Nghiên cứu đa dạng dạng di truyền nguồn gen bông (Gossypium L) sử dụng chỉ thị phân tử SSR
Nghiên cứu đa dạng dạng di truyền ng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 I.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY BÔNG 4 I.1.1 Nguồn gốc, xuất xứ cây bông 4 I.1.2 Đặc điểm hình thái cây bông 5 I.1.3 Đặc điểm sinh thái 5 I.1.4 Đặc điểm genome 6 I.1.5 Giá trị sản xuất thương mại của các loài bông 6 I.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN 6 I.2.1 Khái niệm 6 I.2.2 Nguyên nhân phát sinh đa dạng di truyền 7 I.2.3 Các mức độ đa dạng di truyền 7 I.3 NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN 8 I.3.1 Chỉ thị hình thái 8 I.3.2 Chỉ thị isozym 8 I.3.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền 9 I.4 MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ 9 I.4.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai acid nucleic: RFLP 9 I.4.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở PCR 10 I.4.2.1 Phản ứng PCR 10 I.4.2.2 Chỉ thị RAPD 14 I.4.2.3 Chỉ thị AFLP 15 I.4.2.4 Chỉ thị SSR 16 I.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÂY BÔNG 18 I.5.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông trên thế giới 18 I.5.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông tại Việt Nam 19 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 II.1 VẬT LIỆU 20 II.1.1 Vật liệu thực vật 20 II.1.2 Hóa chất, thiết bị 21 II.1.3 Chỉ thị SSR 21 II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 II.2.1 Tách chiết ADN tổng số 24 II.2.1.1 Chuẩn bị vật liệu 24 II.2.1.2 Quy trình tách chiết 25 II.2.1.3 Kiểm tra ADN tổng số 26 II.2.2 Phản ứng PCR 26 II.2.2.1 Thành phần phản ứng PCR 26 II.2.2.2 Chương trình chạy PCR 27 II.2.3 Điện di, phát hiện sản phẩm 27 II.2.3.1 Nguyên tắc 27 II.2.3.2 Chuẩn bị gel agarose 27 II.2.3.3 Điện di sản phẩm PCR 28 II.2.4 Phương pháp phân tích số liệu: phương pháp phân tích đa dạng di truyền băng phần mềm NTSYS pc v.2.1 (Biostatistics Inc 2002) 28 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 III.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 31 III.1.1 Mục đích 31 III.1.2 Các bước tiến hành 31 III.1.3 Kết quả và nhận xét 32 III.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR CỦA 20 CẶP MỒI SSR 33 III.2.1 Mục đích 33 III.2.2 Các bước tiến hành 33 III.2.3 Kết quả 34 III.2.4 Nhận xét kết quả 37 III.3 NHẬN DẠNG ADN 37 III.3.1 Mục đích 37 III.3.2 Các bước tiến hành 37 III.3.3 Kết quả 37 III.3.4 Nhận xét kết quả 43 III.4 HỆ SỐ PIC VÀ ĐA DẠNG CÁC ALLEN SSR 44 III.4.1 Mục đích 44 III.4.2 Các bước tiến hành 44 III.4.3 Kết quả 45 III.4.4 Nhận xét kết quả 47 III.5 HỆ SỐ TƯƠNG ĐỒNG DI TRUYỀN VÀ BIỂU ĐỒ QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN CỨU. 49 III.5.1 Mục đích 49 III.5.2 Các bước tiến hành 49 III.5.3 Kết quả và nhận xét 49 III.5.3.1 Hệ số tương dồng di truyền S 49 III.5.3.2 Biểu đồ quan hệ di truyền của các giống bông nghiên cứu 51 III.6 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẶP GIỐNG BÔNG CHO ĐA HÌNH DI TRUYỀN CAO 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 uồn gen bông (Gossypium L.) sử dụng chỉ thị phân tử SSR
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Nghiên cứu đa dạng dạng di truyền nguồn gen bông (Gossypium L) sử dụng chỉ thị phân tử SSR, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Më ®Çu
I. §Æt vÊn ®Ò
§îc trång réng r·i ë h¬n 80 quèc gia trªn thÕ giíi, c©y b«ng (Gossypium L.) lµ lo¹i c©y trång lÊy sîi tù nhiªn hµng ®Çu vµ quan träng nhÊt. Hµng n¨m ngµnh c«ng nghiÖp dÖt ®· ®ãng gãp vµo nÒn kinh tÕ kho¶ng 500 tØ USD víi viÖc sö dông kho¶ng 115 triÖu kiÖn b«ng x¬ [14]. Cïng víi nhËn thøc vÒ vÊn ®Ò ch¨m sãc søc kháe vµ møc sèng ph¸t triÓn, con ngêi quay trë l¹i sö dông sîi b«ng thay cho sîi nh©n t¹o (sîi b«ng cã nh÷ng lîi thÕ nh vèn thÊp, n¨ng suÊt cao, ®é thÊm, ®é tho¸ng, gi÷ nhiÖt tèt vµ kh«ng tÜnh ®iÖn) lµm cho nhu cÇu cung cÊp sîi b«ng ngµy cµng t¨ng.
ViÖt Nam lµ mét trong nh÷ng níc cã ngµnh c«ng nghiÖp dÖt may ph¸t triÓn, s¶n phÈm dÖt may chiÕm tíi 4,8% c¬ cÊu gi¸ trÞ s¶n xuÊt c«ng nghiÖp [7]. N¨m 2007, dÖt may v¬n lªn vÞ trÝ dÉn ®Çu trong danh môc c¸c mÆt hµng xuÊt khÈu, vît qua c¶ dÇu th« [8], chÝnh v× vËy c©y b«ng (Gossypium L.) còng lµ c©y trång ®îc chó träng. Nhng do nhiÒu khã kh¨n (s©u bÖnh, chi phÝ s¶n xuÊt cao...), thùc tr¹ng s¶n xuÊt b«ng v¶i ë ViÖt Nam ngµy cµng gi¶m, n¨m 2005 diÖn tÝch b«ng cña c¶ níc lµ 27.996 ha víi tæng s¶n lîng 32.615 tÊn, n¨m 2006 diÖn tÝch gi¶m xuèng cßn 20.900 ha víi s¶n lîng 28.600 tÊn [29]. N¨m 2007 trong tæng sè 220.000 tÊn b«ng nguyªn liÖu, ViÖt Nam ph¶i nhËp trªn 95% tõ c¸c níc Mü, Ên §é, T©y Phi, Uzebekistan... Theo quyÕt ®Þnh phª duyÖt ch¬ng tr×nh Ph¸t triÓn c©y b«ng v¶i ViÖt Nam cña Thñ tíng ChÝnh phñ, chØ tiªu ®Õn n¨m 2015 diÖn tÝch trång b«ng níc ta cÇn ®¹t 30.000 ha, n¨ng suÊt b×nh qu©n 1.5 tÊn/ha, s¶n lîng b«ng x¬ ®¹t 20.000 tÊn, ®Þnh híng ®Õn n¨m 2020 diÖn tÝch ®¹t 76.000 ha, n¨ng suÊt b×nh qu©n 2 tÊn/ha, s¶n lîng b«ng x¬ ®¹t 60.000 tÊn, ®Ó cung cÊp nguyªn liÖu b«ng x¬ cho s¶n xuÊt trong níc, t¹o ®iÒu kiÖn cho ngµnh dÖt may ph¸t triÓn æn ®Þnh [9].
Muèn më réng ®îc diÖn tÝch trång b«ng cÇn ph¶i cã chÝnh s¸ch hç trî, t¹o ®iÒu kiÖn cho ngêi trång vµ quan träng nhÊt lµ ph¶i cã gièng tèt. C¸c gièng b«ng hiÖn nay ë ViÖt Nam chñ yÕu chän t¹o b»ng ph¬ng ph¸p truyÒn thèng (mét sè gièng b«ng do ViÖn nghiªn cøu B«ng vµ PTNN Nha Hè chän t¹o ®· ®îc c«ng nhËn lµ gièng quèc gia vµ ®a vµo phæ biÕn trong s¶n xuÊt, gåm cã c¸c gièng b«ng lai: L18, VN20, VN15, VN01-2, VN01-4, GL03 vµ c¸c gièng b«ng Luåi: TH1, TH2, M45610, TM1, MCU9, LRA5166, D162, C118). Tuy nhiªn ph¬ng ph¸p chän t¹o gièng truyÒn thèng cã h¹n chÕ lµ rÊt khã ®¸p øng ®îc môc tiªu c¶i tiÕn ®ång thêi c¶ n¨ng suÊt, chÊt lîng sîi vµ søc chèng chÞu víi ®iÒu kiÖn kh¾c nghiÖt cña m«i trêng [17]. Sù ph¸t triÓn gÇn ®©y cña di truyÒn ph©n tö ®· gióp cho c¸c nhµ chän gièng tiÕp cËn nhanh chãng vµ chÝnh x¸c ®Ó phèi hîp víi chän läc truyÒn thèng, gióp kh¾c phôc nhîc ®iÓm cña ph¬ng ph¸p nµy.
ChØ thÞ ph©n tö lµ c«ng cô h÷u hiÖu, ®îc ¸p dông réng r·i trong nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn vµ kho¶ng c¸ch di truyÒn. Nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng di truyÒn ®ãng vai trß rÊt quan träng, th«ng qua ph©n tÝch ®a d¹ng cã thÓ chän t¹o ®îc nh÷ng cÆp bè mÑ lai thÝch hîp trong chän t¹o gièng c©y trång [3]. Van Esbroeck and Bowman (1998) chØ ra r»ng ®a d¹ng di truyÒn ®¶m b¶o s¶n xuÊt chèng l¹i bÖnh c©y vµ loµi g©y h¹i, do ®ã cã thÓ thÊy ®îc lîi Ých cña gen di truyÒn trong t¬ng lai [13]. Cho ®Õn nay chØ thÞ ADN tiÒm n¨ng cho nh÷ng ch¬ng tr×nh chän gièng b«ng nhê chØ thÞ ph©n tö (MAS) ®· trî gióp rÊt nhiÒu cho viÖc chän t¹o ®îc nh÷ng gièng b«ng cã n¨ng suÊt cao, chÊt lîng tèt [27].
§èi víi c©y b«ng, hiÖn nay ®· cã sè lîng rÊt lín c¸c chØ thÞ SSR ®îc ph¸t hiÖn t¹i nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi vµ ®îc lu tr÷ trong c¬ së d÷ liÖu c¸c chØ thÞ b«ng (Cotton Marker Database-CDM), cung cÊp nguån chØ thÞ phong phó cho c¸c nhµ nghiªn cøu [12]. §©y chÝnh lµ thuËn lîi ®Ó chóng t«i thùc hiÖn ®Ò tµi:
"Nghiªn cøu ®a d¹ng d¹ng di truyÒn nguån gen b«ng (Gossypium L.) sö dông chØ thÞ ph©n tö SSR"
§Ò tµi nghiªn cøu nµy lµ mét néi dung nghiªn cøu cña ®Ò tµi thuéc ch¬ng tr×nh C«ng nghÖ sinh häc cÊp Nhµ níc "Nghiªn cøu ¸p dông chØ thÞ ph©n tö ®Ó chän t¹o gièng b«ng cã chÊt lîng x¬ tèt".
II. Môc tiªu cña ®Ò tµi
§¸nh gi¸ møc ®é ®a d¹ng di truyÒn cña 21 gièng b«ng chän läc tõ tËp ®oµn gièng cña ViÖn nghiªn cøu B«ng vµ PTNN Nha Hè, tõ ®ã chän läc nh÷ng cÆp gièng cã ®a h×nh di truyÒn cao nhÊt phôc vô lai t¹o, t¹o quÇn thÓ con lai.
Ch¬ng I: Tæng quan tµi liÖu
I.1 Giíi thiÖu vÒ c©y b«ng
C©y b«ng lµ c©y c«ng nghiÖp quan träng, cã gi¸ trÞ kinh tÕ. S¶n phÈm chÝnh cña c©y b«ng lµ x¬ b«ng, cung cÊp nguyªn liÖu cho dÖt may... Ngoµi ra vá rÔ cña c©y b«ng cßn cã thÓ lµm thuèc.
HÖ thèng ph©n lo¹i c©y b«ng [30]
Giíi: Thùc vËt
Ngµnh: Magnoliophy
Líp: Magnoliopsida
Bé: Malvales
Hä: Malvanceae
Ph©n hä: Malvoideae
Chi: Gossypium L.
I.1.1 Nguån gèc, xuÊt xø c©y b«ng
C©y b«ng (Gossypium L.) bao gåm kho¶ng 45 loµi nhÞ béi vµ 5 loµi tø béi víi c¸ch thøc di truyÒn phøc t¹p. Nhãm b«ng nhÞ béi chia lµm 8 nhãm genome tõ A- G vµ k [15], cho ®Õn nay c¸c loµi b«ng nhÞ béi cã 3 nhãm b«ng chÝnh: nhãm b«ng ch©u phi cã kiÓu gen a, b, e, f cã xuÊt xø tõ ch©u phi vµ ch©u ¸; nhãm b«ng cã kiÓu genome d cã nguån gèc xuÊt xø tõ c¸c níc ch©u mü; nhãm b«ng thø 3 cã kiÓu gen c, g, k ®îc t×m thÊy ë ch©u óc [24]. 52 loµi b«ng kÓ c¶ hai loµi b«ng tø béi tù nhiªn Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, ®Òu cã nguån gèc tõ c¸c loµi b«ng tæ tiªn Ch©u Phi A genome vµ c¸c loµi b«ng D genome. Tæ tiªn cña c¸c loµi b«ng tø béi cßn tån t¹i cho ®Õn ngµy nay lµ c¸c loµi b«ng nhÞ béi Gossypium herbaceum(A1) vµ Gossypium arboreum (A2) vµ Gossypium raimondii (D5) Ulbrich [11]. Qu¸ tr×nh tø béi hãa xÈy ra kho¶ng 1-2 triÖu n¨m tríc ®©y [24] ®· t¹o ra 5 loµi b«ng tø béi.
I.1.2 §Æc ®iÓm h×nh th¸i c©y b«ng
RÔ: b«ng cã 1 rÔ cäc ®©m s©u xuèng ®Êt, tõ rÔ cäc ph¸t triÓn rÔ thø cÊp vµ ph©n nh¸nh m¹nh.
Th©n, cµnh: th©n b«ng cao tõ 0.7-1.5m tïy vµo gièng vµ ®iÒu kiÖn m«i trêng, trªn th©n cã c¸c ®èt, trung b×nh tõ 20-30 ®èt. Cµnh cã 2 lo¹i lµ cµnh ®ùc vµ cµnh qu¶.
L¸: l¸ cã mµu xanh, mét sè gièng cã mµu n©u ®á. L¸ b«ng cã tõ 3-5 ®Õn 7 thïy.
Hoa: hoa b«ng ®îc h×nh thµnh tõ n¸ch cña l¸, th©n hoÆc cµnh. Hoa lìng tÝnh cã 3 l¸ ®µi, 5 c¸nh hoa cã mµu tr¾ng, mµu kem vµ mµu vµng, bÇu lín n»m gi÷a hoa, bÇu hoa cã 3-5 «, mçi « ph¸t triÓn thµnh mét mói, mçi mói cã 6-11 no·n. B«ng lµ c©y tù thô phÊn nhng còng cã thô phÊn chÐo nhê c«n trïng. Cã nh÷ng gièng b«ng thô phÊn kÝn do hoa kh«ng në.
X¬: lµ biÕn d¹ng cña líp biÓu b× cña h¹t. Sau khi thô tinh x¬ b«ng trëng thµnh cïng qu¶, sau khi hoa në 15-20 ngµy x¬ b«ng ®¹t chiÒu dµi cao nhÊt khi qu¶ chÝn. X¬ kh« cã d¹ng sîi xo¾n.
Qu¶ vµ h¹t: mçi c©y cã tõ 100-300 qu¶, mçi qu¶ nÆng 4-6g, mçi qu¶ cã 4-5 mói, mçi mói cã 6-7 h¹t.
I.1.3 §iÒu kiÖn sinh th¸i cña c©y b«ng
B«ng lµ c©y cã nguån gèc nhiÖt ®íi, a s¸ng nªn ®ßi hái cao vÒ nhiÖt ®é vµ ¸nh s¸ng. NhiÖt ®é tèi u cho b«ng n¶y mÇm, sinh trëng, ph¸t triÓn lµ 25-30oC, díi 25oC ph¸t triÓn chËm l¹i, ë 37-40oC c©y ngõng ph¸t triÓn. B«ng lµ c©y cÇn ‘®Çu kh«, ch©n Èm’, nhng kh«ng chÞu óng. Do cã bé rÔ kh¸ ph¸t triÓn nªn b«ng cã kh¶ n¨ng chÞu h¹n tèt. HÇu hÕt c¸c lo¹i ®Êt trång c¹n ®Òu cã thÓ trång b«ng v¶i, cã pH thÝch hîp pHKCl>5 vµ ®é mÆn < 0.4% [1]
C¸c vïng trång b«ng truyÒn thèng cã ®iÒu kiÖn ®Êt ®ai, khÝ hËu thÝch hîp t¹i c¸c tØnh [9]:
T©y Nguyªn: §¾c L¾k, §¾c N«ng, Gia Lai.
Duyªn h¶i Nam Trung Bé: Ninh ThuËn, B×nh ThuËn, B×nh Phíc, §ång Nai, vµ Bµ RÞa- Vòng Tµu.
C¸c tØnh vïng nói phÝa B¾c: §iÖn Biªn, S¬n La, Thanh Hãa, B¾c Giang.
Trong ®ã vïng träng t©m lµ T©y Nguyªn.
I.1.4 §Æc ®iÓm genome c©y b«ng
KÝch thíc genome c©y b«ng biÕn ®éng tïy loµi: kÝch thíc genome nhá nhÊt ®îc ghi nhËn ë loµi G.raimondii Ulbrich, ®¹t kho¶ng 880 Mb. Genome ®¬n béi cña G.arboreum cã kÝch thíc kho¶ng 1,75 Gb vµ G.hirsutum cã kÝch thíc 2,5 Gb [16]. BiÕn ®éng thµnh phÇn DNA ë c¸c loµi nhÞ béi ph¶n ¸nh møc ®é nhiÒu hay Ýt cña c¸c b¶n sao c¸c tr×nh tù lÆp l¹i kh¸c nhau [28]. Thµnh phÇn DNA cña c¸c loµi ®a béi xÊp xØ b»ng tæng sè cña genome bè mÑ A vµ D [18]
I.1.5 Gi¸ trÞ s¶n xuÊt th¬ng m¹i cña c¸c loµi b«ng
Trong c¸c loµi b«ng chØ cã 4 loµi b«ng ®îc trång lÊy sîi bao gåm hai d¹ng nhÞ béi genome A (2n=2x=26) lµ G.herbaceum (A1) vµ G.arboreum (A2) vµ 2 d¹ng tø béi (song lìng béi kh¸c nguån A, D (2n=2x=52) lµ G.hirsutum, G.barbadense.
HiÖn nay c¸c gièng b«ng ®îc trång phæ biÕn trong s¶n xuÊt ®Òu lµ b«ng tø béi cã nguån gèc lai gi÷a hai nhãm genome A vµ D. Trong khi ®ã, chØ cã c¸c loµi b«ng thuéc nhãm genome A cho b«ng lÊy sîi cßn nhãm genome D th× kh«ng [14]. Hai loµi b«ng tø béi G.hirsutum L, G.barbadense L chiÕm t¬ng øng 90% vµ 5% s¶n lîng b«ng trªn toµn thÕ giíi [25].
I.2 §a d¹ng di truyÒn
I.2.1 Kh¸i niÖm [4]
§a d¹ng di truyÒn: lµ tËp hîp biÕn ®æi cña c¸c gen vµ c¸c kiÓu gen trong néi bé cña mét loµi.
§a d¹ng di truyÒn lµ ch×a khãa cña mét loµi cã thÓ tån t¹i trong tù nhiªn, v× nã cã kh¶ n¨ng thÝch nghi víi thay ®æi bÊt lîi cña thêi tiÕt, khÝ hËu, m«i trêng, ph¬ng thøc canh t¸c, søc ®Ò kh¸ng cña c¸c loµi s©u bÖnh. Do ®ã nã lµ nguån cung cÊp vËt liÖu cho mäi ch¬ng tr×nh chän t¹o vµ c¶i tiÕn gièng, cho mét nÒn n«ng nghiÖp ph¸t triÓn bÒn v÷ng.
§a d¹ng di truyÒn thÓ hiÖn sù t¸ch biÖt vÒ tÝnh kÕ thõa trong hay gi÷a c¸c quÇn thÓ sinh vËt.
I.2.2 Nguyªn nh©n ph¸t sinh ®a d¹ng di truyÒn
Trong suèt qu¸ tr×nh tån t¹i vµ ph¸t triÓn, mét loµi cã thÓ t¹o thµnh nh÷ng nhãm quÇn thÓ ph©n bè trong nh÷ng ®iÒu kiÖn sinh th¸i kh¸c nhau vµ lu«n biÕn ®æi, nªn sÏ cã nh÷ng chiÒu híng biÕn ®æi kh¸c nhau g©y ra do ®ét biÕn (®ét biÕn gen, ®ét biÕn NST). BiÕn ®æi ®ã tríc hÕt lµ trong kiÓu gen vµ cuèi cïng lµ kiÓu h×nh thÝch nghi, ®iÒu ®ã t¹o nªn sù kh¸c nhau gi÷a c¸c nhãm loµi. Sù biÕn ®æi nµy kh«ng chØ xÈy ra gi÷a c¸c quÇn thÓ cña loµi mµ ngay gi÷a c¸c c¸ thÓ trong mét quÇn thÓ, ®· ®îc biÓu hiÖn ra b»ng h×nh th¸i hoÆc chØ míi lµ sù thay ®æi trong genome. Bªn c¹nh nh÷ng biÕn ®æi di truyÒn do ¸p lùc chän läc tù nhiªn th× biÕn ®æi do ¸p lùc nh©n t¹o (g©y ®ét biÕn nh©n t¹o) còng gãp ph©n rÊt lín. Do vËt chÊt di truyÒn cã thÓ sao chÐp chÝnh x¸c tõ thÕ hÖ sinh vËt nµy sang thÕ hÖ sinh vËt kh¸c qua sinh s¶n nªn nh÷ng biÕn ®æi vÒ mÆt di truyÒn lu«n ®îc b¶o tån vµ ph¸t triÓn t¹o nªn tÝnh ®a d¹ng di truyÒn.
I.2.3 C¸c møc ®é ®a d¹ng di truyÒn
§a d¹ng di truyÒn thÓ hiÖn ë møc ®é ph©n tö vµ c¸ thÓ. Møc ®é ph©n tö biÓu hiÖn ë sù ®a d¹ng c¸c alen gi÷a c¸c c¸ thÓ sinh ra do ®ét biÕn gen hoÆc do sù t¸ch biÖt vÒ tÝnh kÕ thõa c¸c nguån genome cã tríc. Nãi xa h¬n, tËp hîp ®a d¹ng c¸c alen gi÷a 2 c¸ thÓ sÏ t¹o nªn sù kh¸c nhau vÒ genome cña 2 c¸ thÓ ®ã. Møc ®é c¸ thÓ biÓu hiÖn ë sè lîng c¸c NST cña c¸ thÓ hay nhãm c¸ thÓ ®ã nh: cã c¸c loµi ®¬n béi, lìng béi vµ ®a béi.
Trong sinh häc ph©n tö, khi nãi ®Õn sù ®a d¹ng ADN, nghÜa lµ sù kh¸c nhau ë møc ®é ph©n tö ADN gi÷a c¸c c¸ thÓ trong cïng mét loµi sèng ë mét vïng ®Þa lý nhÊt ®Þnh. Nghiªn cøu ®a d¹ng ADN thùc chÊt còng lµ ph©n lo¹i nhng ë møc ®é ADN ®Ó x¸c ®Þnh sù kh¸c biÖt hay gièng nhau gi÷a 2 c¸ thÓ cïng loµi [4].
I.3 Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn
I.3.1 ChØ thÞ h×nh th¸i [2]
C¸c ®Æc ®iÓm h×nh th¸i trong ph©n lo¹i sinh vËt ®îc sö dông tõ rÊt sím. Nguyªn t¾c c¬ b¶n cña ph¬ng ph¸p nµy lµ: hai ®¬n vÞ ph©n lo¹i (taxon) cµng cã nhiÒu ®Æc ®iÓm chung, cµng gièng nhau th× quan hÖ gi÷a hai taxon cµng gÇn gòi nhau. Ngêi ta thêng kÕt hîp nhiÒu ®Æc ®iÓm ®Ó lµm t¨ng gi¸ trÞ tin cËy cña kÕt qu¶ so s¸nh.
C¸c chØ thÞ h×nh th¸i cã u ®iÓm lµ tiÖn lîi, nhanh chãng, kinh tÕ, nhng viÖc lùa chän vµ c©n nh¾c gi¸ trÞ sö dông cña c¸c ®Æc ®iÓm ph©n lo¹i lµ mét trong nh÷ng kh©u khã kh¨n nhÊt, kh«ng chØ ®ßi hái kiÕn thøc mµ cßn ®ßi hái kinh nghiÖm vµ sù khÐo lÐo cña c¸c nhµ ph©n lo¹i häc. Bªn c¹nh ®ã ph¬ng ph¸p nµy nhiÒu khi kh«ng chÝnh x¸c v× cã hiÖn tîng ®ång quy tÝnh tr¹ng vµ kh«ng ph©n biÖt ®îc c¸c loµi ®ång h×nh.
I.3.2 ChØ thÞ isozym
C¸c isozym ®îc ®Þnh nghÜa nh c¸c d¹ng kh¸c nhau cña mét enzym (protein), cã chøc n¨ng gièng hay gÇn gòi nhau ë cïng mét c¸ thÓ [21]. Sù kh¸c nhau vÒ cÊu tróc bËc 1 cña protein enzym do ®ét biÕn gen vµ qu¸ tr×nh chän läc c¸c quÇn thÓ cïng lo¹i theo chiÒu híng ngo¹i c¶nh kh¸c nhau, lµm c¸c enzym kh¸c nhau vÒ träng lîng, kÝch thíc.
Protein enzym lµ chÊt ®a ®iÖn ly nªn ë d¹ng dung dÞch nã ë tr¹ng th¸i ph©n cùc vÒ ®iÖn tÝch. Díi t¸c dông cña dung dÞch ®Öm cã pH kh¸c nhau protein sÏ mang ®iÖn tÝch (-) hoÆc (+). Trong ®iÖn trêng cña dßng mét chiÒu c¸c protein kh¸c nhau di chuyÓn vÒ phÝa anot hay catot theo tèc ®é kh¸c nhau. NÕu ph©n tö protein cã kÝch thíc nhá, träng lîng ph©n tö bÐ, lùc hót tÜnh ®iÖn lín th× sÏ chuyÓn ®éng nhanh vµ ngîc l¹i. Do ®ã chóng sÏ n»m ë vÞ trÝ kh¸c nhau trªn b¶n gel khi ch¹y ®iÖn di hçn hîp protein, sù kh¸c nhau cña c¸c cÊu tö ®iÖn di cña c¸c isozym ®îc dïng ®Ó so s¸nh, ®¸nh gi¸ sù kh¸c nhau vÒ b¶n chÊt di truyÒn cña c¸c loµi. Sù kh¸c nhau cµng Ýt th× mèi quan hÖ hä hµng gi÷a chóng cµng gÇn vµ ngîc l¹i.
ViÖc ph©n tÝch isozym cho ta nh÷ng allen ®ång tréi, lµ ph¬ng ph¸p t¬ng ®èi rÎ, dÔ tiÕn hµnh h¬n c¸c ph¬ng ph¸p ph©n tÝch ADN. Tuy nhiªn víi sè lîng Ýt ái c¸c isozym vµ chóng chØ thÓ hiÖn ë mét giai ®o¹n nhÊt ®Þnh cña qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ vµ lµ s¶n phÈm cña gen nªn cha ph¶n ¸nh thËt chÝnh x¸c b¶n chÊt di truyÒn cña c¸c c¸ thÓ. Do vËy viÖc sö dông chØ thÞ isozym cßn cã nh÷ng h¹n chÕ nhÊt ®Þnh.
I.3.3 ChØ thÞ ph©n tö trong nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn
ChØ thÞ ph©n tö ®îc øng dông réng d·i trong ph©n tÝch di truyÒn, nghiªn cøu lai gièng, nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn vµ hä hµng gi÷a c¸c gièng, loµi vµ tæ tiªn hoang d¹i cña chóng. ChØ thÞ ph©n tö cã mét vµi u ®iÓm khi so s¸nh víi chØ thÞ h×nh th¸i nh: møc ®é ®a d¹ng cao vµ nhËn ra ®îc ¶nh hëng cña ®iÒu kiÖn m«i trêng vµ ph¹m vi ho¹t ®éng sinh th¸i cña thùc vËt [13].
C¸c chØ thÞ ph©n tö rÊt phong phó do tÝnh ®a d¹ng cña ADN. C¸c chØ thÞ ph©n tö chia lµm 2 nhãm bao gåm: ChØ thÞ dùa trªn cë së lai acid nucleic (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). C¸c chØ thÞ dùa trªn c¬ së cña ph¶n øng PCR (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA, SSR - Simple Sequence Repeats…, vµ c¸c lo¹i chØ thÞ ph©n tö kh¸c nh SNP (Single Nucleotide Polymorphism …). C¸c chØ thÞ ph©n tö hiÖn nay ®îc øng dông cã hiÖu qu¶ trong nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn thùc vËt.
I.4 Mét sè LO¹I chØ thÞ ph©n tö
I.4.1 ChØ thÞ dùa trªn c¬ së lai acid nucleic: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Lai acid nucleic gåm 2 kiÓu: lai ADN (ADN hibrization) hay cßn gäi lµ lai Southern vµ lai ARN (ARN hibrization) hay cßn gäi lµ Northern [3]
RFLP cã nghÜa lµ ®a h×nh ®é dµi ®o¹n ph©n c¾t giíi h¹n. C¸c ®a h×nh RFLP sinh ra bëi nh÷ng ®ét biÕn tù nhiªn ë nh÷ng ®iÓm c¾t enzym giíi h¹n trong hÖ gen.
Mçi mét loµi sinh vËt cã mét bé ADN ®Æc hiÖu trong cÊu tróc, sù thay ®æi, mÊt ®i hay thªm vµo c¸c nucleotide kh¸c nhau tïy thuéc vµo ®Æc ®iÓm riªng cña mçi hä, gièng, loµi, thËm chÝ mçi c¸ thÓ. V× vËy khi dïng enzym c¾t giíi h¹n ®Ó c¾t ph©n tö ADN cña hÖ gen cña c¸c ®èi tîng kh¸c nhau, nÕu nh cã ®a h×nh c¸c ®o¹n c¾t h¹n chÕ th× c¸c ®o¹n ADN cÇn kiÓm tra ®a h×nh (c¸c ®o¹n ADN cã ®o¹n tr×nh tù bæ sung víi ADN mÉu dß) ë c¸c ®èi tîng sau khi bÞ c¾t sÏ cã chiÒu dµi kh¸c nhau. Sau ®ã dïng kü thuËt lai Southern ngêi ta cã thÓ nhËn biÕt ®îc nh÷ng ®o¹n ADN cã chiÒu dµi kh¸c nhau nµy. ADN mÉu dß ®îc sö dông ®Ó lai sÏ cã tr×nh tù bæ sung víi ®o¹n tr×nh tù ADN b¶o thñ cña ADN ®Ých.
ChØ thÞ RFLP ®îc øng dông réng r·i vµ cã ý nghÜa quan träng trong lËp b¶n ®å gen, ph©n lËp gen, x¸c ®Þnh sè b¶n sao cña gen, ph©n tÝch cÊu tróc vµ chøc n¨ng gen …[3]. ChØ thÞ RFLP ®îc sö dông lÇn ®Çu tiªn bëi Bitstein vµ cs (1980) ®Ó x©y dùng b¶n ®å liªn kÕt di truyÒn ë ngêi. RFLP còng ®îc dïng ®Ó nghiªn cøu vÒ di truyÒn cña nhiÒu ®èi tîng thùc vËt kh¸c nhau nh: lóa, cµ chua, ng«, khoai t©y, b¾p c¶i, b«ng… §èi víi ®èi tîng b«ng, c«ng tr×nh cña Rong vµ céng sù 2004 sö dông chØ thÞ RFLP ®· ®Þnh vÞ ®îc 2.584 locus ph©n bè thµnh 26 nhãm liªn kÕt c¸ch nhau 1.72 cM (kho¶ng 600 Kb) [20].
ChØ thÞ RFLP lµ chØ thÞ ®ång tréi cã nghÜa lµ cã kh¶ n¨ng biÓu hiÖn tÊt c¶ c¸c allen cña cïng mét locus gen. Do vËy, cã thÓ ph©n biÖt ®îc c¸c c¸ thÓ ®ång hîp tö AA hoÆc aa vµ c¸c c¸ thÓ dÞ hîp tö Aa. Do sö dông mÉu dß mang tÝnh ®Æc hiÖu nªn chØ thÞ nµy cã ®é chÝnh x¸c rÊt cao, dïng ®Ó kiÓm tra chØ thÞ ph©n tö kh¸c.
H¹n chÕ cña chØ thÞ RFLP: tiªu tèn nhiÒu thêi gian, søc lùc, khèi lîng c«ng viÖc cång kÒnh.
I.4.2 ChØ thÞ dùa trªn c¬ së PCR
I.4.2.1 Ph¶n øng PCR
PCR (Polymeraza Chain Reaction) cã nghÜa lµ ph¶n øng trïng ph©n, ph¶n øng chuçi polymeraza, hay ph¶n øng PCR, ®îc Kary Mullis ph¸t minh vµo n¨m 1985 [3], ®· ®a ra mét cuéc c¸ch m¹ng trong di truyÒn häc ph©n tö. §©y lµ kü thuËt invitro ®Ó nh©n nhanh mét ®o¹n ADN trong hÖ gen cña sinh vËt. ADN ®îc nh©n lªn theo cÊp sè nh©n theo c«ng thøc:
Trong ®ã:
D: Lµ lîng ADN ban ®Çu
N: Tæng sè ADN tæng hîp míi sau n chu kú.
Thµnh phÇn ph¶n øng PCR
Trong ph¶n øng PCR gåm cã thµnh ph©n c¬ b¶n sau: ADN khu«n, dNTP, måi (primer), enzyme polymeraza (Taq), MgCl2, vµ ®Öm PCR. Ph¶n øng PCR ®îc thùc hiÖn trong chu kú m¸y nhiÖt (m¸y PCR).
ADN khu«n (DNA template): cã thÓ lµ ®o¹n m¹ch ®¬n hoÆc m¹ch ®«i cña chuçi ADN hay ARN, thêng dµi tõ 300 bp trë lªn, ®· biÕt tríc tr×nh tù hai ®Çu ®Ó thiÕt kÕ måi. Th«ng thêng lîng ADN khu«n cho vµo mçi ph¶n øng nªn sö dông kho¶ng díi 1 μg ®èi víi ADN hÖ gen.
ADN måi (primer): lµ nh÷ng ®o¹n oligonucleotide m¹ch ®¬n dµi 6-100 bp (thêng cã ®é dµi tõ 20-30 bp), cã tr×nh tù baz¬ nit¬ bæ trî víi tr×nh tù baz¬ nit¬ hai ®Çu cña ®o¹n ADN khu«n. Nã ®îc sö dông lµm måi cho sù khëi ®Çu qu¸ tr×nh tæng hîp ADN. C¸c ®o¹n måi cÇn mang tÝnh ®Æc thï ®Ó lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Måi cµng dµi, kh¶ n¨ng tæng hîp chÝnh x¸c ®o¹n ADN ®Ých cµng lín. Nång ®é måi thêng dïng kho¶ng 1-2 μM.
C¸c nucleotide (dNTP): lµ hçn hîp cña 4 lo¹i dATP, dCTP, dGTP, dTTP lµm nguyªn liÖu cho ph¶n øng tæng hîp ADN. Nång ®é dNTP thêng dïng kho¶ng 100 μM.
Enzym ADN polymeraza chÞu nhiÖt: cã nhiÒu lo¹i enzym polymeraza chÞu nhiÖt nh: Taq ADN polymeraza t¸ch ra tõ vi khuÈn Thermus aquatucus, Pfu ADN polymeraza ®îc tæng hîp tõ vi khuÈn Thermococcus litoralis, Tth ADN polymeraza tæng hîp tõ vi khuÈn Pyrococcus furiosus… Mçi lo¹i ®Òu cã ®Æc ®iÓm riªng nhng th«ng dông nhÊt lµ Taq ADN polymeraza, cã träng lîng ph©n tö 94 kDa vµ ho¹t ®éng tèt nhÊt ë 70-80oC. Enzym nµy cã ho¹t tÝnh 5’-3’ exonucleaza.
Dung dÞch ®Öm: thµnh phÇn chung nhÊt cña dung dÞch ®Öm gåm: KCl, MgCl2, vµ Tris [3]. Trong ®ã quan träng nhÊt lµ ion Mg++. Nã h×nh thµnh mét phøc hîp hßa tan víi dNTP, lµm t¨ng nhiÖt ®é nãng ch¶y cña ADN sîi ®«i vµ t¨ng kh¶ n¨ng g¾n måi vµo khu«n. Nång ®é cuèi cïng cña Mg++ trong ph¶n øng biÕn ®æi tõ 0.5-5.0 mM, tèi u lµ 1- 1.5 mM.
DiÔn biÕn ph¶n øng PCR
Giai ®o¹n 1: BiÕn tÝnh ban ®Çu ë nhiÖt ®é 93-98 oC, thêi gian tõ 1-5 phót. ADN khu«n sîi ®«i (ADN tæng sè) ®îc biÕn tÝnh. Khi ®ã c¸c liªn kÕt hydro gi÷a hai m¹ch ®¬n sÏ bÞ ph¸ vì vµ hai m¹ch ®¬n t¸ch nhau ra. NÕu G+C > A+T (liªn kÕt bæ sung gi÷a hai sîi ®¬n bÒn h¬n) hoÆc khu«n ADN kh¸ dµi th× nhiÖt ®é biÕn tÝnh cµng ph¶i cao hay thêi gian biÕn tÝnh l©u h¬n.
Giai ®o¹n 2: Ph¶n øng diÔn ra theo chu kú. Thêng lµ 20-40 chu kú. Mçi chu kú gåm c¸c bíc sau:
Chu kú 1
Bíc 1: BiÕn tÝnh ADN khu«n - diÔn ra nh giai ®o¹n 1
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
Bíc 2: G¾n måi ë nhiÖt ®é 35-65 oC (måi cµng ng¾n vµ Ýt G, C th× nhiÖt ®é g¾n måi cµng thÊp), thêi gian tõ 30 gi©y - 3 phót. §o¹n måi g¾n vµo ®o¹n ADN khu«n cÇn nh©n cã trong ADN tæng sè theo nguyªn t¾c bæ trî víi tr×nh tù baz¬ nit¬ ë 2 ®Çu cña nã.
3’ 5’
5’ 3’ 3’ 5’
5, 3’
Bíc 3: Tæng hîp ADN ë nhiÖt ®é 70-75 oC, thêi gian tõ 1-5 phót. Enzyme ADN polymeraza chÞu nhiÖt ho¹t ®éng vµ sù tæng hîp ADN diÔn ra trªn nh÷ng ®o¹n måi g¾n vµo. ë nhiÖt ®é nµy enzyme ho¹t ®éng víi vËn tèc cao.
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
§o¹n ADN tæng hîp ®îc ë chu kú 1 cã chiÒu dµi tïy thuéc vµo thêi gian tæng hîp. Thêi gian tæng hîp ®îc cµi ®Æt sao cho ®o¹n ADN nµy Ýt nhÊt ph¶i b»ng hoÆc dµi h¬n ®o¹n ADN cÇn tæng hîp. KÕt thóc chu kú 1.
Chu kú 2….n
Tõ chu kú thø 2….n cã diÔn biÕn t¬ng tù nh chu kú 1. Tuy nhiªn thêi gian biÕn tÝnh lµ 30 gi©y -1 phót. ADN khu«n trong c¸c chu kú nµy ngoµi ADN tæng sè cßn cã c¸c ®o¹n ADN ®îc tæng hîp ë c¸c chu kú tríc ®ã, lóc nµy sÏ cho s¶n phÈm lµ ®o¹n ADN cÇn tæng hîp do nã sÏ bÞ chÆn 2 ®Çu bëi cÆp måi.
Sè lîng c¸c ®o¹n ADN cÇn tæng hîp sau mçi chu kú ngµy cµng nhiÒu. Do ®ã sau khi kÕt thóc ph¶n øng PCR ta sÏ khuÕch ®¹i ®îc sè lîng lín ADN cÇn nh©n lªn
Chu kú 2 3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
KÕt thóc chu kú 2
Chu kú 3
3’ 5’
5’ 3’ 3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
S¶n phÈm ADN 5’ 3’
KÕt thóc chu kú 3
Chu kú 4 ®Õn chu kú n diÔn ra gièng chu kú 1, 2, 3 nhng ADN khu«n sö dông chñ yÕu lµ ADN s¶n phÈm.
Giai ®o¹n 3: Sau khi kÕt thóc chu kú cuèi cïng, C¸c ®o¹n ADN ë c¸c chu kú tríc cha tæng hîp xong sÏ ®îc tæng hîp nèt ë nhiÖt ®é 70-75 oC, thêi gian tõ 5-10 phót.
ChÊm døt ph¶n øng vµ cÊt gi÷ ë nhiÖt ®é l¹nh.
I.4.2.2 ChØ thÞ RAPD (Random Amplymorphic ADN).
RAPD nghÜa lµ kü thuËt nh©n ngÉu nhiªn ®a h×nh c¸c ®o¹n ADN, ®îc ph¸t hiÖn bëi William vµ cs, 1990. RAPD lµ kü thuËt dùa trªn nguyªn lý PCR, sö dông nh÷ng ®o¹n måi ng¾n (kho¶ng 10 nucleotide) ®îc tæng hîp ngÉu nhiªn. Trong ph¶n øng, c¸c måi RAPD g¾n ngÉu nhiªn vµo ADN khu«n ë bÊt kú vÞ trÝ nµo cã tr×nh tù bæ sung víi nã. S¶n phÈm PCR ®îc ch¹y ®iÖn di trªn gel agarose 2% nhuém cïng EtBr ®Ó ph©n t¸ch c¸c b¨ng ADN vµ ph¸t hiÖn c¸c b¨ng ADN díi tia s¸ng cña ®Ìn cùc tÝm [3].Do tÝnh ngÉu nhiªn nªn cã thÓ cã rÊt nhiÒu ®o¹n ADN ®a h×nh cã kÝch thíc kh¸c nhau ®îc nh©n b¶n sau ph¶n øng PCR. RAPD- trong ®¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng di truyÒn chÝnh lµ dùa vµo viÖc ph©n tÝch, so s¸nh c¸c ®o¹n ADN ®a h×nh cña c¸c ®èi tîng nghiªn cøu ®Ó thÊy ®îc sù gièng vµ kh¸c nhau trong cÊu tróc genome cña nã.
ChØ thÞ RAPD lµ chØ thÞ tréi bëi nã biÓu hiÖn sù cã mÆt hay v¾ng mÆt nh÷ng b¨ng ADN ®Æc trng. V× vËy kh«ng ph©n biÖt ®îc thÓ dÞ hîp tö trong quÇn thÓ F2.
ChØ thÞ RAPD cã u ®iÓm lµ kh«ng cÇn ph¶i biÕt tríc th«ng tin vÒ tr×nh tù ADN ®Ó thiÕt kÕ måi, rÎ tiÒn, nhanh gän. Tuy nhiªn do sö dông måi ng¾n vµ nhiÖt ®é kÕt cÆp thÊp (kho¶ng 34-37 oC) nªn ®é chÝnh x¸c kÐm. V× thÕ cÇn tiÕn hµnh thÝ nghiÖm nhiÒu lÇn ®Ó cã kÕt qu¶ chÝnh x¸c.
RAPD rÊt phï hîp cho ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn vµ lËp b¶n ®å sö dông quÇn thÓ RIL (Recombinant Inbred Line) [3].
I.4.2.3 ChØ thÞ AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [3]
AFLP cã nghÜa lµ ®a h×nh ®é dµi c¸c ®o¹n ADN ®îc khuÕch ®¹i chän läc, do Vos vµ cs ph¸t hiÖn ra n¨m 1975.
Kü thuËt nµy ®îc ph¸t triÓn trªn nguyªn lý PCR ®Ó nh©n b¶n nh÷ng ®o¹n ADN ®· ®îc c¾t b»ng enzym c¾t giíi h¹n. §iÓm c¬ b¶n nhÊt cña kü thuËt nµy lµ sù thiÕt kÕ måi PCR ®Æc trng.
Quy tr×nh thiÕt kÕ måi ®Æc trng nh sau:
Bíc 1: ADN ®îc c¾t b»ng enzym c¾t giíi h¹n, thêng lµ enzym EcoRI (nhËn biÕt 6 nucleotide) vµ MseI (nhËn biÕt 4 nucleotide), t¹o thµnh v« sè m¶nh cã kÝch thíc kh¸c nhau, mçi m¶nh ®Òu biÕt tríc tr×nh tù nucleotide hai ®Çu c¾t
Bíc 2: Dùa vµo tr×nh tù ë ®Çu c¾t, thiÕt kÕ c¸c ®o¹n g¾n (adapter) vµ g¾n chóng vµo mçi ®Çu.
Bíi 3: Dùa vµo tr×nh tù adapter, ngêi ta thiÕt kÕ måi PCR. Måi gåm 2 phÇn: mét phÇn cã tr×nh tù nucleotide bæ sung víi adapter vµ phÇn kia lµ nh÷ng nucleotide ®îc thªm vµo tïy ý, th«ng thêng tõ 1-3 nucleotide.
Víi måi ®îc thiÕt kÕ nh vËy th× chØ cã nh÷ng ®o¹n ADN cã tr×nh tù hai ®Çu bæ sung víi tr×nh tù måi míi ®îc nh©n b¶n.
Nh vËy cã thÓ nãi kü thuËt AFLP ®îc ph¸t triÓn bëi sù kÕt hîp c¸c yÕu tè kü thuËt RFLP vµ ph¶n øng PCR ®Ó nh©n c¸c ®o¹n giíi h¹n ®Æc trng. S¶n phÈm PCR cña mçi måi ë mçi mÉu nghiªn cøu sÏ xuÊt hiÖn b¨ng ADN ®Æc trng nÕu kh«ng cã ®ét biÕn t¹i ®iÓm c¾t cña enzym giíi h¹n t¬ng øng víi vÞ trÝ b¾t cÆp cña måi, ngîc l¹i sÏ kh«ng xuÊt hiÖn b¨ng ADN ®Æc trng.
VÒ c¬ b¶n AFLP lµ chØ thÞ tréi, vµ vÞ trÝ trªn nhiÔm s¾c thÓ cña chóng cha ®îc x¸c ®Þnh, do vËy nÕu dïng chØ thÞ nµy ®Ó lËp b¶n ®å gen ë quÇn thÓ F2 th× cÇn ph¶i sö dông kÕt hîp víi c¸c chØ thÞ kh¸c ®· biÕt tríc vÞ trÝ trªn NST nh RFLP vµ SSR.
I.4.2.4 ChØ thÞ SSR (Simple Sequence Repeats)
SSR lµ kü thuËt khuÕch ®¹i c¸c ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i ®¬n gi¶n, cßn gäi lµ ph¬ng ph¸p vi vÖ tinh (Microsatellite), do Lit vµ Luty giíi thiÖu vµ n¨m 1989 khi nghiªn cøu genome cña mét sè sinh vËt ®· ph¸t hiÖn ra nh÷ng ®o¹n ADN cã chiÒu dµi kh¸c nhau, ph©n bè mét c¸ch ngÉu nhiªn mµ tr×nh tù cña nã bao gåm c¸c nhãm nucleotide lÆp l¹i mét c¸ch cã tr×nh tù [5].
C¸c nhãm nucleotide lÆp l¹i nµy thêng cã tr×nh tù kh«ng vît qu¸ 5 nucleotide nh (TG)n hoÆc (AAT)n. ë lóa c¸c nucleotide ®· ph¸t hiÖn ®îc gåm GA, GT, CAT, CTT. Nh÷ng ®o¹n ADN lÆp l¹i nh vËy ®îc gäi lµ Microsateline hay cßn cã tªn kh¸c nh: SSLPs (single sequennce length polymorphisms), SSRs (simple sequence repeats), STRs (short tADNom repeats). C¸c ®o¹n ADN nµy cã tr×nh tù hai ®Çu rÊt ®Æc trng cho mçi ®o¹n, bëi vËy tr×nh tù ®Æc trng cho mçi ®Çu cña ®o¹n nh¾c l¹i nµy ®îc sö dông ®Ó thiÕt kÕ måi cho PCR [3].
C¸c ‘vi vÖ tinh’ rÊt phæ biÕn trong hÖ gen cña tÊt c¶ c¸c sinh vËt. Vïng cã ADN lÆp l¹i thêng kÐm æn ®Þnh h¬n c¸c vïng kh¸c, nªn ë c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau, tr×nh tù ®ã ®îc lÆp l¹i víi sè lÇn kh¸c nhau. Do ®ã vïng nµy thêng ®a d¹ng h¬n c¸c vïng kh¸c.
C¸c ®a h×nh SSR ®îc sinh ra do måi SSR khuÕch ®¹i vïng ADN lÆp l¹i cã tr×nh tù bæ sung víi hai ®Çu cña vïng nµy trong ph¶n øng PCR; dïng ®Ó so s¸nh gi÷a c¸c ®èi tîng cÇn nghiªn cøu. NÕu c¸c vïng ADN lÆp l¹i cña c¸c ®èi tîng nµy (do cïng mét måi SSR khuÕch ®¹i) cã ®a h×nh, do cã sè lÇn lÆp l¹i kh¸c nhau th× khi s¶n phÈm PCR ®îc ®iÖn di vµ chôp ¶nh gel sÏ ph¸t hiÖn ®îc c¸c b¨ng ®a h×nh.
Kü thuËt SSR ®¬n gi¶n, tiÖn lîi vµ rÊt h÷u Ých trong nghiªn cøu genome v× chóng ®îc thiÕt kÕ dùa trªn nh÷ng vïng m· hãa cã tÝnh b¶o thñ cao trong hÖ gen [22]. H¬n n÷a chØ thÞ ssr thêng chØ khuÕch ®¹i c¸c locus ®Æc trng cho sù ®a d¹ng cña c¸c loµi trong 1 chi, ®«i khi 1 hä [19]. Tuy nhiªn nhîc ®iÓm cña chØ thÞ nµy lµ qu¸ tr×nh thiÕt kÕ måi rÊt tèn kÐm.
Trong sè c¸c chØ thÞ ®îc sö dông ®Ó lËp b¶n ®å, ssr lµ lo¹i chØ thÞ ®Æc biÖt ®îc sö dông nhiÒu bëi tÝnh ®ång tréi vµ ®a allen [22]. ChØ thÞ ssr cã thÓ sö dông cho c¸c quÇn thÓ ®Ó lËp b¶n ®å kh¸c nhau, cho c¸c nghiªn cøu vÒ tiÕn hãa cña genome, so s¸nh genome còng nh sö dông hiÖu qu¶ nguån gen trong chän t¹o gièng nhê chØ thÞ ph©n tö.
§èi víi ®èi tîng genome c©y b«ng, nhiÒu lç lùc ph¸t triÓn chØ thÞ ssr ®· ®îc tiÕn hµnh vµ chØ thÞ ssr ®ang ®îc sö dông réng r·i trong nghiªn cøu lËp b¶n ®å di truyÒn c©y b«ng [20], [23], [26].
Hµng ngh×n chØ thÞ ssr cña b«ng ®îc x¸c ®Þnh t¹i c¸c phßng thÝ nghiÖm kh¸c nhau: Brookhaven National Laboratoy (BNL), Texas A&M University [23] nghiªn cøu gÇn ®©y nhÊt cña Wangzhen Guo vµ cs 2007 ®· sö dông chØ thÞ ssr ®Þnh vÞ ®îc 1790 locus ë 26 nhãm liªn kÕt bao phñ mét vïng 3425,8 cM víi kho¶ng c¸ch trung b×nh gi÷a c¸c locus lµ 1,91 cM. Trong ®ã b¶n ®å liªn kÕt genome nµy bao gåm 71,96% c¸c locus gen chøc n¨ng, 475 locus cã liªn kÕt víi 3 lo¹i gen chÝnh quy ®Þnh qu¸ tr×nh sinh häc, thµnh tÕ bµo, chøc n¨ng ph©n tö ë b«ng.
Ngoµi c¸c chØ thÞ ph©n tö ®· ®îc ®Ò cËp ®Õn trong néi dung ®Ò tµi nµy cßn cã rÊt nhiÒu c¸c chØ thÞ kh¸c n÷a: STS (sequennce tag site), SCAR (sequence characterized amplified region), CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence).
I.5 t×nh h×nh Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn trªn ®èi tîng c©y b«ng
I.5.1 Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn c©y b«ng trªn thÕ giíi
Lµ mét c©y trång quan träng nhng do cã bé gen lín vµ phøc t¹p, nªn c«ng t¸c nghiªn cøu genome b«ng tiÕn chËm h¬n so víi c¸c c©y trång kh¸c nh lóa, ng«, ®Ëu t¬ng...[26]
Nh÷ng thµnh tùu khoa häc sö dông chØ thÞ ph©n tö nh sö dông chØ thÞ RFLP, chØ thÞ SSR, hay RAPD (môc I.4) ...®Þnh vÞ ®îc rÊt nhiÒu c¸c locus trªn genome b«ng ®· t¹o ®iÒu kiÖn ®Ó viÖc nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn trªn ®èi tîng b«ng sö dông chØ thÞ ph©n tö, trë nªn thuËn tiÖn h¬n.
Trong c¸c chØ thÞ ph©n tö dïng trong nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn chØ thÞ RFLP, SSR cã møc ®é chÝnh x¸c rÊt cao, nhng RFLP cã khèi lîng c«ng viÖc cång kÒnh nªn Ýt ®îc sö dông h¬n chØ thÞ SSR.
C·ndida H.C. de Magalh·es Bertini vµ cs (2006) ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn c¸c gièng b«ng (Gosypium hirsutum L) ®ang ®îc trång ë Brazil, Argentine vµ Paraguay. Sau khi t¸ch chiÕt ADN cña 53 gièng b«ng vµ nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng, sö dông 31 cÆp måi SSR, khuÕch ®¹i 33 locus. KÕt qu¶ thu ®îc tæng sè 66 allen, trung b×nh 2,13 allen/locus SSR vµ gi¸ trÞ PIC kh¸c nhau tõ 0,18 - 0,62 gi¸ trÞ trung b×nh lµ 0.4, hÖ sè kh«ng t¬ng ®ång tõ 0 - 0,41. Còng trªn ®èi tîng b«ng, Gutierrez vµ cs (2002) ®· sö dông 60 cÆp måi cho ®a h×nh, kÕt qu¶ khuÕch ®¹i 69 locus víi tæng sè 139 allen vµ trung b×nh cã 2 allen/locus. Liu vµ cs (2000b) ®· sö dông 56 cÆp måi cho ®a h×nh, khuÕch ®¹i 62 locus b«ng vµ thu ®îc tæng sè 325 allen, trung b×nh 5 allen/lucus, gi¸ trÞ PIC tÝnh ®îc lµ tõ 0.05- 0.82 gi¸ trÞ trung b×nh lµ 0.31. C¸c gièng b«ng mµ Liu vµ cs (2000b) sö dông cã c¶ c¸c gièng G.hirsutum hoang d¹i. Multani vµ Lyon (1995), khi ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn gi÷a 9 gièng b«ng cña óc sö dông chØ thÞ RAPD còng thu ®îc kÕt qu¶ gi¸ trÞ kho¶ng c¸ch di truyÒn thÊp (0.01-0.08). Iqbal vµ cs (1997) còng sö dông chØ thÞ RADP t×m ra kho¶ng c¸ch di truyÒn thÊp (0.18-0.07) gi÷a 17 gièng G.hirsutum [13].
A B Dongre* vµ cs, (2007) ®· ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn cña 19 ®èi tîng b«ng gåm: 11 kiÓu gen cña loµi G. hirsutum vµ 8 kiÓu gen cña loµi G. arboreum, sö dông 25 måi SSR ®îc lùa chän ngÉu nhiªn tõ tËp hîp måi JESPR-307 do phßng thÝ nghiÖm Brookhaven National Laboratories c«ng bè vµ 19 måi ISSR. Trong sè 25 chØ thÞ SSR cã 17 chØ thÞ cho tæng sè 56 b¨ng ®a h×nh, 4 chØ thÞ lµ ®¬n h×nh vµ 4 chØ thÞ cßn l¹i lµ kh«ng ghi ®îc kÕt qu¶ vµ kh«ng cho b¨ng ®a h×nh. HÖ sè t¬ng ®ång giøa hai loµi G.hirsutum vµ G.arboreum lµ 0.59, khi so s¸nh hÖ sè t¬ng ®ång cña c¸c gièng nhÞ béi G.arboreum (0.618) thÊy nhá h¬n cña c¸c gièng tø béi G.hirsutum (0.718). Trong sè 19 chØ thÞ ISSR t¹o ra 72 b¨ng ®a h×nh, mét måi lµ ®¬n h×nh, 3 måi kh«ng ghi ®îc kÕt qu¶ vµ kh«ng cho ®a h×nh. HÖ sè t¬ng ®ång gi÷a hai loµi G.hirsutum vµ G.arboreum lµ 0.59 vµ còng cho kÕt qu¶ hÖ sè t¬ng ®ång cña c¸c loµi tø béi cao h¬n c¸c loµi lìng béi [10].
I.5.2 Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn c©y b«ng t¹i ViÖt Nam [6].
ë ViÖt Nam, NguyÔn thÞ Minh NguyÖt vµ cs (2009) ®· nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn cña 49 gièng b«ng ®Þa ph¬ng vµ nhËp néi, ®¹i diÖn cho 3 nhãm b«ng Luåi (G.hirsutum L.), b«ng H¶i §¶o (G.babardense L.), b«ng Cá (G.arboreum L.) sö dông 50 cÆp måi SSR. KÕt qu¶ trong sè 50 cÆp måi kiÓm tra, cã 27 cÆp måi cho ®a h×nh víi tæng sè allen thu ®îc lµ 128, ®é t¬ng ®ång di truyÒn gi÷a c¸c gièng b«ng n»m trong kho¶ng 0.48-0.97 trung b×nh lµ 0.8, c¸c cÆp gièng xa nhau nhÊt vÒ di truyÒn (cã hÖ sè t¬ng ®ång 48%) chñ yÕu lµ nh÷ng cÆp b«ng Luåi-b«ng H¶i §¶o. §a d¹ng di truyÒn quan s¸t ®îc trong nhãm c¸c gièng b«ng Luåi cao h¬n so víi 2 nhãm b«ng H¶i §¶o vµ b«ng Cá. Còng trong nghiªn cøu nµy, 49 gièng b«ng nghiªn cøu ®· chia lµm 3 nhãm: nhãm 1 gåm 16 gièng b«ng H¶i §¶o, nhãm 2 gåm 21 gièng b«ng Luåi, nhãm 3 gåm 12 gièng b«ng Cá. §é t¬ng ®ång di truyÒn cña nhãm 1 víi 2 nhãm b«ng cßn l¹i thÊp, chØ kho¶ng 59%. Nhãm b«ng Luåi vµ b«ng Cá gÇn nhau vÒ mÆt di truyÒn h¬n, víi ®é t¬ng ®ång di truyÒn kho¶ng 67%. §é t¬ng ®ång di truyÒn gi÷a c¸c gièng b«ng trong cïng nhãm ph©n lo¹i kh¸ cao, trªn 84%.
Ch¬ng II: VËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
II.1 VËt liÖu
II.1.1 VËt liÖu thùc vËt
Chóng t«i nghiªn cøu 21 gièng b«ng bao gåm: 11 gièng b«ng luåi (G.hirsutum L.) vµ 10 gièng b«ng H¶i ®¶o (G.barbadense L.) chän läc tõ tËp ®oµn gièng cña ViÖn nghiªn cøu b«ng vµ PTNN Nha Hè.
B¶ng 1: Danh s¸ch c¸c gièng b«ng Luåi
Tt
Tªn gièng
Mst§
Nguån gèc
N¨m thu thËp
1
591
Ên §é
1984
2
1358
Nam Mü
1999
3
1426
Nam Mü
1999
4
1458
Th¸i Lan
2000
5
1488
Th¸i Lan
2000
6
1490
Th¸i Lan
2000
7
1503
Th¸i Lan
2000
8
1516
Th¸i Lan
2000
9
1530
Trung Quèc
2000
10
1562
Trung Quèc
2000
11
1598
Trung Quèc
2001
B¶ng 2: Danh s¸ch c¸c gièng b«ng H¶i §¶o
tt
Tªn gièng
Mst§
Nguån gèc
N¨m thu thËp
1
10
Ai cËp
1965
2
62
Ên ®é
1984
3
128
Ai cËp
1984
4
129
Ai cËp
1984
5
138
Ai cËp
1984
6
139
Ai cËp
1984
7
141
agy
1984
8
147
agy
1984
9
148
Zaf
1984
10
156
Zaf
1984
Chó thÝch: MST§: m· sè tËp ®oµn
II.1.2 Hãa chÊt, thiÕt bÞ
II.1.2.1 Hãa chÊt
C¸c hãa chÊt th«ng dông dïng trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö:
CTAB, NaCl, Taq polymeraza, dNTP, PVP, BSA, Tris- HCl, Na2-EDTA, DIECA, β- mercaptoethanol, Ascorbic acid, Etanol 100%, NaOAc (sodium acetat), isoamyl alcohol, chloroform, isopropanol, ethidium bromide (EtBr)...
II.1.2.2 ThiÕt bÞ
M¸y li t©m, m¸y nghiÒn m«, m¸y PCR Veriti 96 well thermal cycler, m¸y quang phæ Nanodrop, tñ hót...
II.1.3 ChØ thÞ ssr
C¸c cÆp måi ssr (20 cÆp) ®îc chän läc tõ cÆp måi ®· ®îc lËp b¶n ®å trªn hÖ genome c©y b«ng(Cotton Marker Database: Cotton Genome database:
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
TT
B¶ng 3: Th«ng tin måi SSR
BNL1673
BNL3257
BNL2895
BNL2821
BNL2590
BNL2495
BNL2449
BNL1611
BNL1604
BNL1551
Tªn måi
CTCTTAATGCTTGGCCTTGG
CAATCTGGGATCAAAAAAACC
CGATTTTACTGCTTCAGACTTG
TGTTTTTGCATCATCCTTGC
GAAAAACCAAAAAGGAAAATCG
ACCGCCATTACTGGACAAAG
ATCTTTCAAACAACGGCAGC
CAATGAACAAAAAATGTAAGGG
AGAGGGAGTAAAGATTTGGGG
CGCAAGCCACCTGTAAAAC
Forward primer
Tr×nh tù måi
AGTACCGGACTCGGCACTAT
GGTGAAACATAGCGTGTTGC
TACCATCTCACGGATCCACA
TGTAGGAACAACATGCCCAA
CTCCCTCTCTCTAACCGGCT
AATGGAATTTGAACCCATGC
CGATTCCGGACTCTTGATGT
TGGGCATTTAGCCATTTACC
TCCAGTTCTTTTTGCCTTGG
TCGAATTTTCTCTCTCTCTCTCTCT
Reverse primer
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
TT
B¶ng 3: Th«ng tin måi SSR(tiÕp theo)
NAU3377
NAU3171
NAU2556
JESPR296
BNL4059
BNL3599
BNL3816
BNL1693
BNL3379
BNL3261
Tªn måi
TGCAAGGAATCAAGTTCACA
AATATGGAGATCACCCCTCA
GAGAAGTTAGTTACTTGCAT
GGGTGTTACATAGAGTGTATAAAATTG
GAGTTACGCCTGGCAATCAT
TTTAGCCCCAGTAACATGCC
GTTAGCCACGTGTTAGTTCTATG
CCCTTGGGAATAGCAGGTG
AACGGAACAAACCTTGAGGA
AAACGGAAACGAAGAAGGGT
Forward primer
Tr×nh tù måi
CTGATTGTACTTTGCGGGTA
TGCTTTGGGGTTTGATATTT
ATCAAGTTTTCAGGGCAATC
TGACCTCAATTTAGAAACCC
CCATCCCCAGTGGTGTTATC
ACTGCAAGCTCTGCCCTAAA
ATCGATCACTTGCTGGTTCC
CATGTGTCTCCGTGTGTGTGTG
GTGCATGTGGTATGTTGGGA
CCCAAACCTGTCTCACCAAC
Reverse primer
II.2 Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
II.2.1 T¸ch chiÕt ADN tæng sè
ADN l¸ b«ng ®îc t¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch theo ph¬ng ph¸p CTAB vµ Doyle vµ Doyle (1987) cã c¶i tiÕn.
II.2.1.1 ChuÈn bÞ vËt liÖu
-ChuÈn bÞ mÉu l¸ non cña mçi gièng: c¸c tÕ bµo l¸ non cã cÊu tróc mµng tÕ bµo dÔ bÞ ph¸ vì, sÏ thuËn lîi khi t¸ch chiÕt ADN.
-Dung dÞch ®Öm chiÕt
B¶ng 4: Thµnh phÇn ®Öm chiÕt
Hãa chÊt
Nång ®é
ThÓ tÝch
1 M Tris- HCl pH 8.0
100 mM
100 ml
5 M NaCl
1.4 M
280 ml
0.5M Na2-EDTA, pH 8.0
20 mM
40 ml
CTAB
2% (w/v)
20g
PVP40
2% (w/v)
20g
DIECA
0.1%
1g
β- mercaptoethanol
0.2% (v/v)
2 ml
Ascorbic acid
0.1% (w/v)
1g
H2O
Tæng sè
1000 ml
Hçn hîp nµy cã t¸c dông:
+Ph¸ vì mµng tÕ bµo vµ mµng nh©n ®ång thêi gi¶i phãng ADN ra ngoµi.
+Dung dÞch Tris- HCl pH 8.0 lµm æn ®Þnh pH dung dÞch ®Öm chiÕt.
+Na2-EDTA pH 8.0 cã t¸c dông g¾n chÆt c¸c ion Mg++ lµ yÕu tè cÇn thiÕt cho sù ho¹t ®éng cña enzyme nucleaza, lµm bÊt ho¹t enzyme nµy.
+NaCl lµm t¨ng kh¶ n¨ng hßa tan nucleic acid trong dung dÞch.
-Dung dÞch ®Öm röa:
Hçn hîp ®Öm röa ph¶i cã nång ®é cån cao, nång ®é muèi cao ®Ó tr¸nh cho ADN ®· kÕt tña bÞ hßa tan trë l¹i g©y tæn thÊt ADN.
B¶ng 5: Thµnh phÇn Wash buffer I
Hãa chÊt
Nång ®é
ThÓ tÝch
Etanol 100%
76%
380 ml
1M NaOAc (sodium acetat)
0.2M
100 ml
H2O
20 ml
Tæng sè
500 ml
B¶ng 6: Thµnh phÇn Wash buffer II
Hãa chÊt
Nång ®é
ThÓ tÝch
Etanol 100%
76%
380 ml
1M NaOAc (sodium acetat)
0.2M
100 ml
H2O
20 ml
Tæng sè
500 ml
-C¸c hãa chÊt vµ dông cô cÇn dïng kh¸c...
II.2.1.2 Quy tr×nh t¸ch chiÕt
-MÉu l¸ non ®îc nghiÒn trong nit¬ láng (-196oC) trong èng eppendorf 2 ml. Trong nit¬ láng c¸c m« bÞ ®«ng cøng, díi t¸c dông cña c¬ häc chóng dÔ dµng bÞ ph¸ vì. Ngoµi ra ë nhiÖt ®é thÊp c¸c enzyme ®Òu bÞ bÊt ho¹t, tr¸nh cho ADN bÞ ph©n hñy bëi enzyme Dnase cã trong tÕ bµo khi nghiÒn.
-Thªm 1 ml dung dÞch ®Öm chiÕt.
-ñ 65oC trong 90 phót , cø 15 phót l¾c ®Òu 1 lÇn.
-Cho 500l chloroform: isoamyl alcohol (24:1), l¾c nhÑ trong 5 phót, sau ®ã ly t©m 12.000 (vßng/phót) trong 15 phót. Trong qu¸ tr×nh nµy protein, polysaccharide, lipid vµ c¸c chÊt h÷u c¬ kh¸c bÞ biÕn tÝnh. Khi ly t©m c¸c chÊt nµy vµ x¸c tÕ bµo t¸ch ra khái hçn hîp, cßn l¹i phÇn dÞch hßa tan ADN ë phÝa trªn.
-ChuyÓn phÇn dÞch phÝa trªn sang èng eppendorf míi, cho 500l isopropanol ®Ó tña ADN. Ly t©m 12.000 (vßng/phót) trong 15 phót ®Ó thu tña.
-Röa tña b»ng 500l Wash buffer I, sau ®ã ly t©m 12.000 (vßng/phót) trong 5 phót ®Ó thu tña.
-TiÕp tôc röa b»ng 500l Wash buffer II, sau ®ã ly t©m 12.000 (vßng/phót) trong 5 phót ®Ó thu tña.
-§Ó kh« ADN sau ®ã cho 50l TE
-Khö ARN b»ng c¸ch cho thªm 4l RNAse/eppendorf trong tñ Êm 37oC trong 3h.
II.2.1.3 KiÓm tra ADN tæng sè
ChÊt lîng vµ nång ®é ADN tæng sè ®îc kiÓm tra trªn gel agarose 0.8%. Nång ®é chÝnh x¸c ®îc ®o trªn m¸y quang phæ Nanodrop.
NÕu ADN t¸ch chiÕt cã chÊt lîng tèt, khi kiÓm tra trªn gel agarose 0.8% chØ cã 1 v¹ch ADN quan s¸t ®îc. NÕu ADN bÞ g·y vôn thµnh nhiÒu ®o¹n trong qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt th× trªn gel agarose sÏ quan s¸t thÊy cã nhiÒu v¹ch ADN t¬ng øng víi c¸c ®o¹n cã møc ®é dµi ng¾n kh¸c nhau.
II.2.2 Ph¶n øng PCR
II.2.2.1 Thµnh phÇn ph¶n øng PCR: Mçi ph¶n øng PCR bao gåm c¸c thµnh phÇn ®îc tr×nh bµy ë b¶ng sau:
B¶ng 7: Thµnh phÇn ph¶n øng PCR
tt
Thµnh phÇn
ThÓ tÝch l
1
50 ng ADN tæng sè
3
2
0.15 M måi
3
3
0.2 M dNTPs
1.5
4
1X dÞch ®Öm PCR
1.5
5
Taq 16X
0.75
6
PVP 10%
1.5
7
BSA 10%
1.5
8
H2O
2.25
Tæng thÓ tÝch
15
II.2.2.2 Ch¬ng tr×nh ch¹y PCR: TiÕn hµnh ph¶n øng PCR lÇn lît tõng måi ®èi víi ADN tæng sè cña 21 gièng. Ph¶n øng PCR ®îc tiÕn hµnh trªn m¸y Veriti 96 Well Thermal Cycler. Tæng thÓ tÝch dung dÞch ph¶n øng lµ 15 μl
B¶ng 8: Ch¬ng tr×nh ch¹y PCR
C¸c bíc
NhiÖt ®é( oC )
Thêi gian
1
95
5 phót
2
94
30 gi©y
3
55
30 gi©y
4
72
2 phót
5
LÆp l¹i 35 chu kú (c¸c bíc 2,3,4)
6
4
II.2.3 §iÖn di, ph¸t hiÖn s¶n phÈm
Ph¬ng ph¸p ®iÖn di tiÕn hµnh theo ph¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose cña Khoa Genome thùc vËt, Trêng §¹i häc c«ng nghÖ Texas Mü 2004 cã c¶i tiÕn.
II.2.3.1 Nguyªn t¾c
Trong qu¸ tr×nh ®iÖn di do ADN tÝch ®iÖn (-) nªn c¸c b¨ng ADN sÏ di chuyÓn tõ phÝa cùc (-) sang phÝa cùc (+) cña bÓ ®iÖn di. §iÖn ¸p cµng cao ADN di chuyÓn cµng nhanh. Thêi gian ®iÖn di tïy thuéc vµo kÝch thíc s¶n phÈm PCR.
Sau khi kÕt thóc ®iÖn di c¸c b¨ng ADN cã kÝch thíc kh¸c nhau sÏ ®îc ph©n t¸ch do chóng cã tèc ®é di chuyÓn kh¸c nhau. Cã thÓ quan s¸t thÊy khi chôp ¶nh gel.
II.2.3.2 ChuÈn bÞ gel agarose
Gel agarose: lµ mét lo¹i polymer t¸ch tõ rong biÓn, cÊu t¹o bëi 2 monomer lµ D-galactose vµ 3,6-anhydro-L-galactose.
-Bét agarose ®îc hßa tan trong dung dÞch ®Öm theo ®óng tû lÖ (®èi víi kiÓm tra ADN tæng sè, gel agarose ®îc chuÈn bÞ víi nång ®é 0.8%, ®èi víi kiÓm tra s¶n phÈm PCR, gel agarose ®îc chuÈn bÞ víi nång ®é 3.5%)
-§un s«i dung dÞch agarose b»ng lß vi sãng.
-H¹ nhiÖt ®é s«i cña gel xuèng kho¶ng 50oC
-Bæ sung Ethidium bromide (EtBr) cã nång ®é 0.5g/ ml. Quan s¸t chÊt nµy khi chiÕu ®Ìn cùc tÝm nã ph¸t huúnh quang mµu cam, khi EtBr liªn kÕt víi ADN cêng ®é mµu cã thÓ t¨ng lªn gÇn 20 lÇn.
-ChuÈn bÞ khay gel vµ lîc.
-Rãt hçn hîp gel agarose EtBr vµo khay gel, c¾m lîc. Thêi gian chê gel ®«ng lµ 45-60 phót.
Gel tríc khi ®æ vµo khay ph¶i kh«ng cã bät. NÕu nh cã bät sÏ lµm ¶nh hëng ®Õn kÕt qu¶ cña ¶nh gel kh«ng ®îc ®Ñp.
II.2.3.3 §iÖn di s¶n phÈm PCR
Sau khi chuÈn bÞ gel xong tiÕn hµnh ®iÖn di theo c¸c bíc sau:
-Tra mÉu ADN
-ChuÈn bÞ dung dich ®Öm TBE 0.5X cho vµo bÓ ch¹y ®iÖn di.
-Ch¹y ®iÖn di t¹i 100 mA
-Röa gel trong níc, ®Æt gel vµo m¸y soi UV vµ chôp ¶nh.
II.2.4 Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch sè liÖu: ph¬ng ph¸p ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn b»ng phÇn mÒm NTSYS pc v.2.1 ( Biostatistics Inc, 2002)
Gel ®iÖn di s¶n phÈm cña ph¶n øng PCR ®îc soi trªn m¸y UV vµ chôp ¶nh. ¶nh gel ®îc dïng ®Ó nhËn d¹ng ADN cña tõng c¸c thÓ, sau ®ã so s¸nh nhËn d¹ng ADN gi÷a c¸c gièng ®Ó ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn, thÓ hiÖn th«ng qua:
-HÖ sè PIC (Polymorphic Information Content) ®îc coi lµ thíc ®o tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c alen ë tõng locus SSR. Weir (1996) cho r»ng, gi¸ trÞ PIC cã thÓ ®îc coi nh lµ sù ®a d¹ng di truyÒn cña locus gen nghiªn cøu vµ tÝnh theo ph¬ng tr×nh [13]:
Trong ®ã: Pij : lµ tÇn sè xuÊt hiÖn cña alen thø j t¬ng øng víi måi i.
Gi¸ trÞ PIC cµng lín tøc lµ møc ®é ®a h×nh cña locus do måi i khuÕch ®¹i cµng lín, tøc lµ cµng nhiÒu allen ®îc sinh ra.
-HÖ sè t¬ng ®ång di truyÒn S [3]: ph¶n ¸nh møc ®é gièng nhau vµ kh¸c nhau gi÷a c¸c gièng. C¬ së ®Ó tÝnh to¸n hÖ sè nµy lµ m« h×nh to¸n Nei vµ Li (1979) nh sau:
Trong ®ã: S: lµ hÖ sè t¬ng ®ång( hÖ sè kh¸c nhau lµ )
Nxy: lµ sè b¨ng cïng vÞ trÝ cña mÉu x vµ y
Nx, Ny: lµ sè b¨ng AND cña mÉu x vµ y
Trong trêng hîp sè lîng mÉu Ýt, hÖ sè t¬ng ®ång cã thÓ tÝnh thñ c«ng; tuy nhiªn ngêi ta cã thÓ sö dông phÇn mÒm NTSYS ®Ó thay cho viÖc tÝnh thñ c«ng vµ trong trêng hîp sè lîng mÉu qu¸ lín.
Sau khi nhËn d¹ng ADN, b¶ng d÷ liÖu nhÞ ph©n ®îc chuÈn bÞ gåm c¸c sè 0 vµ 1, trong ®ã 0 lµ kh«ng cã b¨ng ADN vµ 1 lµ cã b¨ng ADN ë cïng mét vÞ trÝ. B¶ng d÷ liÖu nhÞ ph©n nµy sÏ ®îc nhËp vµo ch¬ng tr×nh NTSYS ®Ó cho ra b¶ng hÖ sè t¬ng ®ång S vµ s¬ ®å h×nh c©y biÓu thÞ mèi liªn kÕt di truyÒn gi÷a 21 gièng b«ng nghiªn cøu.
VÝ dô khi kiÓm tra ®a d¹ng di truyÒn cña 5 ®èi tîng, sö dông mét cÆp måi SSR, cã s¬ ®å nhËn d¹ng ADN nh sau:
A
B
C
D
E
1
2
3
Tõ ®ã ta cã b¶ng d÷ liÖu nhÞ ph©n :
A
B
C
D
E
1
1
0
0
0
1
2
0
1
1
0
0
3
0
0
0
1
0
Trong thùc tÕ ®Ó cho kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn chÝnh x¸c th× ph¶i tiÕn hµnh ph¶n øng vµ nhËn d¹ng víi nhiÒu måi kh¸c nhau; nªn b¶ng d÷ liÖu nhÞ ph©n sÏ lµ tËp hîp c¸c b¶ng d÷ liÖu cña c¸c måi mµ ta tiÕn hµnh nhËn d¹ng ADN.
Ch¬ng III : KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn
III.1 KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè
III.1.1 Môc ®Ých
T¸ch chiÕt ADN tæng sè lµ c«ng viÖc ®Çu tiªn, ®ãng vai trß quan träng trong nghiªn cøu genome cña sinh vËt. 21 gièng b«ng sau khi t¸ch chiÕt ADN tæng sè sÏ ®îc sö dông lµm khu«n ADN trong ph¶n øng PCR-SSR ®Ó ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn.
III.1.2 C¸c bíc tiÕn hµnh
T¸ch chiÕt ADN tæng sè cña 21 gièng b«ng ®îc thùc hiÖn theo ph¬ng ph¸p CATB vµ Doyle vµ Doyle (1987) cã c¶i tiÕn ®· miªu t¶ ë môc (II.2.1). KÕt qu¶ t¸ch chiÕt vµ x¸c ®Þnh nång ®é ADN tæng sè ®îc kiÓm tra b»ng ph¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose 0.8% vµ b»ng m¸y Narodrop nh ®· nªu ë môc (II.2.3 ).
Trong thµnh phÇn ®Öm chiÕt dïng ®Ó t¸ch ADN th× CTAB ®ãng vai trß v« cïng quan träng. CTAB lµ chÊt tÈy m¹nh, cã tÝnh chÊt lìng cùc, nã kÕt hîp víi protein mµng vµ c¸c ph©n tö phospholipid lµm ph¸ vì cÊu tróc cña mµng tÕ bµo vµ mµng nh©n, gi¶i phãng ADN ra ngoµi .
H¬n thÕ CTAB cã kh¶ n¨ng t¸ch ADN ra khái polysaccharit v× ADN vµ polysaccharit cã kh¶ n¨ng hßa tan kh¸c nhau trong ®Öm chiÕt cã CTAB. ADN cã thÓ kÕt hîp víi CTAB trong ®Öm chiÕt t¹o thµnh phøc hîp ADN-CTAB, phøc hîp nµy tan vµo dung dÞch cã nång ®é muèi > 0.7 M nhng sÏ kÕt tña trong dung dÞch cã nång ®é muèi < 0.4 M. Dùa vµo ®ã ta cã thÓ t¸ch ADN ra khái protein, polysaccharit vµ c¸c thµnh phÇn kh¸c cña dung dÞch.
Sau khi t¸ch chiÕt ADN thu ®îc ph¶i tinh s¹ch, kh«ng chøa ARN vµ c¸c chÊt øc chÕ ph¶n øng cßn sãt trong qu¸ tr×nh t¸ch (CTAB, chÊt øc chÕ tõ mÉu nh lµ c¸c s¾c tè ...), tr¸nh khi sö dông lµm khu«n ADN sÏ ¶nh hëng ®Õn kÕt qu¶ ph¶n øng PCR.
ADN ®îc kiÓm tra nång ®é chÝnh x¸c b»ng m¸y quang phæ Nanodrop. M¸y Nanodrop ho¹t ®éng dùa theo nguyªn t¾c cña ph¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô:
C¸c bases purin vµ pyrimidin hÊp thô m¹nh ¸nh s¸ng tö ngo¹i ë bíc sãng 260 nm. Do ®ã gi¸ trÞ mËt ®é quang ë bíc sãng 260 nm (A260) cña c¸c mÉu cho phÐp x¸c ®Þnh hµm lîng acid nucleic trong mÉu dùa vµo mèi t¬ng quan: Mét ®¬n vÞ A260 t¬ng øng víi nång ®é 50 ng/l cho dung dÞch chøa ADN sîi ®«i:
Hµm lîng ADN (ng/l) = A260 50 hÖ sè pha lo·ng
§Ó kiÓm tra ®é tinh s¹ch cña mÉu ADN t¸ch chiÕt th«ng qua tû sè A260/A280. Dung dÞch acid nucleic coi lµ s¹ch khi tû sè A260/A280 dao ®éng trong kho¶ng 1.8- 2.0.
§Ó b¶o ®¶m chÊt lîng ADN sau khi t¸ch chiÕt, ADN ®îc b¶o qu¶n trong ®iÒu kiÖn -20oC, qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm ë ®iÒu kiÖn 4oC.
III.1.3 KÕt qu¶ vµ nhËn xÐt
III.1.3.1 KiÓm tra chÊt lîng, ®é tinh s¹ch ADN tæng sè b»ng ®iÖn di trªn gel agarose 0.8% vµ m¸y Nanodrop
H×nh 1: ¶nh ®iÖn di ADN tæng sè cña 21 gièng b«ng
¶nh ®iÖn di ADN tæng sè cña 21 gièng b«ng cho thÊy chØ cã mét b¨ng duy nhÊt, ADN kh«ng bÞ ®øt g·y trong qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt, kh«ng cßn sãt ARN. §é tinh s¹ch cña ADN kiÓm tra ®¹t yªu cÇu. ChÊt lîng ADN sau t¸ch chiÕt tèt, nång ®é cao, ®ñ tiªu chuÈn sö dông cho ph¶n øng PCR.
I.1.3.2 KiÓm tra nång ®é ADN tæng sè b»ng m¸y Nanodrop
Nång ®é chÝnh x¸c cña c¸c mÉu ADN ®îc ®o b»ng m¸y quang phæ Nanodrop, kÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy t¹i b¶ng 9.
B¶ng 9: Nång ®é ADN tæng sè cña 21 gièng b«ng
Tªn gièng
Nång ®é (ng/l)
Tªn gièng
Nång ®é (ng/l)
MÉu 1
MÉu 2
MÉu 3
MÉu 1
MÉu 2
MÉu 3
L1358
1900
1850
1250
L1503
2205
3050
2350
L1426
1600
1700
1500
L1516
1500
980
1170
H§10
2350
4200
2300
L1530
670
1590
2150
H§62
4600
3300
4100
H§141
4100
3600
3800
H§128
2800
3350
3400
L1562
2840
1660
3000
L1458
2970
2400
2250
H§147
4200
2250
2400
H§129
1300
4900
500
L1598
2250
2490
3630
L1488
2000
2150
2170
H§148
250
1850
3300
L1490
1890
1720
1480
H§156
1500
1800
3000
H§138
3600
4600
4100
L591
2050
H§139
2400
4000
2500
III.2 kÕt qu¶ ph¶n øng PCR cña 20 cÆp måi SSR
III.2.1 Môc ®Ých
KÕt qu¶ thu nhËn s¶n phÈm PCR b»ng 20 cÆp måi SSR sau khi ®iÖn di, chôp ¶nh gel, nhËn d¹ng c¸c b¨ng ADN, phôc vô cho ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn.
III.2.2 C¸c bíc tiÕn hµnh
Sau khi t¸ch chiÕt ADN tæng sè, ADN ®îc pha lo·ng vÒ nång ®é 50ng/l sö dông ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lÇn lît víi c¸c måi SSR ®îc lùa chän víi thµnh phÇn vµ chu kú PCR nh ®· nªu ë môc (II.2.2), sau ®ã ®iÖn di s¶n phÈm trªn gel agarose 3.5% vµ chôp ¶nh gel, c¸c bíc tiÕn hµnh nh ®· nªu ë môc (II.2.3).
Trong thµnh phÇn hçn hîp cho ph¶n øng PCR trªn ®èi tîng c©y b«ng ngoµi c¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cña ph¶n øng (môc I.4.2.1) cßn cã thªm cã 2 thµnh phÇn lµ PVP, BSA: v× trong thµnh phÇn tÕ bµo c©y b«ng cã nhiÒu hîp chÊt polysaccharit, qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch ADN cã thÓ cßn sãt l¹i, hai chÊt nµy cã t¸c dông ph©n hñy chóng trong ph¶n øng PCR.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
Đồ án - Tùng.doc- ~$a đồ án.doc
- bìa đồ án.doc
- danh mục bảng và hình.doc
- lời cảm ơn.doc
- mục lục.doc
Thumbs.db- từ viết tắt.doc
