Nghiên cứu cải thiện độ tan của paclitaxel bằng phương pháp tạo phức với hydroxypropyl-Β-cyclodextrin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 359 NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐỘ TAN CỦA PACLITAXEL BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN Nguyễn Thanh Hà*, Lê Minh Trí**, Nguyễn Thiện Hải**, Lương Khánh Duy**, Lê Nguyễn Nguyệt Minh** TÓM TẮT Mục tiêu: Paclitaxel (PTX) là hoạt chất phân lập từ vỏ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), là một trong các chất có tác dụng hiệu quả được sử dụng điều trị ung thư buồng trứng, phổi, vú và não trong lâm sàng. PTX chỉ được dùng dạng tiêm truyền do không hấp thu qua hệ tiêu hoá. Tuy nhiên độ tan của PTX rất kém. Do vậy, nghiên cứu này nhằm cải thiện độ tan PTX bằng phương pháp tạo phức chất với hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) Phương pháp: điều chế dung dịch chứa PTX đậm đặc bằng phương pháp tạo phức chất hoà tan với hydroxypropyl-β-cyclodextrin (chế phẩm nghiên cứu NC-10). Khảo sát tính ổn định của chế phẩm và hàm lượng PTX trong 27 giờ sau khi pha loãng với dung dịch NaCl 0,9%. Kết quả: HPβCD có tác dụng tăng độ hoà tan của PTX. Tỉ lệ mol của PTX: HPβCD để tạo phức được nghiên cứu là 1:360. Dung dịch đậm đặc này được thêm polysorbat 80 (6%) vào để tăng tính ổn định của phức chất sau khi pha loãng trong dung dịch NaCl 0,9%. Dung dịch chứa PTX 0,6 mg/ml sau khi pha trong dung dịch NaCl 0,9% ổn định trong 27 giờ. Kết quả này tương đương với chế phẩm đối chiếu Intaxel®. Hàm lượng PTX được xác định bằng phương pháp HPLC, cột Pentafluorophenyl-propyl và detector PDA, phát hiện ở bước sóng 227 nm, pha động là hỗn hợp acetonitril:nước. Phương pháp phân tích kiểm nghiệm cũng đáp ứng yêu cầu của quy trình phân tích định lượng của chế phẩm theo ICH. Kết luận: dung dịch pha loãng từ dung dịch đậm đặc ban đầu có khả năng duy trì nồng độ PTX trong giới hạn trị liệu cho phép trong 27 giờ. Bên cạnh đó việc khảo sát khả năng hòa tan sau khi loại dung môi cho thấy triển vọng áp dụng dạng bào chế đông khô cho chế phẩm. Từ khoá: paclitaxel, HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), Intaxel(R), NC-10 ABSTRACT AMELIORATE THE SOLUBILITY OF PACLITAXEL BY FORMING THE COMPLEX WITH HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRINE Nguyen Thanh Ha, Le Minh Tri, Nguyen Thien Hai, Luong Khanh Duy, Le Nguyen Nguyet Minh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 359 - 367 Objectives: Paclitaxel (PTX), isolated from the bark of the Pacific yew tree (Taxus brevifolia), is one of the most effective antitumor agents used in clinical trials for ovarian, breast, lung and cervical cancers. Paclitaxel is only used in infusion because it is not absorb in gastrointestinal system. However, the aqueous solubility of paclitaxel is very low. This study was to make a solution containing paclitaxel by forming the complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Methods: this study was to make a concentrated solution containing paclitaxel by forming an inclusion complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrine (sample NC-10). Study on stability of sample and PTX’s content in * Viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Lê Minh Trí ĐT: 0903718190 Email: leminhtri1099@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 360 27 hours after dilute in solution of NaCl 0.9%. Results: HPβCD had increased the water-solubility of paclitaxel. The molar ratio of paclitaxel to HPβCD was found to be 1:360 to form the complex. Polysorbate 80 (6%) was added to the concentrated solution showed the stabilization of the complex after diluted in solution of NaCl 0.9%. Approximately 0.6 mg/ml paclitaxel could be maintained after diluted in solution of NaCl 0.9% for 27 hours. This result was also the same with referent product - Intaxel®. Paclitaxel was determined by HPLC, using Pentafluorophenyl-propyl column and detector PDA, wavelength of detector at 227 nm. Mobile phase was acetonitrile and water. This method was met all the requirements of a pharmaceutical analytical procedure. Conclusion: dilute solution from initial concentrate solution is able to keep concentration of paclitaxel adapte for therapy in 27 hours. After eliminate the solvent, the solution is stable and able to prepare the infusion lyophilisate paclitaxel in the future. Key words: paclitaxel (PTX), HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPβCD), Intaxel(R) ĐẶT VẤN ĐỀ Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ cây thông đỏ Taxus brevifolia, được chứng minh mang lại hiệu quả cao trong trị liệu ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi và ung thư cổ tử cung. PTX không hấp thu qua đường tiêu hoá nên chỉ sử dụng bằng đường tiêm truyền tĩnh mạch. Tuy nhiên, do PTX có độ tan kém trong hầu hết dung môi pha tiêm nên các nghiên cứu hầu như tâp trung cải thiện độ tan của PTX. Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo phức bao của PTX với dẫn chất β-cyclodextrin có nhiều triển vọng và có khả năng ứng dụng vào sản xuất. Từ nhu cầu thực tiễn tạo ra chế phẩm chứa PTX an toàn và hiệu quả cao trong trị liệu, kết hợp với xu hướng ứng dụng cyclodextrin và các dẫn chất vào việc cải thiện độ tan và khả năng hấp thu, đề tài được tiến hành nhằm điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX có thể dùng pha tiêm truyền. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế dung dịch đậm đặc chứa paclitaxel sử dụng hydroxypropyl-β-cyclodextrin tạo phức trợ tan. Dung dịch sau khi pha loãng phải duy trì được nồng độ PTX khoảng 0,3 mg/ml-1,2 mg/ml trong một thời gian nhất định đạt yêu cầu trị liệu (chế phẩm NC-10) Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng paclitaxel trong chế phẩm sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với đầu dò PDA. Nguyên liệu PTX đạt tiêu chuẩn Dược điển USP 34 (Cty Jingi Wen, lô 20090312, Trung Quốc); 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Kleptose®) theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Roquette Pharma. Chế phẩm đối chiếu Intaxel® của nhà sản xuất Fresenius Kabi Oncology Ltd - Ấn Độ, số lô 881AY003, số đăng ký VN-2405-06, ngày sản xuất – hạn dùng: 06/07/13. Phương pháp nghiên cứu Thẩm định quy trình định lượng PTX sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA Khảo sát điều kiện phân tích PTX được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV hoặc PDA. Tham khảo chuyên luận thuốc tiêm PTX trong Dược điển Hoa Kỳ USP 34(7) và một số tài liệu(2,6,5,4), rút ra các thông số sắc ký như pha tĩnh, nhiệt độ cột, thành phần pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện để xây dựng quy trình định lượng PTX trong chế phẩm đạt yêu cầu của một quy trình phân tích. Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu thử: dung dịch PTX đậm đặc được pha loãng đến nồng độ trị liệu thích hợp bằng dung môi pha tiêm NaCl 0,9%. Dung dịch Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 361 thu được được lọc qua màng 0,45 µm rồi đem định lượng. Dung dịch chuẩn: hòa tan hoàn toàn PTX chuẩn trong hỗn hợp theo thể tích nước : acetonitril (50:50) để thu được dung dịch có nồng độ PTX như dung dịch thử. Dung dịch này được lọc qua màng 0,45 µm trước khi định lượng. Thẩm định quy trình phân tích Quy trình định lượng PTX trong chế phẩm được thẩm định theo tiêu chuẩn được hướng dẫn trong Hiệp ước hòa hợp quốc tế về yêu cầu kỹ thuật giữa châu Âu, Nhật và Hoa Kỳ - gọi tắt là ICH Harmonised tripartite guideline. Các yếu tố cần được thẩm định là tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, tính tuyết tính, độ đúng và độ chính xác của quy trình định lượng. Khảo sát tính chất chế phẩm đối chiếu Thu thập mẫu đối chiếu. Khảo sát tính chất lý hoá, độ pha loãng, tính ổn định sau khi pha loãng. Định lượng PTX trong dung dịch pha loãng theo quy trình đã thẩm định. Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX dựa trên tạo phức với HPβCD Do PTX kém tan trong nước nên phương pháp tạo phức trong môi trường dung môi hữu cơ và nước được sử dụng. Dung môi hữu cơ được lựa chọn là ethanol khan vì PTX tan tốt trong ethanol khan (đạt nồng độ tối đa là 46 mM/ml)(3) và ethanol có liên kết yếu với khoang HPβCD, dễ được thay thế bởi hoạt chất. Khảo sát ảnh hưởng của HPβCD lên khả năng cải thiện độ tan của PTX Tiến hành khảo sát với tỉ lệ mol HPβCD : PTX lần lượt là 1, 2, 3, 100, 200, 300, 360 và 400 trong dung môi nước và ethanol theo tỉ lệ thể tích 1 : 1, đánh giá lượng PTX hoà tan thông qua cảm quan (độ trong), chọn lựa tỉ lệ thích hợp và tiến hành xác định hàm lượng PTX từ đó rút ra tỷ lệ có khả năng tốt nhất. Chuẩn bị mẫu : PTX được cân chính xác khoảng 12 mg và hòa tan trong ethanol (với lượng thể tích bằng 1/3 lượng nước dùng hòa tan HPβCD). Một lượng HPβCD tương ứng với các tỉ lệ mol HPβCD : PTX như trên được hòa tan từ từ vào hỗn hợp nước (theo tỉ lệ 1 ml nước cho 1 g HPβCD) và 2/3 lượng ethanol còn lại đến khi thu được dung dịch trong suốt. Hai dung dịch trên được phối hợp vào nhau và khuấy trộn trong thời gian 2 giờ. Dung dịch thu được được pha loãng bằng dung môi pha tiêm NaCl 0,9 % để thu được thể tích 20 ml, tương ứng với nồng độ PTX 0,6 mg/ml. Khảo sát ảnh hưởng của chất trợ tan Dựa trên một số tài liệu(1,2), để ổn định phức tạo thành theo thời gian đạt yêu cầu trị liệu, một số polymer được sử dụng như Polyoxyethylen- sorbitan 20-monooleat (Polysorbat-80), Hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC) hoặc Polyvinylpyrrolidon K30 (PVP K30). Polysorbat 80 được lựa chọn trong phương pháp nghiên cứu này vì được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng trong dung dịch pha tiêm. Theo FDA, nồng độ Polysorbat 80 sử dụng trong dịch truyền được cho phép nồng độ tối đa là 8% theo thể tích. Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan đối với tính chất cảm quan chế phẩm Công thức được lựa chọn (tương ứng tỉ lệ HPβCD : PTX tiềm năng) sẽ được khảo sát độ ổn định khi có mặt polysorbat 80 từ nồng độ 1% đến 8% Tiến hành : Phức được tạo thành như trên. Dung dịch phức được cho thêm vào polysorbat 80 và pha loãng bằng dung môi pha tiêm NaCl 0,9% theo bảng 1. Bảng 1. Tỉ lệ pha loãng sử dụng polysorbat 80 làm chất ổn định Nồng độ Polysorbat 80 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% Dung dịch phức Tương ứng với 10 mg PTX Polysorbat 80 (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Dung dịch NaCl 0,9% Vừa đủ 20 ml Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 362 Dung dịch sau khi pha loãng được đánh giá độ trong trong tại thời điểm 0 giờ sau khi pha loãng, 24 giờ và 48 giờ sau khi pha loãng. Tiêu chí lựa chọn công thức là dung dịch phải trong đến thời điểm quan sát 48 giờ. Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan đối với nồng độ chế phẩm Từ phần (a) rút ra được các nồng độ polysorbat 80 có khả năng duy trì dung dịch trong. Các mẫu đạt tiêu chí cảm quan từ phần (a) sẽ được định lượng hàm lượng PTX tại thời điểm 0 giờ sau khi pha, 24 giờ và 48 giờ sau khi pha. Tiến hành: Chuẩn bị mẫu như trên thu được dung dịch PTX 0,6 mg/ml. Các mẫu được lọc qua màng 0,45 µm và tiến hành định lượng PTX bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tiêu chí lựa chọn: Mẫu được xem là đạt tiêu chí về nồng độ PTX khi hàm lượng PTX được duy trì trên 90% trong thời gian ít nhất 24 giờ so với nồng độ pha loãng lúc đầu. Khảo sát một số nồng độ pha loãng khác trong dãy nồng độ trị liệu Theo hướng dẫn sử dụng của chế phẩm gốc Intaxel®, PTX phải đạt nồng độ trị liệu từ 0,3 mg/ml đến 1,2 mg/ml. Công thức lựa chọn được đánh giá khả năng pha loãng tại nồng độ PTX 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml và 1,2 mg/ml Tiến hành: Dung dịch đậm đặc được chuẩn bị như trên, sau đó pha loãng trong dung dịch NaCl 0,9% được 3 nồng độ 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,9 mg/ml và 1,2 mg/ml. Tỉ lệ pha loãng được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2. Tỉ lệ pha loãng đạt nồng độ trị liệu khảo sát Nồng độ PTX (mg/ml) 0,3 0,6 0,9 1,2 Dung dịch đậm đặc ứng với lượng mg PTX 6 12 18 24 NaCl 0,9% vừa đủ 20 ml Dung dịch đạt khi pha loãng trong và duy trì được độ trong trong ít nhất 12 giờ. Khảo sát độ ổn định hàm lượng trong 24 giờ Công thức được đánh giá hàm lượng PTX, đo pH tại thời điểm sau khi pha và theo dõi hàm lượng trong thời gian 24 giờ. Mục tiêu của đánh giá này để xác định độ ổn định và khả năng duy trì hàm lượng PTX đáp ứng trị liệu của dung dịch pha loãng. Tiến hành: Mẫu được chuẩn bị như trên tương ứng với tỉ lệ mol PTX : HPβCD là 1 : 360. Dung dịch được pha loãng tại nồng độ rút ra như bảng 2. Mỗi nồng độ được pha 3 mẫu. Dung dịch thu được được lọc qua màng 0,45 µm. Mẫu được định lượng PTX tại thời điểm 0 giờ sau khi pha, và 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ và 24 giờ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tiêu chí lựa chọn: dung dịch phải có nồng độ PTX sau 24 giờ đạt trên 90% so với lúc đầu. Đánh giá ảnh hưởng ethanol lên độ tan phức PTX với HPβCD Do dung dịch tạo phức sử dụng lượng HPβCD lớn, cần dùng một lượng nước hòa tan lớn nên dung dịch đậm đặc ban đầu có thể tích lớn. Ngoài ra lượng ethanol từ giai đoạn tạo phức có thể ảnh hưởng đến độ tan phức tạo thành. Để đánh giá ảnh hưởng ethanol lên phức tạo thành và đánh giá khả năng áp dụng dạng bào chế đông khô cho chế phẩm, dung dịch phức sau khi khuấy trộn được loại dung môi trước khi pha loãng bằng dung môi pha tiêm NaCl 0,9%. Tiến hành khảo sát với số mẫu là 3 trên mỗi nồng độ pha loãng. Tiến hành: Dung dịch phức được tạo như trên, sau đó được loại dung môi bằng phương pháp sấy áp suất giảm sử dụng tủ sấy chân không. Nhiệt độ sấy được duy trì tại mức 45 oC để tránh phá cấu trúc phức. Cắn thu được được hòa tan trong dung môi pha tiêm NaCl 0,9%. Dung dịch sau khi pha loãng được đánh giá cảm quan và được lọc qua màng 0,45 µm tiến hành sắc ký xác định nồng độ PTX. So sánh với chế phẩm đối chiếu Tiến hành lặp lại công thức lựa chọn với Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 363 lượng pha chế lớn hơn và so sánh các chỉ tiêu về độ trong, nồng độ PTX với chế phẩm đối chiếu. Nhận xét và đánh giá công thức lựa chọn. Nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế dung dịch đậm đặc PTX có thể dùng pha tiêm Dựa vào tính chất lý hóa của công thức lựa chọn, tiến hành xây dựng quy trình bào chế ở quy mô sản xuất nhỏ dung dịch đậm đặc chứa PTX. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thẩm định quy trình định lượng PTX sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA Khảo sát điều kiện phân tích PTX được định lượng bằng phương pháp HPLC sử dụng đầu dò PDA bước sóng phát hiện 227 nm, cột sắc ký pha đảo Pentaflurophenyl-propyl (250 mm x 4 mm, 5 µm), pha động là hỗn hợp nước:acetonitril được chạy theo chương trình gradient, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl và nhiệt độ cột là 25 oC. Bảng 3. Chương trình gradient pha động Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitrile (%) Tỉ lệ nước (%) 0→13 45 55 13→20 45→65 55→35 20→23 65 45 23→30 65→45 35→55 Đánh giá quy trình phân tích Quy trình phân tích được thẩm định đạt yêu cầu của một quy trình phân tích. Kết quả thẩm định dược trình bày trong bảng 4. Bảng 4. Kết quả thẩm định quy trình định lượng PTX bằng HPLC Tiêu chí thẩm định Yêu cầu Kết quả Tính đặc hiệu Trên sắc ký đồ, mẫu chuẩn và mẫu thử phải có đỉnh PTX tại cùng thời gian lưu. Mẫu trắng không được có đỉnh PTX. Đúng Tính phù hợp hệ thống Các thông số sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử sau 6 lần tiêm mẫu có RSD ≤ 2%. Hệ số bất đối 0,8-1,5 Đạt Tính tuyến tính Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ PTX khi phân tích (dùng công cụ Regression trong MS Excel để kiểm tra). Đánh giá hệ số tương quan r. Mức độ tương quan tốt khi |r| > 0,9 Phương trình hồi qui tuyến tính y = 5941192x + 85098 (R2 = 0,9999) Kết luận có sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu PTX trong khoảng tuyến tính 0,1 – 1,3 mg/ml Độ đúng Tỉ lệ phục hồi 98%-102% Đạt (100,57%) Độ chính xác RSD của 6 mẫu thử nhỏ hơn hoặc bằng 2% Đạt (RSD% = 1,512%) Khảo sát tính chất chế phẩm đối chiếu Chế phẩm đối chiếu Intaxel® được pha loãng trong dịch pha tiêm đến nồng độ trị liệu 0,3 – 1,2 mg/ml. Kết quả nồng độ PTX được duy trì sau khi pha loãng theo thời gian được thể hiện qua bảng 5. Bảng 5. Nồng độ khảo sát theo thời gian Intaxel® Nồng độ PTX (mg/ml) Thời gian định lượng 0 giờ 27 giờ 48 giờ 72 giờ 0,3 100% 99,60% 98,86% 98,13% 0,6 100% 98,87% 98,14% 97,30% 1,2 100% 98,12% 98,08% 98,03% Nhận xét: về cảm quan chế phẩm Intaxel® sau khi pha loãng dung dịch trong duy trì đến 72 giờ, nồng độ PTX duy trì trên 90% sau 72 giờ pha loãng, đạt yêu cầu trị liệu. Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX dựa trên tạo phức với HPβCD Khảo sát ảnh hưởng của HPβCD lên khả năng cải thiện độ tan của PTX Kết quả khảo sát trình bày tại bảng 6. Với lượng HPβCD thấp (tỉ lệ mol PTX : HPβCD từ 1 : 1 đến 1 : 300) thì dung dịch sau khi pha loãng tủa ngay. Với tỉ lệ PTX : HPβCD là 1 : 360 và 1 : 400, dịch pha loãng tại thời điểm lúc đầu trong, chứng tỏ lượng HPβCD sử dụng đủ để tạo phức bao với PTX. Tuy nhiên khi quan sát thêm 1 giờ, dung dịch tủa chứng tỏ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 364 phức tạo thành không ổn định và cần phải sử dụng thêm tá dược để ổn định phức. Tỉ lệ PTX: HPβCD phù hợp là 1 : 360 (kl/kl). Bảng 6. Tính chất cảm quan các mẫu sau khi pha loãng Tỉ lệ PTX : HPβCD Quan sát dịch đậm đặc Quan sát dịch pha loãng 0 giờ 1 giờ 1 : 1 + - - 1 : 2 + - - 1 : 3 + - - 1 : 100 + - - 1 : 200 + - - 1 : 300 + - - 1 : 360 + + - 1 : 400 + + - * Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch có tủa. Khảo sát ảnh hưởng chất trợ tan polysorbat- 80 Trên tính chất cảm quan Kết quả khảo sát trình bày tại bảng 7. Dung dịch pha loãng quan sát tại thời điểm 0 giờ trong, chứng tỏ polysorbat 80 từ 1% đến 8% có tác động giúp ổn định phức. Thời gian duy trì độ ổn định phức tỉ lệ thuận với nồng độ polysorbat 80 sử dụng. Cụ thể để duy trì độ trong đến 24 giờ sau, polysorbat 80 tối thiểu phải là 5%. Để duy trì độ trong đến 48 giờ sau, polysorbat 80 phải là 8%. Tại nồng độ polysorbat 80 6% và 7% sau 48 giờ có xuất hiện tủa nhẹ. Bảng 7. Kết quả đánh giá cảm quan dung dịch pha loãng Thời gian quan sát Nồng độ polysorbat 80 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 0 giờ + + + + + + + + 24 giờ ↓ ↓ ↓ ↓ + + + + 48 giờ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ - - + Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch tủa nhẹ, (↓) biểu thị dung dịch tủa nhiều Trên nồng độ paclitaxel Kết quả khảo sát nồng độ PTX trình bày tại bảng 8. Tại thời điểm 24 giờ, với lượng polysorbat 80 từ 5 đến 8%, PTX duy trì hàm lượng trên 90%, đạt yêu cầu về hàm lượng. Tuy nhiên để duy trì hàm lượng trên 90% sau 48 giờ, nồng độ polysorbat 80 phải từ 6% trở lên. Kết quả khảo sát ảnh hưởng polysorbat 80 trên tính cảm quan và nồng độ có tương đồng với nhau. Tại nồng độ polysorbat 80 5%, dung dịch sau 48 giờ tủa nhiều và hàm lượng không được duy trì (còn lại 79,47% so với lúc đầu). Tại nồng độ polysorbat 80 6%, dung dịch sau 48 giờ tủa nhẹ nhưng hàm lượng vẫn đạt yêu cầu (còn lại 90,17%). Kết luận nồng độ polysorbat 80 thích hợp là 6% để dịch pha loãng vẫn đạt yêu cầu trị liệu sau gần 48 giờ. Bảng 8. Kết quả định lượng PTX với nồng độ polysorbat 80 từ 5 đến 8% Thời gian (giờ) Nồng độ Polysorbat 80 5% 6% 7% 8% C% %PTX C% %PTX C% %PTX C% %PTX 0 0,599 100 0,600 100 0,603 100 0,605 100 24 0,552 92,15 0,568 94,66 0,577 95,69 0,571 94,38 48 0,476 79,47 0,547 90,17 0,558 92,53 0,567 93,72 Với C% là nồng độ PTX (mg/ml), %PTX là hàm lượng PTX tính theo thời gian Khảo sát một số nồng độ pha loãng khác trong dãy nồng độ trị liệu Với nồng độ 1,2 mg/ml ; thể tích pha loãng cuối cùng là 10 ml (ứng với lượng PTX là 12 mg) không đủ để hòa tan 7,1 g HPβCD. Kết quả đánh giá cảm quan các mẫu trình bày tại bảng 9. Bảng 9. Kết quả đánh giá cảm quan với polysorbat 80 6% Thời gian quan sát Nồng độ pha loãng (mg/ml) 0,3 0,6 0,9 1,2 0 giờ + + ↓ Không khảo sát 24 giờ + + ↓ 48 giờ + - ↓ Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch tủa nhẹ, (↓) biểu thị dung dịch tủa nhiều. Nhận xét : dung dịch đậm đặc có thể pha loãng đạt nồng độ PTX từ 0,3 mg/ml đến 0,6 mg/ml. Khi pha loãng đến nồng độ PTX 0,3 mg/ml, polysorbat 80 tuy bị pha loãng đến 3% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 365 nhưng vẫn giúp ổn định được phức. Điều này cho thấy với nồng độ PTX thấp, nồng độ polysorbat 80 cần để duy trì phức ổn định cũng thấp hơn. Tại nồng độ PTX 0,9 mg/ml và 1,2 mg/ml, dung dịch sau khi pha loãng tủa không đạt yêu cầu cảm quan. Khảo sát độ ổn định hàm lượng trong 24 giờ Về mặt cảm quan, 6 mẫu tại cuối thời điểm quan sát (24 giờ) vẫn trong. Kết quả khảo sát nồng độ trình bày tại bảng 10 và hình 3. Bảng 10. Kết quả khảo sát hàm lượng trong thời gian 24 giờ Nồng độ 0,3 mg/ml 0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ C%PTX 0,301 0,298 0,300 0,299 0,298 0,295 0,293 % PTX 100 99,00 99,67 99,34 99,00 98,01 97,34 Nồng độ 0,6 mg/ml 0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ C%PTX 0,590 0,584 0,589 0,585 0,584 0,568 0,562 % PTX 100 98,98 99,83 99,15 98,98 96,27 95,25 95 96 97 98 99 100 0 4 8 12 16 20 24 Th?i gian (gi?) % PTX PTX 0.3 mg/ml PTX 0.6 mg/ml Hình 3. Đồ thị biểu diễn nồng độ trong thời gian 24 giờ Kết quả đo pH trong thời gian 24 giờ đều cho kết quả trong khoảng 4-6 cho cả hai nồng độ. Nhận xét: Với tỉ lệ HPβCD : PTX là 360 : 1, sử dụng polysorbat 80 6%, trong thời gian 24 giờ, dung dịch đậm đặc sau khi pha loãng thành 0,3 mg/ml và 0,6 mg/ml có nồng độ PTX luôn duy trì trên 95% và pH trong khoảng cho phép đối với thuốc tiêm chứa PTX (USP 34)6. Cuối thời điểm quan sát hai dung dịch vẫn trong. Công thức lựa chọn đạt tiêu chí cảm quan và yêu cầu về hàm lượng PTX trong trị liệu. Đánh giá ảnh hưởng ethanol lên độ tan phức PTX với HPβCD Sau khi loại dung môi, thu được một khối bột xốp tan tốt khi hòa tan với dung dịch NaCl 0,9%. Kết quả khảo sát hàm lượng PTX của các mẫu trình bày tại bảng 11. Bảng 11. Hàm lượng PTX tại 0 giờ và 24 giờ Nồng độ PTX mg/ml Nồng độ Polysorbat 80 (%) Nồng độ PTX (mg/ml) 0 giờ 24 giờ % còn lại sau 24 giờ 0,3 3 0,307 0,298 95,44 0,6 6 0,583 0,534 91,60 Nhận xét: Cắn thu được sau quá trình loại dung môi có khả năng hòa tan tốt trong dung dịch NaCl 0,9%. Tại nồng độ PTX 0,3 mg/ml, nồng độ duy trì sau 24 giờ trên 90%, tuy nhiên hàm lượng PTX còn lại thấp hơn so với việc pha loãng không loại dung môi. Tại nồng độ PTX 0,6 mg/ml, hàm lượng PTX vẫn duy trì trên 90% sau 24 giờ, tuy nhiên hàm lượng PTX thấp hơn so với phương pháp không loại dung môi đã nghiên cứu ở trên. So sánh với chế phẩm đối chiếu Công thức lựa chọn là sử dụng tỉ lệ tạo phức PTX:HPβCD 1:360, sử dụng polysorbate-80 nồng độ 6% làm chất ổn định. Pha chế công thức với lượng lớn gấp 30 lần công thức gốc, tiến hành pha loãng với dung môi pha tiêm NaCl 0,9%. Định lượng các dung dịch pha loãng, đánh giá hàm lượng PTX duy trì tại thời điểm 0 giờ, 27 giờ và 48 giờ sau khi pha. So sánh đồng thời với chế phẩm đối chiếu Intaxel®. Kết quả so sánh hàm lượng và cảm quan được thể hiện tại bảng 12 và bảng 13. - Chế phẩm Intaxel® cho dung dịch pha loãng ổn định trong 72 giờ, hàm lượng PTX duy trì luôn duy trì trên 98%. - Công thức lựa chọn khi pha loãng tại nồng độ 0,3 mg/ml ổn định trong 72 giờ, lượng PTX duy trì trên 90% đạt yêu cầu trị liệu. Tuy nhiên công thức pha loãng tại nồng độ 0,6 mg/ml chỉ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 366 đạt ổn định đến 27 giờ, hàm lượng PTX chỉ duy trì trên 90% trong thời gian 48 giờ. Bảng 12. So sánh hàm lượng công thức lựa chọn và Intaxel® Nồng độ Mẫu quan sát Hàm lượng PTX duy trì (%) 0 giờ 27 giờ 48 giờ 72 giờ 0,3 mg/ml T1 100 96,85 94,77 92,04 Intaxel® 100 99,60 98,86 98,13 0,6 mg/ml T2 100 94,42 90,91 83,26 Intaxel® 100 98,87 98,14 98,03 T1: công thức lựa chọn pha loãng tại nồng độ PTX 0,3 mg/ml. T2: công thức lựa chọn pha loãng tại nồng độ PTX 0,6 mg/ml. - Kết quả khảo sát cho thấy công thức lựa chọn sử dụng tỉ lệ tạo phức PTX:HPβCD 1:360 và polysorbat 80 là 6% có thời gian ổn định và duy trì hàm lượng kém hơn so với chế phẩm đối chiếu. Thời gian tối ưu sử dụng là 27 giờ sau khi pha loãng. Bảng 13. So sánh cảm quan công thức lựa chọn và Intaxel® Nồng độ Mẫu quan sát Thời gian quan sát 0 giờ 27 giờ 48 giờ 27 giờ 0,3 mg/ml T1 + + + + Intaxel® + + + + 0,6 mg/ml T2 + + - - Intaxel® + + + + Với (+) biểu thị dung dịch trong, (-) biểu thị dung dịch tủa. Nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế dung dịch đậm đặc PTX có thể dùng pha tiêm Sơ đồ 4. Quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa Paclitaxel - Dung dịch đậm đặc được lọc qua màng 0,22 µm sau đó đóng vào lọ đã được tiệt trùng có dung tích 20 ml và được bịt kín bằng nút cao su đã được tiệt trùng. Tiến hành đánh giá cảm quan, pH, nồng độ PTX và đánh giá độ vô trùng chế phẩm. - Quy trình điều chế dung dịch đậm đặc chứa PTX là hòa tan đơn giản được trình bày trong sơ đồ 4. KẾT QUẢ - Cảm quan: Dung dịch thu được có màu 750 mg PTX 443 g HPβCD Dung dịch chứa PTX trong ethanol tuyệt đối Dung dịch chứa HPβCD trong nước - ethanol Hòa tan trong 150 ml ethanol tuyệt đối (siêu âm đến tan) Hòa tan từ từ vào hỗn hợp 450 ml nước và 300 ml ethanol Phối hợp 2 dung dịch, khuấy trộn trong 2 giờ (không gia nhiệt) 975 ml dung dịch đậm đặc chứa 750 mg PTX 75 ml polysorbat 80 Lọc qua màng 0,22 µm Lọ thủy tinh, nắp cao su tiệt trùng Đóng lọ Dung dịch đậm đặc chứa 30 mg PTX mỗi lọ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 367 vàng nhạt, trong suốt, hơi nhớt và pH từ 4 đến 6. Kết quả đánh giá hàm lượng được trình bày trong bảng 14. Bảng 14. Kết quả định lượng (n=6) Nồng độ Hàm lượng duy trì (%) 0 giờ 27 giờ 0,3 mg/ml 100 96,15 0,6 mg/ml 100 93,97 KẾT LUẬN Quy trình định lượng PTX trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng đầu dò PDA đề ra đã được thẩm định đạt yêu cầu của một quy trình phân tích. Việc áp dụng chương trình gradient nồng độ pha động đã giúp rút ngắn thời gian phân tích đáng kể nhưng vẫn đảm bảo được độ chính xác của kết quả phân tích. Phương pháp tạo phức PTX với HPβCD sử dụng polysorbat 80 làm chất ổn định đã cải thiện được độ tan của PTX. Dung dịch pha loãng từ dung dịch đậm đặc ban đầu có khả năng duy trì nồng độ PTX trong giới hạn trị liệu cho phép trong 27 giờ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brewster ME, Loftsson T (2007), “Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers”, Advanced Drug Delivery Reviews, 59(7), 645-666. 2. Hamada H, Ishihara K, Masuoka N, Mikuni K, Nakajima N (2006), “Enhancement of water-solubility and bioactivity of paclitaxel using modified cyclodextrins”, Journal of Bioschience and Bioenginerring, 102(4), 369-371. 3. Singla AK, Garg A, Aggarwal D (2002), “Paclitaxel and its formulations”, International Journal of Pharmaceutics, 235(1-2), 179- 192. 4. Stella VJ, Mathew AE (1990), “Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof”, United States Patent, US 4 960 790. 5. Straubinger RM, Sharma US, Balasubbramanian SV (1995), “Pharmaceutical and Physical Properties of Paclitaxel (Toxol®) Complexes with Cyclodextrin”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 84(10), 1223-1230. 6. Strickley RG (2004), “Solubilizing excipients in oral and injectable formulations”, Pharmaceutical Research, 21(2), 201- 230. 7. United State Pharmacopoeia (USP34-NF29) (2012), CD-ROM. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014