Nghiên cứu các phương pháp phân tích đánh giá rutin trong nụ hoè

ph¸p quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn dïng c¸c bøc x¹ ®iÖn tõ trong vïng tö ngo¹i gÇn (200 - 400nm) vµ trong vïng kh¶ kiÕn (400 - 800nm). II.2.2. M¸y quang phæ hÊp thô [9] HiÖn t¹i c¸c m¸y quang phæ hÊp thô trong vïng tö ngo¹i gÇn vµ nh×n thÊy (kÝ hiÖu lµ UV – VIS ), ®­îc thiÕt kÕ lµm viÖc trong vïng 200 - 1500nm. ë miÒn bøc x¹ nhá h¬n 200nm m¸y lµm viÖc khã kh¨n, ph¶i lµm viÖc trong ch©n kh«ng nªn Ýt sö dông. §Ó lµm viÖc ë vïng tõ 200 - 1500nm trong m¸y thiÕt kÕ hai nguån ph¸t bøc x¹. Khi lµm viÖc ë b­íc sãng cã <350nm, ng­êi ta dïng ®Ìn ph¸t x¹ lµ c¸c lo¹i hå quang ®iÖn trong mét sè bÇu khÝ nh­: hydro, ®¬t¬ri, xenon, h¬i thuû ng©n. Trong ®ã hå quang qua khÝ ®¬t¬ri lµ phæ biÕn nhÊt. Bé t¸n s¾c th­êng dïng lµ lo¹i c¸ch tö nhiÔu x¹ víi hµng sè c¸ch tö 1200 v¹ch/mm. Bé ghi bøc x¹ cã thÓ lµ c¸c tÕ bµo quang ®iÖn ghÐp nèi víi bé khuÕch ®¹i vµ bé vi xö lý nªn m¸y ®o cã ®é nh¹y rÊt cao vµ cã thÓ ghi theo chÕ ®é gi¸n ®o¹n hoÆc ghi liªn tôc theo chÕ ®é tù ®éng. Ngµy nay, m¸y quang phæ hÊp thô th­êng ®­îc kÕt nèi víi m¸y tÝnh vµ cã phÇn mÒm hç trî. Trªn h×nh 2 lµ s¬ ®å nguyªn lý ho¹t ®éng cña m¸y quang phæ. A P M C S H×nh 2 – S¬ ®å nguyªn lý ho¹t ®éng cña m¸y quang phæ tö ngo¹i ¸nh s¸ng tõ nguån A ®­îc ph©n t¸ch bëi l¨ng kÝnh P, råi héi tô trªn g­¬ng M, g­¬ng nµy tô tiªu phæ cña nguån ph¸t vµo mÆt ph¼ng khe hë S. Ng­êi ta cho chïm s¸ng ®i qua dung m«i hoÆc dung dÞch vµ ®o c­êng ®é cña nã nhê tÕ bµo quang ®iÖn hoÆc nh©n quang ®iÖn tö C. II.2.3. øng dông ph­¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn Ph­¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn ®­îc ¸p dông ®Ó ®Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt vµ ®Þnh l­îng c¸c chÊt cã cÊu t¹o ®Æc biÖt nh­: c¸c hîp chÊt th¬m, hîp chÊt cã chøa c¸c liªn kÕt ch­a b·o hoµ, c¸c hîp chÊt mµu... * §Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt: §Þnh tÝnh mét chÊt b»ng phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn cña chÊt ®ã. Phæ hÊp thô lµ ®å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc cña ®é hÊp thô vµo b­íc sãng. ThiÕt lËp phæ hÊp thô b»ng c¸ch ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é x¸c ®Þnh víi c¸c bøc x¹ cã b­íc sãng t¨ng hoÆc gi¶m dÇn. Sau ®ã, vÏ ®å thÞ ®é hÊp thô/b­íc sãng, ta sÏ cã mét phæ hÊp thô. Trªn phæ hÊp thô sÏ nhËn thÊy c¸c cùc ®¹i hÊp thô ( øng víi b­íc sãng t¹i ®ã sù hÊp thô lµ cùc ®¹i) vµ c¸c cùc tiÓu nÕu cã. C¸c chÊt kh¸c nhau th­êng cã phæ hÊp thô kh¸c nhau. Do ®ã ng­êi ta th­êng dïng phæ hÊp thô ®Ó ®Þnh tÝnh hoÆc ®Ó thö tinh khiÕt c¸c chÊt, c¨n cø vµo d¹ng phæ, c¸c cùc ®¹i vµ cùc tiÓu hÊp thô, tû lÖ c­êng ®é hÊp thô cña c¸c cùc ®¹i hoÆc cùc tiÓu hÊp thô. * §Þnh l­îng: Ta ®Þnh l­îng mét chÊt b»ng c¸ch ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch ë b­íc sãng x¸c ®Þnh, th­êng lµ ë b­íc sãng hÊp thô cùc ®¹i () cña nã. Nång ®é cña dung dÞch ®­îc tÝnh theo c«ng thøc (3). §Ó gi¶m sai sè cña ph­¬ng ph¸p, nªn chän nång ®é vµ chiÒu dµy líp dung dÞch sao cho ®é hÊp thô ®o ®­îc trong kho¶ng 0,2-0,7 vµ cµng gÇn gi¸ trÞ 0,43 cµng tèt. §Ó tÝnh hÖ sè hÊp thô k, ta ®o ®é hÊp thô cña c¸c dung dÞch cã nång ®é ®· biÕt råi tÝnh theo c«ng thøc: (4) NÕu nång ®é ®­îc tÝnh b»ng mol/lÝt vµ chiÒu dµy tÝnh b»ng cm, th× hÖ sè ®ã ®­îc gäi lµ hÖ sè hÊp thô ph©n tö gam vµ kÝ hiÖu lµ ä. NÕu nång ®é biÓu thÞ b»ng sè gam trong 100ml vµ chiÒu dµy líp dung dÞch ®o b»ng cm th× hÖ sè ®ã ®­îc gäi lµ hÖ sè hÊp thô riªng vµ kÝ hiÖu lµ E(1%, 1cm). Khi kh«ng biÕt hÖ sè k, ä hoÆc E(1%, 1cm) cña chÊt cÇn ®Þnh l­îng hoÆc khi m¸y kh«ng chuÈn ho¸ ®­îc, ta ph¶i dïng ®­êng cong chuÈn, “mËt ®é quang/nång ®é ” nh­ trong ph­¬ng ph¸p ®o quang. II.2.4. Nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn Nh­ ta ®· biÕt, rutin lµ mét hîp chÊt th¬m víi nhiÒu liªn kÕt ch­a b·o hoµ trong ph©n tö. CÊu t¹o cña nã rÊt thÝch hîp ®Ó ¸p dông ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn ®Ó nghiªn cøu vµ ph©n tÝch. Khi ®Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt ta ®em so s¸nh víi phæ cña rutin chuÈn, khi ®Þnh l­îng ta dùa vµo ®é hÊt thô cña rutin ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. 1-Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh [3] Phæ hÊp thô tö ngo¹i cña dung dÞch rutin (trong cån methanol hoÆc dung dÞch cån etanol – axit acetic) cã c¸c cùc ®¹i ë 259 ± 1 nm vµ 362,5 ± 1 nm. C¸ch tiÕn hµnh ®­îc nªu ë phÇn ph©n tÝch ®Þnh l­îng d­íi ®©y. 2-Ph©n tÝch ®Þnh l­îng [3] a. §Þnh l­îng rutin dïng dung m«i methanol *Pha dung dÞch rutin chuÈn: C©n 50mg rutin chuÈn ®· ®­îc sÊy kh« tr­íc (trong ch©n kh«ng) tíi khèi l­îng kh«ng ®æi ë 1200C, vµo mét b×nh ®Þnh møc 10ml. Hoµ tan b»ng methanol ®Õn ®ñ thÓ tÝch, l¾c ®Òu. LÊy 1ml dung dÞch nµy cho vµo mét b×nh ®Þnh møc 10ml, thªm n­íc tíi ®ñ thÓ tÝch, l¾c kü. Dung dÞch rutin thu d­îc cã nång ®é 0,5mg/ml. *X©y dùng ®­êng chuÈn: LÊy chÝnh x¸c 0,50; 1,0 vµ 1,50ml dung dÞch chuÈn ë trªn vµo c¸c b×nh ®Þnh møc 10ml riªng biÖt, thªm methanol tíi ®ñ thÓ tÝch vµ l¾c ®Òu. TiÕn hµnh ph­¬ng ph¸p quang phæ, ®o ®é hÊp thô ë 362,5nm. §­êng chuÈn thu ®­îc do m¸y tÝnh tù ®éng vÏ, lÊy ®é hÊp thô lµm tung ®é, nång ®é lµm hoµnh ®é. *TiÕn hµnh: C©n 5g bét nô hoÌ ®· d­îc sÊy kh« ë 600C trong 6 giê, cho vµ dông cô chiÕt sohxlet. Thªm 250ml methanol vµ chiÕt tíi khi dÞch chiÕt kh«ng mµu. DÞch chiÕt ®­îc cÊt quay ch©n kh«ng thu håi dung m«i, cßn l¹i kÕt tña sÊy kh« 600C ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi vµ c©n. C©n 50mg kÕt tña ®· sÊy ë trªn vµ riÕn hµnh pha nh­ ë phÇn “dung dÞch rutin chuÈn”. Sau ®ã lÊy 1ml dung dÞch võa pha vµo b×nh ®Þnh møc 10ml, thªm methanol ®Õn ®ñ thÓ tÝch vµ l¾c ®Òu. TiÕn hµnh ph­¬ng ph¸p quang phæ nh­ ë phÇn “x©y dùng ®­êng chuÈn”, m¸y tÝnh sÏ tù ®éng hiÓn thÞ kÕt qu¶ nång ®é, khèi l­îng rutin trong dung dÞch mÉu thö. Tõ kÕt qu¶ thu ®­îc tÝnh to¸n ra hµm l­îng rutin trong nô hoÌ: (5) Trong ®ã: m: khèi l­îng rutin trong 10ml dung dÞch mÉu thö (mg) n: khèi l­îng kÕt tña thu ®­îc (g) b. §Þnh l­îng rutin dïng dung m«i ethanol [3] C©n 75mg rutin chuÈn cho vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, hoµ tan víi ethanol tuyÖt ®èi b»ng ®un nãng. Sau ®ã thªm ethanol cho ®ñ thÓ tÝch vµ l¾c ®Òu. LÊy 2ml dung dÞch nµy cho vµo mét b×nh ®Þnh møc 100ml, thªm 1ml dung dÞch axÝt acetic 0,02N, sau thªm ethanol cho ®Õn v¹ch vµ l¾c ®Òu. X¸c ®Þnh ®é hÊp thô cña dung dÞch thu ®­îc ë c¸c b­íc sãng 362,5nm vµ 375nm, dïng mÉu tr¾ng lµ dung dÞch ethanol tuyÖt ®èi cã 1% axÝt acetic 0,02N. NÕu tû sè ®é hÊp thô A375/A362,5 ë trong kho¶ng 0,875 ± 0,004 th× quang phæ kÕ thÝch hîp ®Ó ®o ®é hÊp thô cña mÉu ®Þnh l­îng. NÕu tû sè A375/A362,5 n»m ngoµi kho¶ng trªn th× ta ph¶i t×m b­íc sãng x sao cho: x lµ vïng l©n cËn cña b­íc sãng 375nm vµ tû sè Ax/A362,5 ë trong kho¶ng trªn. B­íc sãng x t×m ®­îc sÏ thay thÕ cho b­íc sãng 375nm. * §o mÉu thö: C©n 75mg mÉu thö ®· sÊy kh« vµ tiÕn hµnh pha nh­ víi rutin chuÈn ë trªn. X¸c ®Þnh ®é hÊp thô cña dung dÞch mÉu thö ë c¸c b­íc sãng 362,5nm vµ 375nm (hoÆc xnm), mÉu tr¾ng dïng nh­ víi rutin chuÈn ë trªn. Gäi ®é hÊp thô ®o ®­îc cña mÉu thö ë 362,5nm lµ vµ ë 375nm (hay xnm) lµ . NÕu tû sè ë trong kho¶ng 0,875 ± 0,004, hµm l­îng phÇn tr¨m C27H30O16 trong mÉu thö ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau: (6) Trong ®ã: 325,5 lµ A(1%,1cm) cña rutin ë 362,5nm p: khèi l­îng mÉu thö tÝnh b»ng g. NÕu tû sè > 0,879, hµm l­îng phÇn tr¨m C27H30O16 trong mÉu thö ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: (7) Trong ®ã: p: Khèi l­îng mÉu thö tÝnh b»ng g. II.3. Ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch s¾c ký S¾c ký lµ ph­¬ng ph¸p ph©n t¸ch, ph©n ly, ph©n tÝch c¸c chÊt dùa vµo sù ph©n bè kh¸c nhau cña chóng gi÷a hai pha ®éng vµ tÜnh. S¾c ký lµ qu¸ tr×nh t¸ch tõng vi ph©n hçn hîp c¸c chÊt do sù ph©n bè kh«ng ®ång ®Òu cña chóng gi÷a pha tÜnh vµ pha ®éng khi cho pha ®éng ®i xuyªn qua pha tÜnh [9,10]. Nguyªn t¾c chung cña ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch s¾c ký nh­ sau: Hçn hîp chøa chÊt ph©n tÝch th­êng ë pha ®éng, c¸c chÊt kh¸c nhau trong hçn hîp sÏ cã ¸i lùc kh¸c nhau víi pha ®éng vµ pha tÜnh. Trong qu¸ tr×nh chuyÓn ®éng cña hçn hîp ph©n tÝch qua c¸c líp pha tÜnh, sÏ lÆp ®i lÆp l¹i qu¸ tr×nh hÊp phô – ph¶n hÊp phô. HÖ qu¶ lµ c¸c chÊt cã ¸i lùc lín víi pha tÜnh sÏ chuyÓn ®éng chËm h¬n so víi c¸c chÊt t­¬ng t¸c yÕu h¬n víi pha tÜnh. Nhê ®Æc ®iÓm nµy, ng­êi ta cã thÓ t¸ch c¸c chÊt b»ng qu¸ tr×nh s¾c ký [9]. II.3.1. Ph©n lo¹i s¾c ký Tuú thuéc vµo tr¹ng th¸i tËp hîp cña c¸c pha, lo¹i t­¬ng t¸c vµ sù h×nh thµnh s¾c ký mµ ng­êi ta ph©n biÖt c¸c lo¹i s¾c ký nh­ tr×nh bµy ë b¶ng 1. B¶ng 1 - C¸c d¹ng s¾c ký c¬ b¶n D¹ng s¾c ký Pha ®éng Pha tÜnh C¸ch ph©n bè pha tÜnh C¬ chÕ trao ®æi chÊt KhÝ KhÝ – hÊp phô KhÝ - láng Láng Láng – r¾n Láng – láng Láng – nhùa trao ®æi Líp máng GiÊy R©y ( s¾c ký gel ) khÝ khÝ láng láng láng láng láng láng láng r¾n láng r¾n láng r¾n r¾n láng láng láng cét cét cét cét cét líp máng líp máng giÊy s¾c ký cét hÊp phô ph©n bè hÊp phô ph©n bè trao ®æi ion hÊp phô ph©n bè ph©n bè theo kÝch th­íc ph©n tö II.3.2. S¾c ký khÝ Trong s¾c ký khÝ (gas chromatography, viÕt t¾t GC) th× tuú thuéc vµo tr¹ng th¸i pha tÜnh mµ ng­êi ta ph©n biÖt: s¾c ký khÝ-hÊp phô khi pha tÜnh lµ chÊt hÊp phô r¾n, s¾c ký khÝ-láng khi pha tÜnh lµ chÊt láng (hay chÝnh x¸c h¬n lµ mµng chÊt láng trªn bÒ mÆt chÊt mang r¾n). Cét s¾c ký ®­îc chÕ t¹o b»ng èng thñy tinh, thÐp, ®ång hoÆc b»ng chÊt dÎo ®Æc biÖt, ®­êng kÝnh cét cã thÓ tõ 3 - 6mm, cã thÓ dµi tõ vµi chôc centimet ®Õn hµng chôc mÐt. Cét cã thÓ d¹ng th¼ng, h×nh ch÷ U hoÆc h×nh xo¾n. Tuú theo lo¹i s¾c ký khÝ mµ bªn trong cét th­êng nhåi c¸c chÊt hÊp phô r¾n hoÆc chÊt mang cã phñ mµng máng (pha tÜnh láng). Trong s¾c ký khÝ-hÊp phô, chÊt r¾n hÊp phô cã thÓ dïng: than ho¹t tÝnh kh«ng ph©n cùc, silicagel, zeolit... Trong s¾c ký khÝ-láng, th­êng dïng c¸c dung m«i sau lµm pha tÜnh: dÇu vaz¬lin, dÇu silicon, dimetylformamit, tricresyl photphat, c¸c alkyl phtalat..., ®Æc biÖt lµ c¸c tinh thÓ láng nh­ c¸c este azocxy. ChÊt mang r¾n th­êng lµ c¸c chÊt tr¬, th­êng dïng kizengua, diatomit, teflon... Pha ®éng lµ mét dßng chÊt khÝ chän tr­íc ®Ó t¶i chÊt nghiªn cøu ë thÓ khÝ qua cét, chÊt khÝ nµy gäi lµ khÝ mang. ViÖc chän khÝ mang dùa vµo lo¹i detect¬ dïng trong hÖ s¾c ký. Detect¬ lµ bé phËn ghi nhËn sù thay ®æi liªn tôc cña nång ®é hay c¸c tham sè kh¸c trong dßng khÝ tho¸t ra khái cét s¾c ký. VÝ dô: Khi dïng catoromet hoÆc detect¬ ngän löa ion ho¸ ng­êi ta hay dïng khÝ heli, nit¬ lµm khÝ mang vµ khi dïng detect¬ kiÓu b¾t ®iÖn tö (vÝ dô detect¬ argon) ng­êi ta dïng nit¬ lµm khÝ mang... Trªn h×nh 3 tr×nh bµy s¬ ®å khèi cña mét m¸y s¾c ký khÝ, bé phËn quan träng cña m¸y lµ hÖ thèng cét t¸ch vµ detect¬. Nhê khÝ mang chøa trong b×nh (1), mÉu nghiªn cøu tõ buång h¬i (2) ®­îc dÉn vµo cét t¸ch s¾c ký (3), cét s¾c ký ®­îc æn nhiÖt theo yªu cÇu cña phÐp ph©n tÝch nhê thiÕt bÞ æn nhiÖt (8). Qu¸ tr×nh t¸ch sÏ x¶y ra trªn cét s¾c ký. Sau khi c¸c cÊu tö rêi khái cét t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau, sÏ ®i vµo detect¬ (4), t¹i ®ã chóng ®­îc chuyÓn thµnh tÝn hiÖu ®iÖn. C¸c tÝn hiÖu sÏ ®­îc khuÕch ®¹i ë bé khuÕch ®¹i (5) vµ ®­îc xö lý nhê c¸c bé vi xö lý d­a ra c¸c sè liÖu trªn bé ghi (6). 9 8 7 MÉu 2 4 1 3 5 6 H×nh 3 – S¬ ®å khèi cña m¸y s¾c ký khÝ 1 – b×nh khÝ mang; 2 – bé n¹p khÝ; 3 – cét s¾c ký; 4 – detect¬; 5 – bé khuÕch ®¹i; 6 – bé ghi; 7, 8, 9 – æn nhiÖt. II.3.2.1. Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh b»ng s¾c ký khÝ H C D B A tA tB tC tD tr H×nh 4- S¾c ký ®å hçn hîp A, B, C, D. Trong qu¸ tr×nh s¾c ký ng­êi ta sÏ ghi ®­îc s¾c ký ®å. Tõ s¾c ký ®å ta sÏ nhËn ®­îc c¸c pic s¾c ký t­¬ng øng cña tõng cÊu tö. Thêi gian l­u (tr) cña pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh tÝnh cho c¸c chÊt. §Ó ph©n tÝch ®Þnh tÝnh, ta so s¸nh kÕt qu¶ thu ®­îc víi b¶ng sè liÖu hoÆc kÕt qu¶ cña mÉu chuÈn ®­îc tiÕn hµnh cïng ®iÒu kiÖn. §Ó cã ®­îc kÕt qu¶ chÝnh x¸c h¬n, ng­êi ta th­êng tiÕn hµnh s¾c ký theo nhiÒu cÊp, nghÜa lµ thµnh phÇn t¸ch ë cét s¾c ký tr­íc ®­îc ®­a sang cét s¾c ký tiÕp theo, ë ®©y viÖc t¸ch sÏ thùc hiÖn s©u xa h¬n. HiÖn nay, ng­êi ta ®· chÕ t¹o ®­îc thiÕt bÞ s¾c ký khÝ kÕt hîp khèi phæ (Gas chromatography mass spectrum, viÕt t¾t lµ GCMS) vµ ®­îc kÕt nèi víi m¸y tÝnh nhê ®ã n©ng cao ®­îc ®é nh¹y, ®é chÝnh x¸c còng nh­ cã thÓ tù ®éng ho¸ qu¸ tr×nh ph©n tÝch s¾c ký. II.3.2.2. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng b»ng s¾c ký khÝ Ph©n tÝch ®Þnh l­îng dùa vµo viÖc ®o c¸c tham sè kh¸c nhau cña pic s¾c ký nh­ chiÒu cao, diÖn tÝch, thêi gian l­u (hoÆc thÓ tÝch l­u) hoÆc tû sè gi÷a nã vµ chiÒu cao pic. C¸c ®¹i l­îng nµy vÒ nguyªn t¾c lµ tû lÖ víi nång ®é c¸c cÊu tö trong hçn hîp. C¸c ph­¬ng ph¸p s¾c ký khÝ ®Þnh l­îng chñ yÕu lµ: ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸, ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ theo sè hiÖu chØnh, ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn tuyÖt ®èi, ph­¬ng ph¸p néi chuÈn. ViÖc ¸p dông s¾c ký khÝ vµo ph©n tÝch ®Þnh l­îng rutin trong nô hoÌ nãi chung cßn khã kh¨n, nªn kh«ng ®i s©u vµo c¸c ph­¬ng ph¸p nµy. II.3.2.3. Nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký khÝ Ph­¬ng ph¸p s¾c ký khÝ ®­îc ¸p dông chñ yÕu ®Ó ph©n tÝch thµnh phÇn hçn hîp. V× vËy, ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông vµo ph©n tÝch thµnh phÇn nô hoÌ hoÆc lµ ®Þnh tÝnh rutin s¶n phÈm. C¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng b»ng s¾c ký khÝ nãi chung ®Òu lµ c¸c ph­¬ng ph¸p gÇn ®óng, h¬n n÷a rutin l¹i lµ chÊt r¾n nªn khã ¸p dông. b b lH xl xf a a a H×nh 5- X¸c ®Þnh Rf a-a: tuyÕn xuÊt ph¸t. b-b: tuyÕn dung m«i ë cuèi thÝ nghiÖm. ln II.3.3. S¾c ký líp máng VÒ b¶n chÊt, ®©y lµ hÖ s¾c ký láng-r¾n mµ pha tÜnh (pha r¾n) ®­îc tr¶i thµnh líp máng trªn b¶ng kÝnh, nhùa hay kim lo¹i. II.3.3.1 C¬ së ph­¬ng ph¸p TÝnh chÊt hÊp phô cña hÖ s¾c ký líp máng ®­îc ®Æc tr­ng b»ng ®é linh ®éng Rf Rf = xl/xf (8) Trong ®ã: xl: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng xuÊt ph¸t ®Õn t©m vÕt s¾c ký. xf: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng xuÊt ph¸t ®Õn møc dung m«i sau cïng so víi ®­êng xuÊt ph¸t. §óng ra Rf ph¶i ®­îc tÝnh b»ng tû sè gi÷a vËn tèc chuyÓn ®éng cña t©m vÕt s¾c ký víi vËn tèc cña dung m«i. Tuy nhiªn viÖc x¸c ®Þnh vËn tèc rÊt khã kh¨n nªn Rf ®­îc x¸c ®Þnh theo h×nh 5. Trªn lý thuyÕt th× Rf kh«ng phô thuéc vµo nång ®é vµ c¸c yÕu tè kh¸c. Tuy nhiªn, thùc nghiÖm chøng minh Rf kh«ng æn ®Þnh, nã phô thuéc vµo mét sè yÕu tè nh­: chÊt l­îng vµ ho¹t tÝnh cña chÊt hÊp phô, ®é Èm cña chÊt hÊp phô, chÊt l­îng cña dung m«i… Do ®ã trong thùc tÕ ng­êi ta th­êng dïng ®¹i l­îng t­¬ng ®èi Rftd: Rftd = Rf/Rfc = xl/xlc (9) Trong ®ã: Rfc: ®é linh ®éng cña chÊt chuÈn, tÝnh theo c«ng thøc (8). xlc: kho¶ng c¸ch tõ ®iÓm xuÊt ph¸t ®Õn t©m cña vÕt s¾c ký chÊt chuÈn. ChÊt chuÈn ®­îc hoµ tan trong cïng dung m«i víi chÊt nghiªn cøu vµ ®­îc nhá trªn ®­êng xuÊt ph¸t bªn c¹nh mÉu nghiªn cøu. Nh­ vËy, trong qu¸ tr×nh s¾c ký coi nh­ chÊt chuÈn vµ chÊt nghiªn cøu ®­îc thùc hiÖn trong cïng ®iÒu kiÖn. II.3.3.2. §Æc ®iÓm cña s¾c ký líp máng 1 – Líp máng §Ó tr¶i líp máng th­êng dïng c¸c b¶ng thñy tinh l¸ nh«m hoÆc mµng polyete. Cã lo¹i mµng trong suèt víi tö ngo¹i, cã ­u ®iÓm cã thÓ ®o quang trùc tiÕp nhiÒu hîp chÊt trong líp máng. ChÊt hÊp phô ®Ó tr¶i líp máng th­êng lµ bét silicagel, alumin (Al2O3), kizengua, bét xeluloz¬… 2 – Pha ®éng ViÖc chän dung m«i lµm pha ®éng phô thuéc vµo b¶n chÊt cña chÊt nghiªn cøu. Ng­êi ta cã thÓ dïng c¸c dung m«i ®¬n hoÆc c¸c hÖ dung m«i gåm hai hay ba thµnh phÇn víi tû lÖ thÝch hîp. C¸c dung m«i ®¬n th­êng dïng cã thÓ lµ: parafin cã nhiÖt ®é bay h¬i cao, xyclohexan, benzen, clorofom, ete, axetat etyl, r­îu etylic, dimetylformanit, dimetylsulnfoxit, n­íc. C¸c hçn hîp dung m«i hay dïng vµ tû lÖ thÓ tÝch lµ: benzen: axetat etyl (95: 5); clorofom: axeton (9: 1); benzen: methanol (95: 5); xyclohexan: axetat etyl (1: 1; 1: 4); benzen: axton (1: 1); hÖ ba cÊu tö: n-butanol: axit axetic: n­íc (4: 1: 5)... 3 – Mét sè ®Æc ®iÓm kh¸c Th«ng th­êng trong s¾c ký líp máng, ng­êi ta cho dung m«i thÊm trong líp máng cã chiÒu dµi 10 - 12cm, v× nÕu líp máng dµi h¬n vËn tèc chuyÓn ®éng cña dung m«i rÊt chËm, vÕt bÞ khuÕch t¸n réng vµ gi¸ trÞ Rf bÞ dao ®éng nhiÒu. Sau khi kÕt thóc qu¸ tr×nh s¾c ký th­êng ta ph¶i tiÕn hµnh viÖc hiÖn h×nh vÕt s¾c ký b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc hoÆc ho¸ lý. Khi hiÖn h×nh b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc, ng­êi ta phun lªn b¶ng máng mét dung dÞch thuèc thö cã thÓ t¸c dông víi c¸c cÊu tö cña hçn hîp thµnh hîp chÊt mµu cã thÓ nh× râ b»ng m¾t th­êng, vÝ dô h¬i iot cã thÓ hiÖn h×nh c¸c hîp chÊt kh«ng no. Trong ph­¬ng ph¸p ho¸ lý, ng­êi ta cã thÓ lîi dông hiÖn t­îng ph¸t quang víi c¸c tia tö ngo¹i, cã thÓ dïng mét chÊt chØ thÞ ph¸t quang t¸c dông ®­îc víi c¸c cÊu tö trong hçn hîp. Ngoµi ra, ng­êi ta cã thÓ nhËn d¹ng c¸c vÕt s¾c ký b»ng ph­¬ng ph¸p phãng x¹… II.3.3.3. Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh b»ng s¾c ký líp máng Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh b»ng s¾c ký líp máng ta so s¸nh gi¸ trÞ Rf hay gi¸ trÞ Rftd thu ®ùoc khi tiÕn hµnh s¾c ký ®ång thêi mÉu thö vµ mÉu chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn vµ trªn cïng mét b¶n máng s¾c ký. Hai chÊt (chÊt thö vµ chÊt chuÈn) ®ång nhÊt víi nhau khi Rf (hay Rftd) cña chóng b»ng nhau, hoÆc khi trén lÉn víi nhau, råi tiÕn hµnh s¾c ký, chóng triÓn khai nh­ chØ cã mét chÊt duy nhÊt. C¸c t¹p chÊt ®­îc ph¸t hiÖn khi xuÊt hiÖn trªn s¾c ký ®å c¸c vÕt phô cã Rf (hay Rftd) kh¸c Rf cña c¸c vÕt t­¬ng øng víi chÊt thö. C¸ch thö nµy ®«i khi cã trë ng¹i v× vÕt phô cã thÓ kh«ng hiÖn vÕt víi cïng thuèc thö hiÖn vÕt dïng cho mÉu thö. V× vËy mµ víi nh÷ng t¹p chÊt ®· biÕt ®­îc chØ ®Þnh cô thÓ nh÷ng ®iÒu kiÖn s¾c ký x¸c ®Þnh. Trong thùc tÕ th­êng dïng gi¸ trÞ Rftd v× nã æn ®Þnh h¬n Rf. §Ó cã kÕt qu¶ ®Þnh tÝnh ch¾c ch¾n, nªn tiÕn hµnh s¾c ký song song mÉu thö vµ mÉu chuÈn trªn cïng mét b¶n máng vµ dïng Ýt nhÊt ba hÖ dung m«i kh¸c nhau ®Ó triÓn khai. II.3.3.4. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng b»ng s¾c ký líp máng Ng­êi ta cã thÓ tiÕn hµnh ph©n tÝch ®Þnh l­îng c¸c chÊt b»ng s¾c ký líp máng theo ph­¬ng ph¸p ®o trùc tiÕp trªn b¶ng hoÆc xö lý b»ng c¸c biÖn ph¸p thÝch hîp ®Ó lÊy cÊu tö nghiªn cøu ra khái b¶ng. Khi x¸c ®Þnh trùc tiÕp c¸c cÊu tö theo vÕt s¾c ký trªn b¶ng, ng­êi ta ®o diÖn tÝch vÕt s¾c ký vµ t×m l­îng chÊt nghiªn cøu theo ®å thÞ chuÈn ®· lËp s½n. Nh­ng phÐp ph©n tÝch cho kÕt qu¶ chÝnh x¸c nhÊt vÉn lµ ph­¬ng ph¸p t¸ch c¸c chÊt ph©n tÝch ra khái b¶ng, viÖc t¸ch c¸c chÊt ra khái b¶ng cã thÓ thùc hiÖn b»ng c¬ häc hoÆc b»ng c¸ch röa víi dung m«i thÝch hîp. Sau ®ã tiÕn hµnh x¸c ®Þnh nång ®é c¸c chÊt trong dung dÞch röa b»ng c¸c biÖn ph¸p thÝch hîp. II.3.3.5. Nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký líp máng Ph­¬ng ph¸p s¾c ký líp máng cã ­u ®iÓm tiÕn hµnh nhanh, thao t¸c ®¬n gi¶n, cã ®é chän läc cao v× c¸c chÊt chØ cÇn kh¸c nhau rÊt Ýt vÒ cÊu tróc vµ cÊu h×nh còng cã thÓ t¸ch ra b»ng s¾c ký líp máng. V× vËy, ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc ¸p dông vµo ph©n tÝch hÇu hÕt c¸c hîp chÊt h÷u c¬, rutin kh«ng n»m ngoµi sè ®ã. §Æc biÖt, trong ph©n tÝch ®Þnh tÝnh th× ta dÔ dµng hiÖn mµu vÕt s¾c ký cña rutin b»ng h¬i amoni¨c ®Ëm ®Æc. Tuy vËy, viÖc ®Þnh l­îng rutin nãi riªng vµ c¸c hîp chÊt h÷u c¬ nãi chung b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký líp máng gÆp ®«i chót khã kh¨n v× ta ph¶i t×m dung dÞch ph¶n hÊp phô thÝch hîp, sau ®ã lµ t×m ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh nång ®é thÝch hîp víi tõng hîp chÊt. * C¸ch tiÕn hµnh ph©n tÝch ®Þnh tÝnh rutin trong nô hoÌ: C©n 0,5g bét nô hoÌ, thªm 10ml ethanol, ®un s«i trong 3 phót, ®Ó nguéi, läc. -B¶n máng: chÊt hÊp phô Silicagel G. -Dung dÞch rutin chuÈn: C©n 0,010g rutin hoµ tan trong 10 ml etanol 900, chÊm lªn b¶n máng. -DÞch chÊm s¾c ký: LÊy dung dÞch läc ë trªn vµ chÊm lªn b¶n máng. -HÖ dung m«i triÓn khai: n-butanol: axÝt acetic: n­íc (tû lÖ thÓ tÝch: 4: 1: 5). Sau khi ®· bay h¬i hÕt dung m«i, ®Æt tÊm s¾c ký d­íi ®Ìn tö ngo¹i sÏ thÊy dÞch chiÕt cã vÕt ph¸t quang mµu n©u gièng vÕt rutin chuÈn, ®em hiÖn mµu b»ng h¬i amoni¨c ®Ëm ®Æc sÏ thÊy cã vÕt mµu vµng cïng Rf chuÈn (Rf: 0,50 - 0,54). II.3.4. S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao hay s¾c ký láng cao ¸p (High Performance Liquid Chromatography, viÕt t¾t lµ: HPLC) lµ mét c¶i tiÕn cña s¾c ký láng d¹ng cét. Trong ph­¬ng ph¸p s¾c ký cæ ®iÓn, cét s¾c ký th­êng lµ nh÷ng èng thñy tinh ®­êng kÝnh 0,5 - 5cm vµ cã ®é dµi 20 - 100cm n¹p ®Çy chÊt hÊp phô vµ pha ®éng. Pha ®éng chuyÓn ®éng d­íi t¸c dông cña träng lùc. MÉu ph©n tÝch th­êng ®­îc ®­a vµo ë phÇn trªn cña cét. Ng­êi ta thu thËp dung dÞch tho¸t ra khái cét, trong tõng kho¶ng thêi gian x¸c ®Þnh, tiÕn hµnh ph©n tÝch nång ®é c¸c cÊu tö b»ng ph­¬ng ph¸p thÝch hîp. Nhê c¸c c¶i tiÕn vÒ thiÕt bÞ nh­: d¹ng cét, c¸ch n¹p mÉu, chÊt hÊp phô... ë “s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao” ta cã thÓ nhËn ®­îc kÕt qu¶ ph©n tÝch cã ®é nh¹y, ®é chän läc cao h¬n. 11 3 1 13 5 8 12 9 7 6 10 4 2 H×nh 6- S¬ ®å khèi thiÕt bÞ ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao 1,2: B×nh dung dÞch röa; 3,4: B¬m; 5: Bé ®iÒu khiÓn; 6: Buång hép; 7: èng phun; 8: Cét s¾c ký; 9: Detect¬; 10: Bé ghi; 11: Khèi xö lý kÕt qu¶ ph©n tÝch; 12: Bé thu s¶n phÈm; 13: æn nhiÖt. Trªn h×nh 6 lµ s¬ ®å m« t¶ thiÕt bÞ s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao [9]: hai m¸y b¬m (3,4) ®­îc ®iÒu khiÓn b»ng bé vi xö lý (5) theo mét ch­¬ng tr×nh chän tr­íc. Thµnh phÇn vµ tèc ®é n¹p dung dÞch vµo hÖ thèng s¾c ký ®­îc ®iÒu khiÓn theo chÕ ®é chän tr­íc theo ch­¬ng tr×nh (tuyÕn tÝnh, luü thõa hay bÊt kú mèi quan hÖ nµo kh¸c), tuú thuéc vµo ®iÒu kiÖn ph©n tÝch. §Ó t¨ng nhanh tèc ®é ph©n tÝch mÉu, ng­êi ta th­êng sö dông c¸c b¬m cã ¸p suÊt cao (®Õn 400 MPa). MÉu ®­îc ®­a trùc tiÕp vµo dßng dung dÞch röa nhê cÊu tróc phun ®¨c biÖt (7). Sau khi qua cét s¾c ký (8), c¸c chÊt ph©n tÝch ®­îc dß t×m b»ng mét detect¬ cã ®é nh¹y cao (9). TÝn hiÖu s¾c ký ®­îc ghi l¹i nhê mét cÊu tróc ghi th­êng lµ mét m¸y tÝnh c¸ nh©n (11). Khi cÇn thiÕt ng­êi ta cã thÓ thu thËp tõng phÇn dung dÞch tho¸t mét c¸ch tù ®éng theo yªu cÇu. II.3.4.1. §Æc ®iÓm cña s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao 1- Cét s¾c ký Trong s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao, cét s¾c ký th­êng ®­îc chÕ t¹o b»ng thÐp kh«ng gØ cã ®­êng kÝnh trong 2 - 6mm vµ dµi 10 - 25cm, mÆt trong ®¸nh bãng. Cét ®­îc n¹p c¸c chÊt hÊp phô cã kÝch th­íc h¹t kho¶ng 3 - 10µm vµ th­êng ë d¹ng h×nh cÇu. Cét lo¹i nµy cã kh¶ n¨ng t¸ch rÊt cao, gÊp hµng tr¨m lÇn lo¹i cét më b×nh th­êng. 2- Detect¬ Ng­êi ta th­êng dïng c¸c quang phæ kÕ ®o quang cã ®é nh¹y cao, nhê ®ã cã thÓ nhËn d¹ng c¸c hîp chÊt cã nång ®é cùc nhá ~10-10M trong miÒn ¸nh s¸ng tö ngo¹i ®Õn nh×n thÊy (190 - 800nm). 3- Pha tÜnh Pha tÜnh ®­îc dïng th­êng kh«ng hoµ tan víi pha ®éng, ph¶i bÒn c¬ häc vµ ho¸ häc trong ®iÒu kiÖn ph©n tÝch vµ ph¶i cã ®é chän läc ®ñ cao. Pha tÜnh cã thÓ ë d¹ng r¾n hoÆc láng. NÕu pha tÜnh ë d¹ng r¾n, ta cã s¾c ký láng-r¾n cßn, nÕu pha tÜnh ë d¹ng láng ta cã s¾c ký láng-láng. Pha tÜnh r¾n th­êng dïng lµ silicagel, nh«m oxyt hay mét sè chÊt hÊp phô biÕn tÝnh… Trong s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao,ng­êi ta th­êng dïng c¸c chÊt hÊp phô biÕn tÝnh dùa trªn c¬ së silicagel nh­: ®©y lµ nh÷ng chÊt hÊp phô cã tÝnh chän läc cao. Víi c¸c chÊt hÊp phô dùa trªn silicagel biÕn tÝnh, c©n b»ng hÊp phô – gi¶i hÊp phô thiÕt lËp nhanh h¬n silicagel th­êng. C¸c chÊt hÊp phô nµy th­êng lµ h¹t h×nh cÇu, cã kÝch th­íc dao ®éng trong kho¶ng hÑp (3 ± 0,5; 5 ± 1; 10 ± 1µm) vµ diÖn tÝch bÒ mÆt tõ 200 - 600m2/g. Trong c¸c chÊt hÊp phô biÕn tÝnh kÓ trªn th× c¸c chÊt hÊp phô biÕn tÝnh b»ng hydrocacbon m¹ch th¼ng (I), (II) vµ hydrocacbon m¹ch vßng (III) thuéc nhãm chÊt hÊp phô kh«ng ph©n cùc. C¸c chÊt lo¹i nµy cã ¸i lùc m¹nh víi c¸c hîp chÊt kþ n­íc. II.3.4.2. øng dông cña ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng d¹ng cét nãi chung th­êng ®­îc dïng ®Ó ph©n tÝch vµ ph©n t¸ch c¸c hîp chÊt h÷u c¬, vÝ dô: x¸c ®Þnh c¸c thµnh phÇn trong dÇu má, c¸c hydrocacbon, t¸ch c¸c ®ång ph©n cis-trans, ph©n tÝch c¸c hîp chÊt khã bay h¬i, c¸c hîp chÊt Ýt bÒn... Sù ra ®êi cña ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao cho phÐp t¨ng hiÖu qu¶ ph©n t¸ch lªn h»ng tr¨m lÇn, ®Æc biÖt víi c¸c hîp chÊt kh«ng ph©n cùc hoÆc Ýt ph©n cùc. II.3.4.3. Nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao cã ®é chän läc vµ chÝnh x¸c cao h¬n nhiÒu ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch kh¸c, do ®ã ®· cã rÊt nhiÒu t¸c gi¶ trªn thÕ giíi vµ trong n­íc ¸p dông ®Ó nghiªn cøu rutin. Khi ph©n tÝch ®Þnh tÝnh tiÕn hµnh so s¸nh mÉu nghiªn cøu víi mÉu chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn, cßn khi ph©n tÝch ®Þnh l­îng th× th­êng tiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn víi viÖc ®o chiÒu cao hoÆc diÖn tÝch cña pic s¾c ký. §Ó nghiªn cøu rutin trong nô hoÌ ta cÇn tiÕn hµnh nh÷ng c«ng viÖc sau: - Bét nô hoÌ, sau khi ®· ®­îc sÊy kh«, ®­îc chiÕt soxhlet víi methanol tuyÖt ®èi (hoÆc ethanol). DÞch chiÕt ®­îc ®em ®i lo¹i dung m«i b»ng cÊt quay ch©n kh«ng, kÕt tña ®­îc sÊy kh«, sau ®ã hoµ tan trong methanol. - X©y dùng ®­êng chuÈn: Pha c¸c dung dÞch chøa hµm l­îng rutin chuÈn thay ®æi (nÕu thay ®æi ®Òu th× cµng tèt, th«ng th­êng nång ®é rutin chuÈn dao ®éng trong kho¶ng 0,05 - 0,5µg/µl). TiÕn hµnh ph©n tÝch HPLC nhiÒu lÇn vµ tÝnh to¸n diÖn tÝch pic (hoÆc chiÒu cao pic), c¸c gi¸ trÞ trung b×nh cña chóng ®­îc biÓu diÔn b»ng ®å thÞ: diÖn tÝch pic (chiÒu cao pic)/nång ®é rutin. - Pha dung dÞch nghiªn cøu (sao cho nång ®é n»m trong kho¶ng thay ®æi cña nång ®é rutin chuÈn) víi dung m«i vµ c¸ch pha víi rutin chuÈn. TiÕn hµnh ph©n tÝch HPLC nhiÒu lÇn ®Ó lÊy gi¸ trÞ trung b×nh. Tõ gi¸ trÞ trung b×nh nµy, ta x¸c ®Þnh nång ®é rutin dùa vµo ®å thÞ ®· lËp ë trªn, sau ®ã tÝnh to¸n ra hµm l­îng rutin trong nô hoÌ. II.3.4.4. Mét sè thÝ nghiÖm ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao Nh­ ®· biÕt cã rÊt nhiÒu t¸c gi¶ ®· thùc hiÖn nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao, sau ®©y lµ mét sè trong nh÷ng thÝ nghiÖm ®ã: Trªn thÕ giíi, cã nhiÒu t¸c gi¶ ®· tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hµm l­îng rutin ®­îc t¸ch tõ m¹ch nha nh­ sau [12]: Detector: UV detector HPLC (Breeze 1525 Work station , Waters). B­íc sãng: 350nm. Cét: X- Terra (cét xo¾n X). Pha ®éng: dung m«i (axit axetic 2,4%/etanol/axetol/axetonitrit = 35/5/10 (v /v/v)): metanol = 70: 30. Tèc ®é dßng: 1,0ml/phót. ThÓ tÝch mÉu: 5ml. §Çu tiªn, mét dung dÞch rutin chuÈn (rutin chuÈn 100ppm +100% metanol) ®­îc cho vµo HPLC thu ®­îc ®­êng cong chuÈn. Dùa trªn nh÷ng kÕt qu¶ ph©n tÝch HPLC thu ®­îc tõ rutin chuÈn b»ng c¸ch sö dông ®­êng cong chuÈn theo nång ®é, hµm l­îng cña rutin chøa trong mÉu thö sÏ ®­îc x¸c ®Þnh. ë ViÖt Nam, nhiÒu t¸c gi¶ ®· nghiªn cøu ¸p dông s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ®Ó ph©n tÝch rutin trong nô hoÌ, sau ®©y lµ mét vÝ dô tham kh¶o [8]: ThiÕt bÞ HPLC: Merk & HITACHI víi b¬m: L – 600 Pump. Detect¬: L – 4000 UV Detect¬. B­íc sãng: 254nm. Pha ®éng: hçn hîp methanol/ axÝt acetic 0,4% (tû lÖ thÓ tÝch 60: 40). ThÓ tÝch b¬m mÉu: 20µl. Tèc ®é dßng: 1,0ml/phót. NhiÖt ®é: 20 - 230C. Dung dÞch chuÈn ®­îc pha chøa hµm l­îng rutin tõ 1,0 ®Õn 10,0µg/20µl. §­êng chuÈn thu ®­îc cã d¹ng: y = 3,669x – 1,336. Trong ®ã: y- lµ nång ®é rutin (µg/20µl); x- lµ 1/2 diÖn tÝch pic t­¬ng øng. 5g nô hoÌ chiÕt soxhlet víi ethanol 960 cho ®Õn khi nh¹t mµu. Lo¹i ethanol d­íi ¸p suÊt gi¶m vµ hoµ tan kÕt tña trong 5,0ml methanol. Läc dung dÞch lÊy phÇn dÞch läc, ®em ®i ph©n tÝch HPLC nhiÒu lÇn lÊy gi¸ trÞ trung b×nh. KÕt qu¶ t¸c gi¶ thu ®­îc khi ph©n tÝch ®Þnh l­îng rutin trong nô hoÌ lµ: 26,7%. III. C¸c ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu rutin III.1. C¸c tiªu chuÈn ®¸nh gi¸ [3] III.1.1 – MÊt khèi l­îng do lµm kh« MÊt khèi l­îng do lµm kh« lµ sù mÊt khèi l­îng ®­îc biÓu thÞ b»ng phÇn tr¨m khèi l­îng, khi lµm kh« mÉu thö trong nh÷ng ®iÒu kiÖn x¸c ®Þnh cña mçi thµnh phÈm. ViÖc x¸c ®Þnh mÊt khèi l­îng do lµm kh« nh»m biÕt râ l­îng n­íc, n­íc kÕt tinh vµ c¸c chÊt dÔ bay h¬i kh¸c trong mÉu thö. Cã thÓ x¸c ®Þnh mÊt khèi l­îng do lµm kh« b»ng nh÷ng c¸ch sau ®©y: SÊy trong tñ sÊy ë ¸p suÊt th­êng. SÊy ë ¸p suÊt gi¶m. Lµm kh« trong b×nh hót Èm víi nh÷ng chÊt hót n­íc m¹nh nh­ axÝt sulfuric ®Ëm ®Æc, phosphor pentoxyd, calci clorid khan... * C¸ch tiÕn hµnh: LÊy mét chÐn cã n¾p mµi ®em sÊy kh«, c©n x¸c ®Þnh khèi l­îng cña chÐn (tr­íc khi c©n ph¶i ®Ó nguéi trong b×nh hót Èm cã silicagel). C©n 0,2g mÉu thö cho vµo chÐn, dµn máng thµnh mét líp dµy kh«ng qu¸ 5mm, sÊy ë nhiÖt ®é 1250 ± 20C. NÕu mÉu thö bÞ ch¶y ë nhiÖt ®é thÊp h¬n 1250C th× tr­íc khi ®­a lªn nhiÖt ®é ®ã, cÇn duy tr× 1 - 2 giê ë nhiÖt ®é thÊp h¬n nhiÖt ®é thÊp h¬n nhiÖt ®é nãng ch¶y cña mÉu thö 5 - 100C. III.1.2. §é trong vµ mµu s¾c cña dung dÞch 1- MÉu thö rutin Hoµ tan 0,10g mÉu thö trong 5ml ethanol tuyÖt ®èi b»ng c¸ch ®un nãng dung dÞch thu ®­îc ph¶i trong vµ cã mµu vµng. Hßa tan 0,10g mÉu thö trong 5ml dung dÞch natri hydroxyd 2%, dung dÞch thu ®­îc ph¶i trong vµ cã mµu vµng da cam. 2- §é trong cña dung dÞch §é trong vµ ®é ®ôc cña c¸c dung dÞch ®­îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch so s¸nh c¸c dung dÞch ®ã víi c¸c dung dÞch mÉu chuÈn. *C¸ch ®¸nh gi¸ c¸c kÕt qu¶ ®é trong: Mét dung dÞch ®­îc coi nh­ trong nÕu nh­ nã t­¬ng øng víi ®é trong cña n­íc hay cña dung m«i ®· dïng trong nh÷ng ®iÒu kiÖn th­ nghiÖm ë trªn, hoÆc nÕu dung dÞch ®ã h¬i ®ôc rÊt nhÑ th× còng kh«ng ®­îc ®ôc qu¸ mÉu S1 ®· pha lo·ng gÊp 2 lÇn víi n­íc. C¸ch pha dung dÞch mÉu S1 nh­ sau: NaCl 4.10-4M NaCl 2.10-6M HNO3 10% N­íc AgNO3 0,1N 0ml 0,25ml 5,00ml 3,75ml 1,00ml 3- Mµu s¾c cña dung dÞch Mµu s¾c cña c¸c dung dÞch ®­îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch so s¸nh c¸c dung dÞch ®ã víi c¸c dung dÞch mµu mÉu, viÖc so s¸nh ®­îc tiÕn hµnh trong nh÷n èng thñy tinh ®¸y b»ng, kh«ng mµu, trong suèt, gièng hÖt nhau vµ cã ®­êng kÝnh kho¶ng 15 - 25mm. ChiÒu dµy cña dung dÞch ®em thö vµ dung dÞch mµu mÉu lÊy ®Ó so s¸nh lµ 40mm. Khi cã mµu, quan s¸t dung dÞch theo chiÒu dµi cña trôc èng, trong ¸nh s¸ng khuÕch t¸n, trªn nÒn tr¾ng. Dung dÞch ®em thö ph¶i kh«ng ®­îc thÉm mÇu h¬n dung dÞch mµu mÉu quy ®Þnh. C¸c dung dÞch mµu mÉu ®­îc pha chÕ tõ dung dÞch ®Çu vµ dung dÞch gèc mµu theo 4 ¸nh mµu kh¸c nhau lµ vµng, n©u, lôc vµ ®á. C¸ch pha chÕ dung dÞch gèc mµu vµng kh¸ phøc t¹p, v¶ l¹i dung dÞch mÉu rutin cho mµu vµng mµ m¾t th­êng còng nhËn biÕt ®­îc. Do ®ã, khi nghiªn cøu mµu s¾c cña dung dÞch rutin kh«ng cÇn thiÕt ph¶i pha dung dÞch mµu mÉu. III.1.3. DiÖp lôc vµ s¾c tè ®á TiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i, c¸ch tiÕn hµnh nh­ sau: Hoµ tan 0,20g chÕ phÈm trong 50ml isopropanol b»ng c¸ch ®un nãng. Läc nÕu cÇn. III.1.4. Tro Sulfat C©n chÝnh x¸c mét l­îng chÕ phÈm cho vµo mét chÐn nung b»ng sø hay b¹ch kim ®· ®­îc nung ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi (ë cïng nhiÖt ®é mµ chÊt thö cã tro). Nhá vµo chÐn 0,5 – 1ml axÝt sulfuric ®Ëm ®Æc, ®un nãng cÈn thËn trªn l­íi ami¨ng cho ®Õn khi kh«ng cßn h¬i axÝt bay lªn, chó ý theo vµ ®iÒu chØnh nhiÖt ®é ®Ó sao cho c¸c chÊt trong chÐn kh«ng bÞ trµo vµ dÝnh lªn miÖng chÐn. Sau khi ®èt, cho vµo lß nung vµ nung ë nhiÖt ®é kho¶ng 8000C trong 15 phót. LÊy chÐn ra ®Ó nguéi trong b×nh hót Èm (trªn Silicagel ®Ó gi÷ chÐn cho nguéi) råi c©n. Nung l¹i cho ®Õn khi thu ®­îc khèi l­îng kh«ng ®æi. III.1.5 – Kim lo¹i nÆng PhÐp thö giíi h¹n t¹p chÊt kim lo¹i nÆng nh»m x¸c ®Þnh hµm l­îng ion kim lo¹i nÆng biÓu thÞ b»ng sè microgam ch× trong 1g chÕ phÈm thö cã v­ît qu¸ giíi h¹n cho phÐp cña mçi thµnh phÈm hay kh«ng. Ph­¬ng ph¸p ¸p dông cho rutin nh­ sau: LÊy mét l­îng mÉu thö (kh«ng qu¸ 2g) cho vµo mét chÐn sø. Thªm 4ml dung dÞch magnesi sunfat 25% trong dung dÞch acid sunfuric 2N. Trén ®Òu b»ng mét ®òa thuû tinh nhá råi ®un nãng cÈn thËn. §èt dÇn dÇn ®Ó than ho¸, chó ý kh«ng ®Ó nhiÖt ®é cao qu¸ 8000C, tiÕp tôc ®èt cho ®Õn khi thu ®­îc c¾n mµu tr¾ng x¸m hay mµu x¸m nh¹t. §Ó nguéi, lµm Èm c¾n b»ng 0,2ml dung dÞch H2SO4 2N, lµm bèc h¬i råi ®èt l¹i, sau ®ã ®Ó nguéi. Toµn bé thêi gian ®èt vµ nung kh«ng nªn qu¸ 2 giê. Hßa tan c¾n, dïng hai lÇn mçi lÇn 5ml dung dÞch acid hydrocloric 2N. Thªm 0,1ml dung dÞch phenolphtalein, råi cho tõng giät amoniac ®Ëm ®Æc ®Õn khi cã mµu hång. Lµm nguéi, thªm acid acetic ®Õn khi mÊt mµu dung dÞch, råi thªm 0,5ml n÷a. Läc nÕu cÇn, råi pha lo·ng dung dÞch víi n­íc thµnh 20ml. LÊy 12ml dung dÞch thu ®­îc ë trªn cho vµo mét èng nghiÖm, thªm 2ml dung dÞch ®Öm acetat pH = 3,5 l¾c ®Òu. Thªm 1,2ml dung dÞch thioacetamid l¾c ®Òu, råi ®Ó yªn phót. So s¸nh mµu cña èng thö víi mµu cña èng mÉu ®­îc chuÈn bÞ ®ång thêi trong cïng ®iÒu kiÖn. Mµu cña èng thö kh«ng ®­îc thÉm h¬n mµu cña èng mÉu. èng mÉu ®­îc chuÈn bÞ nh­ sau: LÊy mét thÓ tÝch dung dÞch ion chØ mÉu 10ppm, cho vµo mét chÐn sø, thªm 4ml dung dÞch magsnesi sunfat 25% trong acid sunfuric 2N, sau ®ã tiÕp tôc xñ lý nh­ c¸ch xö lý mÉu thö ghi ë trªn. LÊy 2ml dung dÞch thu ®­îc tõ xö lý chÕ phÈm thö cho vµo mét èng nghiÖm, thªm 10ml dung dÞch thu ®­îc tõ xö lý dung dÞch ion ch× mÉu, 2ml dung dÞch ®Öm acetat pH = 3,5. L¾c ®Òu, thªm 1,2ml dung dÞch thioacetamid. L¾c ®Òu, råi ®Ó yªn 2 phót. III.1.6. C¸c t¹p chÊt C¸c t¹p chÊt lµ nh÷ng chÊt kh¸c cßn lÉn trong thµnh phÈm. Tû lÖ t¹p chÊt ®­îc tÝnh theo c«ng thø sau: (10) Trong ®ã: X: hµm l­îng t¹p chÊt (%). P: l­îng thµnh phÈm (g). a: l­îng t¹p chÊt (g). Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p ®Ó x¸c ®Þnh t¹p chÊt, nh­ng víi rutin th­êng x¸c ®Þnh b»ng ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn hoÆc ph­¬ng ph¸p s¾c ký. VÝ dô: X¸c ®Þnh hµm l­îng quercetin lÉn trong rutin, ta x¸c ®Þnh ®é hÊp thô cña dung dÞch trong phÇn ®Þnh l­îng ë c¸c b­íc sãng 375 nm (A375) vµ 362,5 nm (A362,5). Tû sè A375/A362,5 kh«ng ®­îc lín h¬n 0,879 (nghÜa lµ hµm l­îng quercetin kh«ng qu¸ 5%). NÕu tû sè trªn v­ît qu¸ 0,879, hµm l­îng phÇn tr¨m quercetin trong chÕ phÈm ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau: (11) Trong ®ã: p: L­îng chÕ phÈm khan trong mÉu thö ®em ®Þnh l­îng tÝnh b»ng gam. III.1.7. Hµm l­îng rutin Hµm l­îng rutin tÝnh b»ng phÇn tr¨m khèi l­îng rutin cã trong mÉu thö kh«. ViÖc x¸c ®Þnh hµm l­îng rutin ®­îc tiÕn hµnh theo c¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng rutin nh­ ®· nªu ë phÇn tr­íc. III.2. Tiªu chuÈn cña ViÖt Nam ®¸nh gi¸ vÒ rutin [3] 1- MÊt khèi l­îng do lµm kh«: Tõ 5,5 ®Õn 9,0%. 2 - §é trong vµ mµu s¾c cña dung dÞch: NÕu hßa tan 0,10g mÉu thö trong 5ml ethanol, dung dÞch thu ®­îc ph¶i trong vµ cã mµu vµng. NÕu hßa tan 0,10g mÉu thö trong 5ml dung dÞch natri hydroxyd 2%, dung dÞch thu ®­îc ph¶i trong vµ cã mµu vµng da cam. 3 - DiÖp lôc vµ s¾c tè ®á: Phæ hÊp thô tö ngo¹i cña dung dÞch thu ®­îc kh«ng ®­îc cã c¸c cùc ®¹i hÊp thô ë b­íc sãng kho¶ng 590 vµ 655nm. 4- C¸c s¾c tè tan trong ete: LÊy 0,020g chÕ phÈm, thªm 10ml ete, ®un trªn c¸ch thñy d­íi èng sinh hµn ng­îc trong 30 phót, líp ete ph¶i kh«ng mµu. 5- Tro Sulfat: Kh«ng ®­îc qu¸ 0,3% (víi l­îng mÉu thö lµ 0,5 g). 6 – Kim lo¹i nÆng: Kh«ng ®­îc qu¸ 0,001%. 7- Hµm l­îng quercetin: Kh«ng ®ù¬c qu¸ 5,0%. 8- Hµm l­îng rutin: MÉu thö ph¶i chøa kh«ng d­íi 97% vµ kh«ng qu¸ 102% C27H30O16 tÝnh theo khèi l­îng kh«. III.3. Tiªu chuÈn n­íc ngoµi ®¸nh gi¸ rutin III.3.1. Tiªu chuÈn cña §øc [13] 1- MÊt khèi l­îng do lµm kh«: Tõ 5% ®Õn 8,5%. 2- Tro sulfat: Kh«ng lín h¬n 0,1%. 3- Hµm l­îng rutin: Theo ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch quang phæ (UV hoÆc TBAH): kh«ng nhá h¬n 98,5% vµ kh«ng lín h¬n 102% khèi l­îng kh«. Theo ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC): kh«ng nhá h¬n 95% khèi l­îng kh«. 4- Kim lo¹i nÆng: Kh«ng qu¸ kh«ng qu¸ 0,001%. 5- Hµm l­îng Clorofin: Kh«ng qu¸ 0,004%. 6- S¾c tè ®á: Kh«ng qu¸ 0,004%. 7- Hµm l­îng Isoquercetin: Kh«ng qu¸ 2,0% (theo ph­¬ng ph¸p HPLC). 8- Hµm l­îng Kaemperol 3- rutinoside: Kh«ng qu¸ 2,0% (HPLC). 9- Hµm l­îng quercetin: Kh«ng qu¸ 2,0% (HPLC). III.3.2. Tiªu chuÈn cña Mü [14] 1- MÊt khèi l­îng do lµm kh«: Kh«ng nhá h¬n 5,5% vµ kh«ng lín h¬n 9%. 2- Tro toµn phÇn: Kh«ng lín h¬n 0,5%. 3- Hµm l­îng Clorofin: Kh«ng qu¸ 0,004%. 4- S¾c tè ®á: Kh«ng qu¸ 0,004%. 5- Hµm l­îng quercetin: Kh«ng lín h¬n 5%. 6- Hµm l­îng rutin: Ph¶i chøa kh«ng nhá h¬n 95% vµ kh«ng lín h¬n 101,5% l­îng C27H30O16 trong chÕ phÈm ®· sÊy kh«. III.3.3 Tiªu chuÈn cña Liªn X« [17] 1- MÊt khèi l­îng do lµm kh«: Kh«ng nhá h¬n 6% vµ kh«ng lín h¬n 9% (víi l­îng mÉu thö lµ 0,5g vµ sÊy ë 1350C). 2- §é trong: Hoµ tan 0,1g mÉu thö trong 6ml, dung dÞch ph¶i trong. 3- Clorofin vµ c¸c s¾c tè tan trong ete: L¾c hçn hîp gåm 0,1g mÉu thö vµ 5ml ete, ete ph¶i kh«ng mÇu. 4- Acaloid: Dïng 2 –3ml dung dÞch cån b·o hoµ mÉu thö, thªm 2 –3ml dung dÞch axÝt picric b·o hoµ, ph¶i kh«ng cã kÕt tña. 5- Tro sulfat: Kh«ng lín h¬n 0,1% (l­îng mÉu thö lµ 0,5g). 6- Hµm l­îng quercetin: Kh«ng lín h¬n 5,0%. 7- Hµm l­îng rutin: MÉu thö chøa kh«ng nhá h¬n 95% C27H30O16 tÝnh theo khèi l­îng kh« (tiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i). PhÇn Thùc NghiÖm I. Nghiªn cøu c¸c ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin I.1. c¬ së lý thuyÕt Dùa vµo ®é tan cña rutin trong c¸c m«i tr­êng kh¸c nhau mµ ng­êi ta ®­a ra c¸c ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin. ViÖc chiÕt t¸ch rutin tõ nô hoÌ cã thÓ tiÕn hµnh theo 3 ph­¬ng ph¸p chÝnh, ®ã lµ: - ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc. - ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu. - ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng kiÒm. Ngoµi ba ph­¬ng ph¸p chÝnh trªn ®· cã mét sè t¸c gi¶ nghiªn cøu mét sè ph­¬ng ph¸p kh¸c nh­: chiÕt xuÊt rutin dïng axÝt acetic, chiÕt xuÊt rutin dïng cacbonat-kiÒm... [1,12]. I.1.1. Ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc I.1.1.1. C¬ së ph­¬ng ph¸p Ph­¬ng ph¸p nµy chñ yÕu dùa vµo ®é tan cña rutin trong n­íc ë c¸c nhiÖt ®é kh¸c nhau. Lîi dông tÝnh chÊt nµy ng­êi ta chØ cÇn dïng n­íc ë nhiÖt ®é cao ®Ó t¸ch rutin ra khái nô hoÌ, sau ®ã chê nhiÖt ®é h¹ xuèng rutin sÏ kÕt tña vµ l¾ng xuèng. ViÖc thu håi rutin ®­îc thùc hiÖn b»ng ph­¬ng ph¸p läc. Sau ®ã, rutin ®­îc tinh chÕ b»ng r­îu, qu¸ tr×nh tinh chÕ còng t­¬ng tù nh­ qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt ë trªn. I.1.1.2. Quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc - ChuÈn bÞ mÉu: Nô hoÌ ®­îc ®­îc nghiÒn nhá, sÊy kh« ë 600C trong kho¶ng 1 - 2 giê, sau ®ã c©n mÉu theo nh÷ng khèi l­îng nhÊt ®Þnh chuÈn bÞ cho qu¸ tr×nh t¸ch. Ng©m mÉu ®· c©n ë trªn trong dung dÞch HCl 0,5%, víi môc ®Ých diÖt c¸c enzym cã thÓ lµm ph©n huû rutin, lo¹i mét phÇn nhùa vµ c¸c chÊt nhÇy. Sau khi ng©m, mÉu ®­îc läc röa cho ®Õn khi trung tÝnh. - T¸ch rutin th«: MÉu ®­îc bæ sung n­íc ®Õn tû lÖ ®· tÝnh to¸n vµ tiÕn hµnh gia nhiÖt ®Õn khi hçn hîp ®¹t nhiÖt ®é cao trªn 1000C (cã thÓ gia nhiÖt trong nh÷ng thiÕt bÞ chÞu ¸p suÊt cao). Sau mét kho¶ng thêi gian nhÊt ®Þnh, hçn hîp ®­îc läc ngay ®Ó thu phÇn dÞch läc, phÇn b· läc ®­îc bæ sung n­íc vµ lÆp l¹i qu¸ tr×nh t¸ch tiÕp theo. Qu¸ tr×nh t¸ch cã thÓ ®­îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn cho ®Õn khi kiÓm tra ®Þnh tÝnh kh«ng cßn rutin. DÞch läc ®­îc ®Ó nguéi tù nhiªn (hoÆc lµm nguéi), rutin sÏ kÕt tña d¹ng b«ng vµ l¾ng xuèng. Sau kho¶ng 6 - 12 giê, läc thu phÇn kÕt tña rutin, sÊy ë 600C trong 1 - 2 giê, sau ®ã nghiÒn nhá kÕt tña lµm nguyªn liÖu cho b­íc tinh chÕ. - Tinh chÕ rutin b»ng cån (ethanol) [1]: PhÇn kÕt tña rutin thu ®­îc cßn ë d¹ng th« v× cßn lÉn mét sè t¹p chÊt kh¸c ®­îc t¸ch ra khi dïng dung m«i n­íc vÝ dô nh­ pectin, mét sè glucosid, c¸c flavonoid kh¸c... X¸c ®Þnh khèi l­îng rutin th«, tÝnh to¸n l­îng cån hîp lý ®Ó tinh chÕ (1g rutin trong 60ml cån nãng [3]). Hßa tan rutin th« trong cån b»ng c¸ch ®un c¸ch thñy cã håi l­u, môc ®Ých cña håi l­u nh»m tiÕt kiÖm l­îng cån, h¬n n÷a cån lµ dung m«i dÔ ch¸y nªn cÇn ®un c¸ch thñy. Läc nãng thu phÇn dÞch läc, lo¹i bá phÇn kh«ng tan. DÞch läc ®Ó nguéi (hoÆc nÕu lµm l¹nh th× cµng tèt), rutin kÕt tña vµ l¾ng xuèng. Sau 6 - 12 giê, läc thu kÕt tña, phÇn cån ®­îc ch­ng cÊt thu håi cån ®Ó t¸i sö dông. SÊy kÕt tña rutin thu ®­îc ë 600C ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi. - KiÓm nghiÖm: S¶n phÈm cuèi cïng ®­îc ph©n tÝch ®¸nh gi¸ chÊt l­îng theo nh÷ng tiªu chuÈn ®· yªu cÇu. * ChiÕt xuÊt rutin dïng n­íc cã thÓ tiÕn hµnh nh­ sau [11]: - NghiÒn mÉu hoa hoÌ ®· sÊy th« vµ c©n mÉu. Hoµ trén mÉu vµo mét l­îng n­íc ®­îc tÝnh to¸n. §iÒu chØnh pH cña m«i tr­êng b»ng dung dÞch Na0H 1M sao cho pH =6 - 8. - §un s«i hçn hîp (trong 2h). Läc lÊy phÇn dÞch läc. DÞch läc ®­îc ®iÒu chØnh pH b»ng dung dÞch HCl 1M, pH =5 - 6. Chê kÕt tña rutin l¾ng xuèng. - Läc thu håi kÕt tña. PhÇn kÕt tña ®­îc hoµ tan trong n­íc vµ l¹i ®iÒu chØnh pH =6 - 8 b»ng Na0H . - Sau ®ã ®em ®un s«i vµ läc ngay ®Ó thu phÇn dÞch läc. DÞch läc ®­îc axit ho¸ b»ng HCl, pH = 5 - 6. §Ó nguéi chê kÕt tña. - Läc thu phÇn kÕt tña. §em kÕt tña sÊy kh« ë trªn 700C. PhÇn khèi l­îng kh«mg ®æi sÏ ®­îc mang ®i c©n ®Ó tÝnh to¸n hµm l­îng. Quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc ®­îc m« t¶ ë h×nh 7. Läc ®Õn trung tÝnh sÊy ë 600C trong 1I2h, c©n Bét nô hoÌ ng©m HCl 0,5% Gia nhiÖt ë ¸p suÊt cao (~2at) N­íc Läc nãng B· läc DÞch läc ®Ó nguéi, 6I12h §Þnh tÝnh rutin DÞch läc Läc DÞch läc SÊy kÕt tña ë 600C, 1I2h X¸c ®Þnh khèi l­îng §un c¸ch thñy, håi l­u Ethanol NghiÒn mÞn Ch­ng cÊt Läc nãng PhÇn kh«ng tan Lµm l¹nh dÞch läc, 6I12h DÞch läc Läc KiÓm nghiÖm SÊy kÕt tña ë 600C ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi X¸c ®Þnh khèi l­îng H×nh 7- S¬ ®å quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc I.1.1.3. Nh÷ng ­u- nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc Ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc cã nh÷ng ­u ®iÓm: - N­íc lµ dung m«i rÎ tiÒn, dÔ kiÕm vµ cã mét sè tÝnh chÊt lý ho¸ cã lîi cho viÖc chiÕt xuÊt rutin nh­: ®é nhít thÊp, søc c¨ng bÒ mÆt nhá do ®ã dÔ thÊm vµo d­îc liÖu [6]. - N­íc cã kh¶ n¨ng chuyÓn nguyªn sinh chÊt bÞ ®«ng vãn trong tÕ bµo (trong tÕ bµo nô hoÌ cã rutin [1,3,4]) thµnh d¹ng gel hoÆc d¹ng sol do ®ã dÔ gi¶i phãng chÊt tan vµo dÞch chiÕt [2]. - N­íc kh«ng hoµ tan (hoÆc hoµ tan rÊt Ýt) clorofin trong nô hoÌ [6]. Tuy nhiªn, ph­¬ng ph¸p nµy còng cã mét sè nh­îc ®iÓm sau: - N­íc cã kh¶ n¨ng hoµ tan réng nªn trong dÞch chiÕt lÉn nhiÒu t¹p chÊt nh­: pectin, c¸c chÊt mµu, enzym, c¸c chÊt nhÇy, mét sè glycosid... [1,2,6] - N­íc kh«ng cã kh¶ n¨ng diÖt vi khuÈn, nÊm mèc do ®ã nÕu kh«ng b¶o qu¶n dÞch chiÕt tèt hoÆc nÕu dÞch chiÕt ®Ó qu¸ l©u sÏ bÞ vi khuÈn, nÊm mèc ph©n huû rutin [2]. Trong thÝ nghiÖm cña t«i nÕu ®Ó dÞch chiÕt qu¸ 24h th× xuÊt hiÖn mïi chua chøng tá vi khuÈn, nÊm mèc ®· x©m nhËp vµo dÞch chiÕt vµ ph©n huû rutin. - Ph¶i chiÕt xuÊt ë ¸p suÊt cao míi cho hµm l­îng rutin cao. Do ®ã, tèn kÐm vÒ mÆt thiÕt bÞ vµ nhiªn liÖu. I.1.2. Ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu I.1.2.1. C¸c dung m«i Tõ “r­îu” ë trªn dïng ®Ó chØ c¸c dung m«i ®­îc sö dông trong ph­¬ng ph¸p lµ thuéc nhãm r­îu, gåm: methanol, ethanol, isopropanol... Th«ng th­êng ng­êi ta hay dïng ethanol, bëi v× so víi c¸c dung m«i thuéc nhãm r­îu th× ethanol lµ th«ng dông vµ rÎ tiÒn nhÊt, h¬n n÷a ethanol nãng còng hoµ tan kh¸ tèt rutin. Methanol cã ®é hoµ tan rutin lín nh­ng ®¾t tiÒn, khã kiÕm nªn chØ dïng trong ph©n tÝch. Víi isopropanol vµ c¸c ®ång ®¼ng m¹ch dµi h¬n th× cã rÊt Ýt tµi liÖu ®Ò cËp ®Õn sö dông dung m«i nµy, h¬n n÷a nh÷ng dung m«i nµy hiÕm h¬n nhiÒu so víi ethanol. Do ®ã, nãi ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu th× tõ “r­îu”(hay cån) chñ yÕu nh¾c ®Õn ethanol. I.1.2.2. C¬ së ph­¬ng ph¸p Còng nh­ ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc, ph­¬ng ph¸p nµy còng dùa vµo ®é tan cña rutin trong c¸c dung m«i c¸c nhiÖt ®é kh¸c nhau ®Ó chiÕt xuÊt rutin tõ nô hoÌ (1g rutin tan trong 60ml ethanol nãng vµ 650ml ethanol ë nhiÖt ®é th­êng [3]).Tr­íc tiªn t¸ch rutin tõ nô hoÌ b»ng ethanol nãng, cã thÓ dïng ethanol ë c¸c nång ®é kh¸c nhau nh­ng th«ng th­êng ng­êi ta sö dông tõ ethanol 900 ®Õn ethanol tuyÖt ®èi. DÞch chiÕt ®­îc lµm l¹nh cho kÕt tña rutin, läc thu kÕt tña. KÕt tña thu ®­îc lµ rutin d¹ng th« v× cßn lÉn c¸c t¹p chÊt nh­: clorofin, c¸c s¾c tè, chÊt bÐo [6]. Tinh chÕ l¹i rutin ta dïng n­íc, nh­ng tr­íc khi tinh chÕ cã nhiÒu t¸c gi¶ cho r»ng ph¶i lo¹i clorofin b»ng dietylete [2,3]. I.1.2.3. Quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu Nãi chung, quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu còng t­¬ng tù nh­ chiÕt xuÊt rutin dïng n­íc. Quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu ®­îc m« t¶ ë h×nh 8. §un c¸ch thñy, håi l­u SÊy ë 600C, 1÷2h, c©n Läc ®Õn trung tÝnh Läc §Þnh tÝnh rutin CÊt thu håi dung m«i Läc SÊy ë 600C, 1÷2h. Hoµ tan nãng Läc Läc SÊy kÕt tña ë 600C, ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi KiÓm nghiÖm Bét nô hoÌ Ng©m HCl 0,5% Ethanol B· läc Ethanol thu håi DÞch c« ®Ó kÕt tña, 6÷12h. DÞch läc X¸c ®Þnh khèi l­îng N­íc NghiÒn mÞn PhÇn kh«ng tan DÞch läc ®Ó kÕt tña, 6÷12h DÞch läc X¸c ®Þnh khèi l­îng H×nh 8 – S¬ ®å quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu I.1.2.4. Nh­ng ­u- nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng r­îu Dïng dung m«i ethanol cã nh÷ng ­u ®iÓm sau: - Lµ dung m«i ®­îc dïng trong ngµnh c«ng nghiÖp r­îu nªn dÔ kiÕm. - Ethanol cã ®é s«i thÊp nªn khi c« ®Æc dÞch chiÕt kh«ng lµm ph©n huû rutin. - Ethanol hßa tan Ýt t¹p chÊt vµ ethanol cao ®é cã kh¶ n¨ng lµm ®«ng vãn c¸c chÊt nhÇy, albumin, pectin... [2]. - Ethanol cã thÓ pha lo·ng víi n­íc theo bÊt kú tû lÖ nµo, nªn cã thÓ pha lo·ng ethanol thµnh nh÷ng nång ®é kh¸c nhau theo yªu cÇu chiÕt xuÊt. - Ethanol cã nång ®é 20% thÓ tÝch cã kh¶ n¨ng b¶o qu¶n, kh«ng cho vi trïng nÊm mèc ph¸t triÓn [2]. Tuy nhiªn, dung m«i ethanol cã nh÷ng nh­îc ®iÓm: - Ethanol vµ c¸c ®ång ®¼ng ®Òu kh¸ ®¾t tiÒn, dÔ ch¸y næ, cã tÝnh ®éc vµ cã t¸c dông d­îc lý riªng [2]. Do ®ã, vÒ mÆt kinh tÕ vµ an toµn lµ khã triÓn khai trong s¶n xuÊt. - Ethanol cao ®é khã thÊm vµo bét nô hoÌ [2]. - Hoµ tan clorofin, c¸c alcaloid, mét sè glycosid, tinh dÇu vµ nhùa trong nô hoÌ [2,4,6]. V× nh÷ng nh­îc ®iÓm trªn, khi chiÕt xuÊt rutin ng­êi ta cã thÓ dïng ethanol ®· ®­îc axÝt ho¸ b»ng axÝt acetic. I.1.3. Ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng kiÒm I.1.3.1. C¬ së ph­¬ng ph¸p Rutin cã thÓ t¸c dông víi kiÒm cho s¶n phÈm dÔ tan [6]: Dùa vµo ®ã ng­êi ta dïng kiÒm (NaOH cã nång ®é tõ 5 – 30% [6]) ®Ó hoµ tan rutin trong bét nô hoÌ, sau ®ã ®iÒu chØnh m«i tr­êng vÒ trung tÝnh hoÆc axÝt yÕu (b»ng HCl) cho kÕt tña rutin. Läc thu håi rutin vµ ®em ®i tinh chÕ. Giai ®o¹n tinh chÕ cã thÓ dïng n­íc hoÆc dïng cån [1,6]. I.1.3.2. Quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng kiÒm S¬ ®å quy tr×nh chiÕt xuÊt rutin dïng kiÒm ®­îc tr×nh bµy ë h×nh 9. Läc ®Õn trung tÝnh SÊy ë 600C, 1÷2h, c©n Bét nô hoÌ Ng©m HCl 0,5% Ng©m, 6÷12h NaOH Läc B· läc DÞch läc PH= 6÷7 HCl Chê kÕt tña, 6÷12h Läc DÞch läc SÊy ë 600C, 1÷2h X¸c ®Þnh khèi l­îng §un c¸ch thñy cã håi l­u (Hoµ tan nãng) NghiÒn mÞn Ethanol (hoÆc n­íc) Läc PhÇn kh«ng tan (§Ó nguéi, 6÷12h) CÊt thu håi dung m«i Ethanol thu håi DÞch c«, ®Ó kÕt tña, 6÷12h Läc DÞch läc SÊy kÕt tña ë 600C, ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi KiÓm nghiÖm X¸c ®Þnh khèi l­îng H×nh 9- S¬ ®å chiÕt xuÊt rutin dïng kiÒm Trong ®ã: (DÊu ngoÆc ®¬n) vµ : ®Ó chØ qu¸ tr×nh tinh chÕ dïng n­íc. I.1.3.3. Nh÷ng ­u- nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p chiÕt xuÊt rutin dïng kiÒm Ph­¬ng ph¸p nµy cã ­u ®iÓm: - Qu¸ tr×nh t¸ch rutin kh«ng cÇn gia nhiÖt, do ®ã tiÕt kiÖm vÒ nhiÖt l­îng h¬n so víi 2 ph­¬ng ph¸p tr­íc. - Dïng kiÒm cã thÓ tËn dông ®­îc ­u ®iÓm dÔ thÊm vµo bét nô hoÌ cña n­íc. - Rutin tan trong kiÒm [1,3], nªn cã thÓ t¸ch triÖt ®Ó rutin tõ nô hoÌ. Tuy nhiªn, ph­¬ng ph¸p nµy còng cã kh¸ nhiÒu nh­îc ®iÓm: - Tiªu hao nhiÒu ho¸ chÊt: theo [6] tÝnh to¸n ra ta thÊy, ®Ó chiÕt xuÊt ®­îc 1kg rutin mÊt 75kg NaOH khan vµ mét l­îng HCl t­¬ng øng ®Ó trung hoµ NaOH. - KiÒm lµ dung m«i cã tÝnh ¨n mßn, nÕu ¸p dông trong s¶n xuÊt sÏ tèn kÐm v× thiÕt bÞ ph¶i cã tÝnh chèng ¨n mßn. I.2. Nghiªn cøu chiÕt xuÊt rutin tõ nô hoÌ Th¸i B×nh Theo nhiÒu t¸c gi¶, hµm l­îng rutin trong nô hoÌ Th¸i B×nh cao h¬n so víi nô hoÌ nhiÒu vïng trong c¶ n­íc [1,4,6]. V× vËy, t«i ®i vµo nghiªn cøu chiÕt xuÊt rutin tõ nô hoÌ Th¸i B×nh theo ph­¬ng ph¸p dïng n­íc. I.2.1 C¸c c«ng thøc tÝnh to¸n 1- Hµm l­îng t¸ch chiÕt Hµm l­îng t¸ch chiÕt biÓu thÞ b»ng phÇn tr¨m khèi l­îng, nã ®­îc tÝnh b»ng tû sè phÇn tr¨m gi÷a khèi l­îng rutin th« thu ®­îc trong giai ®o¹n t¸ch rutin b»ng n­íc víi khèi l­îng mÉu ®em ®i t¸ch chiÕt. (%) (12) Trong ®ã: H1: hµm l­îng t¸ch chiÕt (%). r1: khèi l­îng rutin th« thu ®­îc sau giai ®o¹n t¸ch (g). a: khèi l­îng mÉu bét nô hße (g). 2- HiÖu suÊt tinh chÕ HiÖu suÊt tinh chÕ biÓu thÞ b»ng phÇn tr¨m khèi l­îng, nã ®­îc tÝnh b»ng tû sè phÇn tr¨m gi÷a khèi l­îng rutin thu ®­îc sau khi tinh chÕ víi l­îng rutin th« ®­îc tinh chÕ. (%) (13) Trong ®ã: H2: hiÖu suÊt tinh chÕ (%). r: khèi l­îng rutin sau tinh chÕ (g). 3- Hµm l­îng chiÕt xuÊt Hµm l­îng chiÕt xuÊt biÓu thÞ b»ng phÇn tr¨m khèi l­îng , nã ®­îc tÝnh b»ng tû sè phÇn tr¨m gi÷a khèi l­îng rutin cuèi cïng thu ®­îc trong qu¸ tr×nh chiÕt xuÊt (rutin sau tinh chÕ) víi khèi l­îng mÉu ®­îc chiÕt xuÊt. (14) Trong ®ã: H: hµm l­îng chiÕt xuÊt (%). I.2.2. Mét sè nghiªn cøu chiÕt xuÊt rutin tõ nô hoÌ Th¸i B×nh Sau khi ®· t×m hiÓu c¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch rutin còng nh­ nh÷ng tiªu chuÈn ®¸nh gi¸ chÊt l­îng cña nã, ®ång thêi kÕt víi nh÷ng ®iÒu kiÖn hiÖn cã nh­ trang c¬ së vËt chÊt, trang thiÕt bÞ thÝ nghiÖm …vµ kinh tÕ. Chóng t«i ®· thèng nhÊt dïng c¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch s¾c ký ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt l­îng cña rutin. ViÖc chiÕt xuÊt rutin, ®¬n gi¶n nhÊt vÉn lµ b»ng ph­¬ng ph¸p n­íc. Ph­¬ng ph¸p nµy võa rÎ tiÒn l¹i cho hiÖu suÊt cao, tiÕn hµnh ®¬n gi¶n. §Ó chiÕt xuÊt rutin tõ nô hße chóng t«i ®· tiÕn hµnh theo c¶ ba ph­¬ng ph¸p. S¶n phÈm chiÕt xuÊt ®­îc mang ®i ph©n tÝch s¾c ký ®Ó so s¸nh chÊt l­îng vµ hiÖu qu¶. Tõ ®ã, ®­a ra ph­¬ng ph¸p tèi ­u kh«ng nh÷ng cho qu¸ tr×nh ph©n tÝch chÊt l­îng rutin mµ cßn cho c¶ qu¸ tr×nh s¶n xuÊt nã.  Tµi liÖu tham kh¶o [1] – Bµi gi¶ng d­îc liÖu tËp I – Nhµ xuÊt b¶n Hµ Néi 1998. [2] – Kü thuËt bµo chÕ vµ sinh d­îc c¸c d¹ng thuèc – tËp I - Tr­êng ®¹i häc D­îc Hµ Néi – Bé m«n Bµo chÕ – Nhµ xuÊt b¶n Hµ Néi n¨m 1997. [3] – D­îc ®iÓn ViÖt Nam - toµn tËp – Nhµ xuÊt b¶n Y häc n¨m 1994. [4] – C©y thuèc vµ ®éng vËt lµm thuèc ë ViÖt Nam tËp I – nhãm t¸c gi¶ ViÖn D­îc liÖu ViÖt Nam – Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc kü thuËt. [5] – Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam – Gs.Ts §ç tÊt Lîi – Nhµ xuÊt b¶n Y häc n¨m 1999. [6] – Rutin trong nô hoa hoÌ Th¸i B×nh vµ B¾c Giang – Lª thÞ Anh §µo – Tr­êng ®¹i häc s­ ph¹m- §HQG Hµ Néi – Th«ng b¸o khoa häc sè 1.1997 - trang 47-50. [7] – Th«ng b¸o d­îc liÖu sè 3/1989 –tËp 23, sè 4/1989-tËp 21, sè 3+4/1991 tËp 23–Bé Y tÕ –ViÖn d­îc liÖu. [8] - §ãng gãp vµo viÖc nghiªn cøu c¸c flavonoid trong nô hoa hße – NguyÔn V¨n DËu – Khoa hãa häc tr­êng ®¹i häc KHTN, §HQG Hµ Néi – T¹p chÝ d­îc häc sè 8/2001. [9] – Ph©n tÝch hãa lý – GS .TSKH Tõ v¨n MÆc – Nhµ xuÊt b¶n KHKT n¨m 2002. [10]- C¸c ph­¬ng ph¸p s¾c ký – GS. §µo h÷u Vinh vµ nhãm t¸c gi¶ - HiÖu ®Ýnh: GS. NguyÔn th¹c C¸t. [11] – The extraction of rutin from buds of Sophora Japonica – L. Paniwnyk, E. Beaufoy, J.P. Lorimer, T.J. Mason – School of natural and Environmental Sciences, Coventry University, Coventry CV5FB, UK. [12] – Method of extracting rutin from buckwheat growed by hydroponics – Lee Mi-Nyeong (KR); Kim Byeon-Rok (KR); Kim Tae-Kwan (KR); Park Yoon-Chang(KR) [13] – AOAC Official Method 952.28 rutin in Drugs – AOAC international 1998. [14] – German Pharmacopoeia 10th edition – [ DAB-10 ] [15] – US pharmacopoeia - [ USA.NF.XI ] [16] - IVth Hungarian Pharmacopoeia – volume II -[ AkadÐmiai Kiado – Budapest 1970 ] [17] - The State Pharmacopoeia of the Union of Soviet Socialist Republics – 10th edition – Moscow. [18] – PharmacopÐe Francaise – VIII Ðdition – 4, Avenue Ruysdaël – Paris- XVII –1965.