị biến đổi sau đó ủ với một tỉ lệ giữa vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lý. Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN. Trong biến nạp, ADN trần từ một tế bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩn khác (thể nhận). Biến nạp xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tế bào. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do bị tan (lysis), ADN vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các tế bào nhận khác. Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một số nhóm vi khuẩn khác. Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố: + Tính dung nạp của tế bào nhận. + Kích thước của đoạn ADN ngoại lai. + Nồng độ của ADN. 4.1. Cơ chế phân tử Hình 4.1: Sơ đồ diễn biến của quá trình biến nạp ở cấp độ phân tử ADN bám vào. b. Thâm nhập. c. Bắt cặp và tái tổ hợp. d. –Tế bào biến nạp 4.2. Quá trình gồm các giai đọan chủ yếu – Sự phân hủy ADN tế bào cho: ADN tế bào cho có thể là của tế bào tự nhiên bị phân hủy hoặc trong thí nghiệm bị gây chế bằng nhiệt độ cao hay tác nhân phá vỡ tế bào. – ADN bám vào bề mặt tế bào: Protein gắn vào ADN. – Thâm nhập của ADN: Sợi ADN mạch kép của dòng vi khuẩn S sau khi chui qua màng tế bào của dòng R thì một mạch S sẽ bịnucleaz của tế bào cắt, còn lại một mạch nguyên. – Bắt cặp (Synapsis)và tái tổ hợp: Nhờ sự hỗ trợ của protein RecA ADN của thể nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở 1 đoạn dễ bắt cặp với đoạn ADN thể cho S vừa chui vào. Sao chép: Sau khi bắt cặp tạo đoạn lai R - S, phân tử ADN sao chép tạo ra 2 sợi, một sợi kép R-R và sợi kép khác có mang đoạn ADN thể nhận S-S. Kết quả cuối cùng là đọan gen của SIII chèn vào bộ gen tế bào nhận. Sau phân bào thì một dòng tế bào nhận được ADN ngoại lai vào bộ gen - tế bào được biến nạp. Tế bào đã được biến nạp sinh sản tạo dòng nhận RII mới. 4.2.1. Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ hóa biến nạp - Phương thức kinh điển để biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.Coli. + B1: Các tế bào chủ được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận ADN plasmid. + B2: ADN plasmid đưa vào bằng cách shock nhiệt nhanh (40-50giây) + B3: Các tế bào biến nạp được chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương tính trên đĩa agar chứa môi trường LB với kháng sinh thích hợp. Mỗi khuẩn lạc trên đĩa kháng sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn + B4: Bổ sung thêm cơ chất NST cho β – galactosidase (X- gal) => Các tế bào chứa plasmid mang ADN ngoại lai có thể xác định bằng mắt 4.2.2. Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ điện biến nạp - Đây là kĩ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn. - Hai thông số quan trọng là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết. Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ ADN tái tổ hợp dễ dàng. - Hiệu suất khoảng 108 - 109 thể biến nạp/μg plasmid. - Phương pháp này đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền. 4.2.3. Biến nạp gen nhờ polyetylen glycol (PEP) - Là phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lý bằng polyetylen glycol (PEG). - Để tạo tế bào trần người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30 – 40%. - Đây là phương pháp hiệu quả cao đối với tế bào thực vật. Bằng phương pháp này người ta đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ. Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao. Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào. Đặc biệt loai cây có giá trị kinh tế cao như: lúa, ngô, đại mạch. Nhược điểm: Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loài cây. 5. Tải nạp (Transduction) Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, trong đó quá trình chuyển gen và tái tổ hơp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage). Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E.Coli qua phage λ, pha P1 và ở Bacillus subtilis qua phage SP10 thì tải nạp cho hiệu quả cao hơn. Tiêu chuẩn virus làm vector chuyển gen: + Hệ gen của virus phải là ADN. + Không gây tác hại đáng kể cho thực vật. + Có khả năng tải được đoạn ADN gắn vào. Tuy nhiên phương pháp này ít được sử dụng Ưu điểm: Virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. * Tải nạp gồm: tải nạp chung và tải nạp chuyên biệt. 5.1. Tải nạp chung (Genral transduction) Tải nạp chung xảy ra khi phage mang bất kì gen nào của vi khuẩn A chuyển sang vi khuẩn B. Tải nạp chung (genralized transduction) có các đặc điểm: - Thường do phage kiểu P1 thực hiện. - Bất kì gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp. - Tải nạp có được do gói nhầm ADN của tế bào chủ khi phage trưởng thành. - Các thể tái tổ hợp đơn bội được tạo ra. 5.2. Tải nạp chuyên biệt (Special transduction) Tải nạp chuyên biệt hay hạn chế (restricted transduction) là trường hợp chỉ mang một vài gen nhất định, nó có 4 đặc điểm: - Những gen được chuyển nằm sát chỗ prophage gắn vào. - Chỉ prophage kiểu λ thực hiện. - Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi nhiễm sắc thể của tế bào chủ. - Các vi khuẩn tái tổ hợp có thể lưỡng bội một phần. 6. Chuyển gen nhờ vector là virus Nguyên tắc: Virus được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi trước khi được chuyển ghép vào con mẹ. Nhiều nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus...được sử dụng vào những mục đích chuyên biệt. Ðể sử dụng làm vector, các phần khác nhau của genome virus được thay thế bằng gen cấu trúc quan tâm; các virus được sử dụng phải an toàn, không gây bệnh. Các cơ thể chuyển gen sinh ra ở dạng khảm. Gen chuyển chỉ có thể di truyền được nếu retrovirus hợp nhất vào một số tế bào sinh dục. Khi gen chuyển đã hợp nhất trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng mầm và sau đó được lai cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động vật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào. Ở giai đoạn này, phôi mang gen chuyển có thể được đông lạnh và được bảo quản cho các quá trình cấy chuyển về sau. Ưu điểm: Bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm vector để chuyển vật liệu di truyền vào trong tế bào. Nhược điểm: Tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen sơ sinh rất thấp. Hình 6.1 Chuyển gen ở chuột nhờ vector là virus. 7. Chuyển gen bằng súng bắn gen Nguyên tắc: sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tăng tốc độ các hạt. Sử dụng các hạt tungsten đường kính rất nhỏ hoảng 1 micromet ( có thể là các hạt kim loai nặng như vàng, bạc) được bao bọc ADN và bắn trực tiếp vào tế bào. Dùng phổ biến nhất trong chuyển gen các loài ngũ cốc. Hình 8.1: Nguyên lý hoạt động cúa súng bắn gen. Ưu điểm: thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn.... Ứng dụng đa dạng: tạo thực vật chuyển gen, tiêm chủng vaccine di truyền, liệu pháp gen tự sát, sự điều biến miễn dịch, Nhược điểm: Cây chuyển gen khó tái sinh, hiệu quả thấp, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí vật tư đắt (hạt vàng, volfram). => Tóm lại có rất nhiều phương pháp nhưng sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố để chọn ra phương pháp phù hợp nhất. Không có phương pháp nào là tối ưu nhất. III. Kiểm tra sự sát nhập của gen chuyển và biểu hiện của gen 1. Kiểm tra sự sát nhập của gen chuyển - Công việc này tốn nhiều thời gian và công sức, bao gồm từ bước thu nhận mô, tách chiết ADN, xác định sự hiện diện của gen chuyển trong bộ gen. Một số phương pháp thường được sử dụng là PCR, Southern blot, dot blot, sot blot. + Sử dụng PCR để sàng lọc sơ bộ hàng trăm, hàng ngàn cá thể được chuyển gen, sau đó sử dụng các phương pháp Southern blot để khẳng định kết quả sàng lọc ban đầu của PCR. + 2 phương pháp Dot blot và slot blot cũng dùng song song để định lượng tương đối một loại ADN đặc trưng nào đó cũng bằng phương pháp lai phân tử và đánh dấu phóng xạ. 2. Xác định sự biểu hiện của gen chuyển - Kiểm tra sự biểu hiện của gen là bước cuối cùng và quan trọng nhất. Có hai cách đánh giá sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cơ thể vật chủ: + Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein + Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua mARN 2.2. Một số phương pháp xác định sự biểu hiện của gen chuyển 2.2.1. Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein của gen được dịch mã - Sử dụng trong trường hợp kháng thể của protein gen chuyển có sẵn, phát hiện sự biểu hiện protein có thể được tiến hành bằng phương pháp Western blot, ELISA, RIA. 1. Thu nhận protein 2. phân tích kích thước protein bằng điện di 3. Các vạch lai với kháng thể chuyên biệt (lai phân tử) => Sự tồn tại các bắt cặp đặc hiệu của kháng thể và protein trên bảng điện di sẽ dự đoán được sự biểu hiện của gen chuyển. 2.2.1.1. Kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA) - Nguyên lý của kỹ thuật ELISA Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là một phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu; ELISA được sử dụng như một công cụ chẩn đoán y học và bệnh lý học thực vật, cũng như kiểm soát chất lượng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: • Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt. • Kháng thể – antibody (KT) biết trước được “rửa” qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với ezyme. • Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. a. Phương pháp ELISA trực tiếp Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzyme sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên bề mặt đĩa phản ứng. Các bước tiến hành kĩ thuật ELISA trực tiếp Ưu điểm: • Nhanh, vì chỉ sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất à hạn chế tối đa các thao tác khi thực hiện phản ứng. • Loại bỏ được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp. Nhược điểm: • Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể bị ảnh hưởng xấu bởi enzyme hoặc cơ chất gắn, • Khó khăn và tốn kém trong việc lựa chọn kháng thể cho phản ứng. • Không linh hoạt trong việc lựa chọn các cơ chất gắn. • Tín hiệu khuếch đại thu được thấp. b. Phương pháp ELISA gián tiếp Trong phương pháp này, một kháng thể thứ cấp sẽ được bổ sung và bắt cặp đặc hiệu với kháng thể sơ cấp đã bắt cặp với kháng nguyên. Kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất sẽ phát tín hiệu khuếch đại khi xảy ra phản ứng bắt cặp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu. Các bước tiến hành kĩ thuật ELISA gián tiếp Ưu điểm: • Linh hoạt trong việc sử dụng các kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất. • Linh hoạt và dễ dàng trong việc lựa chọn kháng thể sơ cấp cho phản ứng. • Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể phát huy tối đa vì không bị ảnh hưởng bởi cơ chất đánh dấu. • Độ nhạy cao. • Linh hoạt trong việc sử dụng cơ chất. Nhược điểm: • Có thể xảy ra phản ứng chéo với các kháng thể thứ cấp à độ đặc hiệu của phản ứng bị ảnh hưởng. • Thời gian thực hiện phản ứng lâu hơn. c. Phương pháp ELISA “Sandwich” Một kháng thể gắn sẽ được sử dụng để gắn với kháng thể sơ cấp, tiếp theo kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất enzyme được bổ sung để bắt cặp với kháng thể thứ cấp trong phản ứng. Tín hiệu khuếch đại thu được khi có sự bắt cặp kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu. 2.2.1.2. Kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) Nguyên tắc chung của phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ là dựa trên sự gắn cạnh tranh giữa hormon tự nhiên (hormon trong máu cần định lượng) và hormon đánh dấu phóng xạ với kháng thể đặc hiệu. Mức độ gắn của hai loại hormon này với kháng thể tỷ lệ thuận với nồng độ ban đầu của chúng: Đo phức hợp hormon gắn đồng vị phóng xạ-kháng thể bằng máy đếm phóng xạ rồi dựa vào đường cong chuẩn ta có thể tính được lượng hormon có trong dịch cần định lượng. Dựa trên tính đặc hiệu cao của phản ứng miễn dịch trong đó chất cần định lượng đóng vai trò là KN cùng với KN đồng nhất về miễn dịch nhưng được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (KN*) liên kết với KT đặc hiệu để tạo thành các phức hợp (KN*-KT) + (KN-KT). Nếu có một lượng dư thừa KN* và một lượng hạn chế KT, ta có: KN* + KT + KN (KN*-KT) + (KN-KT) + KN* + KN Có sự cạnh tranh KT. Nếu KN cao thì KN*-KT thấp. KN*-KT: phần kết hợp; có thể tách ra khỏi KN* vì tính chất kết tủa của phức KN-KT. Hoạt tính phóng xạ của phức B (KN*-KT) tỷ lệ nghịch với nồng độ KN cần định lượng. Xây dựng đồ thị chuẩn ta sẽ xác định được nồng độ chất cần định lượng bằng cách so sánh số đếm xung của bệnh phẩm với xung của các mẫu chuẩn được làm song song. Để đảm bảo độ chính xác, tất cả các mẫu thử, bao gồm các mẫu bệnh phẩm cũng như các mẫu chuẩn, đều phải được xử lý và xét nghiệm hoàn toàn như nhau và trong cùng các điều kiện như nhau về thời gian ủ, khối lượng, nhiệt độ, pH, thời gian và tốc độ quay ly tâm... 2.2.2. Phát hiện sự hiện diện của gen thông qua mARN được phiên mã - Cách này được sử dụng khi cách phát hiện protein không khả thi (nhiều protein không có sẵn các kháng thể). - Có nhiều phương pháp như: + RT-PCR + Northern blot + ARN dot blot (lai phân tử đối tượng là ARN) + RNase protection assay Đầu tiên cũng phải thu nhận ARN tổng số. Trong các phương pháp trên thì RT-PCR là nhanh và nhạy nhất, Vì acid ribonucleic (ARN) không thể đóng vai trò làm khuôn mẫu trực tiếp cho PCR nên cần kết hợp bước phiên mã ngược (reverse transcription – RT) với PCR để ARN được chuyển thành ADN bổ trợ (cADN) và trở thành khuôn mẫu thích hợp cho PCR. Chỉ cần lượng nhỏ ARN cho quá trình sao mã ngược tạo thành cADN bằng enzyme sao mã ngược (reverse transcriptase). Sau đó, các cADN mang đi PCR để khuếch đại gen chuyển với cặp mồi chuyên biệt. Các phương pháp còn lại cũng chính xác nhưng đòi hỏi lượng mẫu ARN rất lớn. 3. Nuôi và trồng thử ở quy mô thí nghiệm và theo dõi hiệu quả lợi và hại của gen chuyển IV. Ứng dụng của kĩ thuật chuyển gen 1. Động vật biến đổi gen Có rất nhiều ứng dụng như sau: a. Y học - Mô hình gen gây bệnh + Tạo mô hình động vật bị bệnh ở người để tìm hiểu cơ chế gây bệnh + Tạo mô hình đông vật để kiểm tra các liệu pháp trị bệnh mới - Tạo động vật biến đổi gen để nghiên cứu chức năng gen - Kiểm tra chất độc - Tạo sản phẩm trong cơ thể động vật - Cấy ghép b. Chăn nuôi - Thúc đẩy sự tăng trưởng ở vật nuôi Trên thế giới, người ta đã chuyển gen sinh trường ở bò vào lợn, giúp cho hiệu quả tiêu thụ thức ăn cao hom, hàm lượng mỡ ít hơn lợn bình thường. (Nhưng ở con lợn trên lại xuất hiện các vấn đề như tím nở to, hay bị loét dạ dày, viêm da). Đã chuyển được gen xác định mùi sữa ở người vào tế bào phôi bò cái làm cho sữa bò có mùi sữa nguời và dề tiêu hoá dùng để nuôi trẻ trong vòng 6 tháng tuổi. - Tăng năng suất và chất lượng về một tính trạng nào đó (thịt, lông, sữa) - Kháng bệnh trong thú y c. Môi trường - Giảm ô nhiễm phosphor – heo enviro-pig d. Nuôi trồng thủy sản - Kích thích sự tăng trưởng - Tăng khả năng chống chịu: Đã chuyển được gen tổng hợp hoocmôn sinh trưởng và gen chịu lạnh từ cá Bắc Cực vào cá hồi và cá chép. 2. Thực vật Nhìn chung việc sử dụng kĩ thuật chuyển gen trên thực vật nhằm tăng năng suất cây trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp và góp phần bảo vệ môi trường. Hiện nay, các nghiên cứu đang tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng và khả năng chế biến tại những quốc gia có hàng triệu dân bị thiếu hụt thực phẩm. * Những hướng chính trong ứng dụng kĩ thuật chuyển gen vào thực vật - chuyển gen kháng sâu - chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ - chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh - chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật - chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng chất dinh dưỡng - chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Ở Việt Nam trong điều kiện phòng thí nghiệm đã chuyển được gen kháng rầy nâu, kháng sâu kháng bệnh bạc lá, kháng một số loại nấm, gen tổng hợp vitamin A, kháng virut, gen chín sớm vào một số cây trồng như lúa, ngô, khoai tây, cải bắp, thuốc lá, đu đủ. 3. Vi sinh vật a. Tạo ra các chủng vi sinh vật mới Kĩ thuật gen được ứng dụng để tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng sản xuất nhiều loại sản phẩm sinh học (axit ami, prôtêin, vitamin, enziin, hoocmôn, kháng sinh) với số lượng lớn và giá thành rẻ. b. Tạo vi sinh vật biến đổi gen trong xử lý môi trường Sử dụng vi sinh vật biến đối gen có khả năng phân hủy sinh học để làm giảm sự ô nhiễm môi trường. chúng ta đã thành công trong tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt động của vi sinh vật ban đầu để xử lý môi trường thêm vào đó là khả năng làm giảm các vi sinh vật hoặc tạo ra các vi sinh vật mới có khả năng phân hủy các chất độc hóa học hoặc các chất làm ô nhiễm khác thành các sản phẩm cuối cùng không độc hại. Hiện nay đã có sản phẩm từ một chủng đơn lẻ hay tổ hợp gồm nhiều chủng có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm. - AnAADN Chakrabarty đã thiết kế chủng Pseudomonas sp. tổng hợp được tập hợp khả năng phân hủy các hợp chất hydrocacbon từ một vài chủng Pseudomonas, đặc biệt là khả năng phân hủy dầu mỏ, từ điều này, hiện nay người ta đang tiến hành tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy các học chất hữu cơ bền vững như thuốc trừ sâu bằng clo, PCB’s, lignin và các hợp chất khác. - Các quá trình sử dụng vi sinh vật để làm sạch ô nhiễm đã được chứng minh qua thử nghiệm sau vụ tràn dầu ở bãi biển Exxon Valdez vào năm 1989. Các vi khuẩn có thể phá vỡ cấu trúc dầu mỏ một cách tự nhiên, và bằng cách tối ưu các điều kiện sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật có thể giúp biến đổi dầu khí thành các sản phẩm không độc hại. Thêm vào đó, một số chủng vi sinh vật có thể làm giảm các chất độc hại khác, bao gồm cả các kim loại nặng như thủy ngân. c. Vi sinh vật biến đổi gen có khả năng làm tái sinh năng lượng - Vi khuẩn trong các bãi chôn lấp rác có thể cung cấp khí metan, khí này có thể được thu thập và chuyển thành điện năng. - Etanol cũng được xem là một nguồn nhiên liệu thay thế cho các nhiên liệu hóa thạch. Cách trực tiếp nhất đế sản xuất etanol từ thực vật là sử dụng các thành phần có chứa nhiều tinh bột như ngô, lúa mỳ hoặc gạo. Việc sử dụng thực vật có chứa nhiều cellulose để tạo, nhưng hầu hết cá quá trình lên men không thể phá vỡ cellulose để tạo các sản phẩm lên men. Tuy nhiên, vi khuẩn lại có thể được thiết kế để thực hiện điều đó, chúng biến đổi cellulose thành các loại đường đơn có thể lên men được. Chính vì thế, vi sinh vật có thể cho phép sử dụng sinh khối như cỏ và các loại thực vật khác để sản xuất etanol mà không làm ảnh hưởng đến nguồn cung cấp thực phẩm. C. VECTOR VÀ ENZYME SỬ DỤNG TRONG CHUYỂN GEN I. Vector chuyển gen 1. Khái niệm Việc nghiên cứu một gen xác định ở sinh vật eukaryote gặp phải nhiều khó khăn, vì gen đó chỉ là trình tự nhỏ nằm lọt trong toàn bộ gen có kích thước lớn. Để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho) sang tế bào B (tế bào nhận) chỉ có thể thực hiện bằng cách đính các gen cần chuyển vào một yếu tố trung gian được gọi là đoạn dẫn. Thực tế cho thấy rằng một đoạn ADN chứa gen không thể làm gì trong tế bào chủ. Vì nó không phải là một bộ phận của genome bình thường của tế bào, cho nên nó sẽ không được tái bản khi tế bào phân chia, không được biểu hiện và có khả năng bị phân huỷ khá nhanh. Những đoạn dẫn này có khả năng hướng dẫn, vận chuyển các đoạn gen cần nghiên cứu vào tế bào nhận. Đoạn dẫn này chính là các vector chuyển gen. => Vector là phân tử ADN nhỏ (ngắn) dạng thẳng hoặc dạng vòng, trong đó, người ta sẽ cài một mảnh ADN (gen quý) cần nghiên cứu. 2. Những yêu cầu của vector - Vector phải có một vùng nhận biết đối với một enzyme giới hạn loại II. Vùng này sẽ là vùng cài lắp một ADN (gen cần nghiên cứu) đã được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn. Hơn nữa, các vùng nhận biết này thường được đặt vào giữa các gen chỉ thị (gen báo cáo, marker chọn lọc) để tiện theo dõi sự biểu hiện hoạt động của gen tái tổ hợp. - Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn trong tế bào chủ. - Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận lượng ADN tối đa và dễ biến nạp vào tế bào chủ. - Vector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào sự sao chép bộ gen của tế bào chủ. - Đảm bảo sự di truyền bền vững của một ADN tái tổ hợp. - Chúng không có khả năng sống sót ngoài tế bào chủ và không chuyển vào tế bào chủ khác bằng con đường tiếp hợp. - Có trình tự điều hoà tạo điều kiện thuận lợi cho việc phiên mã của gen được đưa vào. - Khả năng biến nạp lớn nghĩa là có khả năng thấm tốt vào tế bào chủ của vector mang gen tái tổ hợp. - Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc phát hiện dòng cần tìm. - Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn bản sao của gen gắn vào vector. => Ngày nay các vector chuyển gen ngày càng hoàn thiện và tiện lợi cho việc sử dụng. Không có vector nào toàn năng cho sự chuyển gen mà cần có sự lựa chọn tùy đối tượng và tùy kích thước đoạn gen cần chuyển. Chúng được cấu tạo với nhiều tính chất chuyên biệt để mang được các trình tự nucleotide như mong muốn. 3. Các loại vector * Dựa vào nguồn gốc người ta phân ra - Các vector là những plasmid. - Các vector là phage. - Các vector lai nhân tạo như: cosmid, bluescript. a) Vector chuyển gen là plasmid Các plasmid là những mẫu ADN nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trong sinh vật eukaryote, plasmid chỉ có trong tế bào nấm men. Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức năng tự tái bản ADN. Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, ADN không thể tự tái lập trong tế bào chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector chuyển gen để nhân dòng ADN cần thiết. Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh. Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi ADN. * Các plasmid thế hệ thứ nhất Thế hệ đầu tiên đó là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1 b) Các vector chuyển gen là phage - Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là plasmid - Dễ xâm nhập vào vi khuẩn. - Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ. - Khả năng tiếp nhận đoạn ADN lạ lớn hơn plasmid. Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như - Thao tác ghép ADN lạ phức tạp, - ADN tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như ADN tái tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn Người ta tìm cách tăng chiều dài của đoạn được cài bằng cách giảm đi nhiều hoặc ít chiều dài những phần không cần thiết của genom phage λ. Phần trung tâm giữa gen J và N không cần thiết cho sự sinh sản của phage có thể được thay bằng ADN lạ. Các đầu mảnh 5’ và 3’ đều là đầu dính. c) Một số vector chuyển gen khác * Các cosmid - Đặc tính cấu tạo: Các cosmid là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sự đóng gói ADN tái tổ hợp vào đầu của phage. Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thể cài lắp ADN lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kích thước cosmid ≈ 5kb do đó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb và có thể tới 47kb. Vào thời điểm gây nhiễm E. Coli, ADN tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắt cặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kín dạng vòng và tái bản như một plasmid. * Ưu điểm và ứng dụng của cosmid - Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn. - Trong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát. => Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịu với môi trường có ampiciline. * Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeart - Artificial - Chromosomes) – thiếu hình minh họa Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự ADN ngày càng lớn, các nhà nghiên cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo ra YAC cho phép tạo dòng với những đoạn ADN dài 150÷1.000kb, trung bình là 350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự: - 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST - CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào - ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự như ori ở plasmid Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với cấu tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn ADN cần chuyển với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh tay gồm các gen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cánh tay mang một mảnh ADN hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori. Việc cài ADN lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine sẽ làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt của ADN lạ. Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm men. Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn. * Các nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú Cấu tạo: Tương tự như YAC và bao gồm - Trình tự TEL - Trình tự CEN - Trình tự ARS Nhưng khác với YAC là trình tự TEL và CEN có nguồn gốc từ người. Điều này cho phép MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào tế bào động vật có vú và giữ được ổn định trong tế bào. Mục đích sử dụng: Chủ yếu sử dụng nghiên cứu cho các tế bào bậc cao mà chúng ta không sử dụng được với tế bào nấm men. Khi đưa NST vào tế bào chủ, nó cũng tồn tại được và nhân lên trong tế bào chủ. II. Enzyme giới hạn (RE) 1. Khái niệm và đặc tính a) khái niệm - Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt ADN đặc hiệu thành những đoạn ngắn. Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodiester của bộ khung ADN mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phân đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gen khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn. Ví dụ: - Hae III cắt ADN ở giữa 4 cặp nucleotid: GG|CC hoặc C|C GG - Sma I cắt ADN bằng giữa 6 cặp nucleotid: CCC|CCC hoặc GGG|GGG - EcoR I cắt ADN lệch giữa 6 cặp nucleotid: G|AATTC CTTAA|G 2. Phân loại enzyme giới hạn - 3 loại (dựa vào khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử ADN) + Enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải của nó không liên quan đến chức năng methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế cạnh vị trí nhận biết. Nên hay được sử dụng. * Vị trí điểm cắt - Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5´-3´ trên mạch ADN (palindrome) dài khoảng 4-6 nucleotide gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này. Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết được gọi là isoschisomers. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotid của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotid khác. D. BÀI BÁO CHUYỂN GEN TÍCH LŨY SẮT TRONG CÂY ĐẬU TƯƠNG SANG CÂY DỨA NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM 1. Chuyển gen ferritin vào Agrobacterium Nguyên tắc: dựa trên khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một đoạn ADN của Agrobacterium (1 chi của vi khuẩn Gram âm do H.J. Conn thiết lập, sử dụng để chuyển gene ngang gây ra các khối u ở thực vật) vào tế bào thực vật. Hình 9.1: Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) là loài được nghiên cứu phổ biến nhất trong chi này. Hình 9.2: Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gene các nhà khoa học đã loại bỏ các gene gây khối u và gene mã hoá opine của T - ADN và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-ADN và các gen vir. Gene chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật. - Hình thành một vết đứt tại vị trí vùng biên phải RB của đoạn T- ADN. - Đoạn gene này sau đó được tách ra khỏi plasmid nhờ sự hình thành một đoạn đứt thứ hai. Đoạn đứt này thường không cố định đối với các plasmid khác nhau. - Trong khi các axit nucleic trống tạo ra trên plasmid được lấp đầy theo nguyên tắc bổ sung của các axit nucleic thì đoạn T- ADN được tách ra được bám bởi một protein bám sợi đơn (SSBP). Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn gen T- ADN được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây chủ. 2. Nuôi cấy khuẩn lạc Agrobacterium - Khuẩn lạc Agrobacterium đơn độc được nuôi qua đêm trong YENB lỏng (0,75% chiết xuất men bia, 0,8% nước dùng dinh dưỡng) vừa bổ sung 50 mg/l kanamycin ở 27 °C và lắc 150 vòng / phút. - Sau đó, tiến hành nuôi cấy liên tục cho đến khi OD600nm xấp xỉ 0,1. - Tiếp tục nuôi cấy 4-5 giờ trong điều kiện tương tự cho đến khi đạt được 0,6-1,6,0 OD600nm. - Sản phẩm nuôi cấy được pha loãng tới nồng độ 0.1 hoặc 0.2 sử dụng để lây nhiễm các mầm lá. 3. Gây nhiễm Agrobacterium vào mầm lá dứa - Cách lấy mẫu mầm lá dứa: Chồi nách lá dứa + Cắt lấy phần gốc lá (leaf base) 3 - 4 cm + Cắt nhỏ phần gốc lá 0.5 - 1cm. - Đưa cả dung dịch chứa khuẩn lạc Agrobacterium đã được chuyển gen nồng độ 0.1-0.2 và mầm lá của chồi lá dứa vào môi trường MS có bổ sung ACS 100 μM để gây nhiễm. - Các mẫu sau khi gây nhiễm được thấm khô kỹ trên các tờ giấy đã được tiệt trùng, và được trồng tiếp trong 3 ngày trên môi trường Pin-1 được củng cố bằng gerite 0,2%. - Sau khi đồng canh tác mầm lá được chuyển sang môi trường đặc (với gerite 0,2%) Pin-1 bổ sung cefotaxime (400 mg/l) và duy trì trong 3 ngày. - Tiếp tục nuôi cấy cho đến khi rễ của mầm phát triển đạt 5 cm (sau 8 tuần). - Cây chuyển gen đã cứng cáp được chuyển vào nhà kính trong cốc giấy chứa đất trồng trọt có chất lượng tốt đã tiệt trùng. 4. Tách chiết ADN từ cây đã được gây nhiễm Agrobacterium chuyển gen - Mẫu xử lý bằng RNAse (100 μg/ml) ở 37 °C trong 1 giờ, sau đó chiết xuất ADN bằng phenolchloroform và kết tủa cồn. Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (TB eukaryote). - Mục đích: Phá màng TB và màng nhân. - Phá vỡ tế bào thực vật bằng phương pháp vật lí hay hóa học. Phương pháp: nghiền TB trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarkosyl) và proteinase (proteinase K) à phá vỡ màng TB và màng nhân, giải phóng ADN ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với ADN. SDS (sodium dodecyl sulfate): Chất tẩy rửa, làm gãy các liên kết không cộng hóa trị. Sarkosyl: Hòa tan các protein màng. Proteinase K: Enzyme phân cắt protein (protease). Lưu ý: Do tế bào thực vật có vỏ cellulose, nên phải được nghiền trong nitơ lỏng ở 196oC, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệ ADN phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein - Mục đích: Loại bỏ các thành phần không phải là ADN. - Dùng dd phenol: chloroform à làm biến tính protein. Phenol-Chloroform không tan trong nước và làm biến tính protein. Protein sẽ bị tủa khi gặp phenol. ADN thì không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước. à Sau li tâm, thu được phần nước phía trên ống nghiệm chứa ADN hòa tan, phần giữa là protein kết tủa, phần dưới đáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn khác. Bước 3: Tủa nucleic acid - Mục đích: Thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc. Bảo quản tránh tác dụng của các enzyme phân huỷ nucleic acid. Hòa tan nucleic acid lại trong dd theo nồng độ mong muốn. Tủa trong ethanol (ethylic alcohol) - Điều kiện: Môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao). Vethanol : V mẫu = 2,5 : 1 à Lượng dư ethanol làm kết tủa hoàn toàn ADN. Nhiệt độ thấp. à Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo kết tủa. - Sau khi tạo tủa bằng ethanol, đem dd li tâm à thu được ADN cô đặc (pellet). 5. Phân tích phân tử của dòng dứa biến đổi gen bằng phản ứng chuỗi polymerase - ADN sau khi tách chiết tiến hành PCR. + Các mồi được sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là: 1. 5′GGATCCAACAATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT3′ 2. 5′GAGCTCGGCTATTCAAGATTAAGCAGCATC3′ Một mẫu 50-ng trên tổng số ADN được sử dụng để phân tích PCR với thể tích phản ứng là 50 μl chứa 1 × Taq polymerase đệm, 100 μM mỗi dNTP, 1 μM mỗi lượng mồi và 1 U lượng Taq polymerase. Quy trình Bước 1. Chuẩn bị Chuẩn bị các vật liệu: đoạn ADN đặc hiệu, đoạn mồi, polymerase, nucleotide tự do, dung dịch đệm. Cho các vật liệu vào ống nghiệm plastic, sau đó đặt ống nghiệm vào máy luân nhiệt. Bước 2. Phản ứng PCR Là một phản ứng theo nhiều chuỗi chu kì nối tiếp nhau. Một chu kì bao gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn biến tính: nóng chảy tại 94 °C trong 5 phút để tách ADN thành sợi đơn, tiếp theo là 30 chu kỳ khuếch đại bao gồm 94 °C trong 1 phút Giai đọan lai ghép: ADN mồi được bắt cặp với sợi đợn của ADN ban đầu thực hiện ở nhiệt độ 58 °C trong 1,5 phút, 72 °C trong 1 phút Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các nu vào sau ADN mồi với mạch khuôn là ADN ban đầu, là phần khuếch đại cuối cùng thực hiện ở nhiệt độ 72 °C trong 10 phút. Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, kết quả cuối cùng của phản ứng PCR sau n chu kỳ phản ứng thì ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Bước 3. Thu nhận ADN Các sản phẩm được hiển thị bằng cách sử dụng gel SYBR bảo vệ ADN (Invitrogen, USA) trên nền gel agarose 2%. Kết quả: - Phân tích PCR của sáu dòng dứa chuyển gen có tính chất cho mỗi cấu trúc cho thấy khuếch đại một đoạn 780 cặp bazơ tương ứng với kích thước dự kiến của ferritin đậu tương, trong khi nó vắng mặt trong các cây không biến đổi gen (Hình 3a, b). Hình 3. a) Phân tích PCR của cây chuyển gen pSF hiển thị khuếch đại băng đoạn 780 cặp bazơ cụ thể đối với gen ferritin đậu tương. + Làn 1 1 kb thang đo + làn 2 của cực dương, làn 3 cây không biến đổi + làn 4–9 các mẫu biến đổi gen. b) Phân tích PCR cây chuyển gen pEFE-SF cho thấy sự khuếch đại dải băng 780 cặp bazơ cụ thể đối với gen ferritin đậu tương. + Làn 1 1 kb thang đo + làn 2 của cây kiểm soát biểu hiện + làn 3 cây không biến đổi +làn 4–9 các mẫu biến đổi gen riêng lẻ. 6. Phân tích PCR phiên mã ngược tìm các dòng có khả năng chuyển gen thành công - Sáu dòng được chọn sau khi PCR tiếp tục phân tích phiên mã ngược (RT) –PCR để xác định biểu hiện tính trạng của gen chuyển. (Quá trình RT-PCR: RNA được chuyển thành cADN nhờ enzyme phiên mã ngược. Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR, bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên cADN, sau đó cADN được khuếch đại nhờ taq polymerase.) - RNA tổng số được phân lập từ lá của các dòng chuyển gen và không chuyển gen, sử dụng bộ RNeasy mini kit cho thực vật (Qiagen, USA) - Một lượng 1-μg trích từ tổng số RNA được sử dụng để tổng hợp cADN bằng cách sử dụng hệ thống cMaster RT-PCR (Eppendorf, Hoa Kỳ). 10 microlit của cADN này được dùng làm mẫu cho PCR với mồi đặc hiệu của ferritin đậu tương với các điều kiện cho phân tích PCR giống như miêu tả trên. Biểu hiện tính trạng được xác định bởi sự khuếch đại của đoạn 780 cặp bazơ. Kết quả: - Đảo ngược phiên mã (RT) -PCR xác nhận biểu hiện của gen chuyển. Một dải ferritin cụ thể là 780 cặp bazơ đã được quan sát thấy trong các cây chuyển gen của cả hai cấu trúc, trong khi vắng mặt ở các dạng cây không biến đổi (Hình 4). Hình 4 Phiên mã ngược phản ứng chuỗi polymerase cho thấy sự biểu hiện của gen ferritin bằng cách khuếch đại 780 cặp bazơ của cADN trong cây chuyển gen. + Làn 1 1 kb thang đo + làn 2 cây không chuyển gen + làn 3 cây kiểm soát biến đổi + làn 4–5 các mẫu biến đổi gen riêng lẻ của pSF + làn 6–7 biến thể riêng lẻ của pEFE-SF. 7. Phân tích đánh dấu Southern của PCR và các dòng RT-PCR-dương tính - Các phương pháp xác định PCR và RT-PCR phân tích hệ gen bằng lai ghép Southern xác nhận sự tích hợp ổn định của gen chuyển. Gắn nhãn DIG cho ferritin cADN cho thấy sự lai tạo trong cả hai dòng pSF và pEFESF, trong khi chúng vắng mặt trong các cây không được chuyển đổi. Dòng pSF chuyển đổi số 4 cho thấy sự tích lũy của ba bản sao và dòng 6 đã được chuyển đổi từ PEFE-SF cho thấy sự tích hợp của bốn bản sao của gen chuyển (Hình 5). Hình 5: Phân tích gen Southern blot cây chuyển gen. ADN của hệ gen được phân cắt bằng HindIII và lai với đầu dò gắn nhãn DIG cho ferritin đậu tương cADN. + Làn 1 1 kb thang đo, + làn 2 plasmid được kiểm soát biểu hiện + làn 3 cây không chuyển gen được kiểm soát biểu hiện + làn 4 chuyển gen dòng pSF-4 + làn 5 chuyển gen dòng của pEFE-SF-6. - Sau khi PCR và RT-PCR thu được hai dòng chuyển gen biểu hiện cao (pSF dòng 4 và EFE-SF dòng 6) - Hai dòng này được nhân lên và phân tích bằng cách lai ghép Southern để xác nhận sự ổn định tích hợp của gen ferritin và để xác định số lượng bản sao. - CTAB chuẩn giao thức được sử dụng để phân lập và cắt nhỏ ADN của bộ gen. In vết ADN lên màng nylon (Hybond N +; Amersham-Pharmacia, USA) sau khi tách gel được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - ADN (10–20 μg) phân lập từ các dòng chuyển gen độc lập được cắt nhỏ với Hind III. ADN được phân cắt được điện di trên gel agarose TAE 1% và chuyển sang màng Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech, Vương quốc Anh) sử dụng các công thức chuẩn. - Những ADN này lai với các đoạn đầu dò ngẫu nhiên được gắn DIG có 780 cặp bazơ thu được bằng PCR khuếch đại pSF với mồi được đề cập ở trên. Xác định dấu hiệu hóa học của phép lai tạo được hiển thị bằng phản chiếu phóng xạ. 8. Ước lượng số lượng sắt và kẽm trong các dòng chuyển gen bằng cách sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử - Dụng cụ thủy tinh được sử dụng cho quang phổ hấp thụ nguyên tử đã được rửa sạch và tráng bằng axit nitric pha loãng và sấy khô trong 12 giờ trước khi sử dụng. - Đĩa thủy tinh được ủ trong lò không khí nóng ở 140 °C trong 12 giờ. - 10 gram mô lá tươi được thu thập từ các cây trong ống nghiệm và được chuyển đến các đĩa petri thủy tinh sạch. - Đối với mỗi mẫu, 0.250 g mô khô được chuyển đến bình hình nón 250 ml và được phân cắt bằng 30 ml axit nitric đậm đặc và axit percloric theo tỷ lệ 5: 1, tương ứng. Các bình được giữ trên một đĩa nóng được điều chỉnh đến 80 °C và đun trong 2-6 giờ cho đến khi thấy được khói trắng của axit perchloric. - Các mẫu được để nguội và được lọc qua giấy lọc Whatman (số 40) vào bình định mức sạch 25 ml và thể tích mẫu đã được điều chỉnh đến 25 ml bằng nước MilliQ vô trùng. - Các mẫu chuẩn bị được phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử than chì PerkinElmer HGA 400. Dung dịch tiêu chuẩn chứa sắt (1–5 μg/ml) và kẽm (0,2–1,5 μg/ml) đã được chuẩn bị và sử dụng cho quang phổ hấp thụ nguyên tử để vẽ đường cong tiêu chuẩn. Kết quả: Sự tăng cường tích lũy hàm lượng sắt và kẽm trong các dòng dứa biến đổi gen được quan sát khi phân tích bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử. - Trong điều kiện in vitro, 574 μg/g DW sắt đã được ghi nhận ở một trong những dòng chuyển gen được chuyển đổi với pSF biểu hiện cassette (expression cassette: khả năng biểu hiện của gen được chuyển), tăng gấp 5,03 lần tích lũy sắt so với cây không biến đổi (Bảng 1). Cùng một dòng cho thấy nồng độ tích lũy kẽm đến 192,01 μg/g DW tăng gấp 2,44 lần so với cây không chuyển gen. Sự tích lũy tăng gấp 3,65 lần sắt và tăng gấp 2,0 lần kẽm thu được trong cây chuyển gen với biểu hiện pEFESF cassette (Bảng 2). Số S Nồng độ Fe (μg / g / dw) Trung bình tăng gấp Nồng độ Zn (μg / g / dw) Trung bình tăng gấp SF-1 479.52±2.27 4.21 188.12±0.52 2.39 SF-2 452.37±3.92 3.96 172.75±0.68 2.19 SF-3 487.12±2.39 4.26 188.51±1.23 2.39 SF-4 574.36±3.02 5.03 192.01±2.12 2.44 SF-5 502.98±3.71 4.41 158.53±0.85 2.01 SF-6 469.75±1.92 4.11 185.51±1.36 2.35 ĐỐI CHỨNG (cây không biến đổi) 114.12±2.02 78.61±0.13 Bảng 1 Hàm lượng sắt và kẽm trong lá của cây chuyển gen của pSF Số S Nồng độ Fe (μg / g / dw) Trung bình tăng gấp Nồng độ Zn (μg / g / dw) Trung bình tăng gấp EFE- SF-1 251.62±2.33 2.21 119.81±3.07 1.52 EFE- SF-2 218.74±3.39 1.91 122.95±0.15 1.56 EFE- SF-3 336.06±2.68 2.94 124.01±2.18 1.57 EFE- SF-4 331.83±4.06 2.91 123.17±1.56 1.56 EFE- SF-5 371.25±2.74 3.25 145.02±2.39 1.84 EFE- SF-6 410.22±2.16 3.65 161.23±3.25 2.05 ĐỐI CHỨNG 114.12±2.02 78.61±0.13 Bảng 2 Hàm lượng sắt và kẽm trong lá của cây chuyển gen của pEFESF - Tương tự trong nghiên cứu này thì sự tích lũy 574,36 μg/g sắt và 192,01 μg/g kẽm khi vùng khởi động ubiquitin được sử dụng, trong khi sử dụng vùng khởi động EFE dẫn đến sự tích lũy của 410,22 μg/g sắt và 161,23 μg/g kẽm trong cây dứa chuyển gen. Như đã đề xuất trong nghiên cứu của họ và trong điều tra này sự khác biệt trong mức độ tích lũy sắt và kẽm trong cây chuyển gen có thể là do sức biểu hiện của vùng khởi động được sử dụng. Tuy nhiên, nghiên cứu và công trình gần đây về chuối cho thấy rằng mức độ tích lũy có thể cao hơn bằng cách tăng mức biểu hiện gen ferritin đậu tương bằng cách sử dụng vùng khởi động mạnh mẽ hơn trong cây chuyển gen. Hơn nữa, mức độ tích lũy tương tự có thể đạt được trong các loại trái cây cung cấp RDA theo yêu cầu trong một lần sử dụng duy nhất. Nỗ lực đang được tiến hành theo hướng nghiên cứu này để xác định sự tăng cường tích lũy sắt và kẽm trong quá trình chuyển gen cây dứa. Tài liệu tham khảo Tài liệu 1. “Công nghệ sinh học trên người và động vật”, Phạm Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc. 2. “Sinh học phân tử”, Hồ Huỳnh thị Thùy Dương. Trang web: 1. Ứng dụng vi sinh vật biến đổi gen trong xử lý môi trường: 2. Top 13 Methods of Gene Transfer (With Diagram): 3. Thực phẩm biến đổi gen: https://www.slideshare.net/nambenho14/thc-phm-bd-gen-1-1 4. “Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi aspergillus oryzae” 5. Marker chọn lọc sử dụng trong công nghệ tạo cây GM và chiến lược cải tiến https://text.123doc.org/document/4278399-marker-chon-loc-su-dung-trong-cong-nghe-tao-cay-gm-va-cac-chien-luoc-cai-tien.htm