Một số nhận định về vi khuẩn gram âm chưa xác định được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 272 MỘT SỐ NHẬN ĐỊNH VỀ VI KHUẨN GRAM ÂM CHƯA XÁC ĐỊNH ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MẪU BỆNH PHẨM CỦA BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH BÌNH DƯƠNG Nguyễn Tú Anh*, Nguyễn Hoàng Thu Trang*, Bùi Thị Kim Thoa* TÓM TẮT Mục tiêu: nhận định về vi khuẩn Gram âm chưa xác định được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Dương Phương pháp nghiên cứu: vi khuẩn Gram âm chưa xác định được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Dương. Vi khuẩn được định danh bằng phương pháp nuôi cấy, quan sát hình thể và phản ứng sinh hóa. Tiếp theo, thử nghiệm kháng sinh đồ được thực hiện trên các vi khuẩn đã định danh với 5 loại kháng sinh amikacin, ciprofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, ceftazidim, cefepim. Kết quả: định danh từ 52 mẫu cho thấy chiếm tỉ lệ cao nhất là Acinetobacter baumannii (30,8%). Ngoài ra cũng xác định được một số vi khuẩn khác như Pseudomonas spp., Burkholderia cepacia, Vibrio spp. và các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Tổng hợp kết quả nghiên cứu, kết hợp các yếu tố như mẫu bệnh phẩm, khoa phòng điều trị là cơ sở để chúng tôi đưa ra nhận định đây có thể là những trường hợp nhiễm trùng bệnh viện. Qua biện giải nhận thấy A. baumannii đề kháng với tất cả 05 kháng sinh với tỉ lệ ≥ 50%. Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. và B. cepacia vẫn còn nhạy cảm với ceftazidim và cefepim. Từ khóa: vi khuẩn Gram (-), nhiễm trùng bệnh viện, Acinetobacter baumannii ABTRACT STUDY ON UNIDENTIFIED GRAM-NEGATIVE BACTERIA ISOLATED FROM THE CLINICAL SPECIMEN OF BINH DUONG GENERAL HOSPITAL Nguyen Tu Anh, Nguyen Hoang Thu Trang, Bui Thi Kim Thoa * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 272 - 276 Objective: study on Gram-negative bacteria in the clinical specimen that can not be identified Binh Duong neral hospital. Methods: unidentified bacteria were determined at Department of Microbiology and Parasitology, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy at HCMC, applying culturing and biochemical methods. Continuously, the identified bacteria were subjects of antibiotic susceptibility testing with five antibiotics amikacin, ciprofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, ceftazidim and cefepim. Results: The result showed that Acinetobacter baumannii was found with the highest rate (30.8%). Besides, there were also other bacteria such as Pseudomonas spp., Burkholderia cepacia, Vibrio spp. and bacteria belonging to Enterobacteriaceae. This data, together with the other factors including type of clinical specimen, clinical department, propose that these cases are hospital – acquired infection. A. baumannii resist all of five antibiotics with the rate above 50%. The bacteria of Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. and B. cepacia are still sensitive to ceftazidim and cefepim. Keywords: Gram-negative bacteria, hospital – acquired infection, Acinetobacter baumannii * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Tú Anh ĐT: 0938130372 Email: nguyentuanhvn@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 273 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm luôn là một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu của các bác sĩ điều trị tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Không chỉ do cơ chế sinh bệnh khá phức tạp mà còn do khả năng đề kháng với nhiều kháng sinh phổ rộng của vi khuẩn Gram âm, vì vậy chúng là nguyên nhân dẫn đến các diễn biến nhiễm trùng phức tạp và gây tỉ lệ tử vong cao. Việc định danh chính xác tác nhân vi khuẩn Gram âm có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh cũng như đưa ra hướng điều trị kịp thời, hiệu quả. Sự thiếu sót hay nhầm lẫn trong định danh vi khuẩn gây bệnh góp phần làm gia tăng thất bại trong điều trị và tình trạng đề kháng kháng sinh. Cùng với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại trong định danh vi khuẩn nói chung và trong lâm sàng nói riêng như PCR (polymerase chain reaction), lai phân tử ADN, giải trình tự 16S rARN, phương pháp định danh truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của vi khuẩn vẫn là công cụ hữu hiệu, phù hợp với điều kiện trang thiết bị của nhiều phòng xét nghiệm vi sinh ở nước ta hiện nay. Sự ra đời các bộ kit sinh hóa thương mại dùng định danh vi sinh vật khá thuận tiện và rút ngắn thời gian thực hiện. Tuy nhiên, mỗi loại kit chỉ giới hạn định danh một, vài nhóm hay một số đơn vị phân loại vi khuẩn nhất định nào đó. Trong thời gian gần đây, tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương, có một số mẫu bệnh phẩm nhiễm vi khuẩn Gram âm nhưng không thể định danh bằng bộ kit IDS14GNR đang sử dụng tại bệnh viện. Do vậy, đề tài được thực hiện nhằm định danh các vi khuẩn Gram âm chưa xác định được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm từ Bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Dương. Từ kết quả định danh này, các vi khuẩn sẽ được thử tính nhạy cảm với một số kháng sinh trong danh mục thuốc của bệnh viện: ciprofloxacin, amikacin, cefepim, ceftazidim và amoxicillin/clavulanic acid. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi khuẩn 52 mẫu vi khuẩn được thu thập từ bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương từ tháng 8/2011 đến tháng 03/2012. Các chủng này được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị tại các khoa, phòng của bệnh viện và chưa định danh được bằng bộ kit IDS14GNR của công ty Nam Khoa. Phân lập, định danh vi khuẩn Các mẫu vi khuẩn sau khi được chuyển đến Bộ môn Vi sinh – Ký sinh đã được phân lập, nuôi cấy trên môi trường MacConkey (MC) và Tryptic Soye Broth (TSB) để tăng sinh số lượng. Các mẫu vi khuẩn này lần lượt được định danh bằng kit IDS14GNR (Nam Khoa), kit API20E (bioMérieux) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và một số phản ứng sinh hóa bổ sung khác theo hướng dẫn phân loại vi khuẩn của Bergey(2). Thử nghiệm tính đề kháng kháng sinh: Thực hiện kháng sinh đồ với các chủng vi khuẩn đã được thuần chủng theo hướng dẫn của CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute - Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm), E. coli ATCC 25922 được dùng làm mẫu chứng(1).Các kháng sinh được lựa chọn theo khuyến nghị của CLSI và có trong danh mục thuốc của bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương, bao gồm: amikacin, ciprofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, ceftazidim, cefepim. KẾT QUẢ Kết quả định danh. Từ tháng 8/2011 đến tháng 3/2012, chúng tôi tiến hành phân lập và định danh 52 mẫu vi khuẩn có nguồn gốc từ 6 nhóm bệnh phẩm khác nhau bao gồm dịch phế quản, mủ, nước tiểu, phân, máu và dịch cơ thể (dịch màng bụng, dịch ối, sản dịch). Mẫu bệnh phẩm được lấy từ 45 bệnh nhân đang điều trị tại 10 khoa phòng của Bệnh viện Đa khoa tỉnh Bình Dương; trong đó, mẫu bệnh phẩm của 6 bệnh nhân phân lập được nhiều hơn 2 chủng vi khuẩn. Các mẫu chủ yếu thuộc nhóm bệnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 274 phẩm dịch phế quản (chiếm 60,4%) và từ khoa Hồi sức tích cực – chống độc (chiếm 50,9%). Sự phân bố giới tính ở bệnh nhân lấy mẫu có sự cân bằng giữa nam : nữ (22 : 23) với độ tuổi trung bình là 56,2 (nhỏ nhất là trẻ sơ sinh và lớn nhất là 90 tuổi). Tất cả 52 mẫu vi khuẩn đều mọc được trên môi trường MC và cho phản ứng catalase dương tính. Kết quả định danh 52 chủng vi khuẩn trình bày tại bảng 1. Bảng 1: Kết quả định danh vi khuẩn Tên vi khuẩn Số lượng Mẫu bệnh phẩm Khoa, phòng điều trị Acinetobacter baumannii 16 Dịch phế quản (12), mủ (1), phân (1), máu (1), dịch khác (1) HSTC-CĐ (11), nội (3), nhi (1), sản (1) Burkholderia cepacia 2 Dịch phế quản (1), mủ (1) HSTC-CĐ (1), TMH (1) Pseudomonas aeruginosa 2 Dịch phế quản (1), mủ (1) HSTC-CĐ (1), TMH (1) Pseudomonas diminuta 1 Dịch phế quản (1) HSTC-CĐ (1) Pseudomonas vesicularis 1 Dịch phế quản (1) HSTC-CĐ (1) Escherichia coli inactive 2 Mủ (2) HSTC-CĐ (1), PT-GM (1) Edwardsiella tarda biogroup 1 3 Mủ (3) Ngoại (2), sản (1) Klebsiella pneumoniae 2 Dịch phế quản (2) HSTC-CĐ (1), PT-GM (1) Klebsiella terrigena 4 Dịch phế quản (2), mủ (1), dịch khác (1) HSTC-CĐ (1), nội (1), sản (1), cấp cứu (1) Serratia mascescens biogroup 1 1 Dịch phế quản (1) Nội (1) Vibrio carchariae 2 Mủ (2) Ngoại (2) Vibrio vulnificus 6 Dịch phế quản (1), mủ (2), nước tiểu (1), phân (1), dịch khác (1) Nội (5), sản (1) HSTC-CĐ: hồi sức tích cực – chống độc PT- GM: phẫu thuật – gây mê Kết quả thực nghiệm cho thấy vi khuẩn Gram âm chưa xác định được chủ yếu là cầu trực khuẩn Acinetobacter baumannii (chiếm 30,8%). Để định danh 16 mẫu A. baumannii, chúng tôi đã kết hợp quan sát hình thái khóm vi khuẩn, nhuộm Gram, các phản ứng sinh hóa trong bộ kit IDS14GNR và các thử nghiệm bổ sung theo hướng dẫn của Bergey. Các thử nghiệm này bao gồm khả năng phát triển ở nhiệt độ cao, khả năng huyết giải và thủy giải gelatin. Tất cả 16 mẫu cầu trực khuẩn đều tăng trưởng được ở 3 nhiệt độ 37 oC, 41 oC và 44 oC; với thử nghiệm sử dụng glucose sinh acid cho kết quả dương tính; thủy giải gelatin và huyết giải đều âm tính. Ngoài A. baumannii, một số vi khuẩn Gram âm khác cũng đã được xác định, gồm có Enterobacteriaceae (chiếm tỉ lệ 23,1%); Vibrio spp. (15,4%); trực khuẩn Pseudomonas spp. (7,6%); Burkholderia cepacia (3,8%). Tuy nhiên, vẫn còn tồn tại 10 mẫu vi khuẩn chưa định danh được (chiếm 19,2%) do kết quả phản ứng sinh hóa không đặc trưng cho một loài vi khuẩn. A B C D Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram một số vi khuẩn định danh A – A. baumanii; B – B. cepacia; C – K. terrigena; D – V. carchariae Kết quả khảo sát kháng sinh đồ. Thử nghiệm kháng sinh đồ được thực hiện trên 42 vi khuẩn đã định danh với 5 loại kháng sinh lựa chọn là amikacin, ciprofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, ceftazidim, cefepim (Bảng 2). Do số lượng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 275 mẫu khảo sát chưa nhiều nên chưa thể đưa ra nhận định chung về hiện trạng đề kháng kháng sinh của những vi khuẩn này ở bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Dương. Tuy nhiên, nhận xét kết quả thu được cho thấy tỷ lệ đề kháng cao của A. baumannii với các kháng sinh thử nghiệm (≥ 50%), đây là những kháng sinh phổ rộng, thuộc nhiều nhóm khác nhau và sử dụng phổ biến trong điều trị. Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae vẫn còn nhạy cảm với ceftazidim và cefepim, tuy nhiên một số chủng thuộc nhóm này đã đề kháng với akamicin, ciprofloxacin và amoxicillin/clavulanic acid. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. hầu như đề kháng với ciprofloxacin (7/8 mẫu). Các vi khuẩn Pseudomonas spp. và B. cepacia vẫn nhạy với ceftazidim và cefepim. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với một số nghiên cứu gần đây về tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm thường gặp trong lâm sàng(4,5,6,7,3). Bảng 2: Kết quả kháng sinh đồ của các vi khuẩn Gram âm định danh. Vi khuẩn Số chủng thử nghiệm Số chủng đề kháng AK CP AC CZ CM Acinetobacter baumannii 16 9 14 14 14 8 Burkholderia cepacia 2 - - - 0 0 Pseudomonas aeruginosa 2 1 1 - 0 0 Pseudomonas spp. 2 0 1 - 0 0 Escherichia coli inactive 2 0 0 0 0 0 Edwardsiella tarda biogroup 1 3 0 0 1 0 0 Klebsiella pneumoniae 2 2 2 2 1 1 Klebsiella terrigena 4 1 1 1 1 1 Serratia mascescens biogroup 1 1 1 1 1 0 0 Vibrio spp. 8 0 7 2 1 1 Tổng số vi khuẩn 42 AK: AmiKacin, CP: CiProfloxacin, AC: Amoxicillin/Clavulanic acid, CZ: CeftaZidim, CM: CefepiM, “-“: Không thực hiện BÀN LUẬN Trong các mẫu bệnh phẩm khảo sát, chiếm đa số các mẫu lấy từ dịch phế quản (60,4%), từ khoa Hồi sức tích cực – chống độc (50,9%) và bệnh nhân trên 65 tuổi (48,1%). Kết hợp các yếu tố mẫu bệnh phẩm (dịch phế quản), khoa điều trị (Hồi sức tích cực – chống độc) và đối tượng bệnh nhân cao tuổi, là cơ sở để chúng tôi nghi ngờ những bệnh nhân nhiễm trực khuẩn Gram âm (Acinetobacter spp., Pseudomonas spp.,) là những trường hợp viêm phổi do nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt trên bệnh nhân thở máy. Kết quả này phù hợp với các báo cáo tại Việt Nam cũng như trên thế giới(4,5,7,3,8). Đề tài góp phần khẳng định các trực khuẩn Gram âm tìm thấy trong mẫu bệnh phẩm là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện hiện nay. Đặc biệt, A. baumannii hiện diện ở 38,7% mẫu dịch phế quản, 42,3% mẫu thu được từ khoa Hồi sức tích cực – chống độc và 40% ở bệnh nhân ≥ 65 tuổi. Đáng chú ý là trường hợp mẫu máu của một bệnh nhân sơ sinh đã phân lập được A. baumannii, đây có thể là dấu hiệu của nhiễm trùng sơ sinh, bắt nguồn từ nhiễm trùng bệnh viện do dụng cụ sử dụng trong sản khoa bị nhiễm khuẩn. Bên cạnh đó, các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae cũng chiếm tỷ lệ không nhỏ (23,08%) trong số mẫu khảo sát. Dựa trên số liệu thu được cho thấy vi khuẩn họ Enterobacteriaceae phân bố rải rác khắp các khoa phòng và cũng như giữa các độ tuổi, không tập trung như trường hợp A. baumannii. Ngoài ra, với 10 mẫu vi khuẩn chưa định danh được do kết quả phản ứng sinh hóa không đặc trưng làm chúng tôi nghi ngờ có hiện tượng chuyển gen ngang. Khác với chuyển gen theo chiều dọc – là hiện tượng chuyển gen từ bố mẹ sang con cái, từ các sinh vật cùng chi – chuyển gen ngang là một hình thức trao đổi gen độc lập với quá trình sinh sản và có thể xảy ra giữa các loài khác nhau. Nhiều vi khuẩn khác nhau tồn tại trong các bệnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 276 lý nhiễm khuẩn là điều kiện thuận lợi để chuyển gen ngang có thể xảy ra, gây hậu quả thay đổi kiểu gen, và dẫn đến làm thay đổi một số tính chất sinh hóa. Đối với những trường hợp này, chúng tôi đề xuất định danh bằng phương pháp áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rARN. Các trình tự này sẽ được tra cứu với ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechology Information) để xác định vi khuẩn. Trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng, ngoài một số khó khăn do nguyên nhân khách quan như đã đề cập, thì kinh nghiệm và thao tác kỹ thuật của kỹ thuật viên có ảnh hưởng quan trọng đến kết quả định danh. Ví dụ, giai đoạn quan sát kính hiển vi có thể nhầm lẫn giữa hình dạng cầu trực khuẩn Gram âm và cầu khuẩn Gram âm hay song cầu khuẩn Gram âm và dẫn đến bỏ qua quy trình định danh trực khuẩn Gram âm bằng bộ kit IDS14GNR. Bên cạnh đó, quá trình thuần chủng các vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quyết định đến kết luận định danh dựa trên phản ứng sinh hóa. Trong nghiên cứu này, khi phân lập trên môi trường NA và MCA, chúng tôi phát hiện một mẫu có 2 loại khóm vi khuẩn, tương ứng với 2 hình dạng tế bào vi khuẩn khác nhau là cầu trực khuẩn và trực khuẩn. Hiện tượng này xảy ra có thể do quá trình phân lập đã chưa tách được các vi khuẩn khác nhau có trong mẫu nên không thể biện giải kết quả thử nghiệm sinh hóa khi tiến hành định danh bằng bộ kit IDS14GNR tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Dương. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tình trạng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, đặc biệt đối với vi khuẩn Gram âm. Vì vậy cần cân nhắc lựa chọn phác đồ điều trị kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn có ti lệ đề kháng kháng sinh cao như A. baumannii, P. aeruginosa, nhằm góp phần kiểm soát tình trạng đề kháng kháng sinh trong nhiễm trùng bệnh viện. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Clinical Laboratory Standards Institute (2011), Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 21st informational supplement, CLSI M100-S21 (ISBN 1-56238-742- 1). 2. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, William ST (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed., William & Wilkin, Baltimore. 3. Jones SL, Nguyen VK, Nguyen TMP, Athan E (2006), “Prevalence of multiresistant Gram-negative organisms in a surgical hospital in Ho Chi Minh City, Vietnam”, Tropical Medicine and International Health, 11 (11):1725–1730. 4. Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục. 5. Nguyễn Văn Kính và Nhóm nghiên cứu quốc gia GARP-Việt Nam (NWG) (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam, Bệnh viện nhiệt đới trung ương. 6. Nguyễn Văn Thanh (2006), Vi sinh học, Bộ Y tế. 7. Peleg AY and Hooper DC (2010), “Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria”, N Engl J Med 362 (19):1804-1813. 8. WHO (2002), Prevention of hospital-acquired infections: A practical guide, 2nd ed., Malta (WHO/CDS/CSR/EPH/2002.12). Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014