Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng vi nhân giống cây hông (paulownia fortunei hemsl.)

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 29, 2005 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG VI NHÂN GIỐNG CÂY HÔNG (Paulownia fortunei Hemsl.) Nguyễn Hữu Thuần Anh Hoàng Văn Hạnh, Trương Thị Bích Phượng Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây hông (Paulownia fortunei Hemsl.) là loại cây gỗ lâm nghiệp và có nhiều giá trị kinh tế cao. Do có nhiều ưu điểm, cây hông đã được đưa vào chương trình trồng rừng [1, 4]. Hông có thể được nhân giống từ hạt hoặc từ đoạn rễ, tuy nhiên với phương pháp này thường cho hiệu quả không cao [1, 5, 6]. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu về giống và áp dụng những tiến bộ công nghệ sinh học vào chương trình trồng 5 triệu ha rừng, việc đưa cây hông vào nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật là hết sức cần thiết [2, 3]. Xuất phát từ những cơ sở như trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là cây hông (Paulownia fortunei Hemsl.) Các bước tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị và khử trùng mẫu; nuôi cấy ban đầu (cấy gây); nhân chồi; tái sinh chồi từ callus, cuống lá, phiến lá; tạo rễ và cây hoàn chỉnh; thu và xử lý số liệu. Điều kiện nuôi cấy: mẫu vật được nuôi cấy trong các chai thủy tinh đặt trong phòng nuôi có nhiệt độ 25-270C, cường độ ánh sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nuôi cấy ban đầu (cấy gây) 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Các đỉnh sinh trưởng và đoạn thân của cây hông sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng là BAP nồng độ từ 1,0-4,0 mg/l. Sau 5 tuần nuôi cấy thu được kết quả như sau: 63 Bảng 1: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi BAP (mg/l) Số mẫu cấy Số mô sống sót Số chồi tạo thành Số chồi/mô Số lá trung bình/chồi 1,0 31 20,00 ± 0,33 17,00 ± 0,88 0,85± 0,03 2,00 ± 0,33 1,5 30 21,00 ± 0,33 20,00 ± 0,33 0,95± 0,03 2,00 ± 0,33 2,0 30 26,00 ± 1,45 104,00 ± 0,88 4,00 ± 0,20 6,00 ± 0,58 2,5 26 18,00 ± 0,88 59,00 ± 0,33 3,28 ± 0,14 4,00 ± 1,20 3,0 27 20,00 ± 1,15 30,00 ± 0,58 1,50 ± 0,12 4,00 ± 0,88 4,0 25 18,00 ± 0,33 28,00 ± 0,88 1,56 ± 0,08 4,00 ± 0,58 Môi trường có nồng độ BAP 2,0 mg/l, chồi tái sinh sinh trưởng tốt nhất, ngoài ra còn có sự tạo thành callus ở mức trung bình; hệ số nhân chồi giai đoạn cấy gây cao nhất, đạt trung bình 4,00 ± 0,20 chồi/mô. Chồi tạo thành sinh trưởng tốt, số lá trung bình khoảng 6 lá/chồiï, lá phát triển tốt. Chiều cao trung bình của chồi tạo thành đạt khoảng 6 ± 0,58 cm, cao hơn nhiều so với các chồi được cấy gây trên môi trường bổ sung nồng độ BAP khác. Các công thức môi trường còn lại kích tạo callus mạnh hơn tạo chồi. 3.1.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi: Các đỉnh sinh trưởng và đoạn thân của cây hông sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP nồng độ 2,0 mg/l và NAA từ 0,0-0,2 mg/l. Kết quả thu được sau 5 tuần nuôi cấy như sau: Tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA Môi trường có bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 5,68 chồi/mô. Cùng với quá trình tạo chồi có quá trình tạo callus, tuy nhiên callus phát triển kém. Số lá trung bình/chồi nhiều nhất, đạt 8 lá /chồi, chiều dài trung bình của chồi tạo thành khoảng 7 cm. Môi trường có bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA là môi trường thích hợp để nuôi cấy ban đầu mô hông. Bảng 2: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi Chất KTST Số mẫu cấy Số mô tạo chồi Số chồi tạo thành Hệ số nhân chồi Số lá trung bình/chồi BAP (mg/l) NAA (mg/l) ĐST ĐTL 2,0 0,0 4 26 26,00 ± 1,20 104,00 ± 0,88 4,00 ± 0,15 6,00 ± 0,88 2,0 0,1 4 22 22,00 ± 0,58 125,00 ± 0,88 5,68 ± 0,17 8,00 ± 0,58 2,0 0,2 6 18 18,00 ± 0,67 38,00 ± 1,33 2,11± 0,07 6,00 ± 1,53 Ghi chú: ĐST: đỉnh sinh trưởng; ĐTL: đoạn thân có mắt lá 3.2. Nhân chồi : Ảnh hưởng của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi Đỉnh sinh trưởng và đoạn thân in vitro được cấy trên môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP nồng độ từ 2,0-7,0 mg/l và NAA từ 0,1-0,2 mg/l. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy như sau: Ở các môi trường có bổ sung NAA với nồng độ 0,2 mg/l kích thích quá trình tạo rễ của mô nuôi cấy. Trong khi đó bổ sung 0,1 mg/l NAA không có quá trình tạo rễ ở mô nuôi cấy. Môi trường CPX5 là môi trường thích hợp để nhân chồi. Hệ số nhân chồi của môi trường này cao nhất, đạt 5,76 ± 0,15 chồi/mô. Lá phát triển tốt, trung bình đạt 8 ± 0,67 lá/chồi. Chiều dài trung bình của chồi tạo thành khoảng 7 cm. Nhân chồi trên môi trường MS bổ sung 5,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA Trên môi trường CPX5 và CPX7, ngoài chồi còn có sự tạo thành của callus ở gốc mẫu cấy. Callus có màu xanh và rắn, một số có màu trắng ngà, xốp. Sau 4 tuần nuôi cấy, trên tất cả các callus này chúng tôi quan sát thấy có sự xuất hiện các chồi mới. Số chồi trung bình hình thành trên một khối callus ở môi trường CPX7 (5 chồi/mô) nhiều hơn so với ở môi trường CPX5 (3 chồi/mô). Bảng 3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi Môi trường Chất KTST Số mẫu cấy Số mô tạo chồi Số chồi tạo thành Hệ số nhân chồi Số lá trung bình/chồi BAP (mg/l) NAA (mg/l) CPX1 2,0 0,1 43 42,00 ± 0,88 152,00 ± 1,15 3,62 ± 0,06 6,00 ± 0,58 CPX2 2,0 0,2 22 22,00 ± 0,58 32,00 ± 1,20 1,45± 0,06 4,00 ± 0,88 CPX3 3,0 0,1 26 25,00 ± 0,33 33,00 ± 0,33 1,32 ± 0,02 4,00 ± 0,58 CPX4 3,0 0,2 23 22,00 ± 1,53 26,00 ± 0,67 1,18 ± 0,10 4,00 ± 1,20 CPX5 5,0 0,1 51 50,00 ± 1,20 288,00 ± 0,88 5,76 ± 0,15 8,00 ± 0,67 CPX6 5,0 0,2 20 18,00 ± 0,33 65,00 ± 0,88 3,60 ± 0,03 6,00 ± 0,88 CPX7 7,0 0,1 36 32,00 ± 1,15 159,00 ± 0,58 4,97 ± 0,17 6,00 ± 0,88 CPX8 7,0 0,2 20 18,00 ± 0,67 59,00 ± 0,88 3,28 ± 0,17 4,00 ± 0,33 3.3. Tái sinh chồi từ cuống lá và phiến lá Sử dụng các mảnh cắt phiến lá (1cm x 1cm) và cuống lá (1cm) in vitro cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS, bổ sung BAP từ 5,0-10,0 mg/l và 0,1 mg/l NAA. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy như sau: Bảng 4. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ phiến lá và cuống lá Chất KTST Khả năng phân hóa phiến lá Khả năng phân hóa cuống lá BAP (mg/l) NAA (mg/l) Chồi Callus Rễ Chồi Callus Rễ 5,0 0,1 - + - - + - 7,0 0,1 - ++ - + ++ - 10,0 0,1 + +++ - ++++ +++ - Sau 1 tuần cấy các mảnh cấy cong lên chứng tỏ có sự phản ứng với môi trường. Sau 2-3 tuần nuôi cấy xuất hiện callus. Sau 4 tuần nuôi cấy, môi trường có bổ sung 10,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA cho khả năng tái sinh chồi từ phiến lá tốt nhất, chồi phát triển tốt, chồi cao nhất đạt khoảng 6 cm tuy nhiên kích thước lá nhỏ, lá màu xanh nhạt. Đối với cuống lá, chỉ có môi trường bổ sung 10,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA kích thích tạo chồi, chồi có kích thước rất nhỏ (đạt chiều cao khoảng 0,5-1,0 cm) và phát triển kém. Tái sinh chồi từ phiến lá trên môi trường bổ sung 10,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA 3.4. Tạo cây hoàn chỉnh Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Chồi in vitro được cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản có bổ sung NAA nồng độ từ 0,1-1,0 mg/l. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy như sau: Bảng 5: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ NAA (mg/l) Số mẫu cấy Số chồi tạo rễ Số rễ/cây Chiều cao cây (cm) Số lá trung bình/cây 0,1 20 20 4,00 ± 0,33 6,00 ± 0,58 6,00 ± 0,33 0,3 20 20 5,00 ± 0,33 6,00 ± 0,33 8,00 ± 0, 67 0,5 20 20 12,00 ± 0,58 15,00 ± 0,88 10,00 ± 0,67 0,7 20 20 12,00 ± 0,33 10,00 ± 0,58 10,00 ± 0,33 1,0 20 20 15,00 ± 0,67 10,00 ± 0,33 10,00 ± 0,33 Nồng độ NAA từ 0,1-1,0 mg/l đều có sự hình thành rễ và khoảng 20% tổng số mẫu cấy có hiện tượng đẻ nhánh, hình thành chồi mới từ nách lá với số lượng khoảng 1 chồi nách/cây. Ở công thức môi trường có 1,0 mg/l NAA, chiều cao cây đạt 10 cm, lá có kích thước lớn, màu xanh đậm, đường kính thân lớn nhất so với các công thức môi trường còn lại. Rễ phát triển tốt với số lượng rễ nhiều (trung bình 15 rễ/cây), chiều dài rễ khoảng 10-12 cm. Như vậy, môi trường bổ sung 1,0 mg/l NAA cho kết quả tạo rễ tốt nhất. IV. KẾT LUẬN Tạo rễ và cây hoàn chỉnh trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l NAA 1. Môi trường cơ bản MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA là môi trường thích hợp để nuôi cấy ban đầu mô cây hông cho hệ số nhân chồi đạt 5,68 chồi/mô. 2. Môi trường cơ bản MS bổ sung 5,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA theo thí nghiệm của chúng tôi là môi trường thích hợp để nhân chồi in vitro, cho hệ số nhân chồi đạt 5,76 chồi/mô. 3. Môi trường cơ bản MS bổ sung 10,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ phiến lá. 4. Môi trường cơ bản bổ sung 1,0 mg/l NAA thích hợp cho tạo rễ và cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro. TÀI LIỆU THAM KHẢO Thái Xuân Du, Đoàn Thị Aïi Thuyền, Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Thị Quỳnh, Bùi Minh Trí. Sổ tay trồng trọt và chăm sóc cây Paulownia. Phòng công nghệ tế bào thực vật. Viện sinh học nhiệt đới, thành phố Hồ Chí Minh. (1999). Nguyễn Hoàng Lộc. Giáo trình thực hành nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Huế (1994). Nguyễn Hoàng Lộc. Giáo trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Huế (1998). Trịnh Hiền Mai. Cây gỗ hông, nguyên liệu để sản xuất bột giấy và giấy. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 4: (2003) 483-484. Burger DW., Liu L., Wu L.. Rapid Micropropagation of Paulownia tomentosa. Hort Science, Vol.20 (1985) 760-761. Marcotrigiano M., Stimart DP. In vitro organogenesis and shoot proliferation of Paulownia tomemtosa Steud. (empress tree). Plant Science Letters 31 (1983) 303-310. TÓM TẮT Hông là một trong những cây thân gỗ có nhiều giá trị, đã được đưa vào chương trình trồng rừng của Nhà nước. Nghiên cứu nhân nhanh cây hông bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là phương pháp hữu hiệu và được ưu tiên sử dụng hiện nay, nhằm cung cấp những cây giống đồng đều với số lượng lớn trong thời gian ngắn. Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh mô cây hông trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Nguyên liệu sử dụng là các đoạn thân có mắt lá, đỉnh sinh trưởng, mảnh lá và callus. Qua nghiên cứu, chúng tôi đã tìm ra mô trường nuôi cấy với nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thích hợp, cho khả năng tái sinh và nhân chồi với hệ số nhân chồi khá lớn, bước đầu tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro. THE EFFECT OF CONCENTRATIONS OF PLANT GROWTH REGULATORS ON MICROPROPAGATION OF PAULOWNIA (PAULOWNIA FORTUNEI HEMSL.) BY TISSUE CULTURE Nguyen Huu Thuan Anh Hoang Van Hanh, Truong Thi Bich Phuong College of Sciences, Hue University SUMMARY Paulownia (Paulownia fortunei Hemsl.) is one of the valuable wood trees, which has been included in the government’s afforestation programme. In vitro propagation of this tree is the most efficient and preferable method providing a large number of homologous seed-bearing plants in a short time. The project studies the effect of various plant growth regulators on tissue regeneration capability of Paulownia in vitro condition. The materials are segments of trunk containing punctum vegetationis, body segment, petiole and lamina. We are successful in finding the optimal concentrations of the plant growth regulator in culture media which give comparatively high ratio of tissue regeneration and shoot propagation.