Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn bí đỏ địa phương bằng chỉ thị SSR

54 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN BÍ ĐỎ ĐỊA PHƯƠNG BẰNG CHỈ THỊ SSR Hà Minh Loan1, Trần Danh Sửu2, Ngô Thị Hạnh3 TÓM TẮT Nghiên cứu sử dụng 41 chỉ thị phân tử SSR để đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 100 mẫu giống bí đỏ địa phương. Kết quả cho thấy, trong số 41 chỉ thị SSR có 23 chỉ thị cho đa hình; các băng đa hình nằm trong khoảng từ 109 - 256 bp. Trong số 23 chỉ thị cho đa hình có 9 locut nhận dạng alen đặc trưng của 13 giống bí đỏ, các locut này có thể được sử dụng làm chỉ thị để nhận dạng các giống bí đỏ. Hệ số tương đồng di truyền của các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu dao động từ 0,48 đến 0,99. Hai cặp giống là B76 (Bí đỏ - SĐK 6559) với B42 (Bí đỏ - SĐK 6740); B76 (Bí đỏ - SĐK 6559) với B71 (Bí đỏ - SĐK 3826) có quan hệ di truyền xa nhất (hệ số tương đồng di truyền là 0,48) có thể sử dụng tạo tổ hợp lai trong tạo giống bí đỏ sau này. Từ khóa: Bí đỏ địa phương, đa dạng di truyền, chỉ thị phân tử SSR 1 Trung tâm Tài nguyên thực vật; 2 Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3 Viện Nghiên cứu Rau Quả I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bí đỏ là một trong những cây rau có giá trị dinh dưỡng cao, thuộc chi Cucurbita, họ bầu bí (Cucurbitaceae). Ở Việt Nam, bí đỏ đang dần trở thành một loại rau hàng hoá quan trọng trên thị trường mang lại giá trị kinh tế cho người nông dân (Lê Tuấn Phong và ctv., 2011). Tuy nhiên cũng như các cây họ bầu bí khác, nguồn gen bí đỏ địa phương đang có nguy cơ bị xói mòn do chuyển đổi mục đích sử dụng đất và sự du nhập ồ ạt của các giống bí lai thương mại có năng suất cao. Do đó, vài năm trở lại đây công tác thu thập, lưu giữ, đánh giá và khai thác nguồn gen bí đỏ phục vụ sản xuất đã bắt đầu được quan tâm hơn trước. Hiện tại, Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia đã thu thập được khoảng trên 1000 giống thuộc chi Cucurbita. Nghiên cứu đa dạng di truyền là chìa khóa cho công tác chọn tạo giống và quản lý, khai thác nguồn gen. Tuy nhiên, công tác nghiên cứu về cây bí đỏ vẫn còn rất khiêm tốn, chưa tương xứng với giá trị tiềm năng mà nguồn gen bí đỏ đem lại. Nghiên cứu đa dạng di truyền ngoài mục đích phân loại đúng nguồn gen phục vụ công tác bảo tồn, khai thác sử dụng, còn xác định được nguồn vật liệu di truyền phục vụ chọn tạo giống cây bí đỏ. Trong những năm qua, SSR được xem là chỉ thị phân tử hiệu quả nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen cây trồng do tính đồng trội và độ chính xác cao (Guichoux et al., 2011). Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chỉ thị SSR được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của 100 mẫu giống bí đỏ đang được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia - An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - 100 mẫu giống bí đỏ địa phương đang còn phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam (Bảng 1). - 41 chỉ thị SSR được chọn lọc từ cơ sở dữ liệu hệ thống genome cây bí đỏ đã công bố được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn bí đỏ nghiên cứu (Gong et al., 2008). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN từ lá non của các giống bí đỏ và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle (Doyle and Doyle, 1987). Phản ứng PCR với mồi SSR được thực hiện với bộ kit PCR KAPA2GTM của hãng KAPA Biosystems. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 95°C (3 phút), 30 chu kỳ [94°C (20s), 54°C (30s), 62°C (30s)], 3 chu kỳ [94°C (20s), 49°C (10s), 72°C (5s)] và kết thúc ở 72°C (10 phút). Sản phẩm PCR được đưa vào máy phân tích ADN tự động (Sequencing 3130xl) với phần mềm GeneScanTM 600LIZ Size Standard và GeneMapper v 4.0 để đọc kích thước các đoạn alen. Phân tích và xử lý số liệu: Kết quả được thống kê dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN (các alen). Số liệu được xử lý, phân tích bằng phần mềm Excel 2010 và phần mềm NTSYSpc 2.1 đưa ra hệ số tương đồng di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại (Rohlf, 2000). Hệ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính theo công thức của Mohammadi (Mohammadi and Prasanna, 2003) như sau: PIC = 1 - ∑ hk2 (hk: tần số xuất hiện của alen thứ k). 55 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 Bảng 1. Danh sách các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu Kí hiệu SĐK* Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu SĐK* Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu SĐK* Tên giống Nguồn gốc B1 T23265 Bí đỏ Hòa Bình B34 3639 Bí nậm Tuyên Quang B67 15115 Mắc ứ Sơn La B2 T23266 Tâu đà Điện Biên B35 3724 Bí đỏ Quảng Ninh B68 15119 Tau đà Sơn La B3 T23267 Tâu Điện Biên B36 3830 Bí ngô hình nậm Sơn La B69 6742 Bí đỏ Lạng Sơn B4 T23268 Má Ứ Điện Biên B37 3833 Bí đỏ Lào Cai B70 3630 Bí đỏ gáo Thái Nguyên B5 T23269 Tâu đà Điện Biên B38 5353 Bi nep Thái Nguyên B71 3826 Bí đỏ Sơn La B6 T23270 Tâu đà Điện Biên B39 5354 Cà đéng nú Lạng Sơn B72 9079 Nhum Sơn La B7 T23271 Tâu đà Điện Biên B40 6553 Bí đỏ Tuyên Quang B73 5356 Bí đỏ Sơn La B8 T23272 Tâu đà Điện Biên B41 6554 Bí đỏ nương Hà Giang B74 5363 Nung làng cao Bắc Giang B9 T23273 Tâu đà Điện Biên B42 6740 Bí đỏ Lạng Sơn B75 6551 Nhung nghìm dạng 2 Tuyên Quang B10 T23274 Tâu đà Điện Biên B43 6741 Bí tẻ Lạng Sơn B76 6559 Bí đỏ Lạng Sơn B11 T23275 Tâu đà Điện Biên B44 7955 Bí đỏ quả tròn Bắc Giang B77 6564 Tẩu héo Bắc Giang B12 T23276 Tâu đà Điện Biên B45 8386 Mã ức đạnh Sơn La B78 9075 Mạc ức Sơn La B13 T23277 Tâu đà Điện Biên B46 8391 Mạc ức Sơn La B79 T23298 Mắc ứ Sơn La B14 T23278 Tâu đà Sơn La B47 8396 Pỉn tô Sơn La B80 T23299 Mắc ứ Sơn La B15 T23279 Tâu đà Sơn La B48 8578 Chum quả méng Bắc Giang B81 T23300 Mắc ứ Sơn La B16 T23280 Tâu đà Sơn La B49 9078 Mạc ức Sơn La B82 T23301 Bí đỏ Sơn La B17 T23281 Tâu đà Sơn La B50 9079 Nhum Sơn La B83 T23302 Bí ngô Sơn La B18 T23282 Bi do Lào Cai B51 9294 Qua đeng Bắc Giang B84 T23303 Bí ngô Sơn La B19 T23283 Lăng cua Lào Cai B52 15084 Nhum nghim Hoà Bình B85 T23304 Tâu đà Sơn La B20 T23284 Lăng cua Lào Cai B53 15088 Má ự Điện Biên B86 T23305 Tâu đà Sơn La B21 T23285 Lăng cua Lào Cai B54 15089 Mắc ự Điện Biên B87 T23306 Tâu đà Sơn La B22 T23286 Kiềng quá Lào Cai B55 15091 Tâu Sơn La B88 T23307 Tâu đà Sơn La B23 T23287 Kiềng quá Lào Cai B56 15092 Làng gua Sơn La B89 T23308 Tâu đà Sơn La B24 T23288 Kiềng quá Lào Cai B57 15095 Phụ nhum vàng Tuyên Quang B90 T23309 Tâu đà Sơn La B25 T23289 Ne qua Lào Cai B58 15096 Pặc đeng Tuyên Quang B91 T23310 Tâu đà Sơn La B26 T23290 Ne qua Lào Cai B59 15097 Táu đa Sơn La B92 T23311 Tâu đà Sơn La B27 T23291 Nắm tấu Lào Cai B60 15100 Mắc ứ Sơn La B93 T23312 Tâu đà Sơn La B28 T23292 Nắm tấu Lào Cai B61 15102 Mắc ứ Sơn La B94 T23313 Tâu đà Sơn La B29 T23293 Cung qua Hà Giang B62 15103 Lông tau Sơn La B95 T23314 Tâu đà Sơn La B30 T23294 Cung qua Hà Giang B63 15105 Má ứ Sơn La B96 T23315 Tâu đà Sơn La B31 T23295 Cung qua Hà Giang B64 15106 Mợ ứ Điện Biên B97 T23316 Tâu đà Sơn La B32 T23296 Tâu đà Hà Giang B65 15112 Tâu Điện Biên B98 T23318 Tâu đà Sơn La B33 T23297 Tâu đà Hà Giang B66 15114 Má ứ Lai Châu B99 T23319 Mắc ức Sơn La B100 T23324 Mắc ức Sơn La *Ghi chú: SĐK là số đăng ký Ngân hàng gen. 56 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2017 - 2018 tại Trung tâm Tài nguyên thực vật - An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội và Đại học Tsukuba, Nhật Bản. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích đa hình các mẫu giống bí đỏ bằng chỉ thị SSR Trong nghiên cứu này, 41 chỉ thị SSR được sử dụng cho phản ứng PCR của 100 mẫu giống bí đỏ, trong đó 18 chỉ thị không đa hình và 23 chỉ thị đa hình. Sản phẩm PCR thống kê trên 23 chỉ thị SSR cho đa hình với kích thước các băng ADN nằm trong khoảng từ 109 - 256 bp. Tại mỗi locut đa hình, biến thiên giữa các alen đa hình dao động trong khoảng từ 2 bp (CMTm65, CMTp106, CMTp62, CMTm98) cho đến 52 bp (CMTm232) (Hình 1). Hình 1. Biến động kích thước alen tại các locut SSR Bảng 2. Thông tin đa hình tại các locut SSR của các giống bí đỏ STT Locus Số alen Kích thước alen (bp) Số alen đặc trưng Giống xuất hiện alen đặc trưng và kích thước sản phẩm PIC 1 CMTp39 6 141 - 164 2 B62 (143bp), B46(150bp) 0,32 2 CMTp88 2 175 - 181 0,02 3 CMTp224 3 164 - 170 0,48 4 CMTp125 5 119 - 143 0,67 5 CMTm29 3 109 - 123 0,06 6 CMTm111 2 130 - 136 0,04 7 CMTp183 4 204 - 223 0,32 8 CMTm65 2 117 - 119 0,49 9 CMTp106 2 181 - 183 0,26 10 CMTmC14 3 149 - 158 1 B32 (158bp) 0,05 11 CMTp36 2 174 - 189 0,40 12 CMTm232 3 204 - 256 0,47 13 CMTm131 2 129 - 137 0,33 14 CMTm261 8 204 - 246 2 B57 (204bp), B2 (246bp) 0,65 15 CMTmC11 3 149 - 155 2 B37 (155bp), B36 (153bp) 0,04 16 CMTm54 4 158 - 165 3 B76 (158), B22 (164bp), B72 (165bp) 0,05 17 CMTm219 3 129 - 131 1 B52 (130bp) 0,41 18 CMTmC15 2 136 - 140 0,03 19 CMTmC61 5 169 - 188 1 B5 (171bp) 0,20 20 CMTp68 2 189 - 202 0,50 21 CMTp62 2 145 - 147 1 B35 (147bp) 0,02 22 CMTm98 2 114 - 116 0,49 23 CMTm130 5 128 - 138 2 B22 (128bp, 136bp) 0,60 TB 3,25 0,29 Tổng số 74 15 Ghi chú: PIC: Hệ số đa hình. 57 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 Tổng số alen được phát hiện tại 23 locut là 74 alen. Số alen đa hình tại mỗi locut biến động từ 2 alen đến 8 alen, trung bình đạt 3,25 alen/locut. Có 3 cặp mồi cho 5 alen (CMTp125, CMTmC61, CMTm130); 1 cặp mồi cho 6 alen (CMTp39); riêng cặp mồi CMTm261 cho 8 alen. Trong số 23 locut cho đa hình, có 9 locut nhận dạng các alen đặc trưng (CMTp39, CMTmC14, CMTm261, CMTmC11, CMTm54, CMTm219, CMTmC61, CMTp62, CMTm130) của 13 giống bí đỏ: B62 (Lông tau - SĐK 15103), B46 (Mạc ức - SĐK 8391), B32 (Tâu đà - T23296), B57 (Phụ nhum vàng - SĐK 15095), B2 (Tâu đà - T23266), B37 (Bí đỏ - SĐK 3833), B36 (Bí ngô hình nậm - SĐK 3830), B76 (Bí đỏ - SĐK 6559), B22 (Kiềng quá - T23286), B72 (Nhum - SĐK 9079), B52 (Nhum nghim - SĐK 15084), B5 (Tâu đà - T23269), B35 (Bí đỏ - SĐK 3724). Các alen đặc trưng được phát hiện sẽ giúp nhận dạng các giống trên nhờ xuất hiện các băng ADN có kích thước khác nhau, như giống B22 (Kiềng quá - T23286) có nguồn gốc ở Lào Cai được nhận dạng bằng 2 chỉ thị CMTm54 và CMTm130. Cũng ở giống B22 (Kiềng quá - T23286) chỉ thị CMTm130 xuất hiện 2 alen đặc trưng tại kích thước 128bp và 136bp. Hệ số PIC thu được tại 23 locut SSR nghiên cứu dao động từ 0,02 (CMTp88, CMTp62) đến 0,67 (CMTp125). Hệ số PIC trong nghiên cứu trung bình đạt được là 0,29 (Bảng 2). 3.2. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống bí đỏ bằng chỉ thị SSR Số liệu thu được từ sản phẩm PCR của 23 chỉ thị SSR đa hình của 100 mẫu giống bí đỏ đã được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, từ đó thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu (Hình 2). Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu dao động từ 0,48 đến 0,99, điều này chứng tỏ các mẫu giống bí đỏ có sự đa dạng khá cao về mặt di truyền. Có 2 cặp giống có mức tương đồng di truyền 0,48 (hệ số khác biệt 0,52); cặp thứ nhất là mẫu giống bí đỏ (B76 - SĐK6559 có nguồn gốc tại Bắc Sơn, Lạng Sơn) và mẫu giống bí đỏ (B42 - SĐK6740 có nguồn gốc tại Chi Lăng, Lạng Sơn); cặp thứ hai là mẫu giống bí đỏ B76 nêu trên và mẫu giống bí đỏ (B71- SĐK 3826, có nguồn gốc Mộc Châu, Sơn La). Tại mức tương đồng di truyền 0,73 phân chia 100 mẫu giống bí đỏ thành 2 nhóm chính: - Nhóm A: gồm 76 mẫu giống, với hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu giống biến thiên trong khoảng 0,79 đến 0,99. Trong đó, tại mức tương đồng di truyền 0,79 các mẫu giống phân tách thành 3 nhóm phụ (A-1, A-2, A-3). + Tại phân nhóm A-1 chỉ có duy nhất 1 mẫu giống B1, đó là mẫu giống bí đỏ - SĐK 23265 có nguồn gốc tại Hòa Bình; + Tại phân nhóm A-2 là phân nhóm lớn gồm 73 mẫu giống các mẫu giống của phân nhóm này có nguồn gốc từ nhiều địa phương khác nhau và hệ số tương đồng di truyền của phân nhóm dao động từ 0,82 đến 0,99. + Tại phân nhóm A-3 gồm 02 mẫu giống B74 (Nung làng cao - SĐK 5363 nguồn gốc Bắc Giang) và B41 (Bí đỏ nương - SĐK 6554 nguồn gốc Hà Giang) có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,86 đến 0,99. Nhóm B: bao gồm 24 mẫu giống, các giống này đều có nguồn gốc tại Sơn La, tại hệ số tương đồng di truyền 0,99 có 4 cặp mẫu giống, cặp thứ nhất là B90 (Tâu đà - T23309) với B92 (Tâu đà - T23311); cặp thứ 2 B86 (Tâu đà -T23305) với B91 (Tâu đà - T23310); cặp thứ 3 B88 (Tâu đà - T23307) với B89 (Tâu đà - T23308) và cặp thứ 4 là B81 (Mắc ứ - T23300) với B82 (Bí đỏ - T23301). Hình 2. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 100 mẫu giống bí đỏ sử dụng 23 chỉ thị SSR 58 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Kết quả đánh giá đa dạng di truyền 100 mẫu giống bí đỏ bằng 41 chỉ thị SSR đã ghi nhận 23 chỉ thị cho các băng đa hình với số lượng alen cao (từ 2 đến 8 alen/locut). Biến động kích thước của các alen từ 109 - 256 bp. Có 9 locut nhận dạng alen đặc trưng ở 13 mẫu giống bí đỏ (CMTp39, CMTmC14, CMTm261, CMTmC11, CMTm54, CMTm219, CMTmC61, CMTp62, CMTm130). Các locut này có thể sử dụng làm các chỉ thị để xác định các giống bí đỏ. Hệ số tương đồng di truyền của các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu dao động từ 0,48 đến 0,99. Cặp mẫu giống bí đỏ (B76 - SĐK 6559) và mẫu giống bí đỏ (B42 - SĐK 6740); cặp mẫu giống bí đỏ (B76 - SĐK 6559) và mẫu giống bí đỏ (B71 - SĐK 3826) có quan hệ di truyền xa nhất (hệ số tương đồng di truyền là 0,48) có thể sử dụng tạo tổ hợp lai trong chọn tạo mẫu giống bí đỏ sau này. 4.2. Đề nghị Sử dụng 9 locut phát hiện các alen đặc trưng làm chỉ thị xác định các giống bí đỏ phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Tuấn Phong, Lê Khả Tường, Đinh văn Đạo, 2011. Sản xuất bí đỏ, tiềm năng và thách thức. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 2/2011, trang 46-50. Doyle J.J. and J.L. Doyle, 1987. A rapid isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull., 19: 11-15. Gong L, Stift G, Kofler R, Pachner M, Lelley T., 2008. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR- based genetic linkage map of  Cucurbita pepo  L. Crossref, Medline, ISI, Google Scholar. Theor. Appl. Genet. 117, pp. 37-48. Guichoux E1,  Lagache L,  Wagner S,  Chaumeil P, Léger P,  Lepais O,  Lepoittevin C,  Malausa T, Revardel E, Salin F, Petit RJ, 2011. Current trends in microsatellite genotyping. Mol. Ecol. Resour. 11: 591-611. Mohammadi, S.A., Prasanna, B.M., 2003. Analysis of genetic diversity in crop plant- Salient statistical tool and considerations. Crop Sci, 43, 1235-1248. Rohlf, F.J., 2000. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Exeter Publications, 1, Version 2.1, New York, USA. Study on genetic diversity of local pumpkin collection using molecular markers SSR Ha Minh Loan, Tran Danh Suu, Ngo Thi Hanh Abstract Forty one SSR markers were used to evaluate genetic diversity of 100 local pumpkin accessions. The result showed that 23 of 41 studied SSR markers had polymorphic bands and the band size ranged from 109 - 256 bp. 9 loci were recorded among 23 SSR markers that generated specific alleles for 13 pumpkin accessions and this loci could be used as markers for identifying pumpkin accessions. Genetic similarity coefficient of pumkin accessions ranged from 0.48 to 0.99. Two pairs of accessions, including B76 (Bí đỏ - SĐK 6559) and B42 (Bí đỏ - SĐK 6740); B76 (Bí đỏ - SĐK 6559) and B71 (Bí đỏ - SĐK 3826) which had the farthest genetic relationship (with genetic similarity coefficient of 0.48) could be used to create the cross combination for further pumpkin breeding. Keywords: Local pumpkin accessions, genetic diversity, SSR markers Ngày nhận bài: 12/3/2020 Ngày phản biện: 19/3/2020 Người phản biện: PGS. TS. Lê Hùng Lĩnh Ngày duyệt đăng: 23/3/2020