Một số đặc điểm sinh học của virus dịch tả lợn nhược độc chủng c được thích nghi trên tế bào PK15 tại công ty Hanvet

15 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 MOÄT SOÁ ÑAËC ÑIEÅM SINH HOÏC CUÛA VIRUS DÒCH TAÛ LÔÏN NHÖÔÏC ÑOÄC CHUÛNG C ÑÖÔÏC THÍCH NGHI TREÂN TEÁ BAØO PK15 TAÏI COÂNG TY HANVET Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Nguyễn Thu Trang, Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Văn Phúc, Nguyễn Thị Bích, Nguyễn Hữu Vũ Công ty Cổ phần Dược và Vật tư thú y (Hanvet) TÓM TẮT Virus nhược độc dịch tả lợn, chủng C đã được thích nghi trên tế bào PK15 tại công ty Hanvet. Sau khi thích nghi, virus đã được kiểm tra các đặc tính sinh học của giống. Kết quả kiểm tra cho thấy chủng virus đạt các tiêu chuẩn về nhận dạng, thuần khiết. Đường cong sinh trưởng của virus trên tế bào ổn định, hiệu giá virus cao nhất đạt 106,5 TCID 50 /ml tại 72 giờ sau khi gây nhiễm. Chủng virus thích nghi trên tế bào vẫn giữ được đặc tính gây sốt thỏ, liều gây nhiễm tối thiểu trên thỏ là 10-5/ml. Virus an toàn khi tiêm cho lợn với liều 106,5 TCID 50 /lợn. Gây miễn dịch cho lợn bằng chủng virus dịch tả lợn thích nghi trên tế bào với các liều miễn dịch 101, 102, 103 và 104 TCID 50 , lợn đều có đáp ứng miễn dịch tốt và được bảo vệ hoàn toàn khi thử thách với 103 MLD 50 virus dịch tả lợn cường độc. Từ khóa: virus nhược độc, dịch tả lợn, đặc tính sinh học, đáp ứng miễn dịch. Characteristics of attenuated classical swine fever virus - C strain adapted on PK15 cell line at Hanvet company Tran Van Khanh, Nguyen Thanh Ba, Nguyen Thu Trang, Nguyen Van Tam, Nguyen Van Phuc, Nguyen Thi Bich, Nguyen Huu Vu Classical swine fever virus, C strain was adapted on PK15 cell line at Hanvet Company. The biological characteristics of cell-adapted virus showed that its identity and purity met the required standards. The growth kinetic of virus was very stable, the highest viral titer was 106.5 TCID50/ml at 72h post-infection. The cell-adapted virus retained the ability to induce fever in the experimental rabbits; the minimum infective dose in the experimental rabbits was 10-5/ml. The pigs were safe when inoculation with dose of 106.5 TCID50/pig. The inoculated pigs with 101; 102; 103 and 104 TCID50 of cell-adapted virus induced good immune response and they were completely protected when challenging with 103 MLD50 virulent CSFV. Keywords: attenuated virus, classical swine fever, biological characteristics, immune response. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Vacxin dịch tả lợn (DTL) là một vacxin rất quan trọng trong việc phòng bệnh cho đàn lợn. Vacxin phòng bệnh DTL cho lợn hiện nay được sản xuất trên hai phương thức chính là sản xuất vacxin từ hạch lách thỏ và sản xuất vacxin trên tế bào. Tại Hanvet, chúng tôi đã có quy trình sản xuất vacxin DTL qua thỏ và sản phẩm đã được phân phối trên thị trường. Tuy nhiên, việc sản xuất vacxin DTL trên thỏ gặp nhiều khó khăn do: - Vacxin có chứa nhiều protein ngoại lai - Dễ tạp nhiễm các vi sinh vật có nguồn gốc từ thỏ - Chất lượng thỏ dùng cho sản xuất khó kiểm soát - Có thể gây phản ứng quá mẫn - Khó mở rộng quy mô sản xuất - Hàm lượng virus không cao. Vacxin sản xuất trên tế bào là một công nghệ mới với nhiều ưu điểm như: - Vacxin đảm bảo độ tinh khiết - Các nguyên liệu đầu vào của quá trình sản xuất dễ kiểm soát - Quá trình sản xuất cần ít diện tích mặt bằng hơn sản xuất vacxin trên thỏ 16 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 - Giảm tiêu tốn nhân lực trong quá trình sản xuất - Dễ dàng nâng cao quy mô sản xuất - Hiệu quả sản xuất cao, giá thành hạ - Chất lượng vacxin được kiểm soát dễ dàng Vì vậy, việc chuyển sang nghiên cứu sản xuất vacxin trên tế bào là một điều tất yếu. Từ thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành thích nghi virus DTL nhược độc chủng C trên nhiều loại tế bào khác nhau: tế bào PK15, tế bào tinh hoàn lợn (ST cell line) và tế bào tinh hoàn bê (BT cell line) để tạo chủng virus dùng cho sản xuất vacxin trên tế bào. Kết quả đã tạo được một chủng virus DTL thích nghi trên tế bào PK15. Nghiên cứu này nhằm xác định các đặc tính sinh học của virus DTL nhược độc chủng C được thích nghi trên tế bào PK15 tại công ty Hanvet. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng trong nghiên cứu này là Virus DTL nhược độc qua thỏ chủng C đã được thích nghi trên tế bào PK15, hiệu giá virus đạt 106.5 TCID 50 /ml. 2.2. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo các nội dung sau: Nhận dạng virus thông qua xác định sự có mặt của gen E2 Kiểm tra thuần khiết Tính cảm nhiễm của chủng virus trên thỏ Tính cảm nhiễm của virus trên tế bào Tính an toàn của virus trên lợn Tính sinh miễn dịch của virus trên lợn. 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu Cặp mồi nhận dạng gen E2 của virus DTL được sử dụng trong nghiên cứu (Yan Li & cs, 2007): Tên mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) CFSVF AACATGGATGGTGTAACTGGT 343 CFSVR TTCTCTATAGTGTTGGTCATTCC Lợn khỏe mạnh trên 2 tháng tuổi, có huyết thanh âm tính với kháng thể DTL được sử dụng trong nghiên cứu. Thỏ mẫn cảm khỏe mạnh, khối lượng 1,8 – 2,2kg, có thân nhiệt bình thường trong 3 ngày liên tiếp, lợn lai hướng nạc hai tháng tuổi, chưa tiêm phòng vacxin DTL và có huyết thanh âm tính với virus DTL khi xét nghiệm bằng ELISA được sử dụng trong nghiên cứu. Tế bào dòng PK15 (ATCC-CCL33) được nuôi cấy giữ giống tại Công ty Hanvet và các loại môi trường hóa chất cho nuôi cấy tế bào như MEM, PBS(-) cũng được sử dụng trong nghiên cứu. Virus DTL cường độc phân lập tại thực địa được giữ giống tại công ty Hanvet có liều MLD đạt 105/ml. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng để nhận dạng virus DTL theo hướng dẫn của Yan Li & cs (2007). Kiểm tra thuần khiết được tiến hành theo TCVN 8684:2011 Tính mẫn cảm trên thỏ của virus DTL được đánh giá thông qua phản ứng thân nhiệt của thỏ khi tiêm virus DTL theo hướng dẫn trong TCVN 8685-8:2011 Kỹ thuật Fluorescent Antibody Test (FAT) được sử dụng để xác định hiệu giá virus DTL trên tế bào, thực hiện theo hướng dẫn trong OIE Terrestrial Manual 2014, chapter 2.8.3. Kỹ thuật ELISA với bộ kit của hãng IDEXX và kỹ thuật trung hòa virus NPLA (Neutralising Peroxidase Linked Assay) theo hướng dẫn trong TCVN 5273:2010 được áp dụng. 17 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Minitab16. 2.3.3. Bố trí thí nghiệm Để xác định tính cảm nhiễm của virus trên thỏ, hỗn dịch virus DTL được pha loãng theo cơ số 10, dịch virus tại các độ pha loãng 10-2 - 10-6 được tiêm cho thỏ, mỗi độ pha loãng tiêm cho 5 thỏ, 1ml/con theo đường tĩnh mạch tai. Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành đo thân nhiệt thỏ 6 giờ một lần đến 120 giờ. 27 chai T-flask 75cm2 tế bào PK15 một lớp được gây nhiễm virus với liều gây nhiễm MOI = 0,01. Sau khi gây nhiễm virus, tại các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ, thu 3 chai tế bào nhiễm chuyển vào tủ lạnh -400C, đông tan 3 lần rồi lấy mẫu để chuẩn độ hiệu giá virus tại các thời điểm thu hoạch để xây dựng đường cong sinh trưởng. Để xác định tính an toàn của virus dịch tả lợn, 20 lợn thí nghiệm chia thành 4 nhóm được tiêm virus nhược độc với liều từ 105, 106 và 106,5 TCID 50 /lợn, một nhóm không tiêm làm đối chứng. Lợn được theo dõi 15 ngày sau khi tiêm virus về các chỉ tiêu, phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm, các biểu hiện lâm sàng và thân nhiệt. Để đánh giá tính sinh miễn dịch, 25 lợn thí nghiệm được chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 5 con. Từ nhóm 1 đến nhóm 4, lợn được gây miễn dịch bằng virus DTL nhược độc đã thích nghi trên tế bào với các liều 101; 102; 103; 104 TCID 50 /con. Nhóm 5 không tiêm virus làm đối chứng. Tại các thời điểm 14, 21, 28 và 35 ngày sau khi gây miễn dịch, lợn được lấy máu để kiểm tra kháng thể bằng ELISA và NPLA. Sau 35 ngày miễn dịch, lợn được công cường độc bằng chủng virus DTL cường độc với liều 103MLD. Lợn chết được mổ khám để kiểm tra bệnh tích. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nhận dạng gen E2 RNA của mẫu dịch virus được tách chiết bằng TRIzol™ Reagent (hãng Invitrogen). Cặp mồi đặc hiệu CSFVF, CSFVR được sử dụng để nhận diện vùng gen E2 của virus dịch tả lợn trong phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch Agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện trên hình 1. Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu dịch virus DTL nhược độc với cặp mồi đặc hiệu CSFV Giếng M: Marker 100bp plus (invitrogen); giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Đối chứng dương; giếng 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu CSFVF – CSFVR Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy hình ảnh của các băng rõ ràng, băng đơn gọn, kích thước băng của mẫu dịch virus DTL nhược độc có kích thước bằng với kích thước của băng của mẫu đối chứng dương. Trong khi đó, đối với giếng đối chứng âm không xuất hiện băng sáng. Kết quả này khẳng định virus được thích nghi trên tế bào PK15 là virus DTL. 3.2. Kết quả kiểm tra thuần khiết virus DTL Dịch virus DTL nhược độc được kiểm tra vô trùng và tạp nhiễm Mycoplasma theo TCVN 8684:2011, kết quả như sau: Sau 7 ngày theo dõi các ống môi trường kiểm tra, không thấy sự có mặt của vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng. Màu môi trường không đổi, không vẩn đục. Sau 14 ngày theo dõi các ống kiểm tra sự tạp nhiễm của nấm, không thấy sự có mặt của các sợi nấm trên bề mặt thạch. Sau 28 ngày theo dõi các mẫu kiểm tra sự tạp nhiễm Mycoplasma, không thấy sự có mặt của Mycoplasma trong môi trường dinh dưỡng. Từ các kết quả trên, mẫu dịch virus DTL nhược độc đạt tiêu chuẩn về vô trùng và không tạp nhiễm Mycoplasma. 1 M 2 3 18 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Hình 2. Đường cong sinh trưởng của virus DTL nhược độc 3.3. Tính cảm nhiễm của virus trên thỏ Việc thích nghi virus DTL nhược độc chủng C trên tế bào PK15 có ảnh hưởng tới tính mẫn cảm của virus trên thỏ như thế nào? Kết quả thu được thể hiện trong bảng 1. Bảng 1. Phản ứng thân nhiệt của thỏ khi tiêm virus DTL nhược độc STT Độ pha loãng Phản ứng thân nhiệt của thỏ Kết luận Thỏ 1 Thỏ 2 Thỏ 3 Thỏ 4 Thỏ 5 1 10-2 ++ ++ ++ ++ ++ + 2 10-3 ++ ++ ++ ++ ++ + 3 10-4 ++ ++ ++ ++ + + 4 10-5 ++ + ++ ++ + + 5 10-6 - - + - - +/- Ghi chú:“++” thỏ sốt điển hình theo TCVN 8685-8:2011 “+” thỏ sốt nhẹ theo TCVN 8685-8:2011 “+/-” thỏ nghi ngờ theo TCVN 8685-8:2011 “-” thỏ không sốt Kết quả thu được cho thấy virus DTL chủng C sau khi thích nghi trên tế bào PK15 vẫn có tính cảm nhiễm rất tốt khi gây nhiễm trên thỏ, khả năng gây nhiễm trên thỏ của virus DTL chủng C thích nghi trên tế bào đạt 105 RID/ml (Rabbit Infected Dose). Kết quả nghiên cứu này tương đồng với kết quả nghiên cứu của các tác giả Chris Morrissy, Trần Xuân Hạnh & cs (2010) khi nghiên cứu phát triển vacxin dịch tả heo mới, cấy chuyển virus DTL chủng C trên tế bào PK15A 12 lần; Chao Tong & cs (2017) khi tiếp truyền liên tục virus DTL chủng C trên tế bào PK15 40 lần; Ferrari (1992) khi nghiên cứu thích nghi virus DTL chủng C trên tế bào MPK sau 20 đời cấy chuyển, virus DTL chủng C vẫn giữ được độc lực trên thỏ khi thích nghi trên tế bào. Tuy nhiên, dòng tế bào sử dụng trong các nghiên cứu có khác nhau. Thực tế, kết quả nghiên cứu này khác với kết quả của Nguyễn Tiến Dũng và cs (2005) khi nghiên cứu thích nghi virus DTL chủng C trên tế bào CPK, sau 73 đời cấy chuyển, độc lực trên thỏ của virus không còn ổn định như virus gốc. 3.4. Tính cảm nhiễm của virus trên tế bào Để xác định đường cong sinh trưởng của virus DTL nhược độc, chúng tôi tiến hành thí nghiệm như mô tả trong mục 2.3.3. Kết quả thu được như sau: 19 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Qua đồ thị sinh trưởng, phát triển của giống virus DTL nhược độc cho thấy: Sau gây nhiễm 24 giờ, virus bắt đầu quá trình nhân lên, hàm lượng virus tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt cao nhất 106.57 TCID 50 /ml tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm. Sau thời điểm 84 giờ, hiệu giá virus giảm nhanh chóng. Đến thời điểm 108 giờ sau gây nhiễm, hiệu giá virus chỉ còn 104.73 TCID 50 /ml. Có sự khác biệt về động thái sinh trưởng của virus DTL trên tế bào trong nghiên cứu này với nghiên cứu của Chao Tong & cs. Trong nghiên cứu của Chao Tong & cs, hiệu giá virus đạt cao nhất tại thời điểm 96 giờ sau gây nhiễm và tác giả không theo dõi tiếp giai đoạn sau. Sự khác biệt này có thể do liều nhân nhiễm virus (MOI) trong hai nghiên cứu có sự khác nhau. Chao Tong & cs sử dụng liều nhân nhiễm MOI = 0.001, trong khi nghiên cứu này sử dụng MOI = 0.01. 3.5. Tính an toàn của virus trên lợn Tính an toàn của virus DTL nhược độc được đánh gia thông qua thí nghiệm đã được mô tả trong mục 2.3.3. Kết quả chúng tôi thu được như sau: Bảng 2. Biểu hiện lâm sàng của lợn sau khi tiêm virus DTL nhược độc Chỉ tiêu theo dõi Số lợn có phản ứng trên các liều tiêm Đối chứng 105TCID50 10 6TCID50 10 6,5TCID50 Phản ứng quá mẫn, sốc phản vệ 0/5 0/5 0/5 0/5 Phản ứng tại vị trí tiêm 0/5 0/5 0/5 0/5 Giảm ăn, bỏ ăn 0/5 0/5 0/5 0/5 Ủ rũ, mệt mỏi 0/5 0/5 0/5 0/5 Tiêu chảy 0/5 0/5 0/5 0/5 Các phản ứng khác 0/5 0/5 0/5 0/5 Như vậy, không phát hiện được phản ứng bất lợi nào xảy ra trên cơ thể lợn ở tất cả các lợn thử nghiệm. Cùng với theo dõi lâm sàng, đã tiến hành theo dõi thân nhiệt lợn thí nghiệm 2 lần/ngày vào sáng và chiều, kết quả thu được thể hiện qua hình 3. Hình 3. Thân nhiệt của lợn khi tiêm virus DTL nhược độc với các liều khác nhau 20 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Bảng 4. Biến động kháng thể của lợn được tiêm virus DTL nhược độc xác định bằng ELISA Liều tiêm % blocking/ngày lấy máu D0 D7 D14 D21 D28 D35 101TCID50 11,580 23,580 39,580 53,080 62,280 67,060 102TCID50 19,780 29,520 45,380 57,000 71,800 78,340 103TCID50 29,920 42,180 53,560 61,600 69,740 78,980 104TCID50 19,000 33,360 55,000 69,980 73,720 78,880 Đối chứng (không tiêm) 20,220 15,120 15,880 8,800 9,360 8,080 Qua đồ thị thân nhiệt của lợn thí nghiệm cho thấy, tất cả lợn trong thử nghiệm đều có thân nhiệt bình thường, dao động trong khoảng 39,2 – 39,60C, không có hiện tượng sốt trong suốt quá trình theo dõi. Nói cách khác, virus DTL nhược độc không gây sốt cho lợn được tiêm. Để đánh giá toàn diện hơn về tính an toàn của virus DTL nhược độc, chúng tôi đã tiến hành theo dõi tăng trọng của lợn trong quá trình thí nghiệm để so sánh với lợn đối chứng. Kết quả thể hiện qua bảng 3. Bảng 3. Tăng trọng của lợn khi tiêm virus DTL nhược độc ở các liều khác nhau Nhóm TN Khối lượng lợn (kg) Tỷ lệ tăng trọng (%) Ngày 0 Ngày 14 105 TCID50 21,9 ± 0,2 28,72 ± 0,11 31,14 106 TCID50 23,71 ± 0,19 30,37 ± 0,25 28,10 106,5 TCID50 22,87 ± 0,12 30,23 ± 0,17 32,18 Đối chứng (không tiêm) 22,69 ± 0,18 29,87 ± 0,15 31,64 Từ bảng số liệu theo dõi tăng trọng của lợn, sử dụng thuật toán thống kê phân tích phương sai một nhân tố cho thấy, không có sự khác biệt có ý nghĩa về khả năng tăng trọng giữa các nhóm lợn thí nghiệm. Từ các kết quả kiểm tra an toàn của giống virus DTL nhược độc cho thấy virus DTL nhược độc an toàn cho lợn khi tiêm với liều 106.5 TCID 50 . Kết quả này hoàn toàn dễ hiểu vì chủng virus dùng để thích nghi trên tế bào là virus DTL chủng C, một chủng virus cực kỳ an toàn, đã được chứng minh qua nửa thế kỷ (Qui Hua – Ji & cs, 2006). 3.6. Tính sinh miễn dịch của virus trên lợn 3.6.1. Đáp ứng miễn dịch dịch thể Biến động kháng thể trong huyết thanh lợn khi xác định bằng ELISA Sau khi miễn dịch cho lợn theo bố trí đã mô tả trong mục 2.3.3, tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh lợn tại các thời điểm khác nhau và thực hiện phản ứng ELISA. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 4. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở các liều tiêm 101, 102, 103, 104, lợn đều có đáp ứng miễn dịch tốt. Sau khi tiêm virus DTL nhược độc 14 ngày, lợn bắt đầu có kháng thể trong máu. Hàm lượng kháng thể tăng dần và đạt hàm lượng cao nhất tại thời điểm 35 ngày sau khi miễn dịch. Có sự khác biệt trong đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm với các liều virus khác nhau. Ở liều 21 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 miễn dịch 101 TCID 50 /ml, lợn có đáp ứng miễn dịch yếu hơn, sự xuất hiện kháng thể muộn hơn và hàm lượng kháng thể trong máu cũng thấp hơn so với các liều tiêm khác. Trong khi đó lợn được tiêm miễn dịch ở các liều 102, 103, 104 TCID 50 , có đáp ứng miễn dịch cao tương dương nhau. Tại thời điểm 35 ngày sau miễn dịch, kháng thể trong máu lợn miễn dịch 101 có giá trị Blocking đạt 67,1%, trong khi đó ở các liều miễn dịch 102; 103; 104 TCID 50 có giá trị Blocking trung bình lần lượt là: 78,4%, 79,0% và 78,9%. Cả 4 liều miễn dịch thử nghiệm đều chưa có dấu hiệu giảm hàm lượng kháng thể sau 35 ngày miễn dịch. Trong khi đó lô đối chứng không tiêm, hàm lượng kháng thể luôn âm tính trong suốt quá trình theo dõi. Kết quả của chúng tôi tương đồng với kết quả của Chris Morrissy, Trần Xuân Hạnh (2010) khi xác định hiệu lực của vacxin DTL chủng C thích nghi trên tế bào PK15A; Sara Munoz-Gonzalez & cs (2015) khi nghiên cứu về hiệu quả của vacxin nhược độc trong sự đề kháng với virus DTL cường độc ở lợn con. Biến động kháng thể của lợn được tiêm virus DTL nhược độc thể hiện qua hình 4. Hình 4. Biến động kháng thể của lợn được tiêm virus DTL tế bào, xác định bằng ELISA Biến động kháng thể trung hòa cùng với việc xác định kháng thể của lợn bằng ELISA, chúng tôi còn xác định hiệu giá kháng thể của lợn bằng phản ứng trung hòa trên tế bào. Kết quả thể hiện qua bảng 5. Bảng 5. Hiệu giá kháng thể trung hòa của lợn được tiêm virus DTL nhược độc Liều tiêm Hiệu giá kháng thể trung hòa/ngày lấy máu (Log2) D0 D7 D14 D21 D28 D35 101 TCID50 0 2 3.4 5.2 6.4 6.8 102 TCID50 0 2.5 4.2 5.8 7 7.8 103 TCID50 0 2.8 5 6.2 7.8 9.2 104 TCID50 0 2.8 5.2 6.8 8 9.4 Đối chứng (không tiêm) 0 0 0 0 0 0 Qua kết quả theo dõi sự biến động kháng thể trung hòa trong máu lợn thí nghiệm cho thấy: Nhóm lợn được tiêm virus DTL nhược độc có hàm lượng kháng thể trung hòa trong máu tăng dần theo thời gian, đạt cao nhất sau 35 ngày miễn dịch và chưa có dấu hiệu giảm. Ở liều miễn dịch 101 cho hàm lượng kháng thể trung hòa trong máu lợn thấp nhất, liều miễn dịch 103, 22 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Bảng 6. Biểu hiện lâm sàng của lợn sau khi công cường độc Biểu hiện lâm sàng Tỷ lệ biểu hiện lâm sàng Liều miễn dịch (TCID50) Đối chứng 101 102 103 104 Ủ rũ 0/5 0/3 0/3 0/3 3/3 Giảm ăn, bỏ ăn 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 Tím tái, xuất huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 Tiêu chảy 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 Sốt 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 Chết 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 104 có hàm lượng kháng thể trung hòa cao tương đối giống nhau. Trong khi đó, lô đối chứng hiệu giá kháng thể giảm dần và gần như bằng 0 sau 21 ngày theo dõi. Hình 5 cho ta thấy rõ biến động hàm lượng kháng thể trung hòa trong máu lợn thí nghiệm. Có sự khác biệt có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch dịch thể khi miễn dịch cho lợn với liều 101 TCID 50 so với các liều miễn dịch còn lại (P<0,0001, khi phân tích thống kê với mô hình MIXED trên phần mềm SAS 9.1). Với các liều miễn dịch khác, sự sai khác không có ý nghĩa. 3.6.2. Khả năng bảo hộ khi thử thách với virus cường độc Để đánh giá một cách hoàn chỉnh về khả năng bảo vệ lợn trước bệnh dịch tả của chủng virus DTL nhược độc, sau 35 ngày theo dõi miễn dịch, chúng tôi đã tiến hành công cường độc cho lợn thí nghiệm và lợn đối chứng, 3 lợn/nhóm miễn dịch và 3 lợn đối chứng được thử thách với cùng 1 liều virus cường độc DTL (103 MLD/lợn). Kết quả thu được như sau: Hình 5. Biến động kháng thể trung hòa của lợn sau khi tiêm virus DTL trên tế bào Qua bảng kết quả trên cho thấy: tất cả lợn đối chứng có biểu hiện ủ rũ, bỏ ăn hoặc giảm ăn, tiêu chảy, sốt, xuất huyết dưới vùng da mỏng; 3/3 lợn đối chứng chết với biểu hiện bệnh tích đặc trưng của DTL. Trong khi đó tất cả lợn miễn dịch đều không có biểu hiện bất thường nào xảy ra. Thân nhiệt lợn sau khi công cường độc cùng với việc theo dõi các biểu hiện lâm sàng, chúng tôi tiến hành theo dõi thân nhiệt của lợn sau khi công cường độc liên tục trong 10 ngày, mỗi ngày kiểm 23 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 tra 2 lần vào 8 giờ sáng và 4 giờ chiều. Thân nhiệt trung bình của lợn được tiêm virus DTL nhược độc và lợn đối chứng có sự khác biệt rõ rệt. Sau khi công cường độc, tất cả lợn được tiêm virus DTL đều không có hiện tượng sốt, trong khi đó 3/3 lợn đối chứng đều sốt cao, lên tới 420C và kéo dài liên tục trong 4 ngày, lợn chết ở ngày thứ 5, 8, 10 sau khi công cường độc. Hình 6. Biến động thân nhiệt lợn thí nghiệm sau khi công cường độc Kiểm tra virus huyết sau khi công cường độc. Ngoài việc theo dõi các chỉ tiêu lâm sàng, chúng tôi còn tiến hành lấy máu lợn để phân lập virus trên môi trường tế bào PK15. Kết quả thể hiện qua bảng 7. Bảng 7. Kết quả phân lập virus DTL trong máu lợn sau khi công cường độc Lô TN Tỷ lệ dương tính tại các thời điểm lấy máu 3d 5d 7d 10d 14d 101TCID50 0 0 0 0 0 102TCID50 0 0 0 0 0 103TCID50 0 0 0 0 0 104TCID50 0 0 0 0 0 Đối chứng 3/3 3/3 3/3 3/3 0 Kết quả phân lập virus DTL trong máu lợn thí nghiệm cho thấy: Sau khi công cường độc, không phân lập được virus trong máu của lợn được tiêm virus DTL ở tất cả các liều miễn dịch cũng như tại các thời điểm lấy máu khác nhau. Ở lợn đối chứng, hiện tượng virus huyết xảy ra ở cả 3/3 lợn (100%), sau đó lợn chết với những triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL. Để xác định chính xác hơn sự lưu hành của virus DTL trong máu lợn sau khi công cường độc, chúng tôi tiến hành kiểm tra virus huyết bằng kỹ thuật rRT – PCR. Kết quả được trình bày trong bảng 8. Kết quả xác định virus huyết bằng rRT-PCR đã khẳng định chắc chắn hơn về khả năng ngăn chặn hiện tượng virus huyết ở lợn được miễn dịch. Qua những kết quả thu được ở trên cho thấy virus DTL nhược độc chủng C được thích nghi trên tế bào PK15 có tính sinh miễn dịch rất tốt. Khi tiêm cho lợn với liều 101TCID 50 , lợn đã có đáp ứng miễn dịch đủ để bảo vệ lợn trước sự tấn công của virus DTL cường độc. 24 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Hình 7. Bệnh tích của lợn khi công cường độc Theo các tác giả Lai &cs (1982), Biront &cs (1987), Dahle & Liess (1995), de Smit &cs (2001) (dẫn theo Qui Hua – Ji & cs, 2006), virus DTL chủng C sinh đáp ứng miễn dịch rất sớm, chỉ 1 tuần sau khi tiêm vacxin, lợn đã được bảo vệ hoàn toàn. Tuy nhiên trong nghiên cứu này mới chỉ xác định được khả năng bảo hộ của chủng virus thích nghi trên tế bào sau 35 ngày miễn dịch mà chưa có điều kiện để đánh giá khả năng bảo hộ lợn ở những thời điểm sớm hơn. Vấn đề này cần được đánh giá thêm. Kết quả kiểm tra bệnh tích giải phẫu lợn thí nghiệm Bảng 8. Kết quả kiểm tra virus huyết bằng kỹ thuật rRT-PCR Lô TN Tỷ lệ dương tính tại các thời điểm lấy máu (%) 3d 5d 7d 10d 101TCID50 0 0 0 0 102TCID50 0 0 0 0 103TCID50 0 0 0 0 104TCID50 0 0 0 0 Đối chứng 100 100 100 100 25 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 2 - 2019 Sau khi công cường độc, lợn đối chứng có biểu hiện sốt, bỏ ăn, ủ rũ, xuất huyết ở các vùng da mỏng (bụng, bẹn, gốc tai). Ở ngày thứ 5, 8, 10 sau khi công, lợn 22, 21, 23 bị chết. Chúng tôi tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích. Bệnh tích chủ yếu gồm: Xuất huyết dưới da, tích nước xoang bao tim, xuất huyết cơ tim, xuất huyết sụn tiểu thiệt, xuất huyết các hạch lâm ba, van hồi manh tràng loét cúc áo IV. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi có các kết luận sau: - Virus DTL nhược độc chủng C thích nghi trên tế bào PK15 tại công ty Hanvet đảm bảo các yêu cầu về nhận dạng, tính thuần khiết, không bị tạp nhiễm các yếu tố ngoại lai. - Virus nhân lên tốt trên tế bào PK15 với đường cong sinh trưởng ổn định, hiệu giá virus cao nhất đạt 106.5 TCID 50 /ml tại thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm virus. - Sau khi thích nghi trên tế bào PK15, virus dịch tả lợn nhược độc chủng C vẫn giữ được đặc tính gây sốt thỏ, liều cảm nhiễm virus tối thiểu cho thỏ đạt 10-5/ml. - Virus DTL chủng C thích nghi trên tế bào an toàn khi tiêm cho lợn với liều 106.5 TCID 50 /ml/lợn. - Virus DTL chủng C thích nghi trên tế bào PK15 sinh đáp ứng miễn dịch tốt trên lợn. Khi gây miễn dịch cho lợn với liều 101 TCID 50 /ml, lợn được bảo vệ hoàn toàn khi thử thách cường độc tại thời điểm 35 ngày sau miễn dịch. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Tiến Dũng, 2005. Nghiên cứu vacxin Dịch tả lợn và phản ứng miễn dịch sau tiêm phòng. Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học trọng điểm cấp Bộ 2001 – 2003. 2. Nguyễn Tiến Dũng, 2007. Nghiên cứu biện pháp khống chế bệnh Dịch tả lợn ở Việt Nam và xây dụng mô hình an toàn bệnh. Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học trọng điểm cấp Bộ 2004 – 2006. 3. Chris Morrissy, Trần Xuân Hạnh & cs, 2010. Bệnh Dịch tả heo: Phát triển vacxin Dịch tả heo mới. Báo cáo nghiệm thu Dự án 014/07 VIE giữa Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam và Chính phủ Úc. 4. Chao Tong, Ning Chen, Xu Liao, Xuemei Yuan, Mengjiao Sun, Xiao Liang and Weihuan Fang, 2017. Continuos passaging of recombinant C strain virus in PK15 cells selects culture adapted variant that showed enhanced replication but failed to induce fever in rabbits. J. Microbiol. Biotechnol., 2017, 27(9), 1701 – 1710. 5. Sara Munoz-Gonzales, Marta Perez-Simo, Marta Munoz, Jose Alejandro Bohorquez, Rosa Rosell, Artur Summerfield, Marriano Domingo, Nicolas Ruggli and Lliliance Ganges, 2015. Efficacy of a live attenuated vaccine in classical swine fever virus postnally persistently infected pigs. Veterinary research, Bio – Med central, 2015. 6. Qui Hua – Ji, Shen Rong-xian and Tong Guang-zhi, 2006. The lapinized Chinese strain vaccine against classical swine fever virus: A retrospective review spanning half a century. Agricultural sciences in China, 2006. 7. M. Ferrari, 1992. A tissue culture vaccine with lapinized Chinese (LC) strain of Hog cholera virus (HCV). Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. Vol 15, No. 3, pp 221 – 228, 1992. 8. Yan Li, Jian-Jun Zhao, Na Li, Zixue Shi, Dan Cheng, Qing-Hu Zhu, Changchun Tu, Guang- Zhi Tong, Hua-Ji Qiu, 2007. A multiplex nested RT-PCR for the detection and differentiation of wild-type viruses from C-strain vaccine of classical swine fever virus. Journal of Virological Methods 143 (2007) 16–22. (Available online at www.sciencedirect.com) Ngày nhận 5-10-2018 Ngày phản biện 16-12-2018 Ngày đăng 1-3-2019