Nghiên cứu cơ chế gây bệnh thoái hóa não xốp của Protein prion do đột biến mất vị trí gắn đồng

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 232 NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ GÂY BỆNH THOÁI HÓA NÃO XỐP   CỦA PROTEIN PRION DO ĐỘT BIẾN MẤT VỊ TRÍ GẮN ĐỒNG  Mai Phương Thảo*  TÓM TẮT  Mục  tiêu: Nghiên cứu những thay đổi trong quá trình trưởng thành và sự di chuyển của protein prion  (PrP) đột biến mất khả năng gắn đồng trong tế bào.  Đối tượng – Phương pháp: Phân tích tính chất sinh hóa PrP đột biến và sự phân bố protein ở dòng tế bào  chuột N2a (neuroblastoma) bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang tế bào (immunocytochemistry).   Kết quả: Protein đột biến mất khả năng gắn đồng mang đặc tính glycosyl hóa giống protein bình thường.  Đột biến tại histidine 95 (H95Y) kháng với protease ngay cả khi biểu hiện ở tế bào bình thường không nhiễm  prion và tích tụ chủ yếu tại early và recycling endosome.   Kết  luận: Chúng tôi xác định được đặc tính kháng protease của đột biến H95Y không liên quan đến quá  trình tổng hợp của protein. Hơn nữa, early và recycling endosome có thể là bào quan chính nơi xảy ra quá trình  biến đổi cấu trúc thành dạng prion gây bệnh.  TỪ KHÓA: Thoái hóa não xốp (bệnh prion), protein prion (PrP), protein bệnh lý (PrPSc), gắn đồng, đoạn  trình tự “8 amino acid lặp lại” (OR), kháng PK, H95Y, glycosyl hóa, vận chuyển nội bào, bào quan endosome,  amyloid, thioflavin.  ABSTRACT  MECHANISMS OF MUTATION IN COPPER BINDING SITES OF PRION PROTEIN LEADING TO  PRION FORMATION  Mai Phuong Thao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 232 ‐ 242  Objective:  Elucidating  cellular  maturation  and  distribution  processes  of  mutants  carrying  copper  bindingsite substitution in prion protein.  Materials  – Methods: Using  the mutagenesis  on  histidine  residues,  analyzing  protein  glycosylation,  protease‐resistance and protein distribution in N2a cells by immunofluorescence.  Results: Mutant proteins shared similar glycosylation patterns as wild‐type PrP. Mutation H95Y acquired  PK‐resistance even when expressed in normal cell line. Moreover, H95Y proteins are accumulated in early and  recycling endosomes.  Conclusion: We  found  that  the protease‐resistance  of H95Y mutation  is not  related  to  its  synthesis.  In  addition, early and recycling endosomes could be the main sites for prion conversion.   Key words: Prion diseases, prion protein  (PrP), PrP  scarpie  (PrPSc),  copper binding,  octapeptide  repeat  region (OR), PK‐resistance, H95Y, glycosylation, endocytosis, endosome, amyloid, thioflavin.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Prion  hay  thoái  hóa  não  dạng  xốp  là một  bệnh  lý  gây  ra  do  sự  biến  đổi  cấu  trúc  của  protein  PrPC  (cellular)  bình  thường  sang  dạng  gây  bệnh  PrPSc  (scrapie).  PrPC  là  một  protein  màng, bám trên bề mặt tế bào. Tại đây, PrPC có  thể  tương  tác  với  nhiều  loại protein  cũng như  các yếu tố khác nhau, có thể có liên quan đến cơ  chế bệnh sinh của bệnh prion. Từ bề mặt tế bào,  PrPC quay trở lại bào tương bằng con đường vận  chuyển nội bào “endocytosis”(21), đi đến các bào  quan  endosome,  và  cuối  cùng  bị phân hủy  tại  lysosome hoặc được đưa trở lại bề mặt tế bào để  * Bộ môn Sinh lý học, ĐH Y Dược TpHCM  Tác giả liên lạc: TS Mai Phương Thảo  ĐT: 091832 9999   Email: maithao292@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 233 tiếp  tục  thực hiện chức năng  trên màng  tế bào.  Ngoài  con  đường  luân  chuyển  này,  các  dạng  PrPC khác cũng được phát hiện trên mô hình tế  bào  cũng như  in vivo. Các nghiên  cứu gần  đây  cho  thấy PrP có khả năng biến đổi qua  lại giữa  dạng  gắn  bên  ngoài màng  tế  bào  và dạng  nội  bào(8, 9).  Vai  trò và  chức năng  của PrP màng  tế bào  vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ nhưng rõ ràng  là PrPC có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh  sinh  của prion(8). Protein PrP  trên màng  tế bào  được  sinh  tổng  hợp  từ  lưới  nội  sinh  chất  (Endoplasmic reticulum, ER) và chiếm dưới 10%  tồng lượng PrP. Giống như các loại protein khác  được tổng hợp từ ER, một lượng PrP nhất định  gấp  cuộn  sai  và  được di  chuyển ngược  trở  lại  vào trong nội bào và cuối cùng là bị giáng hóa ở  các  proteasome.  Khi  chức  năng  của  các  proteasome bị  rối  loạn, PrP  sẽ  tích  tụ  lại  ở nội  bào, tuy nhiên cơ chế gây bệnh cụ thể của lượng  PrP  tích  tụ  này  vẫn  còn  phải  làm  sáng  tỏ(3,26).  Nghiên cứu của chúng  tôi nhằm mục  đích cho  thấy sự  tích  tụ PrP nội bào có  thể  là chìa khóa  kích hoạt bệnh lý thoái hóa thần kinh prion.  ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Plasmid dùng để biến nạp vào tế bào  Các  đột  biến  điểm  thay  thế  histidine  bằng  tyrosine  (H60Y, H68Y, H76Y, H84Y, H95Y)  có  gắn  đuôi  3F4  (L108M, V111M)  được  nhân  bản  (clone) vào vector pcDNA3.1 mang gen mã hóa  PrP  chuột  (MoPrP(1‐254))  bằng  kit  Quick  Change  site‐directed  mutagenesis  (Stratagene).  Tế  bào  chuột  N2a  (mouse  neuroblastoma  cell  line) và tế bào chuột nhiễm prion ScN2a (prion‐ infected neuroblastoma cell  line) được nuôi cấy  trong môi trường Opti‐MEM (GIBCO) chứa 10%  huyết  thanh  bê  (FBS)  và  1%  penicillin‐ streptomycin ở 37°C, 5% CO2. Biến nạp tạm thời  (transient  transfection)  được  thực hiện bằng X‐ treme  gene  DNA  transfection  (Roche  Biochemicals) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.  Sau khi biến nạp 72 giờ, dịch tế bào sẽ được thu  và phân tích.  Thí nghiệm về tính chất sinh hóa của PrPSc  và PrPC  Các  tế bào  được  ly giải  trong dung dịch  ly  giải  (chứa  10  mM  Tris–HCl  pH  8.0,  150  mM  NaCl,  0.5%  Nonidet  P‐40  substitute,  0.5%  sodium deoxycholate), phần chất ly giải sẽ được  định  lượng  nồng  độ  protein  bằng  BCA  kit  (Pierce) và được trữ ở nhiệt độ ‐20oC cho đến khi  sử dụng.   Trong phản ứng cắt bằng enzyme protease K  (PK, Roche) để nhận diện PrPSc, protein được ủ  với PK ở 37oC hoặc ở 25oC. Để ngừng phản ứng,  chúng  tôi  dùng  dung  dịch  phenylmethyl‐ sulphonyl  fluoride  (PMSF)  2mM.  Sau  đó,  các  mẫu  protein  sẽ  được  siêu  ly  tâm  với  vận  tốc  100,000g  trong  vòng  1  giờ  ở  4°C  (Optima  TL,  Beckman Coulter, Inc.). Khối kết tủa sẽ được tái  hòa tan trong dung dịch nạp mẫu.   Để  đánh  giá  mức  độ  trưởng  thành  của  protein đột biến, chúng tôi tiến hành khảo sát sự  glycosyl hóa  của protein,  sử dụng  cặp  enzyme  Endoglycosidase H (EndoH) và PNGAse F (New  England  Biolabs).  Phản  ứng  được  thực  hiện  ở  37oC  và  ủ  trong  16  giờ.  Để  ngừng  phản  ứng,  chúng tôi hòa tan trong dung dịch nạp mẫu. Các  mẫu này sẽ được chạy điện di SDS‐PAGE 10%  và  lai  với  kháng  thể  3F4  (Covance)  phát  hiện  PrP. Hình ảnh kết quả Western blot này sẽ được  chụp  bằng  phần  mềm  UVI  Soft  (UVITEC,  Cambridge).  Hóa  tế  bào  miễn  dịch  (Immunocytochemistry)  Tế bào N2a được nuôi  trên các  lame được  phủ poly‐L‐lysine  trong vòng 24 giờ và  được  cố định bằng paraformaldehyde (PFA) 4%. Các  tế  bào  này  sẽ  được  ủ  với  kháng  thể  1  trong  vòng  12  giờ  ở  nhiệt  độ  4oC  trong  dung  dịch  blocking chứa 0.2% Triton X‐100 (nhằm phá vỡ  cấu  trúc màng  tế  bào,  giúp  các  kháng  thể  có  thể  dễ  dàng  xâm  nhập  nội  bào). Ngày  hôm  sau, các tế bào được rửa và ủ với kháng thể 2  có gắn huỳnh quang  trong vòng 1 giờ ở nhiệt  độ phòng. Riêng  trong  thí nghiệm nhằm phát  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 234 hiện PrP ở bề mặt tế bào thì các tế bào được ủ  với kháng thể kháng 3F4 ở 4°C trong vòng 15  phút mà  không  cần  dung  dịch  Triton  X‐100  0.2%. Để phát hiện PrP nội bào, ban đầu các tế  bào  được  ủ với kháng  thể 3F4  trong vòng 15  phút  ở  4°C,  và  sau  đó  được  ủ  ở  37oC  trong  vòng  1  giờ  nhằm  giúp  cho  các  protein  được  đánh dấu  ở bề mặt  tế bào di chuyển vào bên  trong  tế bào. Tiếp  theo,  các  tế bào  sẽ  được  ủ  với  trypsin  0.5%  (Sigma)  nhằm  loại  bỏ  tất  cả  các protein còn sót lại trên màng(18). Sau đó, các  tế bào được ủ với kháng thể 2 AlexaFlour‐488  trong dung dịch có chứa Triton X‐100.   Để  phát  hiện  các  kết  tụ  bằng  Thioflavin‐S  (ThS), tế bào được cố định bằng PFA 4% và rửa  với  dung  dịch  PBS  có  chứa  Triton  X‐100  0,2%(19,25).   Đối  với  các  bào  quan,  chúng  tôi  sử  dụng  kháng thể anti‐Calnexin (lưới nội sinh chất), anti‐ EEA1  (cho  early  endosome),  anti‐Tfn  (cho  recycling  endosome),  anti‐M6PR  (cho  late  endosomes) và anti‐LAMP2 (cho lysosomes). Tất  cả các kháng thể này được cung cấp bởi công ty  Abcam  và  được  sử dụng  theo  đúng  quy  trình  hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhân tế bào được  nhuộm bằng DAPI (VECTOR Laboratories). Các  hình ảnh được chụp và xử  lí bằng kính hiển vi  confocal  Leica  DMIR2  và  phần  mềm  Leica  Confocal (Leica).  Phân tích thống kê  T‐test được dùng để phân tích và so sánh các  kết  quả.  Sự  khác  biệt  có  ý  nghĩa  thống  kê  khi  p<0.05. Tất cả các dữ  liệu được phân  tích bằng  phần mềm Origin 8.6    KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU   Đột biến vị trí gắn đồng H95Y làm tăng đặc  tính kháng protease‐K (PK) khi biểu hiện ở  tế bào N2a  Đặc  tính kháng PK  thường  được  sử dụng  để phân biệt giữa dạng bình thường (PrPC) và  dạng gây bệnh  (PrPSc)  của protein prion  (5, 15).  Từ kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy đột  biến H95Y  làm tăng  lượng PrPSc khi biểu hiện  trên  dòng  tế  bào  được  gây  nhiễm  prion  ‐  ScN2a, chúng tôi tiến hành khảo sát trên dòng  tế bào bình thường N2a chỉ biểu hiện PrPC nội  sinh. Câu hỏi được đặt ra là liệu khi không có  sự hiện diện của dạng gây bệnh PrPSc, protein  đột biến H95Y  có khả năng hình  thành dạng  kháng PK hay không. Để kiểm chứng giả thiết  này,  tế bào N2a được biến nạp biểu hiện  tạm  thời WT‐PrP hoặc  đột biến H95Y và  được xử  lý ở các điều kiện phản ứng cắt PK khác nhau.  Chúng tôi ghi nhận ở nồng độ PK là 2 μg/mL,  sau phản ứng cắt  tín hiệu của PrP vẫn có  thể  quan sát thấy được ở tế bào N2a biểu hiện đột  biến H95Y,  trong khi ở dòng  tế bao biểu hiện  WT‐PrP không  thấy được bất kỳ  tín hiệu nào  khi thực hiện phản ứng cắt ở nồng độ PK là 2  và 5 μg/mL (Hình 1A).   Để hiểu rõ hơn về  tính bền của protein đột  biến, chúng tôi tiến hành đặt phản ứng cắt ở các  điều kiện khác nhau. Phản ứng được thực hiện ở  nhiệt độ 25°C thay vì 37°C để khảo sát quá trình  cắt PK thuận tiện hơn. Dịch tế bào thu được từ tế  bào N2a  biểu  hiện WT‐PrP  và  đột  biến H95Y  được  xử  lý  với  nồng  độ  enzyme PK  tăng dần  trong 30 phút  (Hình 1B); hoặc đặt phản ứng  ở  cùng điều kiện nồng độ PK (tỉ lệ theo khối lượng  protein:PK  là 250:1) nhưng  ủ  trong  các khoảng  thời gian khác nhau (Hình 1C). Chúng tôi quan  sát  thấy ở nồng độ PK  là 2 và 15μg/mL, không  có  sự khác biệt giữa protein WT và H95Y  (p >  0,05)  (Hình  1B).  Tuy  nhiên  ở  các  nồng  độ  PK  trung gian  (3 và 10μg/mL), H95Y kháng PK  rõ  rệt (p < 0,05) (Hình 1B). Chúng tôi tiếp tục khảo  sát tính bền của H95Y theo thời gian. Tính kháng  PK của H95Y cao hơn hẳn so với protein WT ở  các thời điểm phản ứng (Hình 1C) và ghi nhận  protein  đột  biến H95Y  bền  hơn  dưới  các  điều  kiện khảo sát.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 235 Hình 1. Đột biến H95Y làm tăng tính kháng PK khi biểu hiện ở tế bào N2a. Tế bào N2a cells biểu hiện  WT‐PrP và đột biến H95Y. (A) Dịch tế bào thu được xử lý với enzyme PK nồng độ là 2 hoặc 5 μg/mL ở nhiệt  độ 37oC trong 30 phút. Cùng một tấm màng được hiện phim nhanh (30 giây) hoặc lâu (6 phút). PrP được nhận  diện bằng kháng thể 3F4 kháng PrP. Actin được dùng làm chứng lượng mẫu nạp như nhau ở các giếng. (B)  Dịch tế bào được xử lý ở các nồng độ PK khác nhau ở điều kiện 25oC trong 30 phút; hoặc (C) ủ với PK 2 μg/mL  PK trong các khoảng thời gian khác nhau ở điều kiện 25oC. Tỉ lệ phần trăm mức độ kháng protease được tính  toán dựa trên tỉ lệ tín hiệu kháng PK ở từng điều kiện phản ứng rồi so sánh giá trị kháng PK theo nồng độ và  theo thời gian (n = 3, *p< 0.05).   Đột  biến  trong  đoạn  OR  và  non‐OR  có  cùng đặc điểm glycosyl hóa giống protein  bình thường (wild‐type) PrPC  Để tìm hiểu thêm về tính kháng PK của đột  biến H95Y có phải do  thay đổi  trong quá  trình  hình thành của protein trong tế bào hay không,  chúng tôi phân tích tính chất glycosyl hóa của tất  cả các đột biến liên quan đến histidine gắn đồng  trong  đoạn  OR  và  histidine  95.  Kết  quả  lai  Western blot cho thấy tất cả các protein đột biến  đều  được  glycosyl  hóa,  thể  hiện  bằng  3  vạch  tương  ứng  với  các  dạng  diglycosyl,  monoglycosyl và unglycosyl giống như protein  bình thường WT PrPC (Hình 2A).  PrPC được tổng hợp trong hệ thống  lưới nội  bào ER. Trong quá  trình sinh tổng hợp, protein  sẽ được gắn thêm các chuỗi oligosaccharide, cầu  nối disulfid và đuôi GPI. Tất cả các quá trình này  diễn  ra  trong ER  và  bộ Golgi,  và protein PrPC  trưởng thành sẽ gắn vào mặt ngoài màng tế bào  thông qua đuôi GPI. Để khảo sát tính chất sinh  hóa của các protein đột biến, chúng tôi thưc hiện  thí nghiệm khử glycosyl bằng cách sử dụng cặp  enzyme  Endoglycosidase‐H  (Endo‐H)  and  PNGase‐F.  Endo‐H  chỉ  có  thể  loại  bỏ  các  mannose  oligosaccharides  bậc  cao,  trong  khi  PNGase‐F loại bỏ tất cả các oligosaccharides gắn  vào  asparagine  trên  chuỗi  phân  tử  protein.  Enzyme  Endo‐H  được  dùng  để  đánh  giá  xem  quá  trình  glycosyl  hóa  của  protein  trong  bộ  Golgi (13). Vì vậy, nhạy với phản ứng cắt Endo‐H  là một dấu hiệu của protein chưa trưởng thành,  ngược  lại  protein  đã  vận  chuyển  qua Golgi  sẽ  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 236 kháng  Endo‐H. Kết  quả  lai  với  kháng  thể  3F4  nhận diện protein đột biến biểu hiện trong tế bào  N2a  cho  thấy  không  có  sự  khác  biệt  giữa  các  dạng glycosyl của các protein đột biến và protein  WT khi  xử  lý dịch  tế bào bằng Endo‐H  (Hình  2B). Kết quả  tương  tự được ghi nhận khi  thực  hiện phản ứng với PNGase‐F cho 1 vạch  tương  ứng có kích thước phân tử tương ứng với dang  unglycosyl của PrP, giống nhau giữa các protein  đột biến và protein WT (Hình 2C).   Hình 2. Đột biến trong đoạn OR và non‐OR có  cùng đặc điểm glycosyl với WT MoPrPC. Tế bào  N2a được biến nạp biểu hiện tạm thời WT and đột  biến  PrP  có  gắn  3F4.  (A)  Năm  mươi  μg  protein  ược nạp vào các giếng. (B) Dịch tế bào được xử lý  bằng  enzyme  Endo‐H  hoặc  (C)  PNGase‐F.  Protein  biến nạp được nhận diện bằng kháng thể 3F4 kháng  PrP.  Vị  trí  các  dạng  diglycosyl,  monoglycosyl  và  unglycosyl  (viết  tắt  là  di, mono  and  un)  của PrPC  được đánh dấu phía bên phải của màng. Mock  là tế  bào được biến nạp với plasmid không mã hóa PrP.  Protein đột biến H95Y lắng đọng nội bào  Trong thí nghiệm này, chúng tôi quan sát sự  phân  bố  của  các protein  đột  biến  trong  tế  bào  N2a dưới kính hiển vi và sử dụng kháng thể 3F4  đặc  hiệu  chỉ  nhận diện protein  được  biến  nạp  vào  tế bào. Protein WT‐PrP và  các protein PrP  đột biến biểu hiện  chủ yếu  trên bề mặt  tế bào,  với một số protein lắng đọng khu vực gần nhân.  Kết quả quan sát được tương tự các nghiên cứu  trước đây về phân bố của PrP trong tế bào  (16, 18)  (Hình 3 và 4). Quan  sát dòng  tế bào biểu hiện  H95Y chúng  tôi nhận  thấy một số  tế bào có sự  lắng tụ PrP nội bào, biểu hiện bằng tăng tín hiệu  huỳnh quang (Hình 3, khung H95Y).   Một  trong  những  đặc  điểm  phổ  biến  của  PrPSc là sự tích tụ protein nội bào(7, 22). Vấn đề đặt  ra ở đây là hình ảnh H95Y kết tụ nội bào có phải  là dấu hiệu chỉ điểm của prion hay không.   Bệnh prion gây  ra do  các protein gấp  cuộn  sai  cấu  trúc  kết  tủa  lại  tạo  thành  mảng  xơ  amyloid, đặc trưng bởi cấu trúc dạng phiến β (β  –sheet). Cấu trúc phiến β có thể phát hiện được  bằng một số thuốc nhuộm đặc hiệu như Congo  Red và các thuốc nhuộm có thiazole (Thioflavin‐ S và Thioflavin‐T). Trong thí nghiệm này, chúng  tôi nhuộm  tế bào với kháng  thể nhận diện PrP  và Thioflavin‐S  (ThS) để hiểu  thêm về cấu  trúc  của protein  đột biến H95Y. Tế bào N2a  (chỉ  có  PrPC) và tế bào ScN2a (có cả PrPC và PrPSc) được  sử dụng làm chứng âm và chứng dương để xác  định  tín hiệu của ThS  là do  tủa  lắng đọng chứ  không phải tín hiệu nhiễu. Kết quả cho thấy chỉ  tế  bào  scrapie  có  PrPSc mới  cho  tín  hiệu  ThS  dương tính. Ở tế bào N2a biểu hiện H95Y3F4, chỉ  có một số  thành phần  lắng đọng gần nhân cho  tín hiệu với ThS, trong khi hầu hết các vùng khác  của tế bào không ghi nhận bất kì tín hiệu nào của  ThS  (Hình  5).  Để  khẳng  định  giả  thuyết  tủa  H95Y3F4 có thể mang đặc điểm của prion, chúng  tôi thực hiện thí nghiệm phát hiện PrPSc bằng kỹ  thuật  miễn  dịch  huỳnh  quang  (immunofluorescence)(24). Kết quả  trong Hình 6  cho thấy tín hiệu của PrPC ở tế bào N2a biến mất  trong  khi  tín  hiệu  của PrPSc  tập  trung  chủ  yếu  bên trong tế bào có thể quan sát rất rõ sau khi xử  lý tế bào với enzyme PK.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 237 Hình 3. H95Y PrP lắng đọng ở vùng cạnh nhân trong tế bào N2a khi quan sát dưới kính hiển vi. PrP  biến nạp trong tế bào N2a được nhận diện bởi kháng thể 3F4 kháng PrP. Một số tế bào được quan sát ở độ  phóng đại cao hơn. Tín hiệu huỳnh quang của nhân màu xanh dương, PrP màu xanh lá cây. Thước chuẩn: 24 μm.  Protein  đột  biến H95Y  kết  tụ  chủ  yếu  ở  early và recycling endosomes   Quá  trình  biến  đổi  cấu  hình  từ  dạng  bình  thường PrPC sang dạng  gây  bệnh PrPSc  là hiện  tượng  chính  yếu  trong  cơ  chế  bệnh  sinh  của  bệnh. Nơi diễn ra quá trình biến đổi cấu trúc của  PrP nội bào vẫn  chưa  được xác  định. Tùy vào  mô hình nghiên cứu, người ta đưa ra giả thiết về  các  bào  quan  khác  nhau  có  liên  quan(1,2,4,6,16,20).  Chúng  tôi  tiến hành  khảo  sát  chọn  lọc một  số  bào quan và xác định xem protein H95Y lắng tụ  trong  bào  quan  nào  bằng  cách  quan  sát  dưới  kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả này sẽ giúp  gợi ý nơi diễn  ra hiện  tượng biến  đổi  cấu  trúc  prion.  Hầu hết WT‐PrPC  biểu hiện  trên  bề mặt  tế  bào, một  số  ít  tín  hiệu  của PrP  được  tìm  thấy  trùng  với  tín  hiệu  của  endosome  và  lysosome  (Hình 7A), gợi ý sự hiện diện của protein trong  các bào quan này. Kết quả này  tương đồng với  các nghiên cứu trước đây phân tích sự phân bố  của WT‐PrPC ở các dòng tế bào khác nhau  (12, 17).  Sự phân bố của protein đột biến ở các tế bào biểu  hiểu  hiện  H95Y  tại  các  bào  quan  khác  nhau  tương tự như tế bào biểu hiện WT PrPC. Kết quả  nhuộm miễn  dịch  huỳnh  quang  với  Calnexin  (chất  đánh  dấu  lưới  nội  bào  ER)  cho  thấy  các  protein đột biến có di chuyển qua hệ thống lưới  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 238 nội  bào. Cùng  với  kết  quả  phân  tích  sinh  hóa  (Hình 2B và 2C) cho thấy protein đột biến H95Y  không bị  lắng tụ ở hệ thống  lưới nội bào. Phần  lớn tín hiệu của H95Y nội bào trùng với tín hiệu  của  EEA1  (chất  đánh  dấu  early  endosome)  và  Tfn (chất đánh dấu recycling endosome), chứng  tỏ  protein  đột  biến  H95Y  lắng  tụ  ở  early  và  recycling  endosome. Ngoài  ra, một  lượng  nhỏ  H95Y  được  tìm  thấy  ở  late  endosome  và  lysosome (Hình 7B).  Hình 4. Các protein PrP đột biến biểu hiện chủ yếu trên bề mặt tế bào giống như WT‐PrPC. PrP trên bề  mặt tế bào được nhận diện bằng kháng thể 3F4 không qua xử lý tính thấm của màng. Một số tế bào được quan  sát ở độ phóng đại cao hơn. Tín hiệu huỳnh quang của nhân màu xanh dương, PrP màu xanh lá cây. Thước chuẩn:  24 μm.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 239 Hình 5.Tủa H95Y cho tín hiệu dương tính khi nhuộm với ThS. Tế bào N2a biểu hiện WT3F4 và đột biến  H95Y3F4 được nhuộm với kháng thể kháng PrP và thioflavin‐S (ThS) nhận diện tủa protein có cấu trúc  dạng phiến β. Tế bào N2a và ScN2a được biến nạp với plasmid không mang gen mã hóa PrP (gọi là N2a‐ mock và ScN2a‐mock) được sử dụng như chứng âm và chứng dương. Nhân tế bào có màu xanh dương, tín  hiệu huỳnh quang màu đỏ là của PrP, tín hiệu màu xanh lá cây của protein tủa. Thang thước chuẩn: 12 μm.  Hình 6. Phát hiện PrPSc trên tế bào N2a biểu hiện đột biến H95Y bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.  Tế bào N2a được biến nạp biểu hiện tạm thời WT và H95Y được xử lý với PK để loại bỏ tín hiệu của PrPC và  guanidine  để bộc  lộ vị  trí  trình diện kháng nguyên  trên phân  tử PrPSc. Nhân  tế bào được nhuộm màu xanh  dương, PrP màu đỏ. N2a‐mock và ScN2a‐mock được dùng làm nhóm chứng. Thước chuẩn: 12 μm.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 240 Hình 7. Protein đột biến H95Y‐MoPrP tích tụ ở early và recycling endosome. Phân bố của PrP ở tế bào  N2a biểu hiện WT‐MoPrP (A) và H95Y‐MoPrP (B). Nhân được đánh dấu bằng DAPI (xanh dương), PrP được  nhận diện bằng kháng  thể 3F4  (xanh  lá cây), các chất đánh dấu bào quan, như Calnexin  (lưới nội bào ER),  EEA1 (early endosome), Tfn (recycling endosome), M6PR (late endosome) và LAMP2 (lysosome), phát tín hiệu  màu đỏ. Thước chuẩn: 12 μm.  BÀN LUẬN  Phân  tích  sinh  hóa  cho  thấy  các  phân  tử  protein đột biến đều trải qua quá trình glycosyl  hóa tại ER và Golgi. Đột biến mất vị trí gắn đồng  tại  histidine  95 mang  đặc  tính  kháng  protease  khi được biến nạp vào dòng tế bào nhiễm prion  (ScN2a)  và  ở  dòng  tế  bào  bình  thường  (N2a),  chứng tỏ vai trò quan trọng của sự gắn đồng tại  amino acid này.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 241 Khi khảo sát sự phân bố protein trong tế bào  bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, chúng tôi  nhận  thấy  kết  quả  huỳnh  quang  phù  hợp  với  phân  tích  Western  blot  trước  đây  và  một  số  protein  H95Y  có  khả  năng  biến  đổi  cấu  trúc  thành dạng cấu hình giàu phiến β. Hơn nữa, sự  phân  bố  của  H95Y‐PrP  ở  early  và  recycling  endosome giống với sự phân bố của PrPSc trong  tế  bào  nhiễm  prion(14,  23). Môi  trường  acid(10)  và  những  thay  đổi  trong quá  trình di  chuyển  của  protein qua các bào quan có thể làm thúc đẩy sự  biến  đổi  cấu  hình  của  PrP  từ  protein  bình  thường PrPC thành protein gây bệnh PrPSc bằng  cách đưa protein đến các bào quan chuyên biệt.  Một số đột biến PrP gây bệnh prion được chứng  minh là làm thay đổi sự vẩn chuyển protein nội  bào(11, 18). Kết quả nghiên cứu này cho thấy early  và recycling endosome có thể là bào quan chính  yếu diễn ra quá trình biến đổi PrPC thành PrPSc.   KẾT LUẬN  Qua  các  kết  quả  trên,  chúng  tôi  đã  chứng  minh  rằng  các protein  đột  biến  sử dụng  trong  nghiên cứu này đều  trải qua quá  trình glycosyl  hóa giống như protein bình thường. Tuy nhiên,  đột  biến  H95Y  tập  trung  chủ  yếu  ở  early  và  recycling endosome, với các đặc điểm  tương  tự  protein gây bệnh PrPSc.   TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Arnold  JE, Tipler C, Laszlo L, Hope  J, Landon M, Mayer RJ  (1995) The abnormal isoform of the prion protein accumulates  in  late‐endosome‐like  organelles  in  scrapie‐infected  mouse  brain. J Pathol 176(4):403–411  2. Barmada SJ, Harris DA (2005) Visualization of prion infection  in  transgenic  mice  expressing  green  fluorescent  protein‐ tagged  prion  protein.  J  Neurosci  Off  J  Soc  Neurosci  25(24):5824–5832  3. Brazier MW, Davies P, Player E, Marken F, Viles JH, Brown  DR  (2008) Manganese  binding  to  the  prion  protein.  J  Biol  Chem 283(19):12831–12839  4. Caughey BW, Dong A, Bhat KS, Ernst D, Hayes SF, Caughey  WS  (1991)  Secondary  structure  analysis  of  the  scrapie‐ associated  protein  PrP  27‐30  in  water  by  infrared  spectroscopy. Biochemistry (Mosc) 30(31):7672–7680  5. Caughey B, Neary K, Buller R, Ernst D, Perry LL, Chesebro B,  Race RE (1990) Normal and scrapie‐associated forms of prion  protein  differ  in  their  sensitivities  to  phospholipase  and  proteases in intact neuroblastoma cells. J Virol 64(3):1093–1101  6. 6.  Godsave SF, Wille H, Kujala P, Latawiec D, DeArmond SJ,  Serban A,  Prusiner  SB,  Peters  PJ  (2008)  Cryo‐immunogold  electron  microscopy  for  prions:  toward  identification  of  a  conversion  site.  J Neurosci Off  J Soc Neurosci 28(47):12489– 12499  7. 7.  Harris DA  (1999) Cellular biology of prion diseases. Clin  Microbiol Rev 12(3):429–444  8. 8.  Hegde RS, Mastrianni JA, Scott MR, DeFea KA, Tremblay  P, Torchia M, DeArmond SJ, Prusiner SB, Lingappa VR (1998)  A  transmembrane  form  of  the  prion  protein  in  neurodegenerative disease. Science 279(5352):827–834  9. 9.  Hegde RS, Tremblay P, Groth D, DeArmond SJ, Prusiner  SB,  Lingappa  VR  (1999)  Transmissible  and  genetic  prion  diseases  share  a  common  pathway  of  neurodegeneration.  Nature 402(6763):822–826  10. Hornemann S, Glockshuber R (1998) A scrapie‐like unfolding  intermediate  of  the  prion  protein  domain  PrP(121‐231)  induced by acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A 95(11):6010– 6014  11. Ivanova L, Barmada S, Kummer T, Harris DA (2001) Mutant  prion  proteins  are  partially  retained  in  the  endoplasmic  reticulum. J Biol Chem 276(45):42409–42421  12. Lainé  J, Marc ME,  Sy MS,  Axelrad H  (2001)  Cellular  and  subcellular  morphological  localization  of  normal  prion  protein in rodent cerebellum. Eur J Neurosci 14(1):47–56  13. Maley F, Trimble RB, Tarentino AL, Plummer TH  Jr  (1989)  Characterization  of  glycoproteins  and  their  associated  oligosaccharides  through  the use of  endoglycosidases. Anal  Biochem 180(2):195–204  14. Marijanovic  Z,  Caputo  A,  Campana  V,  Zurzolo  C  (2009)  Identification of an intracellular site of prion conversion. PLoS  Pathog 5(5):e1000426  15. McKinley MP,  Bolton  DC,  Prusiner  SB  (1983)  A  protease‐ resistant  protein  is  a  structural  component  of  the  scrapie  prion. Cell 35(1):57–62  16. McKinley MP, Taraboulos A, Kenaga L, Serban D, Stieber A,  DeArmond SJ, Prusiner SB, Gonatas N (1991) Ultrastructural  localization of scrapie prion proteins in cytoplasmic vesicles of  infected  cultured  cells. Lab  Investig  J Tech Methods Pathol  65(6):622–630  17. Mironov A Jr, Latawiec D, Wille H, Bouzamondo‐Bernstein E,  Legname  G,  Williamson  RA,  Burton  D,  DeArmond  SJ,  Prusiner  SB,  Peters  PJ  (2003)  Cytosolic  prion  protein  in  neurons. J Neurosci Off J Soc Neurosci 23(18):7183–7193  18. Negro A, Ballarin C, Bertoli A, Massimino ML, Sorgato MC  (2001) The metabolism and imaging in live cells of the bovine  prion protein in its native form or carrying single amino acid  substitutions. Mol Cell Neurosci 17(3):521–538  19. Ostrerova‐Golts N,  Petrucelli  L, Hardy  J,  Lee  JM,  Farer M,  Wolozin  B  (2000)  The  A53T  alpha‐synuclein  mutation  increases iron‐dependent aggregation and toxicity. J Neurosci  Off J Soc Neurosci 20(16):6048–6054  20. Pimpinelli  F,  Lehmann  S, Maridonneau‐Parini  I  (2005)  The  scrapie prion protein  is present  in  flotillin‐1‐positive vesicles  in central‐ but not peripheral‐derived neuronal cell lines. Eur J  Neurosci 21(8):2063–2072  21. Shyng SL, Huber MT, Harris DA (1993) A prion protein cycles  between  the  cell  surface  and  an  endocytic  compartment  in  cultured  neuroblastoma  cells.  J  Biol  Chem  268(21):15922– 15928  22. Taraboulos  A,  Serban  D,  Prusiner  SB  (1990)  Scrapie  prion  proteins accumulate in the cytoplasm of persistently infected  cultured cells. J Cell Biol 110(6):2117–2132  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 242 23. Uchiyama  K,  Muramatsu  N,  Yano  M,  Usui  T, Miyata  H,  Sakaguchi  S  (2013)  Prions  disturb  post‐Golgi  trafficking  of  membrane proteins. Nat Commun 4:1846  24. Veith NM, Plattner H, Stuermer CAO, Schulz‐Schaeffer WJ,  Bürkle  A  (2009)  Immunolocalisation  of  PrPSc  in  scrapie‐ infected N2a mouse neuroblastoma cells by light and electron  microscopy. Eur J Cell Biol 88(1):45–63  25. Volpicelli‐Daley LA, Luk KC, Patel TP, Tanik SA, Riddle DM,  Stieber  A,  Meaney  DF,  Trojanowski  JQ,  Lee  VM‐Y  (2011)  Exogenous  α‐synuclein  fibrils  induce Lewy body pathology  leading  to  synaptic dysfunction  and  neuron death. Neuron  72(1):57–71  26. Wopfner F, Weidenhöfer G, Schneider R, von Brunn A, Gilch  S, Schwarz TF, Werner T, Schätzl HM  (1999) Analysis of 27  mammalian  and  9  avian  PrPs  reveals  high  conservation  of  flexible  regions of  the prion protein.  J Mol Biol 289(5):1163– 1178  Ngày nhận bài báo:        05/9/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:    29/9/2014  Ngày bài báo được đăng:  20/10/2014