Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử bacillus subtilis KP3

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 453 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THU NHẬN BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS KP3 Vũ Thanh Thảo*, Phan Cảnh Trình*, Nguyễn Thị Linh Giang*, Lê Văn Thanh**, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Bacillus subtilis KP3 sản xuất chất chống oxi hóa và có các đặc tính probiotic có lợi được phân lập bởi Phòng thí nghiệm Vi sinh công nghệ Dược, tuy nhiên điều kiện lên men của chủng vi khuẩn này để tạo ra một lượng lớn bào tử chưa được nghiên cứu. Mục tiêu: Điều kiện lên men của B. subtilis KP3 được nghiên cứu trên bình nón và trên nồi lên men. Phương pháp Môi trường lên men trên bình nón được tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt. Sau đó, khoáng được bổ sung vào môi trường thích hợp vào các thời diểm khác nhau để cảm ứng B. subtilis KP3 tạo bào tử. Ngoài ra, tỉ lệ truyền chủng, pO2, tốc độ khuấy và các thông số của lên men mẻ bổ sung cơ chất được khảo sát trên nồi lên men để tăng lượng bào tử tạo ra. Kết quả: Môi trường thích hợp để sản xuất sinh khối của B. subtilis KP3 trên bình nón là glucose 10 g/l, đậu không dầu 19,75 g/l, amoni citrat 1,7g/l, mật rỉ 7,2 g/l, pepton từ thịt 11,13 g/l, MnCl2 16,58 mM (1 ml/l), K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, FeSO4.7H2O 1 µM (1ml/l), MgSO4.7H2O 0,38 g/l, sau 8 giờ bổ sung CaCl2 0,5 g/l và FeSO4.7H2O 35 µM (1 ml/l) để kích thích tạo bào tử với lượng bào tử tăng lên 3 lần so với môi trường đối chứng. Đối với lên men mẻ, điều kiện nuôi cấy thích hợp là pO2 50%, tốc độ khuấy 400 vòng/phút, tỉ lệ cấy truyền 5%. Trong lên men mẻ - bổ sung cơ chất mật rỉ bổ sung với tốc độ 58 ml/giờ, trong vòng 8 giờ; bào tử được thu hoạch sau 32 giờ nuôi cấy, đạt mật độ 4,46.109 bào tử/ml, tăng 2,3 lần so với lên men trên bình nón. Kết luận: Điều kiện lên men của B. subtilis KP3 trên bình nón và nồi lên nồi lên men đã được xác định nhằm tạo ra một lượng lớn bào tử để ứng dụng làm probiotic. Từ khóa: Bacillus, lên men mẻ bổ sung cơ chất, bào tử ABSTRACT STUDY ON FERMENTATION CONDITIONS FOR BACILLUS SUBTILIS KP3 SPORES PRODUCTION. Vu Thanh Thao, Phan Canh Trình, Nguyen Thi Linh Giang, Le Van Thanh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 453 - 459 Background: Bacillus subtilis KP3 which produces antioxidants and has good probiotic characteristics, was isolated by Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, but fermentation conditions of this strain have not been studied for producing large number of B. subtilis KP3 spores. Objectives: Fermentation conditions of B. subtilis KP3 on flask and fermenter were investigated. Methods: The fermentation medium on flask were optimized using response surface methodology for B. subtilis KP3 biomass production. Then, the minerals were supplemented to optimal culture medium at different time to induce sporuation of B. subtilis KP3. Moreover, stirring speed, pO2, inoculation rate and data for fed-batch fermentation were surveyed in fermenter in order to increase the density of spores. Results: The appropriate medium for producing B. subtilis KP3 biomass consisted of glucose 10 g/l, non-oil soybean 19,75 g/l, amonium citrate 1,7g/l, molasses 7,2 g/l, pepton from meat 11,13 g/l, MnCl2 16,58 mM (1 *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Bệnh viện Chợ Rẫy Tác giả liên lạc: TS. Vũ Thanh Thảo ĐT: 0985353384 Email: vuthanhthao@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 454 ml/l), K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, FeSO4.7H2O 1 µM (1ml/l), MgSO4.7H2O 0,38 g/l, after 8 hours of fermentation, CaCl2 0,5 g/l and FeSO4.7H2O 35 µM (1 ml/l) were supplemented to the medium to stimulate spore production, and spore yields increased by 3 times compared with control medium. In batch experiment, suitable culturing conditions were 50% of pO2, 400 rpm of stirring speed and 5% of inoculation rate. In fed-batch experiment, molasses was added to the speed 58 ml/hour, for 8 hours. Spores were harvested after 32 hours of incubation, reaching densities 4,46.109 spores/ml, up 2.3 times compared to fermentation flask. Conclusions: The fermentation conditions of Bacillus subtilis KP3 spores on flask and fermenter have been identified to produce large amounts of spores for application as probiotic. Key words: Bacillus, fed-batch, spore ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các chủng Bacillus l| đối tượng h|ng đầu được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để sản xuất probiotic với c{c ưu điểm như sản sinh một số loại enzym ngoại bào và tạo bào tử bền với nhiệt rất thuận lợi trong quá trình chế biến, bảo quản và sử dụng(8,19). Khi tiến hành sản xuất probiotic, nếu áp dụng c{c phương pháp nuôi cấy thông thường sẽ tốn kém về chi phí nguyên vật liệu, thiết bị, diện tích, không đạt hiệu quả kinh tế cao. Lên men chìm được áp dụng chủ yếu trong công nghiệp nhờ khả năng kiểm soát các thông số dễ dàng(13). Do đó, đ}y l| phương ph{p được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu, sản xuất nguyên liệu probiotic. Thành phần môi trường v| c{c điều kiện lên men là các yếu tố cần tối ưu hóa gi p thu được lượng sinh khối cao(15). Monterio (2005)(10) đã tiến hành tối ưu hóa lên men theo mẻ l|m tăng mật độ bào Bacillus từ 2,6.109 lên 2,2.1010 CFU/ml, tăng mật độ bào tử từ 4,2.108 lên 5,6.109 bào tử/ml. Sau đó, nhóm t{c giả đã tiếp tục lên men bổ sung cơ chất (fed-batch) để n}ng lượng bào tử lên đến 7,4.109. Nghiên cứu n|y l|m tăng hiệu quả kinh tế lên đến 17,6 lần khi lên men so với các thành phần v| điều kiện trước khi tối ưu(10). Một nghiên cứu mới đ}y của cùng nhóm tác giả trên Bacillus subtilis 210, khi sử dụng kỹ thuật lên men fed-batch đã gi p tăng mật độ bào tử lên 5,7 lần so với lên men theo mẻ(11). Taveres (2013)(16) lên men Bacillus subtilis 1012 trên môi trường F đạt mật độ 7.109 bào tử/ml. Với xu hướng nghiên cứu trên, Phòng Thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược đã ph}n lập được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis KP3 có các đặc tính probiotic có lợi, an toàn trong các thử nghiệm độc tính(17,18). Tuy nhiên, để thu được sinh khối lớn nhằm ứng dụng làm probiotic, nghiên cứu thực hiện việc khảo s{t môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận bào tử Bacillus subtilis KP3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Chủng vi khuẩn Chủng Bacillus subtilis KP3 phân lập từ mẫu đất ở Krongpa, Gia Lai, đ}y l| chủng vi khuẩn đã được chứng minh có c{c đặc điểm probiotic có lợi, được cung cấp bởi PTN Vi sinh Công nghệ Dược(17,18). Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính đến việc tạo sinh khối của B. subtilis KP3 trên ma trận Plackett-Burman. Sàng lọc 11 yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối gồm có nguồn carbon, nitơ, c{c kho{ng chất với mức cao (+1) và mức thấp (-1). Tổng số thí nghiệm l| 12, được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman. Bảng 1: Các yếu tố và nồng độ trong thiết kế Plackett -Burman Ký hiệu Tên yếu tố Giá trị Thấp (-1) Cao (+1) X1 Glucose (g/l) 5 15 X2 Mật r (g/l) 5 15 X3 Đậu nành không dầu (g/l) 5 20 X4 Pepton từ thịt (g l) 2 15 X5 Amoni citrat (g/l) 0,5 2 X6 MnCl2 (mM) - 1ml/l 5 20 X7 K2HPO4 (g/l) 2,5 10 X8 CaCl2 (g/l) 0,01 0,5 X9 NaCl (g/l) 1 5 X10 FeSO4,7H2O (mM) - 1ml/l 1 35 X11 MgSO4,7H2O (g/l) 0,2 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 455 Khảo sát nồng độ môi trƣờng thích hợp theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt RSM (Response Surface Methodology) Thử nghiệm được tiến hành nhằm x{c định nồng độ của 3 yếu tố có ảnh hưởng chính đến việc tạo sinh khối là mật rỉ, amoni citrat, MnCl2. Thí nghiệm được tiến hành trên 3 yếu tố với 3 cấp độ theo thiết kế của Box-Benhken. Tổng cộng là 15 thử nghiệm với 3 thử nghiệm thử nghiệm tại điểm trung t}m để x{c định mức độ sai số của mô hình đ{p ứng(12). Bảng 2: Nồng độ của các yếu tố khảo sát trong thử nghiệm RSM Yếu tố Phạm vi nghiên cứu Mức -1 0 +1 A Mật r (g/l) 5 – 15 5 10 15 B Amoni citrat (g/l) 0,5 – 2 0,5 1,25 2 C MnCl2 (mM) 5– 20 5 12,5 20 Sau đó sử dụng phần mềm qui hoạch thực nghiệm Design Expert 7.0 (DX 7.0) để tìm ra mô hình thực nghiệm thích hợp. Từ mô hình suy ra được phương trình hồi qui đa thức như sau: Y = βo+ Σ βi χi + Σ βijχi χj + Σ βii χi2 (1) Với Y: là hàm mục tiêu; βo: là hệ số tự do; βi: là hệ số thể hiện ảnh hưởng tuyến tính của yếu tố i; βij: là hệ số thể hiện ảnh hưởng tương tác của yếu tố i và yếu tố j; βii: là hệ số thể hiện ảnh hưởng bậc hai. Khảo sát thời điểm bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử Khảo s{t đường cong tăng trưởng trên môi trường thích hợp với tỉ lệ chủng bổ sung là 1%. Thời điểm bổ sung chủng là t0. X{c định mật độ tế b|o sau mỗi giờ bắt đầu từ t0, cho đến khi mật độ tế bào giảm sau hai mốc đếm liên tiếp. Vẽ đường cong tăng trưởng log [số lượng tế bào] theo thời gian v| x{c định thời điểm: chuyển từ pha lag sang pha log; giữa pha log; kết th c pha log, chuyển sang pha ổn định; giữa pha ổn định. Tại các mốc thời điểm lựa chọn, kho{ng được bổ sung để kích thích tạo bào tử, x{c định số lượng bào tử bằng phương ph{p đếm sống(14). Khảo sát thông số lên men trên nồi lên men 10 lít Các thông số lên men được khảo sát trên nồi lên men 10 L Biostat B Plus, Sartorius. Các thông số lên men thích hợp đối với chủng vi khuẩn thử nghiệm được khảo sát gồm: tỷ lệ cấy truyền: 1, 5, 10% tổng thể tích môi trường lên men, tốc độ khuấy: 250, 400, 600 vòng/ph t, lượng oxi cung cấp: 50, 75, 100%. Chủng vi khuẩn được bổ sung v|o 5 lít môi trường thích hợp. Lấy 5 ml mẫu sau mỗi 2 giờ kể từ 18 giờ (từ khi bắt đầu lên men) để x{c định thời điểm tạo bào tử cao nhất. Đếm sống để tính số lượng bào tử và phần trăm tạo bào tử. Khảo sát quá trình lên men mẻ - bổ sung cơ chất (lên men fed-batch) Các thông số của quá trình lên men fed-batch được tính toán từ thí nghiệm lên men mẻ theo các công thức sau: (ln xt - ln x0) = µ(t-t0); Yx/s = dX/dS )]0t(t[)e(XV/S Y μ F(t) feed X/S   xt, x0: lượng sinh khối tại thời điểm t (g/l), ban đầu t0 (g/l),µ tốc độ tăng trưởng (1/giờ), Yx/s: hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành sinh khối (g/g), F(t): tốc độ bổ sung cơ chất (ml/giờ), X: lượng sinh khối trước khi bổ sung cơ chất (g/l), V: thể tích lên men (L)(9). Thí nghiệm lên men fed-batch được thiết kế với các thông số thích hợp đã được khảo sát ở lên men mẻ. Cơ chất được bổ sung thông qua bơm nhu động có kiểm soát tốc độ dòng chảy. Thời điểm bổ sung cơ chất vào giữa pha log được x{c định bằng cách theo dõi pH (khi pH tăng trở lại). Thời điểm ngừng bổ sung cơ chất được quyết định thông qua tốc độ tăng trưởng (x{c định mật độ tế bào vi khuẩn trên buồng đếm) v| h|m lượng glucose x{c định thông qua phương ph{p đường khử v| độ brix trong môi trường. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 456 Xử lý số liệu Các số liệu trong nghiên cứu đều được thể hiện dưới dạng số trung bình SEM. Thí nghiệm tối ưu ho{ môi trường theo ma trận Plackett-Burman v| phương ph{p đ{p ứng bề mặt được xử lý bằng phần mềm Design Expert® 7.0.0. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Graphpad Prism 6. KẾT QUẢ Sàng lọc các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh khối B. subtilis KP3 theo Plackett-Burman Bảng 3: Mật độ tế bào của B. subtilis KP3 trong các thí nghiệm theo mô hình Plackett-Burman Thí nghiệm Mật độ tế bào (x10 8 CFU/ml) Thí nghiệm Mật độ tế bào (x10 8 CFU/ml) 1 16,80 7 8,87 2 18,18 8 11,85 3 12,44 9 10,84 4 16,22 10 13,75 5 16,44 11 13,67 6 10,69 12 11,71 Thí nghiệm được thiết kế mô hình theo Plackett-Burman với 11 yếu tố trong 12 thí nghiệm. Kết quả giá trị p của mô hình sinh khối là 0,0448, chứng tỏ mô hình có ý nghĩa thống kê. C{c yếu tố mật rỉ, amoni citrat, MnCl2 có giá trị p<0,05, ảnh hưởng có ý nghĩa gi{ trị thống kê đến việc tạo sinh khối. C{c yếu tố còn lại có giá trị p>0,05 nên không có ý nghĩa thống kê. Do đó, 3 yếu tố có ý nghĩa thống kê được lựa chọn là mật rỉ, amoni citrat, MnCl2 để tiếp tục khảo s{t nồng độ thích hợp theo mô hình RSM, các yếu tố còn lại được có định dựa vào dự đo{n lượng sinh khối cao nhất của mô hình Plackett-Burman gồm: glucose 10 g/l, đậu không dầu 19,75 g/l, pepton từ thịt 11,13 g/l, K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, FeSO4.7H2O 1 M (1ml/l), MgSO4.7H2O 0,38 g/l. Khảo sát nồng độ môi trƣờng thích hợp theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt RSM Bảng 4: Mật độ tế bào của B. subtilis KP3 theo RSM TN Tế bào (x10 8 CFU/ml) TN Tế bào (x10 8 CFU/ml) 1 17,83 9 8,05 2 6,84 10 14,65 3 10,50 11 10,99 4 14,90 12 9,52 5 15,62 13 21,00 6 16,85 14 18,07 7 16,12 15 18,07 8 14,65 Kết quả khảo sát trên các môi trường theo mô hình RSM thu được mật độ của B. subtilis KP3 từ 8,05.108 CFU/ml - 21,00.108 CFU/ml. Các dữ liệu về sinh khối phù hợp với mô hình bậc 2 (Quadratic model) với hệ số tương quan của mô hình sinh khối là 0,9452. Dữ liệu phân tích thống kê tính toán được gi{ trị p của mô hình sinh khối là 0,0114 chứng tỏ mô hình có ý nghĩa thống kê. C{c yếu tố B2-amoni citrat, C2-MnCl2 và sự phối hợp giữa mật rỉ và amoni citrat ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê với gi{ trị p<0,05, các yếu tố còn lại ảnh hưởng không có ý nghĩa thống kê. Phương trình hồi quy về lượng sinh khối của B. subtilis KP3 thu được: Sinh khối (x108 CFU/ml) = -5,64 + 0,49*A*B - 5,49*B2 - 0,023*C2 Với hàm mục tiêu là sinh khối cực đại, phần mềm dự đo{n các thông số thích hợp của môi trường là: mật rỉ 7,2 g/l,; amoni citrat 1,7 g/l và MnCl2 là 16,58 mM (bổ sung 1ml/l) với mật độ tế bào 1,96.109 CFU/ml. Kết quả đ{nh giá sự phù hợp của các thông số theo mô hình với thực nghiệm cho thấy độ tương thích là 99,49%. Khảo sát thời diểm bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử Với thành phần công thức môi trường thích hợp, tiến hành khảo sát sự đường cong tăng trưởng của B. subtilis KP3 trong 30 giờ. Đường cong tăng trưởng có các pha như sau: pha lũy thừa từ 1 đến 7 giờ, pha ổn định từ 8 giờ đến 26 giờ, pha suy vong sau 26 giờ. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 457 Các mốc thời điểm bổ sung kho{ng được x{c định từ đường cong tăng trưởng như sau: 1 giờ (đầu pha lũy thừa), 4 giờ (giữa pha lũy thừa), 8 giờ (bắt đầu pha ổn định), 12 giờ (giữa pha ổn định) với 2 khoáng bổ sung giúp kích thích tạo bào tử là FeSO4.7H2O (1ml/l) 35 µM và CaCl2 0,5 g/l. 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 5 6 7 8 9 1 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 T h ô øi g ia n (h ) L o g [T B ] Hình 1: Đường cong tăng trưởng của KP3 trên môi trường thích hợp Bảng 5: Thời điểm bổ sung khoáng ảnh hưởng đến tỉ lệ tạo bào tử hời điểm bổ sung khoáng giờ Khảo át sau 48 giờ Tổng tế ào ào tử Tỉ lệ ào tử (%) 1 2,21±0,12 0,73±0,03 33 4 2,14±0,08 1,04±0,05 49 8 2,24±0,05 2,22±0,06 99 12 2,25±0,07 2,18±0,07 97 Đối chứng 2,21±0,11 0,74±0,04 35 Ghi chú: *: x109 CFU/ml. Đối chứng: môi trường thích hợp không bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử. Các ion kim loại trong môi trường là thành phần cần thiết tạo ra điều kiện stress để giúp vi khuẩn tạo bào tử. Tuy nhiên, trên môi trường thích hợp, tỉ lệ bào tử thu nhận còn khá thấp khoảng 35%. Tỉ lệ tạo bào tử có thể được cải thiện nhờ việc bổ sung thêm các khoáng kích thích tạo bào tử như FeSO4, CaCl2, hay MnCl2 như trong các môi trường có tỉ lệ tạo bào tử cao như DSM hay 2SG (2x Schaeffer's sporulation agar). Kết quả cho thấy việc bổ sung c{c khoáng kích thích tạo b|o tử v|o môi trường tối ưu có hiệu quả tốt. Khi bổ sung kho{ng kích thích tạo b|o tử, mật độ tế b|o vẫn ở mức cao, việc bổ sung kho{ng không l|m giảm mật độ tế b|o nhưng có t{c dụng l|m tăng mật độ v| tỷ lệ b|o tử đạt được. Thời điểm bổ sung kho{ng l c 8 giờ gi p tăng mật độ b|o tử lên 3 lần. Sau khi tối ưu ho{ môi trường nuôi cấy thu sinh khối v| bổ sung kho{ng kích thích tạo b|o tử B. subtilis KP3, công thức nuôi cấy thích hợp cho B. subtilis KP3 như sau: glucose 10 g/l, đậu không dầu 19,75 g/l, amoni citrat 1,7g/l, mật rỉ 7,2 g/l, pepton từ thịt 11,13 g/l, MnCl2 16,58 mM (1 ml/l), K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, FeSO4.7H2O 1 M (1ml/l), MgSO4.7H2O 0,38 g/l, sau 8 giờ bổ sung CaCl2 0,5 g/l và FeSO4.7H2O 35 M (1 ml/l). Khảo sát thông số lên men thu bào tử B. subtilis KP3 Trong 3 tỉ lệ cấy truyền khảo sát là 1%, 5% và 10% trên thể tích môi trường lên men, tỉ lệ cấy truyền 5% có thời gian thu nhận bào tử là 36 giờ mật độ khoảng 14,19x108 bào tử/ml là tỉ lệ cho thời gian thu nhận ngắn nhất và mật độ bào tử cao nhất. Tốc độ khuấy 400 vòng/phút thời gian tạo bào tử của chủng là 32 giờ (14,83x108 bào tử/ml) nhanh hơn so với tốc độ khuấy 250 vòng/phút và 600 vòng/phút. pO2 50% cho thời gian thu bào tử nhanh hơn pO2 75% và 100% với lượng bào tử thu được là 14,83x108 bào tử/ml. Vậy các thông số thích hợp trên nồi lên men là tỉ lệ cấy truyền 5%, tốc độ khuấy 400 vòng/phút và pO2 50% với thời gian nuôi cấy là 32 giờ. Tuy nhiên khi lên men mẻ thì lượng bào tử thu nhận được giảm so với lên men trên bình nón, điều này có thể giải thích do việc sử dụng cơ chất trên nồi lên men nhanh dẫn đến tế bào nhanh chóng chuyển sang pha suy vong trước khi tiến hành tạo bào tử, do đó cơ chất là mật rỉ sẽ được bổ sung gián đoạn để giúp tăng mật độ tế bào và lượng bào tử hình thành. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 458 Khảo sát quá trình lên men mẻ - bổ sung cơ chất Bảng 6: Thông số lên men mẻ - bổ sung cơ chất STT Thông số Giá trị 1 Tốc độ tăng trƣởng cực đại (1/giờ) 0,97 a 2 Hiệu suất sử dụng cơ chất (g/g) 0,60 a 3 Nồng độ mật r trong dung dịch bổ sung (g/l) 500 b 4 Thể tích lên men khởi đầu (L) 3 5 Sinh khối trƣớc giai đoạn bổ sung cơ chất (g/l) 2,1 c 6 Tốc độ bổ sung cơ chất F(t) (ml/giờ) 58 7 Thời điểm bổ sung cơ chất Giờ thứ 3-4 a: giá trị ước đoán dựa vào thí nghiệm lên men theo mẻ, b: tương ứng nồng độ đường tổng trong dịch bổ sung 200 g/l, c: giá trị sinh khối quy đổi từ mật độ vi khuẩn tại thời điểm trước khi bổ sung cơ chất. Thí nghiệm lên men mẻ - bổ sung cơ chất nhằm mục tiêu tăng mật độ bào tử bằng việc bổ sung cơ chất mật rỉ với tốc độ bổ sung cơ chất không đổi. Mật rỉ được bổ sung để duy trì cân bằng pH nhờ acid tạo ra trong quá trình oxi hóa carbohydrat. Thông số cần tính toán trong lên men mẻ - bổ sung cơ chất là tốc độ bổ sung cơ chất F(t). Từ các thông số nêu trên, F(t) tính được là 58 ml/giờ. Đường cong tăng trưởng trong lên men fed-batch có pha log dài 9 giờ, tốc độ tăng trưởng cực đại µmax= 0,89 (1/giờ). Tốc độ sử dụng cơ chất tỉ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng (µ). Do đó, khi vi khuẩn giảm tốc độ tăng trưởng, mật rỉ được bổ sung tiếp tục làm tăng nồng độ cơ chất trong môi trường. Đ{nh giá độ brix, nồng độ glucose và giá trị µ, ngừng bổ sung thêm cơ chất ở giờ thứ 12. Tại thời điểm này, giá trị độ brix là 4,7 cao hơn 0,2; nồng độ glucose là 1,65 g/l cao hơn 0,44 g/l so với thời điểm 11 giờ 30 phút. Mật độ vi khuẩn xác định trên buồng đếm giữa giờ thứ 9 và 12 không có sự khác biệt (1,02.1010-1,12.1010 CFU/ml). Trong suốt quá trình bổ sung mật rỉ, pH không tăng quá cao mà ổn định quanh giá trị pH 7. Hình 2: Diễn biến các thông số của B. subtilis KP3 trong lên men fed-batch BÀN LUẬN Như vậy, việc bổ sung mật rỉ có vai trò điều chỉnh pH môi trường trong quá trình lên men(15). Thí nghiệm lên men fed-batch duy trì vi khuẩn trong trạng thái pha lũy thừa từ giờ thứ 1-9, đạt mật độ vi khuẩn cực đại 1,12.1010, mật độ bào tử sau 32 giờ nuôi cấy là 4,46.109 BT/ml tăng lên 2,3 lần so với lên men theo mẻ là 1,96.109 BT/ml. KẾT LUẬN Môi trường thích hợp cho sự phát triển của B. subtilis KP3 đã được xây dựng theo mô hình Plackett-Burman và RSM là glucose 10 g/l, đậu không dầu 19,75 g/l, amoni citrat 1,7g/l, mật rỉ 7,2 g/l, pepton từ thịt 11,13 g/l, MnCl2 16,58 mM (1 ml/l), K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, FeSO4.7H2O 1 M (1ml/l), MgSO4.7H2O 0,38 g/l, sau 8 giờ bổ sung CaCl2 0,5 g/l và FeSO4.7H2O 35 M (1 ml/l). Quy trình nuôi cấy trên nồi lên men có bổ sung cơ chất đã được xây dựng, với mật độ bào tử B. subtilis KP3 thu nhận là 4,46.109 bào tử/ml tăng lên 2,3 lần so với lên men trên erlen. TÀI LIỆU THAM KHẢO 8. Duc LH, Hong HA, Barbosa TM, et al (2004), "Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use", Applied and Environmental Microbiology. 70(4), 2161-2171. 9. Lee J, Lee SY, Park S, et al (1999), "Control of fed-batch fermentations", Biotechnology Advances. 17(1), 29-48. 10. Monteiro SM, Clemente JJ, Henriques AO et al (2005), "A Procedure for High Yield Spore Production by Bacillus subtilis ", Biotechnology progress. 21(4), 1026-1031. 11. Monteiro SMS, Clemente JJ, Carrondo MJT et al (2014), "Enhanced spore production of Bacillus subtilis grown in a Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 459 chemically defined medium ", Advances in Microbiology. 4(08), 444. 12. Myers RH, Montgomery DC, Anderson-Cook CM (2009), Response surface methodology: process and product optimization using designed experiments. 3rd ed. Wiley series in probability and statistics. Wiley, Hoboken, N.J. 13. Nguyễn Văn Thanh, Trần C{t Đông, Trần Thu Hoa, et al. (2009), Công nghệ sinh học Dược. NXB Giáo Dục, tr. 297. 14. Nicholson W, Setlow P (1990), "Chapter 9. Sporulation, germination and outgrowth", in Molecular biological methods for Bacillus, Colin R Harwood, Simon M Cutting, Editors, Wiley, tr. 391-451. 15. Stanbury PF, Whitaker A, Hall SJ (1995), "Media for industrial fermentation ", in Principles of Fermentation Technology - Second Edition, Peter Hall, F. Stanburyallan, et al, Editors, Pergamon: Amsterdam, tr. 93-122. 16. Tavares MB, Souza RD, LuizWB et al (2013), "Bacillus subtilis Endospores at High Purity and Recovery Yields: Optimization of Growth Conditions and Purification Method", Current Microbiology. 66(3), 279-285. 17. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Bảo Anh Trúc, Trần C{t Đông (2015), "Nghiên cứu đặc tính probiotic của một số chủng Bacillus sinh chất chống oxi hóa", Y Học TP.HCM. 19(3), 289-295. 18. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần C{t Đông (2014), "Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ một số vi khuẩn và vi nấm", Y Học TP.HCM. 18(1), 373-378. 19. World Health Organization (2002), "Guidelines for the evaluation of probiotics in Food". Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018