Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm botrytis cinerea pers gây bệnh thối xám trên thược dược, cà chua và lạc tại đồng bằng sông Hồng

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 73 nghiên cứu bảo vệ thực vật tập 1. Nxb Nông nghiệp Hà Nội. tr 46-57. 3. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J., 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. 4. Booth C., 1971. The Genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute, Eastern Press Limited, Kew Surrey. 5. Doyle J.J. and Doyle J.L.,1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15. 6. Kumar S., Stecher G., Tamura K., 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol Biol Evol 33(7):1870-1874. 7. Luo S., Chen Z., 1989. Study on the Fusarium wilt disease of medicinal Indian mulberry. Journal of Fujian Agricultural College 18(4):526-531. 8. Shi X. and Chi P., 1988. Identification of the pathogen causing wilt disease of the medicinal herb Indian mulberry (Morinda officinalis How.). Acta Phytopathologica Sinica 18(3):137-142. 9. White T.J., Burns T., Lee S. and Taylor J.W., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfald DH, Sninsky JJ and White TJ (eds) PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications (pp. 315-322) Academic press, New York, USA. Phản biện: TS. Hà Minh Thanh NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM Botrytis cinerea Pers. GÂY BỆNH THỐI XÁM TRÊN THƢỢC DƢƠC, CÀ CHUA VÀ LẠC TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Study on Biological Characteristics of Botrytis cinerea Pers. Causing Gray Mold Disease on Dahlia, Tomato and Groundnut in Red River Delta Mai Văn Quân 1 , Trịnh Xuân Hoạt 1 , Đặng Vũ Thị Thanh 2 , Lê Quang Mẫn 1 , Ngô Quang Huy 1 Ngày nhận bài: 08.08.2018 Ngày chấp nhận: 27.08.2018 Abstract Botrytis cinerea is an important pathogen that causes gray mold disease in different crop in Viet Nam. In present study, a total of 15 isolates were isolated from tomato (Solanum lycopersicum L.), dahlia (Dahia pinnata Cav.), groundnut (Arachis hypogae L.) in the Red River delta. The morphological characteristics were based on characters such as conidiophore and conidial length; and the results indicated that all isolates belonged to Botrytis cinerea. PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 amplified DNA fragments of about 700 bp from all isolates. The DNA sequencing and phylogenetic analysis based on ITS confirmed that B. cinerea is the causal agent of gray mold disease on crop. The effect of various culture conditions on mycelium growth, sporulation, sclerotia formation of B. cinerea was performed. CR is an oftimal medium for production of mycelium, spores and sclerotia. The growth of mycelium cultured on CR as the fastest with the production of mycelium, fungal spores and sclerotia. The optimal conditions for mycelium growth and sporulation of B. cinerea isolated from dahlia was 15-20 o C on PDA medium. The optimal conditions for mycelium growth was the 12:12 (CL:D) cycles of 12 hours light and 12 hours darkness; and the continous darkness was optimum condition for sporulation. Keywords: B. cinerea, gray mould disease, biological characteristic and molecular identification 1. Viện Bảo vệ thực vật, 2. Hội KHKT Bảo vệ thực vật Việt Nam BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 74 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Là loài ký sinh đa thực, nấm Botrytis cinerea gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng trên các bộ phận của nhiều loại cây trồng, đặc biệt là bộ phận non mềm. Nấm gây triệu chứng mốc xám trên lá, thân, hoa, quả, củ. Ở Việt Nam, đến năm 2016, nấm B.cinerea đã được phát hiện gây hại trên 50 loại cây trồng thuộc 28 họ thực vật (Mai Văn Quân và nnk, 2016). Sự đa dạng sinh học của nấm B.cinerea đã được tiến hành nghiên cứu trên các mẫu nấm phân lập từ các cây hoa thược dược, cà chua và lạc bị bệnh thối xám vào các thời điểm khác nhau ở Đồng bằng Sông Hồng, tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Chẩn đoán và Giám định dịch hại và thiên địch, Viện Bảo vệ thực vật. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu nấm phân lập từ hoa thược dược, quả cà chua, lạc có triệu chứng bị bệnh thối xám thu thập tại vùng trồng hoa Bắc Từ Liêm (Hà Nội) và phụ cận thuộc Đồng bằng sông Hồng từ năm 2008 đến 2017. Mẫu nấm phân lập từ thược dược ký hiệu từ Bo.HN05 đến Bo.HN09, mẫu nấm phân lập từ cà chua ký hiệu từ Bo.CC165 đến Bo.CC169, mẫu nấm phân lập từ lạc ký hiệu từ Bo.L111 đến Bo.L115. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Các nguồn nấm gây bệnh thối xám trong nghiên cứu được phân lập và làm thuần bằng đơn bào tử (Burgess et al, 1997): Sử dụng kim khêu nấm gạt nhẹ bề mặt tản nấm có chứa bào tử nấm, hòa loãng bào tử nấm trong 1 ml nước cất khử trùng 2 lần. Dùng pipet hút 50µl dung dịch bào tử nấm và trang đều trên đĩa petri có chứa môi trường WA. Để khô bề mặt môi trường, quan sát bào tử nấm trên kính hiển vi ở độ phóng đại 40 lần để tách đơn bào tử nấm. Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp sử dụng dung dịch CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Doyle & Doyle. 1990). Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)/ITS5(5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) để xác định nấm Botrytis cinerea theo nghiên cứu của White et al. (1990). Sản phẩm PCR, sau khi kiểm tra trong agarose gel, được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification (Qiagen, Đức) và được giải trình tự trực tiếp hai chiều theo phương pháp Sanger tại Hàn Quốc. Kết quả trình tự các mẫu được so sánh với Ngân hàng Gen bằng phần mềm trực tuyến http:blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi. Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining với khoảng cách di truyền giữa các trình tự được xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura hai tham số, độ tin cậy của các nhánh được xác định bằng giá trị bootstrap, biểu di n bằng giá trị %, vớ i 1000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013). Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nguồn nấm Botrytis cinerea thu thập được trên các ký chủ (1) trên các môi trường nhân tạo PDA, Cà rốt (CR), Bột đậu (BĐ) và Czapek; (2) ở các mức nhiệt độ 10, 15, 20, 25, và 30 o C trên môi trường PDA; (3) trong các điều kiện chiếu sáng hoàn toàn, tối hoàn toàn, 12 giờ sáng 12 giờ tối ở nhiệt độ 20 o C trên môi trường PDA. Trong mỗi thí nghiệm, theo dõi đặc điểm hình thái, kích thước tản nấm và sự hình thành bào tử, hạch nấm. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng gây hại của nấm B.cinerea Nấm thường gây hại trên chồi non, lá, nụ hoa và quả của cây. Gặp điều kiện ẩm ướt, nấm thường làm cho các bộ phận bị bệnh trở nên thối nhũn trên bề mặt vết bệnh có 1 lớp mốc xám bao phủ. Trên cà chua, nấm gây hại trên lá, chồi và quả non, lá và chồi bị thối, gãy, quả d bị rụng. Trên thược dược, khi hoa bị nấm gây hại cánh hoa bị héo và thối nhũn khi trời ẩm ướt. Trên lạc, nấm gây hại trên lá, ngọn non hay phần thân sát mặt đất của cây non làm cây khô héo hoặc thối nhũn không phát triển được (hình 1). Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 75 Hình 1. Triệu chứng bệnh thối xám trên một số cây trồng; (A): cà chua; (B): thược dược; (C): lạc Cành bào tử mọc đơn lẻ, thẳng, đa bào, cành phân nhánh ngắn, trên đỉnh phân nhánh hơi phình to thành hình cầu, có đính các núm nhỏ. Cành không màu hay có màu nâu nhạt. Bào tử đính trên các núm nhỏ, hình trứng hay bầu dục, đơn bào, không màu. Kích thước bào tử trên môi trường PDA, ở điều kiện nhiệt độ 20 o C, đối với cà chua là 9,78 x 6,67µm, trên thược dược là 9,15 x 6,32 µm, trên lạc là 10,02x 6,79 µm. 3.2 Xác định nấm B. cinerea bằng kỹ thuật sinh học phân tử Hình 2. Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining (Viện Bảo vệ thực vật, 2017) So sánh 15 trình tự đoạn gen của 12 loài nấm khác nhau từ Ngân hàng Gen, mã số Ngân hàng Gen được đặt trong dấu ngoặc đơn; Bo.CC166: mẫu nấm gây bệnh thối xám phân lập trên cà chua, Bo.L155: mẫu nấm gây bệnh thối xám phân lập trên lạc, Bo.HN06: mẫu nấm gây bệnh thối xám phân lập trên thược dược. Gốc nhánh là giá trị thống kê bootstrap với 1.000 lần lặp (chỉ ghi những giá trị lớn hơn 80%). Phytophthora phaseoli là loài khác với Botrytis BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 76 Các mẫu nấm phân lập được từ các cây cà chua, thược dược, lạc bị bệnh thối xám sau khi làm thuần đã được sử dụng để tách chiết DNA tổng số làm mạch khuôn trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung ITS4/ITS5 để khuếch đại vùng ITS. Sản phẩm PCR tất cả các mẫu nấm có kích thước xấp xỉ 700 bp. Giải trình tự hai chiều toàn bộ số mẫu thu được kết quả đồng nhất. Trình tự gen chủng nấm Bo.HN06, Bo.L115, Bo.CC166 được chọn làm đại diện để BLAST so sánh trên Ngân hàng gen NCBI. Trình tự 14 đoạn gen của 12 loài nấm thuộc Botrytis sp. (B. convoluta, B. fabiopsis, B. byssoidea, B. prunorum, B. tulipae, B. elliptica, B. sinoallii, B. squamosa, B. fabae, B. eucalypti, B. aclada và B. cinerea) chọn lựa từ Ngân hàng Gen và trình tự gen của các nguồn nấm Bo.HN06, Bo.L115, Bo.CC166 được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài (Hình 2). Phân tích vị trí trên cây phả hệ của 3 nguồn nấm Bo.HN06, Bo.L115, Bo.CC166 cho thấy gen mã hóa vùng ITS của cả 3 nguồn nấm này có giá trị bootstrap 99% với các mẫu KU145381.1; AJ422103.1 và KU936083.1 của nấm B. cinerea (Hình 2). Kết quả phân tích trình tự gen đã khẳng định bệnh thối xám trên các cây thược dược, cà chua và lạc ở vùng đồng bằng Sông Hồng là do nấm B.cinerea gây ra, các kết quả định danh dựa vào đặc điểm hình thái của nấm trước đây là chính xác. 3.3 Sự phát triển của nấm B.cinerea trên các môi trƣờng dinh dƣỡng Môi trường dinh dưỡng đã ảnh hưởng đến sự phát triển của các nguồn nấm khác nhau. Sau 4 ngày nuôi cấy, nguồn nấm phân lập từ thược dược có kích thước tản nấm lớn nhất trên môi trường BĐ là 8,5cm, nguồn nấm phân lập từ cà chua và lạc có kích thước tản nấm đạt 8,5cm trên môi trường CR. Các nguồn nấm có kích thước tản nấm nhỏ nhất trên môi trường Czapek, sau 4 ngày kích thước tản nấm của nguồn nấm phân lập trên thược dược, cà chua, lạc có kích thước lần lượt là 6,57; 6,67 và 7,1cm (bảng 1) Nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng sau 3- 7 ngày nấm hình thành bào tử. Nguồn nấm phân lập từ cà chua và lạc đều hình thành bào tử trên môi trường PDA, CR, BĐ sau 3 ngày. Trên môi trường Czapek thời gian hình thành bào tử của nguồn nấm phân lập trên cà chua là 6 ngày, nguồn nấm phân lập từ lạc là 3 ngày. Nguồn nấm phân lập từ thược dược không hình thành bào tử trên môi trường PDA, BĐ, Czapek mà chỉ hình thành bào tử trên môi trường CR sau 7 ngày nuôi cấy. Bảng 1. Sự phát triển của các nguồn nấm B. cinerea trên môi trƣờng (Viện Bảo vệ thực vật, 2016) Môi trường Ký chủ của nấm Kích thước tản nấm sau 4 ngày (mm) Thời gian hình thành Sự sinh trưởng của hạch nấm Bào tử (ngày) Hạch (ngày) KTTB (mm) Số lượng Phân bố PDA Thược dược 8,13±0,03 - 4 1,97×1,90 61 Đồng tâm Cà chua 7,23±0,03 3 5 3,83×2,35 112 Đồng tâm Lạc 8,23±0,03 3 6 2,88×1,44 78 Mép đĩa CR Thược dược 7,53±0,03 7 7 2,56×2,20 16 Rải rác Cà chua 8,50±0,00 3 5 2,20×1,96 61 Đồng tâm Lạc 8,50±0,00 3 5 1,83×1,50 77 Đồng tâm BĐ Thược dược 8,50±0,00 - 5 2,53×1,86 72 Rải rác Cà chua 7,70±0,00 3 - - - - Lạc 7,70±0,00 3 - - - - Czapek Thược dược 6,57±0,07 - 3 5,25×2,58 178 Đồng tâm Cà chua 6,67±0,07 6 7 2,45×2,08 87 Rải rác Lạc 7,10±0,00 3 6 2,40×1,90 2 - Tất cả các nguồn nấm thí nghiệm đều hình thành hạch trên môi trường PDA và CR, trên môi trường BĐ các nguồn nấm phân lập từ cà chua và lạc không hình thành hạch nấm và trên môi trường Czapek nguồn nấm phân lập từ lạc rất ít hình thành hạch. Nguồn nấm phân lập từ thược dược đạt kích thước hạch là 5,25×2,58 mm và số lượng hạch lớn nhất trên môi trường Czapek Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 77 và kích thước hạch nhỏ nhất trên môi trường PDA là 1,79 x 1,90 mm, nguồn nấm phân lập từ cà chua có kích thước và số lượng hạch lớn nhất trên môi trường PDA là 3,83×2,35 mm mọc dạng đồng tâm hay rải rác trên môi trường, tuy nhiên nguồn nấm phân lập từ lạc lại mọc tập chung mép đĩa petri trên môi trường PDA (bảng 1). 3.4 Sự phát triển của nấm B.cinerea ở các mức nhiệt độ Nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ 10 o C các nguồn nấm phát triển yếu. Sau 4 ngày kích thước tản nấm đạt từ 1,67- 2,43 cm. Nguồn nấm phân lập từ thược dược có kích thước tản nấm nhỏ nhất 1,67 cm, nguồn nấm phân lập từ lạc có kích thước tản nấm lớn nhất là 2,43 cm. Ở ngưỡng nhiệt độ này các nguồn nấm đều không hình thành bào tử và hạch nấm (bảng 2). Ở nhiệt độ 15 o C, các nguồn nấm phát triển nhanh và có khả năng hình thành bào tử và hạch nấm. Sau 4 ngày nuôi cấy, kích thước tản nấm đạt từ 5,33-6,03 cm, nguồn nấm phân lập từ cà chua hình thành bào tử sau 4 ngày nguồn nấm phân lập từ thược dược sau 8 ngày. Sau 6 ngày hạch nấm hình thành, nguồn nấm phân lập từ thược dược có kích thước và số lượng hạch nấm lớn nhất 3,70×2,53 mm và 93 hạch nấm, nguồn nấm phân từ cà chua là nhỏ nhất (3,00×2,60 mm và 23 hạch nấm). Hạch nấm của các nguồn nấm phân lập từ thược dược và cà chua phân bố đồng tâm, nguồn nấm phân lập từ lạc phân bố rải rác. Ở mức nhiệt độ 20 o C, nấm sinh trưởng phát triển nhanh hơn. Sau 4 ngày kích thước tản nấm đạt từ 7,10-8,00 cm. Sau 3 ngày các nguồn nấm phân lập từ cà chua và lạc hình thành bào tử, nguồn nấm phân lập từ thược dược không hình thành bào tử. Hạch nấm của các nguồn nấm hình thành sau 5-6 ngày, kích thước hạch của nguồn nấm phân lâp từ cà chua là lớn nhất (3,20×2,63 mm), số lượng hạch của nguồn nấm phân lập từ thược dược là lớn nhất (122 hạch nấm). Nguồn nấm phân lập từ lạc có kích thước hạch nhỏ nhất (3,17×2,50mm) và phân bố rải rác, nguồn nấm phân lập từ thược dược và cà chua phân bố dạng đồng tâm (bảng 2). Ở mức nhiệt độ từ 25 o C trở lên, các nguồn nấm phát triển kém hơn, kích thước tản nấm 4 ngày nuôi cấy chỉ đạt 1,87 - 4,93 cm, khả năng hình thành bào tử và hạch nấm đều giảm sút. Ở mức 25 o C nấm có thể sản sinh bào tử nhưng chỉ có các nguồn nấm phân lập từ cà chua, lạc hình thành bào tử sau 2 ngày. Nguồn nấm phân lập từ thược dược không hình thành bào tử. Tất cả các nguồn nấm đều không hình bào tử ở mức 30 0 C và từ nhiệt độ 25 o C trở lên nấm đã không hình thành hạch (bảng 2) Bảng 2. Sự phát triển của nấm B. cinerea ở các mức nhiệt độ khác nhau (Viện Bảo vệ thực vật, 2016-2017) Mức nhiệt độ Ký chủ KTTB tản nấm sau 4 ngày (cm) Thời gian hình thành Sự sinh trưởng của hạch Bào tử (ngày) Hạch (ngày) KTTB (mm) Số lượng Phân bố 10 o C Thược dược 1,67±0,03 - - - - - Cà chua 1,90±0,00 - - - - - Lạc 2,43±0,09 - - - - - 15 o C Thược dược 5,37±0,03 8 6 3,70×2,53 93 Đồng tâm Cà chua 6,03±0,03 4 6 3,00×2,60 23 Đồng tâm Lạc 5,33±0,03 5 6 3,17×2,50 27 Rải rác 20 o C Thược dược 7,10±0,00 - 6 3,17×1,77 122 Đồng tâm Cà chua 8,00±0,00 3 5 3,20×2,63 31 Rải rác Lạc 7,67±0,00 3 6 2,03×1,57 15 Rải rác 25 o C Thược dược 3,53±0,00 - - - - - Cà chua 4,93±0,00 2 - - - - Lạc 3,73±0,00 2 - - - - 30 o C Thược dược 1,97±0,00 - - - - - Cà chua 1,87±0,00 - - - - - Lạc 2,53±0,00 - - - - - BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 78 Hình 3: Sự phát triển của nấm B. cinerea phân lập từ cà chua sau 4 ngày nuôi cấy. Hình bên trái: sự phát của trên môi trường dinh dưỡng khác nhau; hình bên phải: sự phát triển của nấm ở mức nhiệt độ khác 3.5 Sự phát triển của nấm B.cinerea ở các điều kiện chiếu sáng Nuôi cấy trên môi trường PDA ở điều kiện 20 0 C, thời gian chiếu sáng đã ảnh hưởng đến khả năng hình thành bào tử, hình thành hạch cũng như nhịp điệu sinh trưởng của các nguồn nấm thí nghiệm. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng tới nấm cũng rất khác nhau tùy thuộc vào sự khác biệt của các nguồn nấm cũng như mức độ chiếu sáng. Ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn, sau 4 ngày nuôi cấy các nguồn nấm phân lập từ các ký chủ khác nhau có kích thước tản nấm đạt từ 6,87- 7,83 cm nấm phát triển không tuân theo nhịp điệu sinh trưởng. Nguồn nấm phân lập từ lạc có kích thước tàn nấm lớn nhất là 7,83 cm đồng thời có thời gian hình thành bào tử ngắn nhất là 5 ngày, nhưng nấm không hình thành hạch. Nguồn nấm phân lập từ thược dược và cà chua hình thành hạch sau 7 và 8 ngày (bảng 3). Nguồn nấm phân lập từ thược dược có kích thước hạch đạt 3,40×3,02 mm và số lượng hạch lớn nhất là 55 hạch. Bảng 3. Sự phát triển của nấm B. cinerea ở các thời gian chiếu sáng khác nhau (Viện Bảo vệ thực vật, 2016-2017) Thời gian chiếu sáng Ký chủ KTTB tản nấm (cm) sau 4 ngày Nhịp sinh trưởng Thời gian hình thành Sự hình thành hạch nấm Bào tử (ngày) Hạch nấm (ngày) KTTB hạch (mm) Số lượng hạch Phân bố hạch Sáng hoàn toàn Thược dược 6,87±0,03 Không 8 7 3,40×3,02 55 Rải rác Cà chua 7,27±0,03 Không 6 8 2,52×2,24 26 Rải rác Lạc 7,83±0,03 Không 5 - - - - 12h sáng/ 12h tối Thược dược 7,63±0,03 Có - 8 2,80×1,40 32 Rải rác Cà chua 8,43±0,03 Có 6 8 3,10×2,83 30 Rải rác Lạc 8,33±0,03 Không 5 - - - - Tối hoàn toàn Thược dược 7,27±0,03 Không - 6 2,45×1,50 212 Rải rác Cà chua 8,47±0,03 Không 3 5 2,85×2,50 76 Rải rác Lạc 8,47±0,03 Không 4 5 3,08×2,30 66 Rải rác Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 79 Điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng tối xen kẽ, đã ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của các nguồn nấm so với điều kiện chiếu sáng liên tục. Sau 4 ngày nuôi cấy kích thước của tản nấm của các nguồn nấm phân có kích thước trung bình từ 7,63-8,43 cm. Đặc biệt ở điều kiện chiếu sáng 12 sáng tối xen kẽ, sự sinh trưởng của các nguồn nấm phân lập từ thược dược và cà chua tuân theo nhịp điệu sinh trưởng, nguồn nấm phân lập từ lạc không tuân theo quy luật này. Nguồn nấm phân lập từ thược dược không hình thành bào tử, nguồn nấm phân lập từ cà chua và lạc hình thành bào tử sau 6 và 5 ngày. Sau 8 ngày nguồn nám phân lập từ thược dược và cà chua hình thành hạch nấm, nguồn nấm phân lập từ lạc không hình thành hạch. Nguồn nấm phân lập từ cà chua có kích thước hạch lớn nhất (3,10×2,83 mm), nhưng lại có số lượng hạch ít hơn nguồn nấm phân lập từ thược dược. Hình 4: Sự phát triển của nấm B. cinerea phân lập từ cà chua sau 4 ngày nuôi cấy ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau Ở điều kiện tối hoàn toàn, sự sinh trưởng của các nguồn nấm phân lập từ các ký chủ khác nhau cũng không tuân theo nhịp điệu sinh trưởng, kích thước tản nấm sau 4 ngày nuôi cấy từ 7,27- 8,47 cm. Nguồn nấm phân lập từ thược dược không hình thành bào tử, nguồn nấm phân lập từ cà chua có thời gian hình thành bào tử sớm nhất là 3 ngày. Các nguồn nấm hình thành hạch sau 5-6 ngày. Nguồn nấm phân lập từ lạc có kích thước hạch lớn nhất là 3,08×2,30 mm, nguồn nấm phân lập từ thược dược có kích thước hạch nhỏ nhất (2,45×1,50 mm) nhưng lại có số lượng hạch nhiều nhất là 212 hạch. ở điều kiện tối hoàn toàn, các nguồn nấm đều phân bố rải rác trên môi trường PDA. 4. KẾT LUẬN Bệnh thối xám trên cây thược dược, cà chua, lạc do nấm Botrytis cinerea gây ra, bệnh gây hại ở các bộ phận non như chồi non, lá, nụ hoa và quả của cây. Đặc điểm sinh học của các nguồn nấm B.cinerea gây bệnh thối xám trên các cây thược dược, cà chua và lạc ở vùng đồng bằng Sông Hồng khá đa dạng. Mặc dù ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của các nguồn nấm không có nhiều khác biệt, các nguồn nấm B.cinerea phân lập từ các cây ký chủ khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng, thời gian chiếu sáng để hoàn thành các giai đoạn phát triển của nấm khác nhau. Nguồn nấm B.cinerea phân lập từ cà chua và lạc hình thành bào tử trên các môi trường PDA, BD và Czapek, sau 3-6 ngày, nguồn nấm phân lập từ thược dược không hình thành được bào tử trên các môi trường này. Nguồn nấm phân lập từ thược dược hình thành hạch nhiều nhất trên môi trường Czapek, nguồn nấm phân lập từ cà chua hình thành hạch nhiều nhất trên môi trường PDA. Nguồn nấm phân lập từ thược dược và cà chua tuân theo quy luật phát triển theo nhịp điệu sinh trưởng khi gặp điều kiện chiếu sáng, tối xen kẽ, nguồn nấm phân lập từ lạc không tuân theo quy luật này. Nguồn nấm phân lập từ thược dược chỉ hình thành được bào tử trong điều kiện BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 80 chiếu sáng hoàn toàn, các nguồn nấm phân lập từ cà chua và lạc có thể hình thành được bào tử trong tất cả các điều kiện sáng hoàn toàn, sáng tối xen kẽ và tối hoàn toàn TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Mai Văn Quân, Dương Thị Nguyên, 2017. Kết quả giám định và một số đặc điểm của nấm Botrytis cinera Pers. Gây bệnh thối xám trên hoa thược dược (Dahia pinnata Cav.) tại Việt Nam. Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, số 7 (80), tr87-91 2. Đặng Vũ Thị Thanh, Vũ Duy Hiện, Mai Văn Quân, 2007. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Botrytis cinerea gây bệnh thối xám trên đào, hoa hồng, hoa lily ở vùng Sa Pa, Lào Cai. Những nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 370-380. 3. Đặng Vũ Thị Thanh, Vũ Duy Hiện, Mai Văn Quân, 2010. Nghiên cứu phổ ký chủ của nấm Botrytis cinerea Pers. gây bệnh thối xám trên cây trồng. Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 1, tr 8-9. 4. Viện Bảo vệ thực vât, 1997. Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật tập 1. NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 46-57, 5. Doyle J.J. and Doyle J.L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12, 13-15. 6. Liu, J., Tian, S., Meng, X., & Xu, Y., 2007. Effects of chitosan on control of postharvest diseases and physiological responses of tomato fruit. Postharvest Biology and Technology, 44(3), 300-306. 7. Ferrada, E. E., Latorre, B. A., Zoffoli, J. P., & Castillo, A., 2016. Identification and Characterization of Botrytis Blossom Blight of Japanese Plums Caused by Botrytis cinerea and B. prunorum sp. nov. in Chile. Phytopathology, 106(2), 155-165Mai Văn Quân, Trịnh Xuân Hoạt, Đặng Vũ Thị Thanh, Trần Thị chi, Hà Văn Dũng, Lê Thị Thanh Thuỷ, Nguy n Công Thành, 2016. Một số kết quả nghiên cứu về nấm Botrytis cinerea Pers. gây bệnh thối xám trên cây trồng. Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 6/2016, tr 37-41. 8. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S., 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729. 9. Williamson, B., B. Tudzynski, P. Tudzynski and J. A. van Kan, 2007. "Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease." Molecular plant pathology 8(5): 561-580. 10. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. J. W. T., & Taylor, J. L., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications, 18(1), 315-322. Phản biện: TS. Nguyễn Huy Chung KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN (Ralstonia solanacearum Smith) CỦA TẬP ĐOÀN DÕNG/GIỐNG LẠC Evaluation the Resistance of Groundnut Lines/Varieties to Bacterial Wilt Disease (Ralstonia solanacearum Smith) Lê Thị Phƣơng Lan 1 , Nguyễn Xuân Thu 2 , Lê Tuấn Tú 1 , Nguyễn Thị Tho 1 và Tạ Hồng Lĩnh 3 Ngày nhận bài: 10.08.2018 Ngày chấp nhận: 18.09.2018 Abstract Bacterial wilt disease, caused by Ralstonia solanacearum Smith, is one of the key biotic constraints affecting groundnut production. Planting resistant cultivars is the most important solution for controlling of bacterial wilt disease. The high toxic bacterium Phu Cuong 11 isolates was used in pathogenicity assays for evaluation the resistance of the tested lines/varieties. The result indicated that among 100 lines/varieties of 1. Viện Bảo vệ thực vật 2. Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm 3. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam