Nghiên cứu định lượng Acyclovir trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 3 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACYCLOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Lê Văn Thanh1; Vũ Thị Thu Giang2; Trần Cát Đông3 Tạ Mạnh Hùng4; Nguyễn Văn Bạch1 TÓM TẮT Mục tiêu: thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm định lượng acyclovir trong huyết tương chó. Đối tượng và phương pháp: loại protein trong huyết tương chó bằng phương pháp tủa protein, sau đó định lượng acyclovir bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Khảo sát các điều kiện sắc ký, thẩm định độ đặc hiệu, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết và độ ổn định của acyclovir theo các tiêu chí của FDA. Kết quả: chiết acyclovir từ huyết tương chó bằng phương pháp tủa protein với dung môi gây tủa là axít percloric 20%; xác định được các điều kiện sắc ký như: cột, pha động, tốc độ dòng, detector. Phương pháp được thẩm định và đạt các tiêu chí theo quy định của FDA. Kết luận: có thể sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng acyclovir trong huyết tương chó khi đánh giá sinh khả dụng của acyclovir trên chó thực nghiệm. * Từ khóa: Acyclovir; Huyết tương chó; Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. ĐẶT VẤN ĐỀ Acyclovir (ACV) là một dẫn chất tổng hợp của axít nucleosid - guanosin, có tác dụng mạnh và chọn lọc trên virut gây bệnh ở người, bao gồm virut Herpes simplex týp 1 và 2, các virut Varicella- Zoster, virut Epstien-barr và cytomegalo. Tuy nhiên, ACV có thời gian bán thải ngắn, hấp thu qua đường tiêu hóa chậm và không hoàn toàn. Với liều hiện nay, lượng thuốc hấp thu rất thấp (15 - 30%) do thời gian lưu trú tại vùng hấp thu ngắn. Kết quả, hầu hết thuốc được đào thải qua phân (50 - 60%) ở dạng không được hấp thu [1, 2]. Để khắc phục những nhược điểm trên, chúng tôi đã bào chế thành công viên nén ACV kết dính sinh học, chế phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở theo các tiêu chí về viên nén của Dược điển Việt Nam V và dạng thuốc kết dính sinh học giải phóng kéo dài. Việc xác định sinh khả dụng và tương đương sinh học dựa vào các thông số dược động học của viên nén ACV kết dính sinh học là cần thiết [3]. Nhằm mục đích đánh giá sinh khả dụng trên chó thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng ACV trong huyết tương chó [4]. 1. Học viện Quân y 2. Trường Đại học Dược Hà Nội 3. Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 4. Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Người phản hồi (Corresponding author): Lê Văn Thanh (levanthanh09091963@gmail.com) Ngày nhận bài: 04/09/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 03/10/2019 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2020 T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020 4 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu và thiết bị. * Nguyên liệu và hóa chất: - ACV chuẩn: hàm lượng 99,9% (do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp). - Viên nén ACV khả dụng sinh học đường tiêu hóa (tự bào chế) đạt tiêu chuẩn cơ sở. - Huyết tương chó trắng đạt tiêu chuẩn thử thuốc. - Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho HPLC hoặc tinh khiết phân tích. * Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU; máy ly tâm lạnh SARTORIUS (Đức), máy lắc xoáy VELP (Italia); cân phân tích SARTORIUS (Đức) có độ chính xác 0,1 mg và các dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn phân tích. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phương pháp định lượng: - Xử lý mẫu ACV trong huyết tương: mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng. Lấy 1 ml huyết tương, thêm 250 µl dung dịch axít percloric 20%, lắc xoáy 15 giây, ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, sau đó hút lớp dung dịch phía trên, tiêm sắc ký. Các mẫu huyết tương trắng có pha ACV chuẩn và huyết tương chó sau khi uống thuốc đều được chiết theo quy trình trên rồi tiến hành định lượng. - Điều kiện sắc ký: + Cột sắc ký: C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm. Nhiệt độ cột 400C. + Pha động: methanol:dung dịch đệm pH 3,0 (tỷ lệ 8:92) (dung dịch đệm pH 3,0 pha như sau: 0,43 g natri octansulfonic trong 1.000 ml nước, chỉnh về pH 3,0 bằng axít photphoric). + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. + Detector: PDA 252 nm. + Thể tích tiêm: 100 µl. + Nhiệt độ autosampler: 4oC. * Thẩm định phương pháp định lượng ACV trong huyết tương chó: - Pha dung dịch ACV chuẩn trong huyết tương trắng: + Dung dịch chuẩn gốc: nồng độ chính xác 500 µg/ml ACV trong nước cất. + Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với huyết tương trắng để thu được mẫu ACV trong huyết tương có nồng độ 1 và 5 µg/ml. + Mẫu chuẩn: pha loãng dãy dung dịch trên với huyết tương trắng để thu được mẫu chuẩn có nồng độ ACV trong từ 0,1 - 5 µg/ml. Quy trình thẩm định phương pháp định lượng tiến hành theo hướng dẫn của FDA [5]: - Tính chọn lọc: chuẩn bị 6 mẫu huyết tương chó khác nhau ở nồng độ giới hạn định lượng dưới (LLOQ) dự kiến khoảng 0,1 µg/ml. Phân tích các mẫu bằng phương pháp HPLC. - Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: chuẩn bị mẫu huyết tương chó chứa ACV với 7 nồng độ chính xác (0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 µg/ml), mỗi nồng độ 2 mẫu độc lập (có điều chỉnh khối lượng ACV cân). Phân tích các mẫu bằng phương pháp HPLC. Xây dựng đường chuẩn theo mô hình hồi quy tuyến tính. - LLOQ: chuẩn bị 6 mẫu huyết tương chó chứa ACV ở nồng độ chính xác (0,1 µg/ml) (có điều chỉnh khối lượng ACV cân). t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 5 Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện. Phân tích các mẫu bằng phương pháp HPLC. Xác định độ đúng bằng cách so sánh nồng độ tính được từ đường chuẩn với nồng độ thực đã pha. Xác định độ chính xác bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD. - Độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và khác ngày): chuẩn bị 3 lô mẫu huyết tương chó chứa ACV, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập: mẫu kiểm tra nồng độ thấp (LQC) khoảng 0,3 µg/ml. Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (MQC) khoảng 2,5 µg/ml. Mẫu kiểm tra nồng độ cao (HQC) khoảng 4,0 µg/ml. Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện. Phân tích các mẫu bằng phương pháp HPLC. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh nồng độ phân tích của mẫu kiểm tra so với nồng độ thực đã pha. Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giữa các giá trị phân tích của mỗi nồng độ. Xác định độ lặp khác ngày bằng cách lặp lại các bước trên trong 3 ngày. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giữa giá trị phân tích của mỗi nồng độ trong những ngày đánh giá. - Độ ổn định: chuẩn bị 2 lô mẫu huyết tương chó chứa ACV, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập: mẫu kiểm tra LQC khoảng 0,3 µg/ml. Mẫu kiểm tra HQC khoảng 4,0 µg/ml. Phân tích ngay các mẫu bằng phương pháp HPLC, xác định hàm lượng dược chất trong mẫu ban đầu. Sau 24 giờ, phân tích lại các mẫu bằng phương pháp HPLC, xác định lại hàm lượng dược chất trong các mẫu trên. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Tính tương thích của hệ thống. Xác định tính tương thích của hệ thống HPLC: tiêm lặp lại 6 lần các dung dịch chuẩn ACV trong mẫu huyết tương tự tạo có nồng độ khoảng 2,5 µg/ml. Xác định thời gian lưu (TR), diện tích píc của ACV trên sắc ký đồ. Bảng 1: Kết quả đánh giá tính tương thích của hệ thống HPLC (n = 6). Mẫu Diện tích píc (mAU.s) Thời gian lưu (giây) Hệ số kéo đuôi 1 455080 7,575 1,381 2 451887 7,568 1,383 3 453141 7,567 1,377 4 452448 7,566 1,384 5 450325 7,555 1,384 6 452407 7,557 1,388 Trung bình 452548 7,565 1,383 CV (%) 0,3 0,1 0,3 Hệ thống HPLC hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt. Hệ số biến thiên CV (%) của thời gian lưu, diện tích píc và hệ số kéo đuôi của ACV đều < 2,0%, chứng tỏ hệ thống có tính phù hợp cao. Phù hợp với việc phân tích dược chất trong dịch sinh học. T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020 6 2. Kết quả thẩm định tính chọn lọc. Phân tích các mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương tự tạo chứa ACV chuẩn có nồng độ 0,1 µg/ml (ở nồng độ LLOQ). Bảng 2: Đáp ứng píc của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu (tR ) của ACV. Mẫu Diện tích píc của mẫu trắng (mAU.s) Diện tích píc mẫu chuẩn ACV ở nồng độ LLOQ (mAU.s) 1 2377 19615 2 2782 20542 3 2545 20007 4 1982 19669 5 2289 20808 6 2405 18366 Trung bình 2397 19835 Tỷ lệ đáp ứng píc (%) 12,1 (a) (b) Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (a) và sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn ACV ở nồng độ 0,1 µg/ml (b). Kết quả cho thấy, tỷ lệ diện tích píc của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của ACV bằng 12,1% so với diện tích píc của mẫu LLOQ nằm trong giới hạn cho phép (≤ 20%). Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng, hầu như không có píc xuất hiện tại vị trí xuất hiện píc của ACV pha trong huyết tương trắng. Vì vậy, phương pháp phân tích ACV đáp ứng yêu cầu về độ chọn lọc theo hướng dẫn của FDA. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 7 3. Kết quả thẩm định độ tuyến tính và giới hạn định lượng dưới. Bảng 3: Tương quan giữa nồng độ ACV trong huyết tương chó và diện tích píc. Tên mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Nồng độ thực (µg/ml) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 Diện tích píc (mAU.s) 26639 45027 102556 200375 384079 587020 977053 Phương trình hồi quy (Y = aX+b)* Y = 193848x + 5048,8 R 2 = 0,9999 Nồng độ xác định từ đường chuẩn (ng/ml) 0,110 0,210 0,503 1,008 1,9553 3,002 5,014 Nồng độ xác định từ đường chuẩn so với giá trị thực (%) 111,4 103,1 100,6 100,8 97,8 100,1 100,3 y = 193848x + 5048.8 R2 = 0.9999 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ (mcg/ml) Di ện tíc h pí c (m AU . s) Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ ACV trong huyết tương chó và diện tích píc. Tính lại nồng độ hoạt chất có trong mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy đã xây dựng. Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, 100% số điểm đạt độ đúng so với giá trị thực nằm ở giới hạn cho phép (85 - 115%), giá trị R2 = 0,9999. Như vậy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát, có tương quan tuyến tính giữa nồng độ ACV trong huyết tương chó và diện tích píc thu được. Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lượng ACV trong huyết tương chó. LLOQ: tiến hành khảo sát mẫu chuẩn ACV ở nồng độ khoảng 0,1 µg/ml. T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020 8 Bảng 4: Kết quả xác định LLOQ. Mẫu Diện tích píc mẫu huyết tương trắng (mAU.s) Diện tích píc mẫu huyết tương có ACV (≈ 0,1 µg/ml) (mAU.s) Nồng độ tìm thấy(a) (µg/ml) Độ đúng(b) (%) Đạt/không đạt 1 2377 19615 0,091 93,8 Đạt 2 2782 20542 0,096 99,0 Đạt 3 2545 20007 0,093 96,0 Đạt 4 1982 19669 0,091 94,1 Đạt 5 2289 20808 0,098 100,5 Đạt 6 2405 18366 0,084 86,7 Đạt Trung bình 2397 19835 0,092 95,0 RSD (%) 5,1 5,1 Đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ/mẫu trắng (%) 8,3 (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực) Độ đúng tìm thấy ở nồng độ LLOQ cao hơn 90% và có sự chênh lệch không nhiều giữa các mẫu (RSD 5,1%), chứng tỏ LLOQ xác định phù hợp. 4. Độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày. Chuẩn bị các mẫu kiểm tra nồng độ trong huyết tương có nồng độ 0,3 µg/ml; 2,5 µg/ml và 4,0 µg/ml, mỗi nồng độ chuẩn bị 6 mẫu. Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày. LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml) Mẫu Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) 1 0,294 101,1 2,296 94,7 3,802 98,0 2 0,287 98,5 2,448 100,9 3,952 101,8 3 0,291 100,0 2,497 102,9 3,986 102,7 4 0,274 94,3 2,511 103,5 3,984 102,7 5 0,274 94,1 2,513 103,6 4,019 103,6 6 0,280 96,4 2,512 103,6 4,007 103,3 Trung bình 0,283 97,4 2,463 101,5 3,958 102,0 RSD (%) 3,0 3,0 3,5 3,5 2,0 2,0 (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực) t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 9 Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày. LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml) Ngày Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) 1 0,294 101,1 2,296 94,7 3,802 98,0 2 0,287 98,5 2,448 100,9 3,952 101,8 3 0,291 100,0 2,497 102,9 3,986 102,7 4 0,274 94,3 2,511 103,5 3,984 102,7 5 0,274 94,1 2,513 103,6 4,019 103,6 I 6 0,280 96,4 2,512 103,6 4,007 103,3 1 0,298 102,3 2,209 91,1 3,733 96,2 2 0,292 100,2 2,453 101,2 3,969 102,3 3 0,288 99,0 2,471 101,9 3,966 102,2 4 0,295 101,4 2,466 101,7 4,003 103,2 5 0,283 97,3 2,440 100,6 3,966 102,2 II 6 0,287 98,5 2,459 101,4 3,970 102,3 1 0,287 96,5 2,498 100,6 4,129 104,0 2 0,291 97,8 2,578 103,9 4,276 107,7 3 0,280 93,8 2,617 105,4 4,250 107,0 4 0,289 97,0 2,620 105,6 4,260 107,3 5 0,283 95,1 2,633 106,1 4,277 107,7 III 6 0,288 96,8 2,644 106,5 4,291 108,0 Trung bình 0,287 97,8 2,492 101,9 4,047 103,4 RSD (%) 2,3 2,6 4,5 3,8 4,1 3,1 (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực) Ở cả 3 nồng độ, phương pháp đều cho độ đúng trong ngày và khác ngày cao (trong khoảng 85 - 115%) và độ lặp lại trong ngày và khác ngày với giá trị RSD < 15%, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ đúng, độ lặp lại đáp ứng yêu cầu đối với phương pháp phân tích các chất trong dịch sinh học. T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020 10 5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp. Tiến hành sắc ký các lô mẫu kiểm tra nồng độ bao gồm LQC 0,3 µg/ml, MQC 2,5 µg/ml và HQC 4,0 µg/ml, mỗi lô gồm ít nhất 5 mẫu độc lập. Đồng thời tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng. Bảng 7: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của ACV. LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml) Mẫu Diện tích píc ACV trong huyết tương (mAU.s) Diện tích píc ACV trong dung môi (mAU.s) Diện tích píc ACV trong huyết tương (mAU.s) Diện tích píc ACV trong dung môi (mAU.s) Diện tích píc ACV trong huyết tương (mAU.s) Diện tích píc ACV trong dung môi (mAU.s) 1 61551 56215 447720 469120 738476 740886 2 60113 55721 477169 464937 767251 740639 3 60913 55531 486505 465630 773939 739433 4 57716 58111 489222 465148 773549 739792 5 57635 57280 489611 463732 780200 740734 6 58890 59172 489519 463607 778021 740505 Trung bình 59470 57005 479958 465362 768573 740332 RSD (%) 2,8 2,5 3,4 0,4 2,0 0,1 Tỷ lệ thu hồi (%) 104,3 103,1 103,8 Quy trình chiết đạt tỷ lệ thu hồi cao và ổn định. Giá trị RSD% của đáp ứng píc ACV giữa các mẫu ≤ 3,4%. Tỷ lệ thu hồi khác nhau giữa các nồng độ không quá ± 1,2%. Do vậy, có thể khẳng định phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp, có thể áp dụng trong thực nghiệm. 6. Độ ổn định của mẫu huyết tương. - Độ ổn định của mẫu sau ba chu kỳ đông - rã đông: phân tích các mẫu LQC và HQC theo phương pháp đã xây dựng. So sánh nồng độ ACV trong các mẫu LQC và HQC ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) với bảo quản sau 3 chu kỳ đông - rã đông. Bảng 8: Độ ổn định của ACV trong mẫu huyết tương chó sau 3 chu kỳ đông - rã đông. Nồng độ (µg/ml) Mẫu LQC (≈ 0,3 µg/ml) Mẫu HQC (≈ 4,0 µg/ml) Mẫu Ban đầu Sau 3 chu kỳ đông - rã đông Ban đầu Sau 3 chu kỳ đông - rã đông 1 0,335 0,310 4,140 4,189 2 0,330 0,311 4,181 4,156 3 0,319 0,312 4,274 4,223 t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 11 4 0,329 0,320 4,315 4,258 5 0,334 0,315 4,324 4,295 6 0,331 0,320 4,276 4,339 Trung bình 0,330 0,315 4,251 4,243 RSD (%) 1,7 1,4 1,8 1,6 Độ lệch (%) -4,5 -0,2 Sau 3 chu kỳ đông - rã đông, nồng độ của ACV vẫn ổn định, độ lệch giữa nồng độ thời điểm ban đầu và nồng độ sau 3 chu kỳ đông - rã đông ≤ 4,5% (< 15%) và kết quả định lượng ở mỗi nồng độ có RSD ≤ 1,8% (< 15%), đạt yêu cầu theo quy định để có thể phân tích lại mẫu khi cần thiết. - Độ ổn định dài ngày: bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC, nhiệt độ -350C ± 50C. Phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định (7 ngày, 22 ngày và 44 ngày). Bảng 9: Kết quả độ ổn định dài ngày của ACV trong huyết tương chó. Nồng độ (µg/ml) Mẫu LQC (≈ 0,3 µg/ml) Mẫu HQC (≈ 4,0 µg/ml) Mẫu Ban đầu Sau 7 ngày Sau 22 ngày Sau 44 ngày Ban đầu Sau 7 ngày Sau 22 ngày Sau 44 ngày 1 0,335 0,318 0,306 0,299 4,140 4,004 3,997 3,999 2 0,330 0,319 0,304 0,287 4,181 4,091 4,227 4,031 3 0,319 0,348 0,305 0,277 4,274 4,052 4,270 4,127 4 0,329 0,319 0,300 0,285 4,315 4,160 4,351 4,027 5 0,334 0,345 0,305 0,277 4,324 4,181 4,368 4,095 6 0,331 0,338 0,299 0,283 4,276 4,193 4,288 3,955 Trung bình 0,330 0,331 0,303 0,285 4,251 4,114 4,250 4,039 RSD (%) 1,7 4,3 1,0 2,9 1,8 1,9 3,2 1,6 Độ lệch (%) -0,3 -8,1 -13,7 2,4 0,0 -5,0 Độ lệch của nồng độ mẫu 44 ngày với nồng độ tại thời điểm ban đầu ≤ 13,7% (< 15%) và giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ có RSD ≤ 4,3% (< 15%), đạt độ lệch chuẩn theo quy định, chứng tỏ mẫu vẫn ổn định sau 44 ngày bảo quản, đảm bảo phân tích hết mẫu. T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020 12 KẾT LUẬN Đã thẩm định được độ chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết và độ ổn định của ACV trong huyết tương chó. Quy trình đã đáp ứng được các yêu cầu của một phương pháp phân tích trong dịch sinh học theo quy định của FDA. Phương pháp này có thể áp dụng để định lượng ACV trong huyết tương chó khi nghiên cứu sinh khả dụng và xác định các thông số dược động học của viên nén ACV 200 mg kết dính sinh học trên chó thực nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế. Dược thư Quốc gia Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2009, tr.36-40. 2. Sweetman S.C et al. Martindale. Pharmaceutical Press. 2009, pp.862-864, 911. 3. Gaoo J. Bioanalytical method validation for studies on pharmacokinetics, bioavailability and bioequivalence: Highlights of the FDA’s guidance. Asian J Drug Metab Pharmacokinet. 2004, 4 (1), pp.5-13. 4. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, FDA, U.S. Department of Health and Human Services. 2001. 5. Food and Drug Administration USA. Guidance for Industry: Q1A (R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products. 2003.