Nghiên cứu Acyl hóa Rutin với xúc tác Lipase

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 283 NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE Vũ Thanh Thảo*, Huyền Tôn Nữ Quỳnh Hương*, Trần Thị Yến Chi*, Nguyễn Thị Kim Uyên*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu Rutin là một flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa... Tuy nhiên, ứng dụng của nó còn bị giới hạn nhiều, do độ tan và độ ổn định kém trong cả pha dầu và pha nước. Do đó, việc acyl hóa rutin sẽ cải thiện tính tan của nó trong pha dầu. Mục tiêu: Tối ưu hóa điều kiện của phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác enzym lipase từ Candida Phương pháp: Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng như: dung môi và loại enzym (enzym tự do và enzym cố định). Sau đó, tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl gồm tỉ lệ cơ chất, tỉ lệ enzym và thời gian phản ứng theo phương pháp bề mặt đáp ứng. Bên cạnh đó, ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của các acid béo (từ C6 đến C18) đến phản ứng acyl hóa rutin cũng được khảo sát. Hiệu suất chuyển đổi thành rutin ester được xác định bằng HPLC. Kết quả: Điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin trong tert-butanol là enzym lipase cố định 5 g/l, tỷ lệ rutin:acid béo (1:2), thời gian phản ứng (4,52 ngày). Đối với acid lauric, acid palmitic và acid stearic có hiệu suất chuyển đổi cao nhất lần lượt là 75,8%, 71,08% và 71,13%, tương ứng. Trong đó, so với các acid béo bão hòa (C18: 0), acid béo không bão hòa (C18: 1) có hiệu suất chuyển đổi thấp hơn. Kết luận: Xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase với hiệu suất chuyển đổi của phản ứng tăng 1,67 lần so với trước khi tối ưu. Từ khóa: rutin, rutin ester, acyl hóa, lipase. ABTRACT ACYLATION OF RUTIN BY LIPASE AS BIOCATALYST Vu Thanh Thao, Huyen Ton Nu Quynh Huong, Tran Thi Yen Chi, Nguyen Thi Kim Uyen, Tran Cat Dong* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 283 - 288 Introduction: Rutin, a flavonoid, has many biological properties such as blood vessel protection, antioxidation. However, the use of rutin was strongly limited due to their low solubility and stability in both lipophilic and aqueous media. The acylation of this molecule can improve it’s lipophilic properties. Objectives: To optimize the acylation conditions of rutin with lipase from Candida as biocatalyst. Methods: Initial investigation the reaction conditions such as: solvents and types of enzyme (free or immobization enzyme) were determined. Then, reaction parameters to acylation reaction consist of subtrate ratio, enzyme ratio and reaction time were optimized using response surface methodology. Besides, the effects of carbon- chain length of the fatty acids (C6 to C18) on the rutin acylation performance were investigated. The convertion yield of rutin ester were measured by HPLC. Results: The optimum conditions of acylation reaction in tert-butanol solvent with immobilized lipase were identified as followed the ratio of rutin and fatty acid is 1:2, the reaction time is 4.52 days, and quantity of enzymes is 5g/L. For lauric acid, palmitic acid and stearic acid, the conversion yields were 75.8%, 71.08% and ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Vũ Thanh Thảo ĐT: 0985353384 Email: vuthanhthao@uphcm.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 284 71.13%, respectively. Herein, compared to the saturated fatty acid (C18:0), the unsaturated one (C18: 1) exhibited a lower reactivity. Conclusions: Optimum conditions of acylation reaction of rutin the by lipase as biocatalyst were identified, with the convertion yield of acylaton reation was 1,67 -fold increased after optimization. Keywords: rutin, rutin ester, acylation, lipase. MỞ ĐẦU Rutin là một flavonoid dạng glycosid bao gồm aglycol là quercetin và một đường đôi rutinose (rhamnose và glucose). Rutin được sử dụng rộng rãi để làm thuốc với mục đích chống lão hóa tế bào, phòng và trị một số bệnh liên quan đến mạch máu . Tuy nhiên, ứng dụng của rutin trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm đang bị giới hạn, bởi độ ổn định và độ tan kém của nó trong cả pha dầu và pha nước(9). Vì vậy, hiện đang có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc của rutin (acyl hóa hoặc glycosyl hóa), bằng các phương pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học (enzym) nhằm tăng độ ổn định và độ tan của rutin. Trong bào chế dược phẩm, glycosyl hóa flavonoid sẽ khiến chúng tăng tính thân nước, thích hợp để điều chế các chế phẩm đường tiêm. Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa của flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn(4,6,7). Các phương pháp tổng hợp hóa học hay sinh học để tổng hợp các dẫn xuất trên cũng đã được nghiên cứu nhiều. Trong đó, phương pháp tổng hợp bằng con đường xúc tác sinh học (enzym) cho thấy có nhiều ưu điểm và thích hợp hơn bởi phản ứng enzym có tính đặc hiệu cao. Một số nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố như cấu trúc mạch acyl, khung flavonoid, nguồn gốc enzym, bản chất dung môi hay hàm lượng nước trong môi trường ... có ảnh hưởng khá mạnh đến phản ứng acyl hóa flavonoid bằng enzym(1,4). Bên cạnh đó, các nghiên cứu cho thấy việc acyl hóa rutin sẽ tăng khả năng chống oxi hóa của rutin. Vì vậy, trong báo cáo này chúng tôi nghiên cứu các điều kiện acyl hóa rutin với xúc tác lipase để cải thiện tính tan của rutin. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Rutin (BV Pharma, Việt Nam) được làm nguyên liệu tổng hợp; rutin hydrat (≥ 94%, Sigma) được dùng làm chất chuẩn. Các acid béo có chiều dài mạch carbon từ C6 đến C18 được mua từ Sigma. Enzym lipase cố định có nguồn gốc từ Candida antarctica với hoạt tính 10000 U/g và lipase tự do có nguồn gốc từ Candida rugosa (Sigma). Các dung môi aceton, tert-butanol, acetonitril và hạt rây phân tử 3A (Merck). Phản ứng acyl hóa Rutin (15 mM) (C27H30O16) và acid béo được cho vào chai Duran có chứa sẵn 20 ml dung môi khan (bằng 100 g/l hạt rây phân tử 3A trong 3 – 5 ngày). Thêm 100 g/l hạt rây phân tử 3A đã hoạt hóa (150oC trong 24 giờ) để điều chỉnh phản ứng theo hướng ester hóa. Phản ứng bắt đầu khi cho 1 – 5 g/l enzym lipase vào bình phản ứng. Phản ứng tiến hành ở 50oC, 200 vòng/phút, trong 3 đến 5 ngày(5,10). Sau phản ứng, lọc với áp suất giảm hỗn hợp sau phản ứng và rửa sản phẩm bằng tert-butanol. Thu hồi hạt rây phân tử và enzym để tái sử dụng. Dịch lọc đem đi cô để loại hết dung môi thu cắn. Cắn được đem đi chiết tách rutin ester và xác định hiệu suất chuyển đổi. Hình 2: Phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase Chiết tách sản phẩm Trong cắn của dịch lọc sau phản ứng ngoài sản phẩm rutin ester, còn có rutin dư, acid béo dư. Tiến hành loại acid béo dư bằng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 285 heptan:nước (4:1 tt/tt) khoảng 3 – 4 lần, votex mạnh, ly tâm 9600 vòng/phút trong 5 phút và loại bỏ lớp heptan (acid béo nằm trong lớp heptan). Sau đó loại rutin dư với ethyl acetat:nước (1:5 tt/tt) ở 60oC. Ly tâm thu lớp ethyl acetat chứa rutin ester và loại bỏ lớp nước (rutin dư nằm trong lớp nước). Cô quay lớp etyl acetat để loại hết dung môi, thu sản phẩm. Sau đó, đem sản phẩm đi phân tích định tính, định lượng(10). Định tính rutin ester với sắc ký lớp mỏng Tiến hành định tính sản phẩm thu bằng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng silica gel GF 254 tráng sẵn của Merck với hệ dung môi EtOAc/HCOOH/CHCl3 (3:3:1), phát hiện dưới UV 254 nm. Định lượng rutin ester bằng phương pháp HPLC Cột Europher RP 18 (150 x 4,6mm, 5µm), đầu dò UV-Vis, thể tích bơm mẫu 20µl, tốc độ dòng 1ml/phút. Pha động methanol (A) và nước (B): 0 phút (A:B 10:90); 10 phút (60:40); 16 phút (100:0); 25 phút (60:40); 26 phút (10:90). Bước sóng phát hiện là 280 nm. Hàm lượng rutin và rutin ester trong sản phẩm được tính toán dựa vào đường chuẩn rutin(8). Hiệu suất chuyển đổi của phản ứng acyl hóa rutin được tính theo công thức sau: H(%)=ne/nrx100 với : số mol sản phẩm rutin ester, : số mol rutin ban đầu. Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng acyl hóa Khảo sát 2 loại enzym: lipase cố định từ Candida antarctica, lipase tự do từ Candida rugosa Đồng thời khảo sát 3 loại dung môi: acetonitril, aceton, tert-butanol(8). Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Thử nghiệm được tiến hành với 3 yếu tố khảo sát là tỷ lệ cơ chất, thời gian phản ứng và lượng enzym; mỗi yếu tố 3 cấp độ theo thiết kế của Box-Wilson Central Composite Design (CCD). Tổng cộng có tất 15 thí nghiệm. Thí nghiệm thứ 13 - 15 là thử nghiệm trung tâm được lập lại 3 lần để xác định mức độ sai số của mô hình đáp ứng. Sau đó sử dụng phần mềm Design Expert 7.1 (DX 7.1) để tìm ra mô hình thực nghiệm thích hợp. Thông số đầu ra của thử nghiệm là hiệu suất chuyển đổi của phản ứng. Khảo sát ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của acid béo đến hiệu suất phản ứng acyl hóa Thử nghiệm được tiến hành ở điều kiện tối ưu đã khảo sát, tuy nhiên, với các acid béo khác nhau: Acid caproic (C6), acid caprylic (C8), acid capric (C10), acid lauric (C12), acid myristic (C14), acid palmitic (C16), acid stearic (C18), acid oleic (C18:1) của Sigma(4). KẾT QUẢ Điều kiện sơ bộ của phản ứng acyl hóa Trong thử nghiệm này chúng tôi cố định các thông số phản ứng như sau: tỷ lệ rutin : acid béo (1:2), thời gian phản ứng (3 ngày), lượng enzym (3 g/l) và dùng acid palmitic để acyl hóa rutin(1,3). Bảng 1: Kết quả khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của dung môi và loại enzym Dung môi Enzym tự do Enzym cố định Acetonitril 22% 34% Aceton 28% 40% Tert-butanol 31% 47% Dựa vào bảng kết quả trên thì enzym tự do cho hiệu suất thấp hơn enzym cố định trong cả 3 dung môi khảo sát (Bảng 2). Đồng thời, tert- butanol là dung môi cho hiệu suất cao nhất (47%) (Hình 1-A). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kontogianni cho thấy 2 dung môi aceton và tert-butanol cho hiệu suất phản ứng acyl hóa flavonoid cao(8). Trong khi đó, Nakajima lại cho rằng acetonitril và aceton là những dung môi thích hợp cho phản ứng ester hóa của enzym lipase (2). Tuy nhiên, aceton là dung môi có những đặc tính bất lợi cho phản ứng như khả năng bay hơi cao, độc và dễ cháy; Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 286 acetonitril hòa tan cơ chất (rutin) kém hơn nhiều so với tert-butanol. Khảo sát loại enzym (tự do hoặc cố định), kết quả cho thấy lipase tự do cho hiệu suất phản ứng thấp hơn, đồng thời chi phí cũng cao hơn enzym cố định do không thể thu hồi để tái sử dụng. Nhiều nghiên cứu gần đây về phản ứng acyl hóa các flavonoid cũng đã sử dụng enzym xúc tác là lipase cố định. Đặc biệt, Novozym 435 là lipase cố định có nguồn gốc từ Candida antarctica hiện được sử dụng khá rộng rãi trên thị trường. Như vậy, chúng tôi chọn dung môi tert-butanol và enzym cố định cho những thử nghiệm tiếp theo. Hình 3: Sắc ký đồ HPLC của rutin và sản phẩm sau phản ứng acyl hóa rutin bằng enzym A. Rutin nguyên liệu, B. Sản phẩm phản ứng trong tert-butanol chưa tối ưu, C. Sản phẩm phản ứng trong tert-butanol tối ưu, D. Sản phẩm phản ứng trong tert-butanol tối ưu sau khi chiết tách. Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Thí nghiệm được tiến hành theo thiết kế Box Behnken với 15 thử nghiệm như Bảng 3. Bảng 2: Kết quả thí nghiệm theo phương pháp RSM Số TN Tỷ lệ cơ chất (rutin/acid béo) Thời gian phản ứng (ngày) Lượng enzym (g/L) Hiệu suất phản ứng (%) 1 1:2 3 3 45,79 2 1:4 3 3 33,88 3 1:2 5 3 47,66 Số TN Tỷ lệ cơ chất (rutin/acid béo) Thời gian phản ứng (ngày) Lượng enzym (g/L) Hiệu suất phản ứng (%) 4 1:4 5 3 36,34 5 1:2 4 1 44,31 6 1:4 4 1 29,62 7 1:2 4 5 77,07 8 1:4 4 5 69,07 9 1:3 3 1 30,41 10 1:3 5 1 34,63 11 1:3 3 5 47,67 12 1:3 5 5 62,94 13 1:3 4 3 41,18 14 1:3 4 3 38,65 15 1:3 4 3 41,75 Dựa vào phần mềm cho thấy các dữ liệu về hiệu suất của phản ứng acyl hóa rutin phù hợp với mô hình bậc hai (Quadratic model) với hệ số tương quan của mô hình là R2 = 0,96 nghĩa là các đáp ứng tương ứng sẽ được mô hình tính toán với độ chính xác là 96%. Giá trị P (p-value) của đáp ứng là 0,0069 < 0,05, như vậy mô hình trên có ý nghĩa thống kê và tương thích với thực nghiệm. Sau khi loại trừ các hệ số hồi qui không có ý nghĩa (p-value > 0,05) suy ra được phương trình hồi qui của đáp ứng như sau: Hiệu suất phản ứng (%) = 40,52 – 5,74X1 + 14,72X3 + 8,75X32, với X1, X2, X3 là các biến số đại diện lần lượt cho các yếu tố tỷ lệ cơ chất, thời gian phản ứng, lượng enzym. Từ phương trình hồi qui cho thấy, yếu tố tỷ lệ cơ chất có hệ số hồi qui là -5,74 (p-value = 0,0221) nên có ảnh hưởng bậc 1 bất lợi đến hiệu suất phản ứng. Trong khi đó, yếu tố lượng enzym thì vừa có ảnh hưởng bậc 1 vừa có ảnh hưởng bậc 2 tích cực lên sự tổng hợp rutin ester nghĩa là khi lượng enzym ở mức cao trong khoảng khảo sát thì hiệu suất phản ứng sẽ có xu hướng tăng. Hơn thế nữa, hệ số hồi qui của X3 là 14,72 lớn hơn nhiều so với 2 biến số còn lại. Suy ra yếu tố lượng enzym là Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 287 yếu tố ảnh hưởng chính lên quá trình acyl hóa rutin. Hiệu suất phản ứng tăng từ 29 đến 77% khi lượng enzym tăng từ 1 đến 5 g/l. Mặt khác, chúng tôi cũng đã tiến hành các thử nghiệm với lượng enzym là 7 g/l và 10 g/l, thu được hiệu suất phản ứng lần lượt là 79% và 81%. Như vậy, khi tăng lượng enzym ra ngoài khoảng khảo sát thì hiệu suất phản ứng tăng nhưng không đáng kể. Vì vậy, lượng enzym thích hợp để hiệu suất phản ứng đạt tối đa nhưng vẫn có lợi về mặt kinh tế là 5 g/l. Hàm mục tiêu trong thử nghiệm này là hiệu suất phản ứng cao nhất. Điều kiện này được xác định trong phần dự đoán điểm của phần mềm như sau: tỷ lệ cơ chất là 1:2, thời gian phản ứng là 4,52 ngày, lượng enzym là 5 g/l. Với các giá trị tối ưu này, hiệu suất phản ứng được dự đoán là 75,26%. Công thức dự đoán tối ưu này được đánh giá bằng cách lặp lại 3 lần thu được hiệu suất chuyển đổi là 76,5% với độ chính xác 98,37%. Như vậy mô hình có tính tương thích với thực nghiệm cao. Ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của acid béo đến phản ứng acyl hóa Dựa vào kết quả được biểu diễn trong Hình 3, phản ứng giữa acid lauric và rutin cho hiệu suất cao nhất (75,8%), phản ứng của acid palmitic và stearic cho hiệu suất lớn hơn 70%. Bên cạnh đó, hiệu suất phản ứng của acid oleic (69,38%) khác biệt không đáng kể so với acid stearic (71,13%). Các acid béo còn lại có hiệu suất hơn các acid béo được nêu trên và tăng dần theo thứ tự : C6 < C14 < C8 < C10. Kết quả này khác với nghiên cứu của Kontogianni cho rằng chiều dài mạch carbon (C8, C10, C12) không ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng acyl hóa các flavonoid (rutin, naringin) bằng Novozym 435®(8). Tuy nhiên, Ardhaoui lại cho rằng hiệu suất phản ứng có bị ảnh hưởng bởi chiều dài mạch carbon của acid béo và hiệu suất thấp ở những acid béo mạch ngắn (<C10)(3). C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 C18:1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 Chie àu da øi ma ïch carbon cu ûa acid be ùo H ie äu s ua át ph aû n öù ng ( % ) Hình 4: Ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của acid béo đến phản ứng acyl hóa Sau khi thực hiện phản ứng acyl hóa rutin, chúng tôi đã tiến hành xác định cấu trúc của một sản phẩm rutin ester là rutin palmitat (phổ UV, MS, 1H NMR, 13C NMR) để khẳng định tính đặc hiệu của phản ứng acyl hóa với xúc tác lipase. Kết quả xác định cấu trúc cho thấy enzym lipase xúc tác phản ứng acyl hóa của rutin đặc hiệu vào vi trí C4”’ trên đường rhamnose. O O O O HO OH OH OH OH OH HO O O CH3 OH OH OCO C15H31 Chemical Formula: C43H60O17 Exact Mass: 848,3831 ông thức: C43H60O17 Hình 4: Công thức hóa học của rutin palmitate (Phần mền ChemDraw ultra V9) KẾT LUẬN Tóm lại, điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin: tỷ lệ cơ chất rutin:acid béo là 1: 2, thời gian phản ứng là 4,52 ngày, lượng enzym là 5 g/l. Hiệu suất chuyển đổi tối ưu là 75,26%. Kết quả sau khi tối ưu làm tăng hiệu suất phản ứng 1,67 lần so với trước khi tối ưu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ardhaoui M, Falcimaigne A et al. (2004). Acylation of natural flavonoids using lipase of candida antarctica as biocatalyst. Molecular Catalysis, 29:63-67. 2. Nakajima N, Ishihara K et al. (1999). Lipase-catalyzed direct and regioselective acylation of flavonoid glucoside for mechanistic investigation of stable plant pigments. J Biosci Bioeng, 87(1):105-107. 3. Ardhaoui M, Falcimaigne A et al. (2004). Effect of acyl donor chain length and substitutions pattern on the enzymatic acylation of flavonoids. J Biotechnol, 110(3):265-271. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 288 4. Chebil L, Humeau C et al. (2006). Enzymatic acylation of flavonoids. Process Biochemistry, 41:2237–2251. 5. Duan Y, Du Z et al. (2006). Effect of molecular sieves on lipase- catalyzed esterification of rutin with stearic acid. J Agric Food Chem, 54(17):6219-6225. 6. Gao C, Mayon P et al. (2000). Novel enzymatic approach to the synthesis of flavonoid glycosides and their esters. Biotechnol Bioeng, 71(3):235-243. 7. Havsteen BH. (2002). The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol Ther, 96(2-3):67-202. 8. Kontogianni A, Skouridou V et al. (2003). Lipase-catalyzed esterification of rutin and naringin with fatty acids of medium carbon chain. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 21(1–2):59-62. 9. Lue BM, Nielsen NS et al. (2010). Antioxidant properties of modified rutin esters by DPPH, reducing power, iron chelation and human low density lipoprotein assays. Food Chemistry, 123(2):221-230. 10. Lue BM, Guo Z et al. (2010). Scalable preparation of high purity rutin fatty acid esters. Journal of the American Oil Chemists' Society, 87(1):55-61. Ngày nhận bài báo 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014